Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського

ЛЯХОВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА

УДК 547.678.3+547.835+547.865.3].057:547.556.5:615.218

СИНТЕЗ ТА БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ

ГІДРАЗИНОВМІСНИХ ПОХІДНИХ АКРИДИНУ, АНТРАЦЕНУ ТА ФЛУОРЕНУ

02.00.10 – біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

ОДЕСА – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України.

Науковий керівник: | доктор хімічних наук, професор

Грень Андрій Іванович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук,

старший науковий співробітник

Броварець Володимир Сергійович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат хімічних наук

Кириченко Тетяна Іванівна,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, старший науковий співробітник

Провідна установа: | Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 7 ” липня 2005 р. о 10 годині на засіданні cпе-ціалізованої вченої ради Д 41.219.02 в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України (65080, м. Одеса, вул. Люстдорфська дорога, 86).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Фізико-хімічного інституту-ім. О.В. Бо-гатського НАН України (65080, м. Одеса, вул. Люст-дор-фсь-ка дорога, 86).

Автореферат розісланий “ 4 ” червня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02,

кандидат хімічних наук | Литвинова Л.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Розуміння механізмів інгібування вірусної ре-про-дук-ції та розвитку вірусної патології лежать в основі раціонального дизайну нових ефективних противірусних препаратів. Актуальність цієї проблеми обу-мов-лена виникненням нових і мутаціями існуючих збудників, а також роз-витком множинної лікарської резистентності до препаратів, що застосо-вують-ся в клініці.

Раніше було показано, що інтер-ка-ля-ція плоского арома-ти-чного по-ліцик-лі-ч-ного фраг-мен-та між двома сусідніми парами основ ДНК є однією з ос-нов-них причин високої протиінфекційної та про-типухлинної активностей низки спо-лук, що містять вка-зан-ий фрагмент. Об'єднання двох інтеркалюючих фраг-мен-тів в одній мо-ле-ку-лі біс-інтеркалятора призводить до підвищення їх спо-рід-не-ності до ДНК і, як наслідок – до посилення інгібування процесів з її участю. Зни-ження можливої цито- і гено-ток-сич--ності такого типу сполук може бути реа-лізоване за рахунок введення груп, що здатні розщеплюватися у фізі-о-ло-гіч-них умовах. З погляду вибірковості дії та безпечності пре-па-ратів є доцільною їх висока специфічність до визначених послідовностей ДНК. Таку властивість ма-ють лекситропсини, в основі специфічності дії яких лежить моле-ку-ля-р-не роз-пізна-ван-ня за рахунок формування множинних водневих зв'язків з мішенню.

На прикладі похідних і аналогів аміксину й доксорубіцину показано по-ліп-шення фарма-кологічних властивостей при переході від кетонів до від-по-від-них гідразиновмісних похідних. Серед гідразиновмісних похідних акридину від-омі сполуки із шис-то-со-мо-цидною та протимік-роб-ною дією.

У зв'язку із цим є доцільним пошук потенційних протиін-фек-ційн-их аген-тів серед біс-інтеркаляторів, що містять в лінкері біодегра-дує-мі зв'язки, лекси-тропсиноподібні фрагменти та термінальні гідразинові групи, вивчення їх ДНК-зв'язуючих властивостей, біологічної активності та встановлення зв'яз-ку структура-активність.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з планами науково-дослідницьких робіт у відділі медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України (№ держ. реєстрації 0100U001145; 0102U001465; 0102U001629 – 1999 – 2004 рр).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – дизайн, синтез та вивчення властивостей гід-разиновмісних бісінтерлексинів, інтеркалю-ючи-ми фрагментами яких є акри-дин, флуорен і ант-рацен.

Для досягнення поставленої мети передбачалося вирішення наступних завдань:

? Розробка й удосконалення методів отримання функціональних похідних обраних інтер-ка-ля-то-рів, синтез модельних сполук, вивчення їх властивостей, та оцінка можливості засто-су-ван-ня 9-метоксіакридину, 9-формілантрацену та аміксину як реагентів для синтезу біс-інтер-ка-ля-то-рів.

? Дизайн симетричних гідразиновмісних лекситропсино-по-діб-них сполук та оцінка їх струк-тур-ної подібності з описаними лекситропсинами. Відбір перспективних сполук. Розробка методів синтезу вибраних потенційних лекситропсинів.

? Розробка методів отримання біс-інтеркаляторів на основі синтезованих лекситропсино-по-діб-них лінкерів.

? Вивчення спектральних, фізико-хімічних, ДНК-зв'язуючих властивостей та біологічної активності синтезованих сполук.

? Аналіз зв'язку "структура-властивість" вивчених сполук.

Об'єкт дослідження – ДНК, ліганди ДНК, зв'язок між структурою ліганду, його ДНК-зв'язуючими властивостями та біологічною активністю.

Предмет дослідження – гідразиновмісні бісінтерлексини, інтеркалюю-чими фрагментами яких є акридин, флуорен і антрацен, та їх властивості.

Методи дослідження – органічний синтез, ЯМР 1Н-спектроскопія, спектро-фото-мет-рія та спектрофлуориметрія, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), противірусний скринінг, оцінка інтерфероніндукуючої здатності.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено зручний дво-ста-дійний спосіб одержання 9-хлороакридину. Роз-роб-лено й удоско-на-ле-но ме-тоди синтезу нових гідрази-но-вмі-с-них похідних антра-це-ну та флуо-ре-ну. Для синтезу моно- і біс-похідних акридинілгідразину показано пе-ре-ваги ви-ко-ристання 9-метоксіакридину. Показано здатність до окис-лю-ван-ня N-ак-ри-ди-ніл-9-N'-арилгідразинів і вивчена її залежність від замісників в ариль-но-му фраг-менті.

Для вперше синтезованих аміноацетилгідразонів акридону, 9-форміл-ак-ри-ди-ну і 9-фор-міл-ант-рацену вивчено ДНК-зв'язуючі властивості й здат-ні-сть інгі-бувати реп-лі-ка--цію ДНК. Вста-нов-лено зв'язок структура-властивость в цьому ряду.

Синтезовано нові лекситропсиноподібні дигідразиди і їхні біс-акридин-, біс-антрацен- та біс-флуоренопохідні, вивчено їхні ДНК-зв'язуючі влас-ти-во-с-ті та здат-ність інгібувати полі-мери-зацію ДНК. Серед синтезованих сполук ви-яв-лено активні противірусні агенти та високо-ефек-тивні індуктори інтер-фе-ро-ну.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонований спосіб одержання естерів амінокислот, ацильованих піридинкарбоновими кислота-ми може бути вико-ристаний для синтезу відповідних похідних при кім-нат-ній температурі без до-мішок смоли. Покращені методи одер-жан-ня 9-меток-сі- й 9-хлороакридину дозволяють масштабувати син-ез цих сполук, що є ви-хід-ними в пре-паративних синтезах ряду потенційних протиінфек-цій-них засо-бів. Розроблений метод скринін-гу нуклеотропних сполук з викорис-тан-ням ПЛР дозволяє оцінювати потенційну противірусну актив-ність нових пре-паратів. Наявність активних противірусних й інтерферон-індукуючих агентів вказує на перспективність подальшого вивчення бісінтерлексинів.

Особистий внесок автора. Синтез усіх сполук, флуоресцентні та УФ-спект-ральні дослід-жен-ня, аналіз спектральних даних, вивчення ДНК-зв'я-зу-ю-чих властивостей, обробка отриманих результатів проведені безпосе-ред-ньо здобувачем.

Інгібування матричних функцій ДНК методом ПЛР вивчено під керівництвом д.м.н. Ле-бе-дюка М.М. співробітниками НДЦ “ЗПСШ” при учас-ті здобувача. Противірусна активність in ovo вивчена в ОНУ ім. І.І. Меч-никова на кафедрі мікробіології під керівництвом к.б.н. Пан-чен-ко М.М. Інтерфероніндукуюча активність in vitro вивчена в Інституті епіде-міо-ло-гії і мікробіології ім. Громашевського МОЗ України під керів-ниц-твом д.б.н. Рибалко С.Л. Поста-нов-ка завдань, аналіз, обговорення ре-зуль-татів і формулювання ви-сновків дисертації проведені спільно з нау-ко-вим керівником д.х.н. А.І. Гренем та к.х.н. С. А. Ляховим.

Апробація результатів роботи. Результати роботи були представлені на International Symposium on Molecular aspects of chemotherapy (Гданськ, Польща, 1999, 2001); XVIth International symposium on Medicinal chemistry (Бо-лонья, Італія, 2000); VIIth International conference on chemistry of anti-bi-otics and related microbial products (Меркі, Польща, 2000); XIX Українській кон-ференції з органічної хімії (Львів, Україна, 2001); Міжнародній науково-пра-к-тичній конференції "Нові технології одержання та застосування біо-ло-гі-ч--но активних речовин" (Алушта, Україна, 2002); V Конференції молодих вче--них та студентів-хіміків Південного регіону України (Одеса, Україна, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових ста-тей у фахових виданнях, 7 патентів, 1 методичні рекомендації та 11 тез допо-ві-дей міжнародних і українських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (розділ 1), обговорення результатів (розділи 2 – 4), висновків, списку цитованої літератури (304 дже-рела) та додатка. Робота викладена на 122 сторінках, містить 26 схем, 17 рисунків і 19 таблиць.

Основний зміст роботи

У першому розділі наведено огляд робіт, присвячених механізмам зв'язування з НК та біологічним властивостям інтеркаляторів, лекситроп-си-нів та комбілексинів. Запропоновано й обгрунтовано структурні властивості но-вого класу лігандів НК – бісінтерлексинів.

У другому розділі наведено методи синтезу і властивості гід-ра-зино-вмісних моно-інтер--ка-ля-торів – похідних акридину, антрацену та флуорену.

Для отримання похідних акридину був обраний 9-меток-сі-ак-ри-дин 4 як вихідний реагент, у зв'язку з чим, з метою зменшення кількості смолистих домішок розроблено зручний і безпеч-ний двостадійний спосіб одержання вихідного 9-хлороакридину 3, на першій стадії якого отри-му-ють ак-ри-дон 2 за описаною методикою, а наступне твер-до-фаз-не спікання суміші 2 з PCl5 до-з-во-ляє отримати 3 зі значним вихо-дом (схема 1). Основними перевагами цього способу є під-ви-щен-ня вихо-ду продукту 3 при перерахунку на N-феніл-антра-ніло-ву кисло-ту 1 (85 – 92 %), і зменшення смолоутворення.

При отриманні 9-метоксіакридину показана можливість використання 60 %-го розчину КОН у комерційно доступному метанолі як основи.

Схема 1. Синтез 9-хлороакридину і 9-метоксіакридину

З метою відпрацьовування методів акридинілювання отримано різні моно-похідні акри-ди-нілгідразину I (R див. табл. 1) за схемою 2, додаванням еквімолярних кількостей 4 до кип-ля-чо-го насиченого розчину гідразиду в метанолі.

I

Схема 2. Синтез моно-акридинілгідразинів

Для з'ясування впливу структури інтеркалятора на біологічні та ДНК-зв'я-зу-ю-чі влас-ти-вості синтезовано похідні 9-формілакридину II, 9-фор-міл-ант-рацену III і аміксину IV (схема 3).

Схема 3.Синтез моно-похідних гідразину на основі акридину, антрацену та флуорену

У процесі хроматографічного аналізу синтезованих сполук І виявлено, що арил- та ал-кіл-гід-разини піддаються окис--ної трансформації киснем повітря на поверх-ні сорбенту, що під-тверд-жено окислюванням сполуки 9 діетилазо-ди-кар-бок-силатом (схема 4). Реакція відбувається мит--тєво з утворенням одного лише про-дукту – арилазо-акри-ди-ну 10 – ідентичного за хромато-гра-фіч-ною ру-хо--містю і спект-ральними характеристиками до продукту трансформації на по-верхні сор-бен-ту.

Схема 4. Окисне перетворення 1-арил-2-акридинілгідразинів

Швидкість повного окислювання акридиніларилгідразинів на поверхні си-лі-кагелю при кі-м--нат-ній температурі значною мірою залежить від заміс-ни-ка в арильному залишку (R = CН3 (6 го-д), R = Н (24 год), R = CООН (36 год)). Для R = NO2 через 72 год спостерігалися лише сліди про-дук-тів окислю-ван-ня, а для 2,4-динітропохідного продукт окислювання був від-сут-ній навіть че-рез тиждень, що свідчить на користь зниження інтенсивності цього про-цесу елект-рон-акцеп-тор-ни-ми замісниками.

Таблиця 1

Умови проведення реакції та виходи моно-інтеркаляторів на основі акри-ди-ну, антрацену та флуо-рену

Тип | R | Умови | Вих., %

I | X = O, S, NH

Y = H, C6H5 | А | 72 – 95

I | X = CH3; СООН; NO2; F; Cl; Br … | А | 57 – 98

I | X = C6H5OH; C6H5NH2; C6H5Cl; 2-піридил (11); 3-піридил (12); 4-піридил (13); 2-хіноліл (14)… | Б | 75 – 98

IV | 2-піридил; 3-піридил; 4-піридил; 2-хіноліл. | В | 36 – 44

I | X = 3-CH3; 4-CH3;

3-OC6H5; 3-OCH3. | Б | 87 – 98

III | Г | 76 – 85

IV | В | 44 – 54

I | X–N–X = діетил-амін (I – 15, II – 22, III – 29); піперидин-1-іл (I – 16, II – 23, III – 30); морфолін-4-іл (I – 17, II –24, III – 31); піро-лідин-1-іл (I – 18, II – 25, III – 32); 4-метил-піпе-рид-ин-1-іл (I – 19, II – 26, III – 33); азепан-1-іл (I – 20, II – 27, III – 34); 4-метил-пі-пе-раз-ин-1-іл (I – 21, II – 28, III – 35). | Б | 53 – 85

II | Д | 61 – 70

Є | 41 – 62

III | Г | 51 – 72

Примітка: А – 4, СН3ОН, 65 °C, 2 – 5 хв; Б – 4, СН3ОН, 65 °C, 10 – 15 хв; В – 8, С2Н5ОН, 78 °C, СН3СООН, СН3СООNa (безв), 15 – 20 год; Г – 7, С2Н5ОН, 78 °C, СН3СООН, 4 – 6 год; Д – 5, С2Н5ОН, 78 °C, СН3СООН, 4 – 6 год; Є – 6, С2Н5ОН (абс), 78 °C, 4 – 6 год, 4 М HCl в діоксані.

У третьому розділі наведені результати дизайну, обгрунтовано вибір об'єк-тів дослід-жен-ня та описаний синтез гідра-зи-но-вмісних вихідних лін-ке-рів та бісінтерлексинів.

Потенційні бісінтерлек-сини повинні мати набір струк-турних осо-б-ли-вос-тей, що забез-пе-чу-ють: 1) можливість біс-інтеркаляції; 2) біо-де-гра-ду-є-мість; 3) низьку ци-то-ток-сичність; 4) неінди-фе-рентність лінкеру до малого жолобу ДНК.

Для реалізації біс-інтеркаляції молекула повинна мати два трицик-ліч-них фраг-мен-ти, по-єднаних так, щоб вони могли би знаходитися в пара-лель-них площинах з роз-во-ротом 30 – 90 градусів. Лінкер повинен забезпечувати від-стань між інтерка-лято-рами не менш 7.5 – 9.8 ?. Вимозі біодеградуємості від-повідає наявність хоч би одного амід-ного або естерного зв'язку в само-му лін-кері, або в “точці” його поєднання з інтер-каля-то-ром. Наявність в струк-турі фун-к-ціо-наль-них реакційноздатних груп (альдегідні групи, хінони, та ін.) не-при-пустимо з точки зору цитоток-сичності та мутагенності. Константи асоціації з ДНК для сполук, що здатні бути біс-інтер-ка-ляторами, досить великі (106 – 108 М-1), але якщо вони містять гнучкий лінкер і/або амід-ний зв'язок, то ци-то-токсичність їх виявляється незначною. Лінкер по-вин-ний мати в струк-ту-рі такі функ-ціо-наль-ні групи, щоб вони забезпечували зручне “пришиття” інтерка-ля-то-ра.

Як загальна структура об'єктів дослідження може виступати структура 36А. Для структури 36А Y = –CO–NH–N= (36Б, Int = 2,7-біс-[2-(діетиламі-но)-етокси]флуорен-9-іліден, тип IV). Якщо Int = акридин-10-H-9-іліден, стру-к--тура 36А відповідає альтер-на-тив-ній таутомер-ній формі акри-ди-ніл-гід-ра-зиду (тип I) і містить в собі дескриптор 9-аміноакридину. З урахуванням цих понять реа-гентом для антраценовмісних біс-інтеркаляторів (тип III) мо-же бути об-ра-ний легко-дос-туп-ний 9-фор-мілантрацен. З огляду на висловлені ви-ще поняття, приходимо до структури 36Б як загальної структури об'єктів дослідження.

З метою оцінки перспективності обраних для синтезу потенційних бісін-тер-лек-си-нів на основі піридин-2,6-дикарбонової кислоти була проведена оцінка ступеня подібності засобами програмного пакета CS ChemFinder Pro® (версія 6.0, Free trial version). Макси-маль-ний ступінь подібності (80 – 90 %) досягався при порівнянні 36В з комбілек-си-нами, таким чином, 36В повинен виявляти властивості бісінтерлексину, а 36Г – властивості комбілексину.

З іншого боку, описана протиінфекційна активність низки акридинілгідразидів

де INT = I, III, IV | феноксикарбонових кис-лот. У зв'язку з цим дру-гим нап-рям-ком досліджень нами об-ра-ні ана-ло-гічні їм за структурою біс--інтерка-ля--то-ри 37.

37

Біс-похідні феноксіоцтових кислот одержували алкілуванням естерів ок--си---бен-зойних кислот і дифенолів метил-бромо-ацетатом з наступним гід-ра-зи-нолізом (схема 5).

де X = “–”; C(CH3)2; O

Схема 5. Синтез дигідразидів на основі феноксидіоцтових кислот

Обробкою піридин-2,6-дикарбонової кислоти хлористим тіонілом одер--жували дихлороан-гід-рид 40, кон-денсацію якого з гідрохлоридами мети-ло--вих естерів амінокислот прово-дили в дво-фаз-ному середовищі. Насичений кар-бонат-бі-кар--бонат-ний буфер використано як водний розчин основи, а спо-лу-ку 40 додавали у суміші діе-ти-ло-вого ефіру і CH2Cl2. В цих умовах вихо--ди ді-е-с-терів до-сяга-ли 85 – 90 %, причому феноль--ний гідроксил тирозину не аци-лю-вавс-я. Гідра-зи-ноліз при-зво--д-ив до відповідних дигідрази-дів з 75 – 90 %-ви-ми виходами (схема 6).

де R = –(CH2)n– [n = 1 (41), 2 – 5]; –CH(CH3)–; 4-OH-Ph-CH2-CH<.

Схема 6. Синтез дигідразидів на основі піридин-2,6-дикарбонової кислоти

Біс-акридиніловані похідні піридин-2,6-дикар-бонової і біс-фено-к-сі-оц-тових кислот одер-жу-вали кип'ятінням дигі-дразидів з надлишком 4 в ме-та-но-лі (схеми 7 і 8).

Схема 7. Синтез біс-інтеркаляторів – похідних феноксіоцтових кислот

Схема 8. Синтез бісінтерлексинів на основі піридин-2,6-дикарбонової кисло-ти

У випадку біс-похідних антрацену у зв'язку з низькою розчинністю на-пів-продук-тів у ре-ак--ційному середовищі доводилось збільшувати тривалість проведення реакції до 48 -– 50 год, ви-ко-ристовуючи при цьому 1.5-разовий надлишок 7.

Біс-похідні аміксину одержували обробкою вихідних дигідразидів 10-разовим надлишком ди-гідро-хлориду аміксину в прису-тності CH3COONa та оцтової ки-слоти в ета-нолі протягом 72 – 96 год з наступною екстракцією суміші основи аміксину, продукту і напівпродукту, яку ро-з-ді-ляли кри-с-талізацією із гептану або ко-лоночною хрома-то-гра-фією.

При синтезі сполуки 71 із реак-ційної су-мі-ші був виді-лений продукт, якому на ос--но-ві при--сутності в йо-го ІЧ-спектрі смуг, властивих як вихідному ди-гід-разиду 41, так і біс-про-дук-ту 71, була приписана струк-тура 78, що під-т-верд-жена методами спектро-ско-пії 1Н-ЯМР і мас-спек-т-рометрії.

Алкілування піперазину метил-бром-аце-т-а--том в ацетонітрилі в при-сутності карбонату нат-рію з наступними екстракцією продукту бензолом, гідразинолізом і акридинілюванням приз-во-дило до похідного 79 (схема 9). Біс-антрацено-похідне 80 одержували за методикою, що описана для біс-похідних антрацену.

Схема 9. Синтез біс-акридинілгідразиду та біс-гідразону формілантрацену ді-ал-кіл-піперазину

У четвертому розділі подано результати дослідження нуклеотропних і біологічних влас-ти-востей синтезованих моно- та біс-похідних.

Фотометричне вивчення взаємодії з ДНК. Щодо робочої гіпотези клю-човою ланкою в прояві сполуками, що вивчаються, їх противірусної дії є взаємодія з ДНК.

Інтеркалююча здатність похідних акридинілгідра-зину методом фотометрії про-де-монст-ро-вана для постійних концентрацій лігандів 15, 16, 17 і 79 при змінних кон-центраціях ДНК.

Таблиця 2

Взаємодія лігандів з ДНК

Ліганд | lgКа | ? | P

15 | 4.74 | 0.08 | < 0.05

16 | 4.83 | 0.11 | < 0.05

17 | 4.42 | 0.08 | < 0.05

79 | 6.63 | 0.11 | < 0.05

Рисунок 1.Спектри сполуки 16 (постійна концентрація) в присутності змінних кон--цен-трацій ДНК СДНК = 0 – 848 Ч 10-6 М)

На рис. 1 наведені як приклад від-повідні спектри для сполуки 16. У всьому діапазоні концент-ра-цій ДНК мають місце значні зміни спектральних характеристик ліганду – максимум пог-ли-нан-ня зміщається з 412.4 нм (при відсутності ДНК) до 417.2 нм (при 848 М ДНК) при одночасному 40 %-вому гіпохромізмі (оптична щільність у мак-си-му-мі становить 0.296 й 0.179, відповідно), що характерно для інтеркаляторів. Отримані значення констант зв'я-зування (табл. 2) свідчать на користь при-пу-щення про реалізацію ін-тер-ка-ляції.

Флуориметричне вивчення взаємодії з ДНК. Якщо досліджувана ре-чо-вина є інтер-каля-то-ром, то кон-ку-рен-ція її з інтеркальо-ваним етидієм приз-во-дить до витіс-не--ння останнього з його ком-плексу з ДНК і до зниження інтен-сив-ності флуорес-цен-ції.

Із табл. 3 випливає, що досліджені спо-луки (крім 41 і 15 – 21) уже при ма-лих концент-ра-ці-ях значною мірою ви-ті-сняють етидій бромід із комплексу з ДНК, тобто є ін-тер-ка-ля-торами. Криві ви-тіснення (рис. 2) надають мож-ли-вість для точ-ного обчислення lgC50 – кон-цен-т-ра-ції, що призводить до 50 %-вого витіснення етидію броміду.

При порівнянні афінітету в рядах амі-но-аце-тилгідразонів акридону (I, 15 – 21), 9-фор-міл-акридину (II, 22 – 28) і 9-формілантра-це-ну (III, 29 – 35) спос-те-рігаються практично одна-ко-ві зміни в залежності константи асо-ціа--ції спо-лук з ДНК від інтеркалю-ючого фраг-мен-та (рис. 3).

Це вказує на ймовірно адитивний ха-рак-тер логариф-мів конс-тант ас-о-ціа-ції по ін-терка-лю-ю-чому та боковому фраг-ментах, що від-кри-ває можливість роз-ра-ховувати парамет-ри асо-ці-а-ції a pri-ori, виходячи зі ста-тис-ти-чно досто-вір-них інкрементів груп.

Таблиця 3

Параметри зв'язування, отримані для вивчених сполук за витісненням етидію броміду із комплексу з ДНК селезінки великої рогатої худоби

С-ка | lgС50 | Kа, 10-4, M-1 | lgКа | С-ка | lgС50 | Kа, 10-4, M-1 | lgКа

А | -5.06 ± 0.04 | 148 | 6.17 | 31 | -4.67 0.11 | 60 | 5.78

15 | -3.75 ± 0.08 | 3.6 | 4.56 | 32 | -4.97 0.08 | 60 | 5.78

16 | -3.72 ± 0.17 | 3.4 | 4.53 | 33 | -5.01 0.18 | 132 | 6.12

17 | -3.94 ± 0.09 | 5.6 | 4.75 | 34 | -5.10 0.17 | 162 | 6.02

18 | -4.42 ± 0.19 | 17.1 | 5.23 | 35 | -5.01 0.09 | 132 | 6.12

19 | -4.08 ± 0.10 | 7.8 | 4.89 | 41–––

20 | -4.20 ± 0.18 | 10.3 | 5.01 | 63 | -6.06 ± 0.08 | 743 | 6.87

21 | -4.07 ± 0.12 | 7.6 | 4.88 | 64 | -5.98 ± 0.21 | 1230 | 7.09

22 | -6.68 0.19 | 6170 | 7.79 | 65 | -6.24 ± 0.05 | 2240 | 7.35

23 | -6.33 0.10 | 2760 | 7.44 | 66 | -6.02 ± 0.09 | 1350 | 7.13

24 | -6.32 0.16 | 2700 | 7.43 | 71 | -6.89 ± 0.02 | 5020 | 7.70

25 | -6.45 0.22 | 3715 | 7.57 | 72 | -6.49 ± 0.14 | 3900 | 7.60

26 | -6.68 0.19 | 11000 | 8.04 | 73 | -6.62 ± 0.07 | 5290 | 7.72

27 | -6.33 0.10 | 5380 | 7.73 | 74 | -6.07 ± 0.21 | 1320 | 7.12

28 | -6.32 0.16 | 2350 | 7.37 | 75 | -7.00 ± 0.07 | 6470 | 7.81

29 | -4.56 0.08 | 23 | 5.37 | 77 | -7.43 ± 0.11 | 34700 | 8.54

30 | -4.83 0.25 | 87 | 5.94 | 78 | -5.99 ± 0.17 | 1240 | 7.09

Примітка: А (тут і далі) – аміксин; Н. д. – 50е витіснення етидію броміду із йо-го комплексу з ДНК не було досягнено. Довірчі інтервали наведені для P < 0.05.

Значення конс-тант ас-о-ціа-ції, отримані для ліган-дів 63 – 66, 71 – 75, 77 знаходяться в діапазоні lgKa = 6.87 – 8.54, що є характерним для біс-інтер-ка-ля-торів. В ряду біс-акридинів 63 – 66 константи асоціації мало залежать від дов-жини лін-ке-ра, що не дозволяє оцінити її вплив на аф-інність лігандів до ДНК. У порівнянні з акри-ди-на-ми, похідні аміксину більш афі-нні-до ДНК, що з ура-ху-ванням ролі електро-статичних взаємодій можна інтер-претувати як вплив додаткових (у по-рів-нян-ні з акридинами) груп, здатних до про-то-ну-ван-ня.

Майже 35-разове збільшення величини Ka при переході від А до сполуки 71 однозначно вказує на її біс-інтеркаляцію. З іншого боку, моно-інтеркалятори А та сполука 78 у 8 разів роз-різ-няються за величинами Ka, що вка-зує на участь лінкера в процесі зв'язування і дозволяє припустити бі-функ-ціо-наль-ний характер ліганду 78 та зарахувати цей ліганд до комбілек-си--нів. В сполуці 71 можна виділити 3 фрагменти, що відповідальні за зв'я-зу-ван-ня – 2 хро-мофори та лінкер, тобто вона є трифункціональним бі-сін-тер-лек-сином.

Якщо все сказане з приводу похідних аміксину й лінкера справедливо, то треба визнати ана-логічний характер зв'язування і похідних акридину, то-му що фактором, котрий ускладнює біс-ін-теркаляцію, є стеричні переш-ко-ди, які для похідних акридину значно менші.

Інгібування полімеразної ланцюгової реакції. Існує принаймні два мож-ливих механізми інгібування ПЛР інтерка-ля-то-ра-ми – стабілізація под-вій-ної спіралі та інгібування полімеризації полінуклеотиду. Дані літератури свід-чать на користь односпрямованості тен-ден-ції при інгі-бу-ван-ні ПЛР і реп-ро--дук-ції інфек-цій-ного агента нуклеотропними сполуками оскільки пока-за-но, що інгібування ком-білек-сина-ми ПЛР кор-е-лює з їх про-ти-пухлинною ак-тив-ніс-тю.

Для досліджень використані фрагменти ДНК вірусу герпесу простого (ВПГ-1) – позитив-ний конт-роль діагностікума. Активність відображається величинами C100 – мінімальною кон-цент--ра-ці-єю речовини (), що забезпечує пов-не пригнічення реакції, яке визначається відсутністю реп-лі-ката в реак-ційному середовищі після 32-разової ампліфікації при наявності реп-лі--ката в контролі.

Результати вивчення активності синтезованих сполук і А на-ве-де-ні в табл. 4. При-мітно, що аміноацетилгідразони акридону 15 – 21, що харак-те-ри-зуються мі-німаль-ним в ря-ду I – II – III афінітетом за результатами витіснення етидію бро-мі-ду (lgKа = 4.53 – 5.23), є найефективнішими інгібіторами ПЛР (С100 = 3.27 – 325 ).

Цікавою є тенденція залежності здатності речовин інгібувати ПЛР від їх структури в ряду інтеркалятор (А) – комбілексин (78) – бісінтерлексин (71). При переході від А до моно-гідразону 78 С100 знижується більш, ніж у 2 рази. Наступний “під-вісок” ще одного ін-тер-ка--лятора (71) призводить до подаль-шо-го змен-шення цієї величини до 5.05 . Ці закономірності є додатковим ар-гу--мен-том на користь зробленого раніше висновку про бі-функціональний ха-рак--тер зв'язування 78 і трифунк-ціо-наль-ний – 71.

Таблиця 4

Інгібування ПЛР ВПГ-1 деякими з синтезованих сполук

С-ка | С100, | С-ка | С100, | С-ка | С100,

А | 68.9 ± 2.5 | 24 | 3760 76 | 34 | > 3780

15 | 3.37 ± 0.10 | 25 | 4240 31 | 35 | 923 ± 17

16 | 3.27 ± 0.10 | 26 | 4610 38 | 41 | 303 ± 11

17 | 48.3 ± 2.0 | 27 | 3710 49 | 71 | 5.05 ± 0.08

18 | 325 ± 15 | 28 | 3790 57 | 72 | 0.29 ± 0.01

19 | 290 ± 10 | 29 | > 2700 | 73 | 6.03 ± 0.12

20 | 316 ± 15 | 30 | > 4370 | 74 | 2.83 ± 0.10

21 | 158 ± 7.3 | 31 | > 3900 | 75 | 470 ± 12

22 | 5790 17 | 32 | > 5430 | 77 | > 893

23 | 4370 15 | 33 | > 4630 | 78 | 30.3 ± 1.8

В ряду біс-гідразонів 71 – 75 при переході від похідного гліцину 71 (C100 = 5.05 ) до похідного -аланіну 72 (C100 = 0.29 ) спостерігається майже 17-разове зменшення C100, да-лі (сполуки 73 – 74) ця величина знов зростає (немонотонно) і для 75 досягає зна-че-ння 470 . Ці закономірності можна пояснити тим, що при збільшенні довжини полі-ме-ти-ленового лан-цю-га в амінокислотній частині молекули збільшується гнучкість молекули, що, з од-ного боку, знижує стеричні ускладнення при інтеркаляції обох хромо-фо-рів з од-но-часним зв'язуванням лінкера в малому жолобі, з іншого – приз-во-дить до посилення крипінгу ("сreeping" – "переповзання"), що зменшує здат-ність речовини інгібувати полімеразу. Оптимальним, очевидно, є лінкер, що містить 2 етиленові групи (72) і забезпечує мінімальні стеричні усклад-нен-ня при мінімальній здатності до крипінгу.

Противірусна активність (ПВ). ПВ вивчали на курячих ем-брі-о-нах що-до вірусу грипу А2/Гонконг (вакцинний штам у роз-веденні 1:100) при одно-часному введенні препарату та вірусу. Використовано розчин пре-паратів у ди--мексиді в концентрації 1.5 мг/мл при введенні 0.1 см3 на ем-б-рі-он, 6 ембріонів на пре-п-а-рат. ПВ оцінювали за індексом захисту (ІЗ) і змен-ше-н-ню інфекційного титру вірусу (СГТ). Останній отримано мак-си-мальним розведе-нням алан-тоїсної рідини, при якій вірус ще визначається за реакцією гемаглютинації. Як препарат порівняння був використаний амік-син.

Таблиця 5

Противірусна активність деяких із синтезованих сполук

Сполука | ІЗ | СГТ | Сполука | ІЗ | СГТ

38 | 0 | 1:9.2 | 49 | 83.33 | 1:2.24

39 | 33.33 | 1:16 | 50 | 66.67 | 1:2.20

42 | 0 | 1:10 | 52 | 0 | 1:4.1

43 | 16.67 | 1:16 | 53 | 50 | 1:4

44 | 50.0 | 1:2.52 | 56 | 50 | 1:5

45 | 0 | 1:8 | 59 | 83.33 | 1:2

46 | 83.33 | 1:1.59 | Контроль | 0 | 1:128

47 | 83.33 | 1:3.2 | А | 66.67 | 1:2

48 | 66.67 | 1:2.00

Із результатів табл. 5 випливає, що збільшення відстані між акри-диновими хромо-фо-рами та збільшення гнучкості лінкерного фрагмента (42 – 44 – 46) призводить до збільшення ПВ. При переході від пара-похідних з од-ним ариль-ним фрагментом (45) до аналогів, що містять два бензольних кіль-ця 48 і 49, спостерігається збільшення ПВ, що виража-ється як у зни-жен-ні титру вірусу, так і у збільшенні ІЗ.

Інтерфероніндукуючу активність вивчали при використанні лей-ко-ци-тів до-норської крові I (0) групи як клітин-продуцентів. Препарати дослід-жували введенням їх водних розчинів у концентраціях 10 – 100 мкг/см3. Після визначення загального титру ін-тер-фе-ро-ну (при pH = 7) культуральне сере-довище, що містить інтерферон, закислювали до pH = 2, інкубу---ва--ли (для гідролізу кис-ло-то-ла-біль-ного -інтерферону), знов підвищували pH до 7.0 і ще раз визначали титр інтерферону. Якщо після такої обробки титр дуже сильно знижуєть-ся або інтер-ферон не виявляється, то його відносять до -типу. В інших випадках – до -інтер-феро-ну.

Із табл. 6 випливає, що тільки три із вивчених речовин не проявляють інтерферон-інду-кую-чі властивості, а ще чотири індукують інтерферон на рівні з А або трохи ме-нш. Більш 60 % речовин (14 із 21) здатні індукувати дуже високі титри ( 1280 од/мл), знач--но перевищуючи А. Серед біфункціональних агентів 63 – 65, 70, 71 – 73, 75 усі сполуки ін-дукують се-ред-ні (320 – 640 од/мл) і високі ( 1280 од/мл) титри інтерферону. Для цих же сполук константи асоціації з ДНК перевищують 107 -1. В ряду моно-функ--ці-о-наль-них агентів з константами асоціації в діапазоні 104 – 106 -1 є три неактивних і два серед-ньоактивних індуктори.

Таблиця 6

Результати вивчення інтерфероніндукуючої активності синтезованих сполук (розчини лігандів в воді)

Сполу-

ка | Титр ІФН | Тип

ІФН | Сполу-ка | Титр ІФН | Тип

ІФН

рН = 7 | рН = 2 | рН = 7 | рН = 2

А | 640 | 320 | , | 41 | 401 | 1280

11 | 0 | 1280 | 63 | 2560 | 0

12 | 0 | 0– | 64 | 0 | 1280

13 | 1280 | 640 | , | 65 | 2560 | 0

14 | 160 | 1280 | 70 | 320 | 640

15 | 1280 | 1280 | 71 | 1280 | 0

16 | 0 | 0– | 72 | 640 | 1280

17 | 1280– | 73 | 320 | 1280

18 | 0 | 0– | 75 | 640 | 20 |

19 | 80 | 640 | 78 | 1280 | 40

20 | 1280– | (I)n:(C)n | 2560 | 2560

21 | 40 | 80

Так, і А, і дигідразид 41 – ви-со-коак-тив-ні індукто-ри -ін-тер-фе-ро-ну, а їх гібри-ди 1:1 (78) і 1:2 (71) – ін-дук-то-ри -ін-тер-ферону.

Незважаючи на низький коеф-і-цієнт лі-ній-ної кореляції (рис. 4) між лога--риф-мами Ка і ло-га-риф--ма-ми титрів інтер-фе-ро-ну, від-зна-че-на тен--ден-ція свід-чить на користь пра-во-мір--нос-ті вис-лов-ле-ної раніше гіпотези про ін-тер-ка-ля-ційний механіз-м індукції ін-тер--фе-ро-ну.

Висновки

1. Серед синтезованих похідних акридину, флуорену та антрацену виявлено ви-сокоефективні індуктори - і -інтерферону, що підтверджує при-пу-щен-ня, за яким наявність у сполук інтеркалюючих властивостей дозволяє очікувати від них високу інтерфероніндукуючу активність.

2. Показано, що інгібування полімеразної ланцюгової реакції є адекватною мо-деллю пригнічення вірусної репродукції нуклеотропними проти-вірус-ни-ми препаратами.

3. Методом спектрофлуориметрії показано та в тесті інгібування ПЛР під-тверджено висновок про те, що 2-{[2,7-біс-(2-(діетиламі-но)ето-к-си)флу-о-р-ен-9-іліденгідразинокарбонілметил]амід}-6-гід-ра---зи-нокарбонілметиламід пі-ри-дин-2,6-дикарбонової кислоти зв'язується з ДНК як біфункціо-наль-ний лі-ганд, а біс-[2,7-біс-(2-(діетиламіно)етокси)флуорен-9-іліденгідрази-но-кар-бо--ніл-алкіл] аміди піридин-2,6-дикарбонової кислоти – як трифунк-ціо-нальні ліганди.

4. Встановлено, що в ряду трифункціональних лігандів ДНК – похідних амік-сину – здатність до інгібування ПЛР залежно від довжини алкі-ле-но-во-го ланцюга змінюється немонотонно, а саме: зростає в 16 разів при пе-ре-ході від однієї метиленової групи у ланцюгу до двох. Подальше збіль-шен-ня кількості метиленових груп призводить до швидкої втрати ін-гі--бу-ю-чої здатності. Найбільш активне похідне – біс-[2,7-біс-(2-(діети-ламі-но)ет-о-кси)флуорен-9-іліден-гідразинокарбонілетил]амід піридин-2,6-дикар-бо-нової кислоти.

5. У низці синтезованих біс-акридинів, біс-флуоренів та біс-антраценів, що містять у складі лінкерів фрагменти фталевої, карбоксифенілоксіоцтової та карбоксиметоксіарілоксіоцтової кислот, підвищення гнучкості та довжини лінкера призводить до підвищення противірус-ної актив-нос-ті. Чотири спо-луки – похідні карбоксиметоксіарілоксіоцтових кислот – значно переви-щу-ють аміксин за противірусною активністю.

6. Показано, що в ряду аміноацетилгідразонів акридону, 9-формілакридину і 9-фор-міл-антра-це-ну похідні 9-формілакридину є найбільш афінними до ДНК інтер-каля-тора-ми.

7. Встановлено, що акридиніл-9-арилгідразини легко окислюються як діетил-азо-ди-карбокси-ла-том в неполярних розчинниках, так і киснем повітря в ад-сор-бованому на силікагелі стані.

Список опублікованих ПРАЦЬ ЗА темОЮ дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.