НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ

І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ЛОМНИЦЬКА МАРТА ІГОРІВНА

УДК 618.11-006.6:616.13-073.756.4:616.155.3-097.37:577.2-037

АНГІОГЕНЕЗ В РАКУ ЯЄЧНИКА: ЦИТОКІННА РЕГУЛЯЦІЯ ТА ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті ім. Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник – кандидат медичних наук, доцент

Володько Наталія Антонівна,

Львівський національний медичний університет

ім. Данила Галицького, старший науковий

співробітник кафедри онкології та медичної радіології.

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук

Поліщук Людмила Захарівна,

Інститут експериментальної патології, онкології

і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

механізмів протипухлинної терапії; м. Київ.

- кандидат медичних наук

Ціп Наталія Павлівна,

Інститут онкології АМН України,

старший науковий співробітник

науково-дослідного відділення онкогінекології; м. Київ.

Провідна установа - Національний медичний університет ім.

О.О.Богомольця МОЗ України, кафедра онкології,

м. Київ.

Захист відбудеться „ 14 ”грудня 2005 р. об 1100 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий „_12_”листопада 2005р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.БОРОДАЙ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Рак яєчника (РЯ) є найчастішою причиною смерті пацієнток із онкогінекологічними захворюваннями (Abdollahi T., 2004). Висока летальність обумовлена безсимптомністю перебігу захворювання, внаслідок чого у 75% випадків РЯ виявляють на III-IV стадії пухлинного процесу, що погіршує прогноз та результати лікування (Воробйова Л.І., 2003). Захворюваність на РЯ в Україні у 2004р. за даними Національного Канцер-Реєстру складала 15,2 на 100 тис. населення. Високими є показники смертності від РЯ, у тому числі протягом першого року після встановлення діагнозу (станом на 2004 рік – 35,6% хворих) (Бюлетень Нац. Канцер-Реєстру України, 2005). П’ятирічна виживаність хворих на РЯ становить 15-25% і протягом останніх 30 років майже не змінилась (Кулаков В.И., 1999). Щороку від РЯ помирає більше жінок, ніж від раку шийки матки та ендометрію разом узятих (Гилятудзинова З.Ш. та співавт., 2000).

Таким чином, актуальним є визначення додаткових параметрів, які б характеризували ріст та агресивність РЯ, сприяли індивідуалізації та підвищенню ефективності лікування хворих. Одним із таких напрямків є вивчення ангіогенезу РЯ і механізмів його регуляції, а також асоційованих з ангіогенезом діагностичних та прогностичних параметрів, терапевтичних мішеней (Brown M.R. et al., 2000; Bamberger E.S. et al., 2002; Paley P.J. et al., 2002).

За даними літератури ріст та метастазування злоякісних пухлин прямо залежать від їх кровопостачання (Paley P.J., 2002; Carmeliet P., 2003). Від активності ангіогенезу залежить ріст РЯ, розвиток асциту та метастазування РЯ (Bamberger E.S. et al., 2002). Однак, немає одностайної думки щодо прогностичної цінності ступеня мікроваскуляризації РЯ, адже одними авторами підтверджується його прогностичне значення щодо загальної (Wang Z. et al., 2000) та безрецидивної (Raspollini M.R. et al., 2004) виживаності хворих, а іншими - спростовується (Obermair A. et al., 1999; Nakayama K. et al., 2001).

До активаторів ангіогенезу злоякісних пухлин належать регуляторні молекули цитокіни, що синтезуються пухлинними клітинами, ендотеліоцитами, інфільтруючими пухлину макрофагами: фактор росту ендотеліоцитів судин (ФРЕС) (Ferrara N., 2000; Новак О.Є., 2002), основний фактор росту фібробластів (оФРФ) (Poole T.J. et al., 2001) тощо. Підвищена експресія ФРЕС у РЯ є несприятливою прогностичною ознакою (Kassim S.K. et al., 2004). Роль таких цитокінів як фактор некрозу пухлин- (ФНП-?) та трансформуючий фактор росту-? (TФР-) в регуляції ангіогенезу РЯ, дотепер залишається нез’ясованою. У системах in vitro та in vivo ФНП- та TФР- здатні як пригнічувати, так і стимулювати ангіогенез, що обумовлено активністю компонентів внутрішньоклітинних сигнальних шляхів ФНП- та TФР- (Souchelnytskyi S., 2002; Lamouille S. et al., 2002; Lдtti S. et al., 2003). ?дним із сучасних підходів до визначення представників сигнальних шляхів цитокінів та їх функціональної активності є ідентифікація цитокін-регульованих білків за допомогою аналізу протеому клітин (Figeys D., 2003; Ping P., 2003; Blagoev B. et al., 2003).

При розвитку РЯ часто зустрічається дисфункція генів-супресорів пухлинного росту BRCA1, p53, р57 та кодованих ними білків (Schuijer M. et al., 2003). Дисфункції BRCA1 належить одне із провідних місць у розвитку як успадкованого, так і спорадичного РЯ (Zheng W. et al., 2000; Hilton J.L. et al., 2002). Встановлено, що білок BRCA1 взаємодіє із ФРЕС (Kawai H. et al., 2002), однак роль першого у регуляції ангіогенезу РЯ не вивчалась. Для РЯ характерними є мутаційні та немутаційні пошкодження гену р53 (Cadwell C. et al., 2001; Halperin R. et al., 2001), а з пошкодженням гену р57 пов’язаний розвиток раку грудної залози, сечового міхура, легень, нирки, яєчок (Lee M.H. et al., 2001), але зв’язок цих змін із особливостями ангіогенезу остаточно не визначений, на що вказує низка робіт (Lee J.S. et al., 2003; Lim J.J. et al., 2003).

Одним із напрямків досліджень в онкології протягом останніх років є розробка антиангіогенної терапії злоякісних пухлин специфічними та неспецифічними інгібіторами ангіогенезу (Folkman J., 1999; Mross K., 2000; Kerbel R. et al., 2002), цитостатиками (Hanahan D. et al., 2000, Kerbel R. et al., 2004). Антиангіогенна дія інтерферону-?2b (ІФН-2b) та цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду, паклітакселу) у низьких дозах і доцільність їх застосування у хворих на РЯ не з’ясовані.

Таким чином, незважаючи на значну кількість досліджень, присвячених різним аспектам РЯ, ангіогенез РЯ, його цитокінна регуляція, прогностичне та клінічне значення для хворих залишаються остаточно невивченою актуальною проблемою онкології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана у відповідності з планами науково-дослідних робіт кафедри онкології та медичної радіології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького за темою: „Індивідуалізація комплексного лікування раку грудної залози, жіночих статевих органів, травного тракту та гемобластозів на основі об’єктивних факторів прогнозу і перебігу захворювання” (№ Держреєстрації 0102U00722; роки виконання: 2002-2006).

Мета дослідження – визначити роль ріст-інгібуючих цитокінів і білків генів-супресорів пухлинного росту в регуляції ангіогенезу РЯ та оцінити прогностичне значення мікроваскуляризації РЯ для індивідуалізації лікування хворих.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні завдання дослідження:

1. Дослідити мікроваскуляризацію РЯ, оцінити її клініко-прогностичне значення та зв’язок із 3- і 5-річною виживаністю.

2. Визначити концентрацію цитокінів ФНП- та ТФР- у супернатантах первинних клітинних культур РЯ і у плазмі крові пацієнток та їх зв’язок із особливостями мікроваскуляризації пухлин.

3. Дослідити особливості експресії тумор-супресорних білків BRCA1, р53 та р57 у клітинах РЯ з різним ступенем мікроваскуляризації.

4. Визначити функціональні білкові мішені ТФР- в ендотеліоцитах мікросудин та оцінити роль ідентифікованих білків у регуляції ангіогенезу.

5. З’ясувати вплив ріст-інгібуючих цитокінів (ФНП-, ТФР-?, ІФН-2b) та цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду і паклітакселу) на функціональну активність ендотеліоцитів мікросудин у системі in vitro. Обгрунтувати можливість використання ІФН-?2b у “метрономному режимі” для лікування хворих на РЯ.

Об’єкт дослідження – 125 хворих на РЯ І – IV стадії захворювання.

Предмет дослідження – механізми ангіогенезу РЯ, пов’язані із цитокінами ТФР-? і ФНП- та білками генів-супресорів пухлинного росту BRCA1, p53 та p57; клінічне та прогностичне значення ангіогенез-асоційованих параметрів.

Методи дослідження - клінічні, гістологічні, імуногістохімічні, культуральні, тест захоплення [3Н]-тимідину, метилтетразолієвий тест, імуноцитохімічні, протеомікс - двомірний електрофорез білків, масс-спектрометрія, імуноблотинг білків, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше встановлена обернена залежність між активністю ангіогенезу РЯ та рівнем експресії ФНП- пухлиною.

Вперше досліджено зміни білкового спектру ендотеліальних клітин мікросудин під впливом ТФР-?, ідентифіковано і проведено функціональний аналіз 54 білків та ідентифіковано білки, що взаємодіють із основним компонентом сигнального шляху ТФР-? – білком Смад3.

Визначено залежність активності ангіогенезу РЯ від стадії пухлинного процесу, гістологічної будови РЯ та ступеня диференціації його клітин і прогностичну цінність ступеня мікроваскуляризації РЯ для загальної тривалості життя та 3- і 5-річної виживаності хворих.

Показано зв’язок активації ангіогенезу РЯ зі зниженням експресії тумор-супресорних білків BRCA1 та p57 у клітинах пухлини, асоціацію гіперекспресії білка р53 у клітинах РЯ із високим ступенем мікроваскуляризації пухлини.

Встановлено залежність загальної тривалості життя та 1-, 3- і 5-річної виживаності хворих на РЯ від ступеня експресії білка BRCA1 у клітинах пухлини.

Показано пряму антипроліферативну та проапоптотичну дію ІФН-?2b у низьких дозах та пряму антипроліферативну дію цис-платину, циклофосфаміду та паклітакселу у низьких дозах на ендотеліальні клітини мікросудин.

Практичне значення одержаних результатів.

Запропоновано визначення ступеня мікроваскуляризації РЯ імуногістохімічним методом із антитілами до фактора VIII для оцінки прогнозу загальної тривалості життя та 1-, 3- і 5-річної виживаності хворих.

Запропоновано визначення ступеня експресії тумор-супресорного білка BRCA1 у клітинах РЯ як показника загальної тривалості життя та 1-, 3- і 5-річної виживаності пацієнток.

Вперше обґрунтовано доцільність застосування ріст-інгібуючого цитокіну ІФН-?2b із антиангіогенною метою у комбінованому лікуванні хворих на РЯ та проведено апробацію введення цитокіна у антиангіогенному низькодозовому „метрономному режимі” у хворих із хіміорезистентним РЯ.

Результати роботи впроваджені у Закарпатському, Івано-Франківському, Тернопільському обласних онкологічних диспансерах.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено клінічний відбір хворих на РЯ, відбір гістологічних блоків у патологоанатомічному відділенні Львівського державного онкологічного регіонального лікувально-діагностичного центру, аналіз документації канцер-реєстру, імуногістохімічні дослідження РЯ та аналіз їх результатів. Автором виконано інтраопераційний забір зразків РЯ, проведено ензимну дезагрегацію із отриманням первинних клітинних культур РЯ та їх добових супернатантів. Автором виконано вимірювання концентрації цитокінів ФНП-? та ТФР-? у супернатантах первинних клітинних культур РЯ біологічним методом. Автор брала участь у клінічному обстеженні та лікуванні (оперативному, хіміотерапевтичному та антиангіогенному) хворих на РЯ, проводила моніторинг пацієнток, що отримували антиангіогенну терапію із використанням ІФН-?2b. У Людвіг-Інституті дослідження раку (м. Упсала, Швеція) автор виконала дослідження впливу ІФН-?2b та цитостатиків у низьких дозах на проліферацію та апоптоз ендотеліоцитів мікросудин in vitro. Автор виконала двомірний електрофорез білків, масс-спектрометрію, і вивчила зміни білкового спектру ендотеліоцитів мікросудин під впливом ТФР- та ідентифікацію білків, що взаємодіють з білком Смад3. Автор проаналізувала результати, оформила їх у статтях та доповіла на конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи представлені та обговорені на: ІХ Міжнародному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2005); І-му Українському Конгресі клітинної біології (Львів, 2004); 14-й Європейській конференції студентів та молодих вчених (Німеччина, 2003); Міжнародній зустрічі дослідників ТФР-? (Швеція, 2003); Міжнародному форумі „Онкологія-ХХІ” (Київ, 2003); конференції „Проблеми онкоімунології” (Київ, 2003); Міжнародній медичній конференції студентів та молодих науковців (Дніпропетровськ, 2001); 11-й Європейській конференції студентів та молодих вчених (Німеччина, 2000); 2-й Міжнародній медичній конференції студентів та молодих лікарів із 9-м Міжнародним симпозіумом Європейської асоціації студентів-медиків (Польща, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 статей у провідних фахових журналах, в тому числі - у 2 іноземних, та 17 тез у матеріалах конференцій, в тому числі – міжнародних.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 8 розділів, висновків, практичних рекомендацій. Вона викладена на 149 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 33 таблицями та 41 рисунком, містить додатки (6 сторінок). Список літератури включає 353 літературні джерела (англомовних – 330, українських і російських – 23) на 37 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на базі Львівського державного онкологічного регіонального лікувально-діагностичного центру (ЛДОРЛДЦ), у науково-дослідному секторі кафедри онкології та медичної радіології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького та у Людвіг-Інституті дослідження раку (м. Упсала, Швеція).

Клінічну групу склали 125 хворих на РЯ, які лікувались протягом 1995-2005рр. Середній вік пацієнток становив 54,70,9 років (90,4% хворих вікового діапазону 45 - 65 років). У 48(38%) хворих була І та ІІ стадії РЯ, а у 77(62%) - III та IV стадії (за класифікацією FIGO). Лікування 78 (62,4%) хворих було комбінованим: радикальне оперативне (екстирпація матки з додатками, оментектомія) із ад’ювантною поліхіміотерапією (ПХТ), а 35 (28%) полягало у неоад’ювантній ПХТ із операцією та ад’ювантною ПХТ (за схемою СР - 6 циклів: цис-платин 75,0 мг/м2, циклофосфамід 750,0 мг/м2). У рандомізованій групі 22 хворих із хіміорезистентним нерезектебельним рецидивним РЯ проведено апробацію застосування Лаферону у антиангіогенному режимі.

Усім хворим проведено комплексне обстеження (бімануальне, трансвагінальне ультразвукове дослідження органів малого тазу, черевної порожнини із допплер-ефектом, рентгенобстеження органів грудної клітки, визначення рівня СА-125 у плазмі крові, цитологічне дослідження асцитної рідини, фіброезофагогастродуоденоскопія, ректороманоскопія, цистоскопія, колоноскопія), за показами - комп’ютерну томографію тазу. Опрацьовано історії хвороб, амбулаторні картки, матеріали Національного Канцер-реєстру.

Проведено інтраопераційний забір пухлинного матеріалу та підбір парафінових блоків видалених пухлин поточного та ретроспективного матеріалу (103 хворих на РЯ). Для оцінки виживаності хворих на РЯ відібрано групу з 66 пацієнток, період спостереження за якими перевищував 5 років від початку специфічного лікування. На клінічному матеріалі 49 хворих (частина з них із попередньої групи) проведено дослідження зв’язку ангіогенезу РЯ із експресією білків генів-супресорів пухлинного росту, на 37 із них – із експресією цитокінів.

Для експериментальної частини дослідження використано наступні методи: клінічні; гістологічні; імуногістохімічні з моноклональними антитілами до фактора VIII для візуалізації ендотеліоцитів мікросудин із наступним підрахунком останніх під світловим мікроскопом (20 полів зору, ?1500), а також – з моноклональними антитілами до білків BRCA1, p53 та p57 для вивчення експресії цих білків у клітинах РЯ. Експресію білка BRCA1 вважали слабкою при його експресії у 10-30% клітин, помірною – у 31 – 50% клітин, сильною – понад 50% клітин. Експресію у 10 – 25% клітин ввавжали легкою, у 26 – 50% клітин – помірною, у понад 50% клітин – сильною. Експресію білка р57 вважали позитивною при експресії у 50% клітин. Біологічним методом із клітинами ліній L929 та Mv1Lu (CCL64) визначено концентрацію цитокінів ФНП- і ТФР-, відповідно. Клітини лінії ендотеліоцитів мікросудин дерми людини для вивчення впливу ріст-інгібуючих цитокінів (ФНП-, ТФР-, ІФН-?2b), цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду і паклітакселу) на ці клітини та для дослідження ТФР--залежного білкового спектру цих клітин. Виділення первинних клітинних культур РЯ проводили шляхом ензимної дезагрегації пухлин і короткотривалого культивування для отримання добових супернатантів первинних клітинних культур РЯ та визначення концентрації ФНП- і ТФР- у них. Для вивчення проліферації клітин та її змін під впливом ріст-інгібуючих цитокінів (ФНП-, ТФР-, ІФН-?2b) та цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду і паклітакселу) використано тест захоплення [3Н]-тимідину та метилтетразолієвий тест. Для візуалізації апоптозу в ендотеліоцитах мікросудин реагентом ДАФІ використано імуноцитохімічний метод. Проведено аналіз ТФР-?-регульованого протеому ендотеліальних клітин мікросудин: двомірний електрофорез білків на апараті Dalt-Six (Amersham Biosciences) для розділення білків лізатів ендотеліальних клітин мікросудин, що інкубувались із ТФР-1 (5,0 нг/мл) або без нього, за молекулярною масою (до 250 кДа) та градієнтом рН (3-10). Проведено статично обґрунтований аналіз двомірних електрофореграм білків з допомогою комп’ютерної програми ImageMaster2DElite (Amersham Biosciences, Швеція) для відбору білкових точок і наступною їх трипсинізацією до пептидних сумішей. Масс-спектрометрію пептидних сумішей проведено на апараті Bruker Autoflex MALDI (Bruker Daltonics, Німеччина) для ідентифікації окремих пептидів, за вмістом, яких за допомогою систем MASCOT () і ProFound ( Правильність ідентифікації підтверджено імуноблотингом білків з комерційними антитілами. Статистичні методи аналізу результатів дослідження проведено за допомогою комп’ютерної програми STATISTICA 6.0. (StatSoft Inc.,1994-2001 – ) для визначення критерію Ст’юдента (t), коефіцієнтів відповідності (2) та кореляції (r), загальної тривалості життя однопоказниковим методом Каплана-Меєра, незалежних факторів прогнозу багатопоказниковим методом регресійних моделей ризику Кокса.

Результати досліджень та їх обговорення

Прогностичне значення мікроваскуляризації (МВ) раку яєчника

Після імуногістохімічної візуалізації мікросудин з’ясувалось, що ступінь МВ РЯ не є однорідним, зокрема, кількість мікросудин у 20 полях зору (1500) коливалась від 24 до 156. Тому за дискримінантою у 75 мікросудин, хворих на РЯ розділено на дві групи – із високим ступенем мікроваскуляризації (ВМВ - 100,2±4,7 мікросудин) та низьким ступенем мікрваскуляризації (НМВ - 51,6±2,2 мікросудин). У хворих, лікування яких розпочиналось із оперативного, спостерігалась однакова кількість пацієнток із ВМВ та НМВ РЯ: у 27 (32%) хворих на РЯ спостерігали ВМВ, а у 30 (35%) – НМВ. Натомість, серед хворих на РЯ, лікування яких розпочиналось із неоад’ювантної ПХТ, переважали пухлини, які характеризувались ВМВ (20 випадків із 28 – 71,4%). Середня кількість мікросудин пухлин у цій групі була достовірно вищою (119,0±4,4), ніж у пацієнток, яким відразу проводилось радикальне оперативне лікування (екстирпація матки з додатками, оментектомія) (t=2,94, p<0,005). У групі хворих, лікування яких розпочиналось із неоад’ювантної ПХТ, було лише 8 (9,5%) випадків із НМВ РЯ. Зростання ступеня МВ РЯ спостерігалось як на початкових (І – ІІ), так і на поширених (III – IV) стадіях захворювання. Поясненням загального зростання ступеня МВ РЯ можуть бути процеси активації гену ФРЕС у клітинах РЯ (Gorski D.H. et al., 1999) та виживання резистентних до хіміопрепаратів клонів ракових клітин, під впливом проангіогенних молекул яких відбувається активація ангіогенезу (Kerbel R. et al., 2002).

Визначено достовірне зростання ступеня МВ РЯ на поширених (III – IV) стадіях захворювання, порівняно із початковими (І – ІІ). Показано, що ступінь МВ серозного РЯ є нижчим, ніж серозно-папілярного та муцинозного. Низьким виявився ступінь МВ ендометріоїдного РЯ. Недиференційований РЯ характеризувався вірогідно вищим ступенем МВ пухлини, ніж інші гістологічні варіанти пухлини. МВ РЯ є найвищою при РЯ G3, на відміну від G2 та G1.

Достовірно вищою є загальна тривалість життя хворих із НМВ РЯ, що визначено однопоказниковим методом Каплана-Меєра (рис. 1).

Рис. 1. Загальна тривалість життя хворих на РЯ у залежності від МВ.

Встановлено, що 1- річна виживаність хворих на РЯ із НМВ пухлини на 19% вища, ніж у хворих із ВМВ, 2-річна – на 24%, 3-річна – на 15% та 5-річна – на 13%. Багатопоказниковим методом регресійних моделей ризику Кокса МВ РЯ визначена достовірним незалежним фактором прогнозу виживаності хворих на РЯ (табл. 1).

Таблиця 1

Вірогідні прогностичні фактори виживаності хворих на РЯ

Параметр | Варіанта | Критерій достовірності загальної виживаності

Р

Вік | < 60 pоків

60 років | 0,9717

Стадія (FIGO) | І | 0,0358

ІІІ | 0,4458

Мікроваскуляризація | ВМВ

НМВ | 0,0449

Неоад’ювантна ПХТ | ні

так | 0,6602

Таким чином, такий критерій ангіогенезу РЯ як ступінь МВ пухлини, поряд зі стадією пухлинного процесу, є вірогідними незалежним фактором прогнозу загальної тривалості життя пацієнток та 1-, 3- і 5-річної їх виживаності. Це вказує на доцільність визначення ступеня МВ РЯ для визначення прогнозу виживаності хворих та є обґрунтуванням для розробки підходів до антиангіогенної терапії РЯ.

Дослідження експресії ріст-інгібуючих цитокінів ФНП- та ТФР-? та тумор- супресорних білків BRCA1, p53 та p57 у РЯ із різною МВ

Для вивчення експресії ФНП- та ТФР-? досліджені первинні клітинні культури РЯ, їх добові супернатанти та плазма крові. Виявлено негативну кореляцію між ступенем МВ РЯ та продукцією ФНП-? у супернатантах первинних клітинних культур (r= -0,4713, p=0,007). Вища продукція ФНП-? первинними клітинними культурами РЯ була характерною для НМВ РЯ, а низька - для пухлин із ВМВ (табл. 2).

Таблиця 2

Концентрація ФНП-? у супернатантах первинних клітинних культур РЯ в залежності від мікроваскуляризації та проведеного лікування

Проведене лікування

і кількість хворих на РЯ, n=38 | Ступінь МВ РЯ | Концентрація ФНП-? у супернатанті, нг/мл

Радикальне оперативне+ад’ювантна ПХТ, n=27 | НМВ (n=11) | 1,12±0,31* #

(0,18 – 2,5)

ВМВ (n=16) | 0,44±0,09*

(0,09 – 1,05)

Неоад’ювантна ПХТ + оперативне лікування + ад’ювантна ПХТ, n=11 | НМВ (n=2) | 0,5

(0,4; 0,61)

ВМВ (n=9) | 0,44±0,16 #

(0 – 1,25)

Примітка: t*= 2,06; t# = 2,00, p* # < 0,05.

Після неоад’ювантної ПХТ продемонстрований зв’язок між ступенем МВ РЯ та продукцією ФНП-? у супернатанти первинних клітинних культур не змінювався. У плазмі хворих на РЯ визначена позитивна кореляція (r=0,551; p=0,063) між ступенем МВ пухлини та концентрацією ФНП-. Виявилось, що у хворих на РЯ із НМВ спостерігалась низька концентрація ендогенного ФНП-? у плазмі крові, а у плазмі крові хворих із ВМВ РЯ – високі рівні ФНП-?. При неоад’ювантній ПХТ цей зв’язок не змінювався: у хворих на РЯ із ВМВ вміст ендогенного ФНП-? був високим. Отримані результати підтвердились і дослідженнями у системі in vitro. Зокрема, продемонстровано, що дія ФНП-? на проліферативний потенціал (ПП) клітин лінії ендотеліоцитів мікросудин не є прямолінійною (рис. 2): ФНП- у низьких дозах (до 0,05 нг/мл) підвищував ПП досліджуваних клітин, порівняно із контролем. Дія ФНП- щодо ендотеліоцитів мікросудин у дозі понад 0,5 нг/мл ставала антипроліферативною і ефект ФНП- наростав у дозі 5,0 нг/мл. Виявлені зміни можуть бути обумовлені існуванням в ендотеліоцитах мікросудин двох внутрішньоклітинних шляхів відповіді на дію ФНП- (Shono T. et al., 1996). Отже, ФНП- регулює ангіогенез РЯ людини у „дозо-залежний” спосіб. ФНП-, секретований у супернатанти первинними клітинними культурами РЯ, у низьких дозах стимулював ангіогенез, а у високих – пригнічував.

Рис. 2. Зміни проліферативного потенціалу ендотеліальних клітин мікросудин під впливом ФНП-? (*p<0,001 відносно контролю).

Щодо ТФР-?, продемонстровано лише тенденцію до негативної кореляції (r= -0,356, p=0,095) між ступенем МВ РЯ та продукцією ТФР-? первинними клітинними культурами РЯ (5,42±0,70 нг/мл при НМВ РЯ та 5,37±0,43 нг/мл при ВМВ РЯ). Однак у системі in vitro ТФР-? у дозі 0,05 нг/мл виявляв виражену антипроліферативну дію щодо ендотеліоцитів мікросудин (рис. 3).

Отже, у супернатантах первинних клітинних культур РЯ із різним ступенем МВ виявлялись однакові рівні ТФР-. Близькими до рівнів ТФР- у супернатантах первинних клітинних культур РЯ були концентрації цитокіна у плазмі крові хворих. Однак, в системі in vitro ми показали, що ТФР- пригнічує ПП ендотеліальних клітин мікросудин у „дозо-залежний” спосіб. Це стало поштовхом для з’ясування ролі ТФР- у регуляції ангіогенезу шляхом застосування методів аналізу протеому для дослідження регульованого цим цитокіном білкового спектру ендотеліальних клітин мікросудин.

Рис. 3. Зміни проліферативного потенціалу ендотеліальних клітин мікросудин під впливом ТФР-? (*p<0,001 відносно контролю).

Двомірні електрофореграми білків ендотеліальних клітини мікросудин містили близько 1000 білкових точок, переважна кількість яких займала зону молекулярних мас від 50 до 200 кДа і рН від 3 до 7. Під впливом ТФР-?1 змінювалась експресія 102 білкових точок, 60 із яких повністю зникали (42 точки) чи з’являлись (18 точок). У 60 білкових точках ідентифіковано 54 білки. Ідентифіковані білки розділено на 11 функціональних груп: передавачі сигналу (13 білків), регулятори клітинного циклу (р57Kip2, E2F6), білки родини Ras (Rab39, Rab35), нові білки, компоненти цитоскелету (7 білків), регулятори метаболізму, транскрипції, трансляції, реплікації ДНК, імуноглобуліни та фрагменти антигенів.

За допомогою методів аналізу протеому ідентифіковано 25 білків, що взаємодіють із функціональними доменами компоненту внутрішньоклітинного сигнального шляху ТФР-? білком Смад3. Серед ідентифікованих білків є 8 компонентів цитоскелету, особливу увагу із яких привертає ТФР-?-регульований білок ендотеліальних клітин мікросудин актин-?. Це вказує на роль Смад3 у регуляції міграції клітин ендотеліальних клітин мікросудин, що має важливе значення в ангіогенезі.

Отже, регуляторна щодо пухлинного ангіогенезу дія ТФР- є опосередкованою і прямою. Відсутність зв’язку між вмістом ТФР- у супернатантах первинних клітинних культур РЯ та ступенем його МВ свідчить про значний вплив компонентів внутрішньоклітинного сигнального шляху цього цитокіна. Різною функціональною активністю цих білків визначається кінцевий ефект ТФР- на ендотеліальні клітини мікросудин, а відтак – на ангіогенез.

Цитокіни ФНП- і ТФР- взаємодіють із білками генів-супресорів пухлинного росту. Експресія білка BRCA1 у клітинах РЯ спостерігалась лише у 23 (46,9%) хворих на РЯ: у 12 (24,5%) хворих вона була слабкого, у 11 (22,4%) хворих – помірного (10,0%) та сильного (12,4%) ступенів. У 26 (53,1%) хворих експресія білка BRCA1 у клітинах РЯ не спостерігалась. У хворих із різним ступенем МВ РЯ спостерігаються різні ступені експресії білка BRCA1 у клітинах пухлини (табл. 3). Як видно із табл. 3, характерною особливістю НМВ РЯ було переважання позитивної експресії білка BRCA1 у 15 (62,5%) хворих з домінуванням слабкого (+) та помірного (++) її ступенів. Натомість, ВМВ РЯ характеризувався відсутністю експресії білка BRCA1 у 17 (68%) хворих і тільки у 8 (32,0%) експресія білка була позитивною. Однак у 16% випадків РЯ із ВМВ експресія білка BRCA1 у клітинах пухлини була сильного на відміну від РЯ із НМВ, у якому сильна експресія білка BRCA1 спостерігалась лише у 8,3% хворих.

Таблиця 3

Експресія білка BRCA1 в клітинах РЯ пухлин із різною мікроваскуляризацією

Ступінь МВ РЯ | Кількість n (%) випадків з різним ступенем експресії білка BRCA1 | Кількість випадків n (%) із позитивною експресією білка BRCA1

0 | + | ++ | +++

НМВ (n=24) | 9 (37,5) | 9 (37,5) | 4 (16,7) | 2 (8,3) | 15 (62,5)

ВМВ (n=25) | 17 (68,0) | 3 (12,0) | 1 (4,0) | 4 (16,0) | 8 (32,0)

Примітка: 2 = 15,9, p<0,01.

Математична обробка даних показала, що між ступенем МВ РЯ та ступенем експресії тумор-супресорного білка BRCA1 у клітинах РЯ існує слабка обернена кореляція (r= - 0,231, p=0,061), що свідчить про тенденцію до асоціації позитивної експресії білка BRCA1 із НМВ РЯ, а негативної – із ВМВ. Встановлено, що ступінь експресії білка BRCA1 у клітинах РЯ на різних стадіях пухлинного процесу різний: із прогресуванням пухлинного процесу ступінь експресії білка BRCA1 достовірно зменшувався (r= -0,370, p=0,0096). Загальна тривалість життя хворих на РЯ при сильній (+++) експресії білка BRCA1 у клітинах значно вища, ніж за її відсутності (рис. 4).

Рис. 4. Загальна тривалість життя хворих на РЯ у залежності від експресії білка BRCA1 у клітинах пухлини.

Показано, що 1-, 3- та 5-річна виживаність хворих на РЯ при сильному (+++) та помірному (++) ступені експресії білка BRCA1 у клітинах пухлин значно вища, ніж при слабкій (+) чи за її відсутності. Одержані результати вказують на можливий зв’язок білка BRCA1 з ангіогенезом РЯ, адже зниження експресії білка BRCA1 у клітинах пухлини асоціюється із активацією ангіогенезу. На користь цього вказують дані про те, що білок BRCA1 регулює експресію білка ФРЕС через естрогеновий рецептор-альфа, а наслідком функціональної інактивації BRCA1 є підвищення транскрипції гену ФРЕС (Kawai H. et al., 2002).

Аналіз експресії білка р53 у РЯ показав, що у 22 (52%) випадках її не спостерігалось, а у 20 (47%) хворих спостерігалась експресія білка р53 слабкого (+), помірного (++) та високого (+++) ступенів. НМВ РЯ переважно (11 - 64,7% випадків) асоціювалась із відсутністю експресії білка р53 у клітинах пухлини. Натомість, для РЯ із ВМВ характерним було зростання кількості випадків із позитивною експресією білка р53 у клітинах пухлини – 9 (56,2)% випадків. У групі хворих, що отримували неоад’ювантну ПХТ, також спостерігалась асоціація ВМВ із позитивною експресією білка р53 у клітинах пухлин (5 - 62,5% випадків). Між ступенем МВ РЯ та експресією білка р53 у його клітинах існує позитивний кореляційний зв’язок (r=0,39, p=0,011), тобто підвищене накопичення білка р53 у клітинах РЯ асоціювалось із підвищеною активністю ангіогенезу.

Методом аналізу протеому ендотеліальних клітин мікросудин ми виявили у них білок р57Kip2, при чому ТФР-? пригнічував його експресію. Наявність цього регулятора клітинного циклу в ендотеліоцитах мікросудин, а також залежність його експресії у цих клітинах від присутності ТФР-?, вказує на можливу його причетність до регуляції ангіогенезу у злоякісних пухлинах. У 12 (63,2%) хворих експресія тумор-супресорного білка р57 у клітинах РЯ була позитивною, а у 7 (36,8%) її не спостерігали. Аналіз імуногістохімічних препаратів продемонстрував, що для РЯ із НМВ характерною є позитивна експресія білка р57 (75% випадків). При ВМВ РЯ позитивна експресія білка р57 спостерігалась лише у 4 (44,4%) випадках. Отже, зниження експресії білка р57 у клітинах РЯ асоціювалось з більшою активністю ангіогенезу в пухлині.

Таким чином, одержані результати вказують на зв’язок між активністю ангіогенезу РЯ та експресією білків генів-супресорів пухлинного росту BRCA1, p53 та p57 у його клітинах, що вказує на роль цих білків у регуляції ангіогенезу РЯ.

Вплив ІФН-?2b та цитостатиків на ендотеліоцити мікросудин

Обґрунтування можливості терапевтичного використання ріст-інгібуючих цитокінів (ІФН- ?2b) з антиангіогенною метою

У експерименті із ендотеліальними клітинами мікросудин показано, що ІФН-?2b (Лаферон, „Біофарма”, Україна та Інтрон А, „Шерінг”, США) пригнічує їх проліферативний потенціал (ПП) у дозо-залежний спосіб. У низьких дозах (2,5-5,0 МО/мл) він пригнічував ПП ендотеліоцитів у 1,5 раза, а у вищих дозах (50-75 МО/мл) – у 1,5-2,0 рази, порівняно із контролем. Збільшення дози ІФН-?2b від 200 до 1000 МО/мл не призводило до зростання антипроліферативної дії цитокіна щодо ендотеліоцитів мікросудин. Проапоптотична дія Лаферону та Інтрону А на ендотеліоцити мікросудин була суттєвою у дозі 5,0 МО/мл. Натомість, антипроліферативна активність низьких доз Лаферону щодо ракових клітин ліній OVCAR-3 та MCF-7 була мінімальною чи відсутньою і починала проявлятись при збільшенні дози препарату до 5000 МО/мл. При вивченні впливу цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду та паклітакселу) на ПП ендотеліальних клітин мікросудин, продемонстровано їх виражену антипроліферативну дію у низьких дозах.

Отримані результати досліджень у системі in vitro та дані досліджень низки авторів про антиангіогенну дію ІФН-2b у системі in vivo (Slaton J. et al., 2001; Tedjarati S. et al., 2002; Streck J. et al., 2004) стали обґрунтуванням для пропозиції застосування цього цитокіна в новому „антиангіогенному режимі”. Мішенню дії ІФН-2b в такому режимі є не пухлинні клітини, а ендотелій мікросудин. Новий режим застосування Лаферону наближається до „метрономної хіміотерапії” - використання низьких доз цитокіну щоденно протягом тривалого часу (6 – 10 міс.), чим забезпечується постійна присутність низьких концентрацій ІФН-2b в організмі.

Перші спроби застосування низькодозової терапії ІФН-2b у такому режимі проведено у першому гінекологічному відділенні ЛДОРЛДЦ. У рандомізоване дослідження включено 22 хворих із рецидивним некурабельним нерезектабельним хіміорезистентним РЯ. 12 хворим призначали Лаферон, а 10 отримували паліативну хіміотерапію алкераном. Режим введення Лаферону був наступним: 1 млн МО внутрішньом’язево чи підшкірно 1 раз на день, без перерви від моменту призначення (понад 6 міс.). Показами для включення хворих у дослідження були ознаки резистентності до попередньо застосованих схем ПХТ (цис-платин + циклофосфамід, цис-платин + паклітаксел, карбоплатин + паклітаксел) чи монотерапії паклітакселом, нерезектеабельність пухлин.

Термін спостереження за пацієнтками, що отримували таке лікування коливався від 3 до 24 міс. Часткову ремісію та стабілізацію спостерігали у 4 хворих, стабілізацію – у 7 пацієнток та прогресування – у 1 хворої. Основним побічним явищем, яке спостерігалось у пацієнток при терапії Лафероном у “метрономному режимі”, був гіпертермічний синдром, який купувався прийомом парацетамолу.

Основними об’єктивними критеріями ефективності застосованого лікування Лафероном була стабілізація та зниження концентрації СА-125 у плазмі крові; підвищення індексу резистентності при доплерівському УЗД; стабілізація та полегшення ознак кишкової непрохідності; стабілізація та зменшення асциту, зниження продукції асциту; стабілізація росту та регресія пухлин у тазовій та черевній порожнині.

До основних суб’єктивних критеріїв ефективності терапії Лафероном у “метрономному режимі” ми відносили покращення загального стану, активності та самопочуття (із підвищенням величини індексу Карновського чи зниження ступеня важкості стану за ВООЗ); покращення апетиту, сну, послаблення обстипаційного синдрому. Завдяки такому лікуванню на 30% збільшена 2-річна виживаність і на 10 міс. - загальна тривалість життя хворих на РЯ.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вивчено прогностичну цінність мікроваскуляризації РЯ, експресією цитокінів ФНП-, ТФР-? та білків-супресорів пухлинного росту BRCA1, р53 та р57 при різній мікроваскуляризації РЯ, роль ТФР-? у ангіогенезі та обґрунтовано підхід до антиангіогенної терапії РЯ.

1. Злоякісні епітеліальні пухлини яєчника характеризуються гетерогенною мікроваскуляризацією, ступінь якої асоційований із агресивністю пухлинного процесу та пов’язаний з експресією цитокінів ФНП-, ТФР-?, білків-супресорів пухлинного росту BRCA1, р53 та р57.

2. Ступінь мікроваскуляризації тканини РЯ є фактором прогнозу загальної тривалості життя та 3- і 5-річної виживаності хворих на РЯ. Високий ступінь мікроваскуляризації РЯ визначає гірший прогноз для хворих, асоціюється із агресивністю пухлинного процесу (III – IV стадія), зростає у недиференційованому РЯ та при низькій диференціації його клітин.

3. Встановлено залежність ступеня мікроваскуляризації РЯ від продукції цитокіна ФНП-? клітинами пухлини, зокрема - між ступенем мікроваскуляризації РЯ та концентрацією ФНП-? у супернатантах первинних клітинних культур існує обернений зв’язок.

4. Встановлена регуляція ангіогенезу РЯ білками генів-супресорів пухлинного росту BRCA1, р53 та р57: активація ангіогенезу в пухлині асоційована зі зниженням експресії білка BRCA1 та р57 у клітинах РЯ та із гіперекспресією білка р53 у клітинах пухлини.

5. Встановлено, що регуляторна щодо ангіогенезу активність цитокіна ТФР-? опосередкована експресією низки внутрішньоклітинних білків ендотеліальних клітин мікросудин. Ідентифіковано і проведено функціональний аналіз 54 білків та ідентифіковано білки, що взаємодіють із основним компонентом сигнального шляху ТФР-? – білком Смад3.

6. Показано, що інтерферон-?2b (Лаферон та Інтрон А) у низьких дозах (2,5 – 50 МО/мл) та цитостатики (цис-платин, циклофосфамід та паклітаксел) у низьких дозах пригнічують проліферацію ендотеліальних клітин мікросудин in vitro. Обґрунтовано можливість терапевтичного використання інтерферону-?2b (Лаферону) з антиангіогенною метою у “метрономному режимі” – у низьких дозах протягом тривалого часу (понад 6 міс.) - для комбінованого лікування хворих на хіміорезистентний РЯ, що підвищує загальну тривалість життя (на 10 міс.) та 2-річну (на 30%) виживаність хворих.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Оптимальним методом оцінки ступеня мікроваскуляризації РЯ є візуалізація мікросудин імуногістохімічним методом із використанням антитіл до фактора фон Віллебрандта (фактора VIII). Високий ступінь мікроваскуляризації РЯ (більше 75 мікросудин у 20 полях зору мікроскопу (1500)) визначає більш несприятливий прогноз хворих на РЯ. Ступінь мікроваскуляризації РЯ є фактором прогнозу загальної тривалості життя та 2-, 3- і 5-річної виживаності хворих.

2. При комбінованому лікуванні хіміорезистентного РЯ доцільним є застосування інтерферону-?2b (Лаферону) у “метрономному режимі” із антиангіогенною метою. Такий підхід підвищує загальну тривалість життя (на 10 міс.) та 2-річну виживаність хворих на 30%. Режим введення інтерферону-?2b (Лаферону) метрономний - 1 млн МО/день підшкірно чи дом’язево протягом тривалого часу (понад 6 міс.).

3. У практичній роботі онкогінеколога доцільною є оцінка ступеня експресії білка BRCA1 у клітинах РЯ для визначення прогнозу загальної тривалості життя та 1-, 3- і 5-річної виживаності хворих. Кращий прогноз для хворих визначається високим ступенем експресії білка BRCA1 у клітинах РЯ.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ломницька М.І., Володько Н.А. Активність ангіогенезу в раку яєчника: прогностичне значення, терапевтична мішень //Український радіологічний журнал.-2005.-Т.3,№13.-С.340-343. (Автор виконала забір пухлинного матеріалу, імуногістохімічне дослідження, аналіз результатів, оформлення статті).

2. Ломницька М.І., Володько Н.А., Соломко Б.І., Білинський Б.Т. Вплив хіміотерапевтичного лікування на ангіогенез в раку яєчників //Здоров’я жінки.-2005.-Т.2,№22(2).-С.55-57. (Автор виконала забір пухлинного матеріалу, імуногістохімічне дослідження, аналіз результатів, оформлення статті).

3. Ломницька М.І., Володько Н.А., Барилка В.А., Сушельницький С.І., Білинський Б.Т. Зв’язок ангіогенезу в раку яєчника людини з експресією білків р53 і BRCA1, продукцією цитокінів ФНП- та ТФР-? //Онкологія.-2005.-Т.7,№3.-С.195-200. (Автор виконала інтраопераційний збір матеріалу, отримання первинних клітинних культур та їх супернатантів, імуногістохімічне дослідження, аналіз результатів, оформлення статті).

4. Ломницька М.І., Володько Н.А., Сушельницький С.І., Білинський Б.Т. Вплив низьких доз інтерферону-?2b і талідоміду на ендотеліальні клітини мікросудин: перспектива використання для антиангіогенної терапії при злоякісних захворюваннях //Онкологія.-2005.-Т.7,№2.-С.101-105. (Автор дослідила антипроліферативну та проапоптотичну дії, аналіз результатів).

5. Ломницька М.І., Володько Н.А. Ангіогенез в раку яєчника: прогностична цінність ангіогенез асоційованих параметрів //Експериментальна і клінічна фізіологія та біохімія.-2005.-Т.2,№.30-С.36-43. (Автор виконала забір пухлинного матеріалу, імуногістохімічне дослідження, аналіз результатів, підготовку статті).

6. Ломницька М.І., Володько Н.А. Цитокіни та тумор-супресорні білки в регуляції ангіогенезу ракової пухлини яєчника людини //Клінічна та експериментальна патологія.-2005.-Т.IV,№1.-С.51-55. (Автор виконала забір пухлинного матеріалу, отримання первинних клітинних культур, вимірювання концентрації цитокінів, імуногістохімічне дослідження, аналіз результатів, оформлення статті).

7. Grimsby S., Jaensson H., Dubrovska A., Lomnytska M., Hellman U., Souchelnytskyi S. Proteomics-based identification of proteins interacting with Smad3: SREBP-2 forms a complex with Smad3 and inhibits its transcriptional activity //FEBS Letters.-2004.-V.577.-P.93–100. (Автор виконала ідентифікацію білків за пептидними спектрами,