ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н. КАРАЗІНА

ЛУТАЙ НАТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.112.85:547.917:618.3:616.006

ГЛІКОЗИЛЬОВАНІСТЬ ФІБРОНЕКТИНІВ І ЇХ БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ

У НОРМІ ТА ПРИ ПАТОЛОГІЧНИХ СТАНАХ

03.00.04-біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України

(м. Дніпропетровськ).

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Бразалук Олександр Захарович,

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри біохімії та загальної хімії.

Офіційні опоненти: –

доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

завідувач відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем

(м. Харків);–

кандидат біологічних наук, доцент

Ушакова Галина Олександрівна,

Дніпропетровській національний університет МОН України,

доцент кафедри біофізики та біохімії (м. Дніпропетровськ).

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України

(відділ регуляції метаболізму), м. Київ.

Захист відбудеться 02.11.2005 року о _14__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету

ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий 30.09.2005 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Великий інтерес для досліджень у галузі медицини та біології становить вивчення фібронектинів – глікопротеїнів, що знаходяться в біологічних рідинах і тканинах організму людини. На сучасному етапі відомо багато структурних і функціональних особливостей цих білків, охарактеризовані окремі ізоформи фібронектину (ФН), доведена їхня участь у патогенезі багатьох захворювань, але на сьогодні залишається недостатньо вивченою роль фібронектинів у процесах проліферації та онкогенної трансформації. Субодиниці молекул ФН складаються з функціонально активних доменів, які володіють спорідненістю до різних молекул міжклітинного матриксу та плазми крові: гепарину, фібрину, колагену/желатину, інтегринових рецепторів та інших молекул (Себко Т.В., 1991, Pankov R., 2002). Ця особливість обумовлює участь ФН у процесах адгезії, диференціюванні та проліферації клітин, пухлинної малігнізації тканин. Дослідження, що стосуються вмісту ФН у хворих на пухлинні захворювання, спрямовані на визначення рівня ФН у плазмі й експресії цього білка на поверхні трансформованої клітини. Тому перспективним є дослідження локалізації та розподілу клітинного ФН у пухлинних тканинах (Ена Я.М., 1991, Giannini R., 2003, Shor S.L., 2003). Прикладом може служити використання клітинного ФН, що містить унікальний домен альтернативного сплайсингу, як маркера ангіогенезу і злоякісно трансформованих клітин (Castellani P., 2002, Santimaria M., 2003). Одержало розвиток також застосування ФН та його фрагментів у терапії онкозахворювань завдяки їхній властивості пригнічувати пухлинний ріст (Yi M., 2001).

У літературних джерелах є свідчення про структурні зміни молекул ФН у складі біологічних рідин при різних типах захворювань (Carsons S., 1994, Nabi I.R., 1998, Dennis J.W., 1999, Галич И.П., 2003, Маслак Г.С., 2003), але практично відсутні вичерпні факти про кількісний аналіз змін рівня ФН, його деградованость і глікозильованость у плазмі крові при онкопатологіях. Припускають, що продукти деградації ФН активно впливають на процеси трансформації клітини і можуть служити пухлинними маркерами (Ена Я.М., 1991). На основі даних, наведених у літературних джерелах, можна стверджувати, що різні захворювання, включаючи онкологічні, супроводжуються зміною вуглеводної частини окремих глікокон’югатів та порушенням процесів глікозильованості, наслідком чого є модифікація міжклітинного розпізнавання, зміна асоціації та агрегації клітин, виникнення новоутворень. Тому для подальшого розвитку уявлень про особливість біохімічних змін, які виникають при патологічних станах, дуже важливим є більш детальне дослідження кількісних характеристик ФН плазми крові, його вуглеводного компоненту, фрагментованості, а також закономірностей розподілу клітинного ФН і його глікозильованості при онкозахворюваннях.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біохімії та загальної хімії Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України “Дослідження глікокон’югатів як біохімічних маркерів патологічних станів” (N держреєстрації 0100 U 00 05-91).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є визначення кількісних змін та ступеня глікозильованості плазмового ФН, а також виявлення особливостей експресії клітинного ФН у нормі та при неоплазії.

Для виконання цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Отримати антисироватку до ФН плазми крові та оцінити її специфічність.

2. Провести порівняльний аналіз рівня плазмового ФН у крові онкохворих з різною локалізацією пухлин.

3. Визначити особливості глікозильованості фібронектинів у нормі та при неоплазії.

4. Проаналізувати розподіл вуглеводних детермінант у проліферативно активних тканинах.

5. Охарактеризувати особливості розподілу клітинного ФН за нормальних умов та при пухлинному рості.

6. Виявити зв'язок між експресією клітинного ФН та проліферативною активністю клітин.

Об’єкт дослідження. Модифікація вуглеводного компоненту ФН та особливості експресії ФН у процесі онкогенезу.

Предмет дослідження. Ступінь глікозильованості ФН, його вміст у плазмі крові та розподіл у тканинах людини.

Методи дослідження. Кількісний ракетний імуноелектрофорез, афінний ракетний імуноелектрофорез, радіоімунологічний аналіз, диск-електрофорез у ПААГ з ДСН, імуноблотинг, імуногістохімічні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше було встановлено, що ступінь глікозильованості ФН плазми крові змінюється при розвитку доброякісних та злоякісних новоутворень щитоподібної залози. Виявлено, що кількість реагуючих з лектином СоnA вуглеводних епітопів ФН, не залежить від статі людини. Найбільша кількість біантенних N-гліканів комплексного типу притаманна плазмовому ФН у нормі, а при розвитку неоплазії їх кількість вірогідно зменшується, що можна пояснити модифікацією олігосахаридних структур біантенних N-гліканів (появою додаткових антенн та розділяючого GlcNAc). При розгляді впливу оперативного лікування на ступінь глікозильованості ФН виявлено, що через тиждень після хірургічного втручання спостерігаються незначні зміни у глікозильованості цього глікопротеїну відносно вихідних значень (р>0,05).

У плазмі крові хворих на рак щитоподібної залози ідентифіковані поліпептидні фрагменти ФН з молекулярною масою 185 та 158 кДа, які не виявляються у здорових людей.

Уперше встановлено зміни рівня плазмового ФН у динаміці лікування в групах хворих на рак гортані та порожнини рота та в пацієнтів з пухлинами головного мозку. Доповнені відомості про кореляцію між рівнем плазмового ФН та рівнем тиреоїдних гормонів і тиреотропного гормону при папілярній карциномі та доброякісних новоутвореннях щитоподібної залози.

Уперше за допомогою моноклональних антитіл 3Е2 була охарактеризована локалізація клітинного ФН у тканинах щитоподібної залози людини і знайдені відмінності його розподілу за умов розвитку неоплазії. У нормальних тканинах клітинний ФН локалізується переважно у з’єднувальній тканині; у тканинах еутиреоїдного та токсичного зобів визначається у колоїді деяких фолікул та у складі клітин фолікулярного епітелію, у тканинах папілярної аденокарциноми – в окремих ракових клітинах та їх сукупностях, а також у стромі паренхіми щитоподібної залози. Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їх узагальнення доповнюють і поглиблюють cучасні уявлення про особливості глікозильованості фібронектинів, їх розподіл у проліферативно активних тканинах. Виявлені відмінності у ступені глікозильованості та фрагментованості плазмового ФН онкохворих порівняно з нормою свідчать про участь цього глікопротеїну в розвитку патологічного стану. У хворих на рак щитоподібної залози після лікування L-тироксином та радіоактивним йодом виявляється тісний позитивний кореляційний зв’язок між рівнем плазмового ФН та рівнем тироксину та негативний кореляційний зв’язок між рівнем цього глікопротеїну та рівнем тиреотропного гормону, що дозволяє вважати рівень ФН у плазмі крові за один з маркерів оцінки функціонального стану щитоподібної залози, при дозуванні та корекції прийому лікарських препаратів. У ході роботи виявлено відмінності у ступені глікозильованості плазмового ФН хворих на рак щитоподібної залози порівняно з нормою, аналіз значення ступеня його глікозильованості за допомогою лектину ConA може слугувати основою для створення клінічного тесту для діагностики та прогнозування перебігу захворювань пухлинного характеру.

Особистий внесок здобувача полягає в підготовці та проведенні експериментальних досліджень, інтерпретації одержаних результатів. Усі експериментальні дані, використані в дисертації, отримані при безпосередній участі автора роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дослідження були представлені на V Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2002); VII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); у Матеріалах Міжнародної науково-практичної конференції “Україна наукова” (Дніпропетровськ, 2003); на IV Міжнародній конференції студентів і молодих вчених “Медицина-здоров’я XXI сторіччя” (Дніпропетровськ, 2003); у Матеріалах Всеукраїнської науково-практичної конференції “Біохімія” (Дніпропетровськ, 2003); на HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress (Montreal, 2003); на Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); у Матеріалах науково-практичної конференції “Актуальні питання променевої діагностики і лікування онкологічних захворювань” (Чернівці, 2004), на III Lviv-Lublin Congress in experimental and clinical biochemistry (Lviv, 2004), на 30th FEBS Congress – 9th IUBMB Conference (Budapest, 2005).

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, серед яких 6 статей та 10 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 132 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, списку літератури, що містить 135 джерел. Текст ілюстрований 16 таблицями та 42 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розділ складається з чотирьох підрозділів, у яких докладно розглянуто структурні та функціональні особливості молекул фібронектинів, їх експресію та роль у нормі та при розвитку патології. Викладено сучасний погляд на доцільність визначення ступеня глікозильованості та рівня плазмового ФН у біологічних рідинах, а також розподілу клітинного ФН у тканинах для диференційно-діагностичної та прогностичної оцінки розвитку патологічного стану.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для дослідження використовувались: плазма здорових людей (n = 37) та плазма хворих людей з пухлинами різної локалізації (n = 71), з яких – 30 хворих з новоутвореннями щитоподібної залози (ЩЗ), 7 – на рак слизової порожнини рота, 8 – на рак гортані та 26 хворих з пухлиною головного мозку; тканини пухлин ЩЗ. Деякі із досліджених груп хворих включали як жінок, так й чоловіків, що обумовлено відсутністю вірогідних відмінностей у рівні плазмового ФН при порівнянні цього показника у хворих обох статей. Діагностика захворювань пацієнтів розглянутих груп була виконана завідувачем кафедри радіології та променевої терапії ДДМА, доктором медичних наук, професором Хворостенком М.І. Дані за групою цих хворих подано у табл. 1.

Визначення вмісту плазмового ФН у крові хворих та здорових людей проводилось методом кількісного ракетного імуноелектрофорезу з використанням моноспецифічної поліклональної кролячої антисироватки до ФН людини, котру одержували шляхом імунізації кролів високоочищеним плазмовим ФН людини (Фримель Г., 1987). Специфічність отриманої антисироватки перевіряли перехресним та ракетним імуноелектрофорезами.

Визначення ступеня глікозильованості ФН виконувалось методом афінного ракетного імуноелектрофорезу з використанням лектину ConA, який взаємодіє з біантенними N-гліканами комплексного типу молекули ФН. Фрагментованість плазмового ФН вивчалась методом імуноблоту, який здійснювався після розділення білків плазми крові за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН (Гааль Э., 1982).

Таблиця 1

Характеристика групи здорових людей та груп онкологічних хворих

Групи хворих за типом захворювання | Кількість людей | Діапазон віку, роки | Вік, роки

Ж | Ч | Ж та Ч | Ж | Ч | Ж та Ч | Ж | Ч | Ж та Ч

Новоутворення ЩЗ, n = 30

Доброякісні | 7– | 7 | 28-67– | 28-67 | 49– | 49

Злоякісні | 13– | 13 | 30-61– | 30-61 | 51– | 51

Злоякісні після тиреоїдектомії | 10– | 10 | 29-67– | 29-67 | 50– | 50

Пухлини головного мозку, n = 26

Доброякісні | 4 | 3 | 7 | 35-63 | 33-57 | 33-63 | 49 | 48 | 48,5

Злоякісні | 7 | 12 | 19 | 29-65 | 31-79 | 29-79 | 43 | 46 | 44,5

Рак гортані | 8– | 8– | 39-70 | 39-70– | 58 | 58

Рак ротової порожнини | 2 | 5 | 7 | 39-68 | 51-60 | 39-60 | 53 | 53 | 53

Здорові | 17 | 20 | 37 | 42-71 | 31-70 | 31-71 | 54 | 47 | 50,5

Примітка. Ж – жінки, Ч – чоловіки.

Отримання пероксидазних кон’югатів лектинів проводилось згідно з методом, що запропонований Луциком М.Д., 1989. Дослідження розподілу клітинного ФН, а також сіальованих глікокон’югатів в умовно нормальних, проліферативно активних та патологічно змінених тканинах проводилось методами імуногістохімічного та лектингістохімічного аналізу (Луцик М.Д., 1989). Виявлення клітинного ФН у тканинах щитоподібної залози здійснювали за допомогою моноклональних антитіл 3Е2 (Sigma, США).

Статистична обробка результатів проводилась за допомогою Excel 97 – додатка до пакету програм Microsoft Office 97 з використанням непараметричних та параметричних критеріїв оцінки розбіжності між вибірками.

У роботі застосовувалися хімічно чисті реагенти фірм Sigma (США), Chemicon (США), Serva (США), Pharmacia (Швеція), Лектинотест (Львів), Immunotech, (Чехія), DAKO (Данія).

Результати досліджень та їх обговорення

Рівень плазмового фібронектину при різних типах захворювання. Наші дослідження спрямовувалися на вивчення рівня плазмового ФН в крові хворих з новоутвореннями ЩЗ та головного мозку, на рак гортані та ротової порожнини порівняно з його рівнем у здорових людей, причому вказані групи хворих досліджувалися до та після операції, а також до та після курсу лікування.

Як нормативні (контрольні) значення плазмового ФН приймалися усереднені показники рівня ФН (М + m), одержані при дослідженні 37 здорових людей (див. табл. 1). Група хворих з новоутвореннями ЩЗ була представлена жінками. I групу склали хворі з доброякісними новоутвореннями ЩЗ (n = 7), II група включала хворих на рак ЩЗ з призначеною тиреоїдектомією (n = 13), III група – хворі з уже зробленою тиреоїдектомією (n = 10). У більшості хворих із II-ї та III-ї груп діагностовано папілярний рак II стадії.

Для оцінки функціонального стану ЩЗ у хворих на доброякісні та злоякісні захворювання ЩЗ визначалися рівні Т3, Т4 та ТТГ, що дозволило виявити взаємозв’язок між рівнем плазмового ФН та вмістом тиреоїдних гормонів і ТТГ. Дані щодо вмісту тиреоїдних гормонів подано у табл. 2.

Таблиця 2

Характеристика рівня тиреоїдних гормонів при новоутвореннях щитоподібної залози

Групи | Зв’язаний трийодтиронін (Т3), нмоль/л | Вільний тироксин (Т4), пмоль/л | Тиреотропін (ТТГ), мМЕ/л

I, (n = 7):

до операції,

після операції | 1,59 + 0,19

1,19 + 0,24 | 11,10 + 1,20

9,39 + 1,15 | 4,95 + 2,49

9,38 + 0,26***

II, (n = 13):

до операції

після операції

після лікування | 1,89 + 0,38

0,80 + 0,17***

1,53 + 0,32 | 15,10 + 2,38

10,47 + 1,72

5,27 + 3,01* | 12,81 + 5,95

30,52 + 6,83***

64,94 + 16,50***

III, (n = 10):

до лікування

після лікування | 1,31 + 0,14

1,22 + 0,13 | 3,30 + 0,48***

12,20 + 2,63 | 76,95 + 12,51***

46,35 + 12,80**

Норма (n = 10) | 1,31 + 0,06 | 11,64 + 0,45 | 2,14 + 0,23

Примітки: *, ** та ***– вірогідно відрізняється від норми при p<0,05, p<0,01 та р<0,001 відповідно.

У групі хворих на доброякісні новоутворення ЩЗ у доопераційний період рівні Т3 та Т4 знаходились у межах норми, а після проведення операції незначно зменшувались відносно вихідного значення. Зміна рівня ТТГ характеризувалась протилежною тенденцією завдяки існуванню зворотного кореляційного зв’язку між синтезом ТТГ та секрецією Т3 і Т4.

У хворих на рак ЩЗ (II група) спостерігалося вірогідне зниження рівнів Т3, Т4 та достовірне підвищення рівня ТТГ (р<0,05) відносно вихідного значення через тиждень після операції та у віддалені строки спостереження (р<0,01). Примітно, що після проходження лікування L-тироксином рівень Т3 повертався до нормального, а рівень Т4 характеризувався значенням, меншим за норму (p<0,05), уміст ТТГ виявлявся більшим за норму при p<0,001. Між вмістом Т4 та вмістом ТТГ до та після тиреоїдектомії спостерігався зворотний кореляційний зв’язок (r = –0,61 при p<0,05 та r = –0,66 при p<0,01 відповідно). Для III групи хворих, які проходили радіойодтерапію, рівень Т4 вірогідно збільшився відносно значення, яке спостерігалося до лікування (p<0,05), та значно корелював з рівнем ТТГ (r = –0,86, p<0,001).

Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновок про функціональний стан ЩЗ у розглянутих групах онкохворих. Для I групи до операції був властивий еутиреоїдний стан, а після хірургічного втручання спостерігався незначний гіпотиреоз. II група після операції та після закінчення лікування тироксином перед призначенням подальшої терапії I131 характеризувалась гіпотиреоїдним станом, який був властивий також і для III розглянутої групи. Очевидно, що цей стан ЩЗ є результатом хірургічної операції щодо видалення однієї або обох часток ЩЗ.

Як свідчать результати, наведені у табл. 3, в доопераційний період у хворих на новоутворення ЩЗ (I та II групи) рівень плазмового ФН характеризується значенням, меншим за норму (p<0,05), а після проведеної хірургічної операції та лікування L-тироксином його вміст зростає і досягає нормального значення.

Таблиця 3

Вміст плазмового фібронектину в крові онкохворих

Групи хворих за типом захворювання | ФН, мкг/мл

До операції

(лікування) |

Після операції

(лікування) у ближчі строки спостереження | Після операції

(лікування) у віддаленні строки спостереження

Пухлини ЩЗ (n = 30):

I, жінки (n = 7) | 302 + 31* | 389 + 72¤

II, жінки (n = 13) | 300 + 38* | 288 + 29* | 332 + 39¤

III, жінки (n = 10) | 363 + 80¤ | 465 + 77¤

Пухлини головного мозку (n = 26):

I, жінки і чоловіки (n = 7) | 318 + 75¤

II, жінки і чоловіки (n = 19) | 285 + 38** | 363 + 43¤

Рак гортані, чоловіки (n = 8) | 242 + 33** | 234 + 60*

Рак ротової порожнини,

жінки і чоловіки (n = 7) | 171 + 41*** | 147 + 30***

Здорові (n = 37)

жінки (n = 17)

чоловіки (n = 20) | 413 + 31

432 + 50

397 + 39

Примітки: *, ** та ***– вірогідно відрізняється від норми при p<0,05, p<0,01 та p<0,001 відповідно, ¤ – вірогідно не відрізняється від норми (р>0,05).

Схожі результати отримані й іншими дослідниками. Так, у пацієнтів після повної тиреоїдектомії у ближчі строки спостереження після операції рівень плазмового ФН був нижчим за норму, а після прийому L-тироксину значно зростав (Watzke H., 1987). Результати, отримані при наших дослідженнях, свідчать, що між рівнем плазмового ФН та рівнем Т4 існує позитивна кореляція, яка спостерігається у хворих на рак ЩЗ (r = 0,82, p<0,05) після курсу хіміотерапії. Ці дані узгоджуються із свідченнями, поданими авторами, у роботах яких розглядались інші патології ЩЗ. Так, дослідження рівня плазмового ФН у пацієнтів з гіпер- та гіпотиреоїдним станом виявили позитивну кореляцію між рівнем плазмового ФН та тироксиновим індексом (Graninger W., 1985). У нашому дослідженні характерною була негативна кореляція між вмістом ФН у плазмі та рівнем ТТГ (r = –0,78, p<0,05), що знаходить підтвердження у літературних джерелах (Foldes J., 1990, Foldes J., 1991).

У хворих із злоякісними пухлинами головного мозку (II група) рівень плазмового ФН був нижчим за норму (р<0,01), що погоджується з даними інших авторів (Kokoglu E. et al., 1995), у роботах яких розглядалася група пацієнтів з гліобластомою. Визначення плазмового ФН після операції у ближчі строки спостереження у хворих на рак головного мозку показало, що його рівень зростає до норми. Підвищення плазмового ФН у післяопераційний період обумовлюється впливом препаратів, які, можливо, приводять до підвищення його синтезу.

У хворих на рак гортані та рак порожнини рота спостерігався вірогідно знижений відносно норми вміст плазмового ФН, який після операції або проведення променевої та хіміотерапії ще продовжував зменшуватися. При цьому в окремих хворих спостерігався критично низький уміст плазмового ФН (до 45-46 мкг/мл), що за даними інших досліджень (Sandberg L.B., 1990) свідчить про загрозу летального наслідку. Є свідчення про критично низький рівень ФН при інших патологічних станах, де його зниження пов’язують із включенням ФН у тромб чи до складу тканини рубця, що формується після травм чи опіків (Османов С.К., 1989).

Отримані результати збігаються з результатами інших авторів, згідно з якими при плоскоклітинній карциномі голови та шиї рівень ФН плазми досягає значення 95,6 + 16,8 мкг/мл, яке є вірогідно нижчим за норму (Gallurt P., 1992). Ймовірно, що зниження вмісту плазмового ФН після операції пов’язано з втратою ФН у зоні рани та крововтратою, а також залученням його до репаративних процесів. Зменшення вмісту плазмового ФН у крові хворих з карциномою порожнини рота можна пов'язати з дією хіміопрепаратів та променевою терапією.

Наші результати показали, що рівень плазмового ФН, відбиваючи патологічний стан хворих, може служити критерієм, який свідчить наскільки ефективно проводилося лікування, а також прогнозувати важкість перебігу захворювання.

Особливості розподілу клітинного фібронектину у тканинах при нормальному та патологічному станах. Як об’єкт дослідження розглядалися тканини папілярного раку, токсичного та еутиреоїдного зобів ЩЗ. Зразки умовно нормальної тканини біля вогнища новоутворення брали у пацієнтів з доброякісними новоутвореннями ЩЗ. Розподіл клітинного ФН досліджувався методом імуногістохімічного аналізу з використанням моноклональних антитіл 3Е2 (Sigma, США).

У наших дослідженнях показані схожі зони локалізації клітинного ФН у стромі нормальної та патологічно зміненій тканинах ЩЗ, що збігається з даними літературних джерел (Scarpino S., 1999). У нормі клітинний ФН переважно локалізувався у стромі ЩЗ: забарвлювались клітини та ендотелій судин з’єднувальної тканини, що знаходяться між фолікулами. Переважне накопичення ФН у стромі ЩЗ пояснюється загальновизнаними свідченнями того, що головними джерелами синтезу ФН є фібробласти з’єднувальної тканини й ендотеліоцити кровоносних судин (Єна Я.М., 1997).

У деформованих великих фолікулах гіперпластичного зоба клітинний ФН переважно накопичувався в зоні, яка прилягає до папілярного вростання, що посередньо свідчить про участь цього глікопротеїну у формуванні папілярних вростань у просвіт фолікула. У деяких фолікулах колоїд з клітинним ФН забарвлювався зонально у вигляді гранулярних нагромаджень. Можливо, такий розподіл клітинного ФН пов’язаний з особливостями фолікулогенезу, оскільки відомо, що він, разом з факторами росту, бере участь у проліферації та диференціюванні клітин, що особливо властиве для тироцитів, які оточують фолікули. Даних чи свідчень про розподіл клітинного ФН у тканинах токсичного зоба ми не зустріли.

Для тканин еутиреоїдного зоба ЩЗ була характерна гетерогенна локалізація клітинного ФН. Значне забарвлення спостерігалося ближче до апікальної частини тироцитів навколо фолікула, для кровоносних судин та волокон з’єднувальної тканини у міжфолікулярних областях. Відмічено, що найбільша кількість клітинного ФН характерна для тканин гіперпластичного зоба ЩЗ. Ймовірно, це пов’язано з інтенсивним розвитком з’єднувальної тканини, клітини якої продукують клітинний ФН.

У тканинах карциноми ЩЗ клітинний ФН локалізувався у складі колоїду незначної кількості фолікул у вигляді невеликих відносно інтенсивно забарвлених зон. Можна припустити, що наявність таких забарвлених зон пов’язана із загибеллю й руйнуванням ФН - позитивних клітин, що були десквамовані у порожнину пухлинних фолікулів. Цей глікопротеїн виявився також в елементах строми пухлини, а саме: у з’єднувальнотканинних волокнах, цитоплазмі фібробластів, що знаходилися на межі між паренхімою ЩЗ та лімфоїдною тканиною. Крім цього, клітинний ФН знаходили також у просвіті кровоносних судин та цитоплазмі ендотеліоцитів. Для ракових клітин характерним є гетерогенне забарвлення на клітинний ФН. Цей глікопротеїн виявлявся як в окремих ракових клітинах, так і в їх сукупностях. Особливо інтенсивно забарвлювалися пухлинні клітини, що гинули у зоні великої лімфоїдної інфільтрації.

Нами встановлено тенденцію до зростання в 3,7 рази клітинного ФН у ракових клітинах зразків тканин папілярної карциноми ЩЗ порівняно з тканинами без морфологічних ознак патології (табл. 4). Серед 30% досліджених зразків тканини папілярної карциноми виявлено гіперекспресію цього глікопротеїну. Проліферативна активність клітин оцінювалась за вмістом ядерного антигену клітинної проліферації (PCNA) в ядрі. Також встановлено низький рівень проліферативної активності клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози в нормі та її підвищення в папілярних карциномах (p<0,01).

Таблиця 4

Вміст клітинного ФН та PCNA у клітинах тканин ЩЗ

у нормі та при папілярному раку

Групи | Кількість позитивно забарвлених клітин, % | Кореляція за Спірменом (клітинний ФН-PCNA)

Клітинний ФН | PCNA

Контроль, n = 10 | 1,20 + 0,31 | 0,60 + 0,19 | 0,48¤

Папілярна карцинома, n = 10 | 4,50 + 1,77¤ | 9,90 + 3,53** | 0,10¤

Примітки: ¤ - вірогідно не відрізняється від норми (р>0,05); ** – вірогідно відрізняється від норми (р<0,01).

Виявлені в нашому дослідженні відсутність кореляційного зв’язку між умістом клітинного ФН та проліферативною активністю епітеліальних клітин папілярної карциноми ЩЗ та нормальної тканини ЩЗ можна пояснити підвищенням клітинного ФН не лише в клітинах, які мають PCNA в ядрі, але й, як мінімум, у клітинах з ознаками загибелі. Згідно з даними інших авторів (Scarpino S. et al., 1999), уміст клітинного ФН у ракових клітинах не має кореляції із ступенем їх диференціювання та ступенем фіброзу тканини.

Таким чином, наведені дані показують, що дослідження локалізації клітинного ФН у гіперпластичних та пухлинних тканинах ЩЗ є доцільним у діагностиці як додатковий критерій оцінки нозологічних форм патологій ЩЗ.

Особливості розподілу глікокон’югатів у тканинах при доброякісних новоутвореннях та гіперпластичних захворюваннях. Для з’ясування процесів глікозильованості і причин їх порушень доцільним є вивчення особливостей перерозподілу глікокон’югатів у патологічно змінених тканинах ЩЗ. Нами виявлено, що при доброякісному новоутворенні ЩЗ – еутиреоїдному зобі – відбувається збільшення, порівняно з умовно нормальними тканинами, кількості сіалоглікокон’югатів, що накопичуються у сполучній тканині і колоїді фолікулів. За допомогою лектинів SNA (лектин бузини чорної) та МАА (лектин маакії амурської) встановлена поява у складі глікокон’югатів пухлинної тканини зобу ЩЗ крім послідовності Neu5Ac?2>6Gal, також й послідовності Neu5Ac?2>3Gal. Примітно, що в умовно нормальній тканині рецептори до МАА не виявлялися (табл. 5).

Таблиця 5

Розподіл сіальованих глікокон’югатів у паренхімі патологічно зміненої

та нормальної тканини ЩЗ

Вуглеводні структури | Стан ЩЗ | Місце локалізації у тканині

А | Нормальний | Не виявляється

Гіперпластичний

зоб | Не виявляється

Еутиреоїдний

зоб | Фібробласти з’єднувальної тканини, колоїд окремих груп фолікул

В | Нормальний | Ендотелії кровоносних судин, колоїд фолікул та апікальні частини фолікулярних клітин

Гіперпластичний

зоб | Ендотелії кровоносних судин, волокна з’єднувальної тканини, базальна мембрана фолікулярних клітин, колоїд фолікул, апікальна частина тироцитів

Еутиреоїдний

зоб | Ендотелії кровоносних судин,

цитоплазма фібробластів, фіброзні волокна, базальна мембрана фолікулярних клітин, колоїд фолікул, апікальна частина тироцитів

Примітки: А – Neu5Acб2>3Gal (?ецептор лектину МАА), В – Neu5Acб2>6Gal (?ецептор лектину SNA).

Нами було встановлено, що рецептори до лектину SNA в умовно нормальній тканині ЩЗ з найбільшою щільністю розподілу виявлялися приблизно в 5% фолікулів; стільки ж фолікулів уміщувало меншу кількість цих лектинових рецепторів.

У тканинах токсичного зоба ЩЗ рецепторам до SNA властивий нерівномірний розподіл у складі паренхіми. Виявлялись окремі фолікули з різною інтенсивністю гомогенного забарвлення. Були знайдені також зони накопичення сіаловміщуючих рецепторів до SNA у з’єднувальній тканині. Для апікальних частин А-клітин деяких фолікул знайдені зони локалізації рецепторів до SNA, при цьому колоїд мав слабке за інтенсивністю забарвлення.

Тканини еутиреоїдного зоба характеризувалися середнім за щільністю розподілом рецепторів до SNA в ендотелії кровоносних судин. Більш 50% фолікулів виявили значне позитивне забарвлення на сіалоглікокон’югати, які в основному накопичувалися у складі колоїду та в апікальних частинах тироцитів. У фіброзній тканині рецептори до SNA розташовувалися в цитоплазмі фібробластів.

Розподіл рецепторів МАА в ЩЗ мав дещо інший характер. При токсичному зобі сіальовані глікокон’югати до цього лектину не виявлялися, а в тканині еутиреоїдного зоба характеризувалися нерівномірним розподілом. Найбільш інтенсивно забарвлювалися фібробласти та окремі групи фолікул. При цьому групи фолікулів з інтенсивним забарвленням чергувалися з групами фолікул, що мають помірне забарвлення, та з групами, які мали негативне забарвлення.

Поява специфічної послідовності Neu5Ac?2>3Gal у тканинах еутиреоїдного зобу може бути пов’язана з процесами онкогенної трансформації клітин, модифікацією їх морфології та збільшенням проліферації. Відомо, що на поверхні клітин гліоми головним чином експресуються глікокон’югати, які вміщують N-глікани комплексного типу, котрі у своєму складі мають термінальні послідовності Neu5Ac?2>3Gal, але не мають Neu5Ac?2>6Gal. Іншими дослідниками доведено, що заміна Neu5Ac?2>3Gal на Neu5Ac?2>6Gal приводить до зниження адгезії клітин гліоми до клітинного ФН і колагену, їх пухлиногенності та інвазивності (Yamamoto H., 2001).

Фрагментованість плазмового ФН крові в нормі та при пухлинних захворюваннях. Дослідження стану ФН плазми крові в контрольній групі та в групі хворих на рак ЩЗ (II та III групи) проводилися за допомогою методів електрофорезу в ПААГ за присутності ДСН та імуноблотінгу. Аналіз зразків крові у здорових і у хворих людей показав, що субодиниці плазмового ФН знаходилися як в інтактному стані (молекулярні маси 250 та 220 кДа), так і в деградованому у вигляді фрагментів з молекулярними масами 185, 158, 132, 125, 120, 112, 105, 100, 75, 64 та 35 кДа. Причому фрагменти з молекулярними масами 185, 158, 75, 64 та 35 кДа виявлялись виключно у хворих на рак ЩЗ, найбільшою частотою виявлення серед яких характеризувалися фрагменти ФН з молекулярними масами 185 у хворих з II групи та 158 кДа у пацієнтів з III групи.

Очевидно, що поява цих фрагментів пов’язана з активацією протеолітичної системи при прогресуючих проліферативних процесах. Так, у пухлинних тканинах відбувається гіперекспресія матриксної металопротеїнази мембранного типу (МТ1-ММР), яка безпосередньо впливає на протеоліз желатину, колагену I та ФН (Labat-Robert J., 2002). Згідно з літературними джерелами (Komorowski J, 2002), на ранніх стадіях злоякісної трансформації відбувається деградація ФН екстрацелюлярного матриксу, яка супроводжується підвищенням його продукції навколопухлинною стромою. Як показано в Kobayashi H., 1996, Schnepel J., 2001, Labat-Robert J., 2002, утворення фрагментів ФН може відбуватися внаслідок активації ферментів плазми крові, матриксних металопротеїназ або аутопротеолізу.

Відомо, що фрагмент з молекулярною масою 75 кДа утворюється при дії трипсину на нативну форму плазмового ФН з його гепаринзв’зуючого С-кінцевого домену, для якого характерна афінність до гепарину. Для нього була показана участь у розпластуванні та адгезії клітин (Златопольский А.Д., 1991). Цей фрагмент може з’являтися при дії катепсину D, як і фрагмент 60-65 кДа (Пелешенко Г.Б., 2004). Фрагмент 185 кДа також утворюється внаслідок дії плазміну на плазмовий ФН та здатний зв’язувати желатин (Королев Н.П., 1987). Іншими дослідниками було виявлено, що фрагмент 180-190 кДа має здатність посилювати морфологічну трансформацію клітин. Ця активність гальмується у присутності желатину або інтактної молекули плазмового ФН (De Petro G., 1981).

Слід звернути увагу, що гепаринзв’язуючий фрагмент 35 кДа має мітогенну активність, яка вказує на його значимість у процесах розвитку онкогенної трансформації (Homandberg G.A., 1999). Поява фрагменту 125 кДа корелює з підвищенням активності еластази нейтрофілів та розщепленням ?2-макроглобуліна і ?1-інгібітора протеїназ. Відомо, що фрагмент 120 кДа виникає із зв’язуючого клітину домену та проявляє хемотаксичну активність (Clark R.A., 1988). Таким чином, фрагментованість плазмового ФН може бути одним із засобів регуляції поведінки клітини, її морфологічної будови за рахунок модифікації її взаємодії з іншими клітинами та екстрацелюлярним матриксом при розвитку новоутворень.

Ступінь глікозильованості фібронектину плазми крові в нормі та при патологіях. Ступінь глікозильованості плазмового ФН досліджувалася методом афінного ракетного імуноелектрофорезу в групах хворих з доброякісними та злоякісними новоутвореннями ЩЗ (n = 7 та n = 13 відповідно), а також у групі здорових жінок (n = 17) та чоловіків (n = 21). Відомо, що ConA зв’язується із залишками ?-Man корової частини N-гліканів, у котрій заміщений кисень при другому вуглецевому атомі. Для цього лектину показана спорідненість до біантенних N-гліканів комплексного типу (Breborowicz J., 1989). Результати наших досліджень подано в табл. 6.

Таблиця 6

Характеристика глікозильованості плазмового ФН у нормі

та при патологіях щитоподібної залози

Групи хворих | Ступінь глікозильованості плазмового ФН#

До операції (лікування) | Після операції (лікування)

Доброякісні новоутворення (n = 7) | 2,33 + 0,26* | 2,09 + 0,29**

Злоякісні новоутворення (n = 13) | 2,13 + 0,29** | 2,19 + 0,37*

Здорові жінки (n = 17) | 3,31 + 0,30

Примітки: * та **– вірогідно відрізняється від норми при p<0,05 та p<0,01 відповідно; # – величина ступіні глікозильованості ФН розраховувалася за співвідношенням площ піків преципітації, що формувалися у відсутності та присутності лектину відповідно, мм2/мм2.

Знайдено, що між ступенем глікозильованості плазмового ФН у досліджуваних групах здорових жінок та чоловіків не існує вірогідної відмінності (р>0,05), що свідчить про наступне: наявність біантенних вуглеводних структур N-гліканів ФН практично не залежить від статі людини. У хворих з доброякісними пухлинами ЩЗ ступінь глікозильованості ФН коливалася від 1,47 до 2,86 до операції, а після неї, у найближчий строк спостереження, її значення становили від 1,14 до 3,22.

У хворих із злоякісними пухлинами ступінь глікозильованості ФН плазми характеризувалася величиною від 1,06 до 4,18 в доопераційний період та від 1,11 до 5,00 у післяопераційний період. Як свідчать дані табл. 6, у нормі для плазмового ФН спостерігається найбільша кількість реагуючих із ConA вуглеводних структур. У хворих з доброякісними новоутвореннями ЩЗ та раком ЩЗ у доопераційний період плазмовий ФН крові має достовірно нижчу за норму (р<0,05) кількість вуглеводних структур, що розпізнаються ConA. Через 6-10 днів після операції у хворих з доброякісними пухлинами ЩЗ ступінь глікозильованості майже не змінюється й залишається достовірно нижчою за норму (р<0,01). При раку ЩЗ через тиждень після операції ступінь глікозильованості плазмового ФН незначно зростає, приближаючись до норми (р>0,05).

Припускаємо, що зниження зв’язуючої активності ФН плазми крові хворих на пухлинні захворювання ЩЗ із ConA свідчить про модифікацію його вуглеводної структури, яка приводить до зменшення кількості вуглеводних детермінант, що розпізнаються вищезгаданим лектином, тобто біантенних N-гліканів комплексного типу. Отримані результати узгоджуються з даними інших авторів (Guo J.M., 2001), котрі виявили, що при раку сечового міхура зв’язуюча активність ФН сечі з ConA складає лише 18,1 % від зв’язуючої активності в нормі. У той же час ФН сечі ракових хворих мав у 3,34 та 3,26 разів більшу активність до DSA (лектину дурману) та WGA (лектину зав'язів пшениці) відповідно. Це свідчіть про те, що модифікації у структурі вуглеводного компоненту ФН при розвитку раку приводять до появи у N-гліканів додаткових олігосахаридних гілок та поділяючого GlcNAc, які не розпізнаються ConA.

Висновки

У роботі охарактеризовані зміни в основних ізоформах фібронектину, які визначалися показниками ступеня глікозильованості плазмового фібронектину, його вмісту, концентрації, розподілом та локалізацією клітинного фібронектину у нормі та при розвитку процесів новоутворення та проліферації тканин різних органів.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.