НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
ЛУК'ЯНЕЦЬ ОЛЕНА ОЛЕКСАНДРІВНА
УДК 577.352.5:576.382
РОЛЬ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ У ФУНКЦІОНУВАННІ НЕРВОВИХ ТА НЕЙРОЕНДОКРИННИХ КЛІТИН В НОРМІ ТА ПАТОЛОГІЇ
03.00.02 - Біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ - 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Науковий консультант: Академік НАН та АМН України,
Доктор біологічних наук,
професор
Костюк Платон Григорович
директор та зав. відділом загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор
Шуба Михайло Федорович,
зав. відділом нервово-м?язевої фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор
Костерін Сергій Олексійович,
заст. Директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м?язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
Доктор біологічних наук, професор
Мірошниченко Микола Степанович,
зав. кафедрою біофізики Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка.
Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.Богомольця
Захист дисертації відбудеться 28.02.2006 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Акад. Богомольця,4.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Акад. Богомольця, 4.
Автореферат розіслано 26.01.2006 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
Доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми
Однією з перших описаних експериментаторами властивостей кальцієвих каналів, яка не укладалася в існуючі теоретичні уявлення і залишається неясною по сьогоднішній день, була надзвичайно висока залежність струму, протікаючого через кальцієві канали, від внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+. Іони Ca2+ в субмікромолярних концентраціях впливали як на величину струму, протікаючого через канали, так і на селективність і потенціалозалежні параметри каналу (Kostyuk et al., 1983). Звичайно, така підвищена чутливість досліджуваного процесу до іонів Ca2+ асоціюється з високою спорідненістю зв?язування цих катіонів з білками-мішенями. Найчастіше аналогія проводилася з найпоширенішим з Ca2+-звязуючих блків - кальмодулином. Ці дослідження стимулювали розвиток уявлення про кальцієвий канал як про Ca2+ -зв'язуючий білок, яке частково підтверджується сучасними даними про первинну структуру канальної молекули. Саме з цієї точки зору деякі учені і пояснювали надзвичайно високу залежність Ca2+ каналів від внутрішньоклітинного Ca2+. З другого боку, висока чутливість досліджуваного процесу до концентрації вільного Ca2+ може визначатися і активацією цим катіоном ряду Ca2+-залежних ферментів, у тому числі і тих, що входять в ланцюжок метаболізму вторинних посередників із участю протеїнкінази-А або протеїнкінази-С (РК-А або РК-С) та Ca2+-залежних фосфатаз. Особлива роль в останній час приділяється участі Ca2+-залежної фосфатази – кальцинейрину, яка специфічно експресується в нервовій тканині, а отже може бути залучена в специфічні функції нейронів. Відносно участі процесів фосфорилування та дефосфорилування в модуляції активності кальцієвих каналів існує ряд робіт. Проте, із всієї сукупності отриманих даних, часто суперечливих, не можна зробити однозначного висновку про молекулярні механізми їх дії в регуляції потенціалокерованого транспорту Ca2+.
Не менша роль в останній час приділяється і функціональній ролі Ca2+- каналів. Одним із головних напрямів в цьому сенсі є вивчення ролі Ca2+-каналів в синаптичній передачі, а саме вивільненні нейротрансмітерів або екзоцитозі на простих моделях-таких як хромафінні клітини наднирника. По своєму походженню нейросекреторні хромафінні клітини мозкової речовини наднирників аналогічні постгангліонарним нейронам симпатичної нервової системи і тому можуть використовуватись як експериментальні моделі для дослідження синаптичної передачі. Наявність в цих клітинах різних типів Ca2+ каналів і цілого ряду популяцій везикул, що здатні приймати участь у екзоцитозі, та зручність в використанні цих клітин для проведення багатьох вимірювань одночасно дає можливість формувати різного типу модельні системи.
З іншого боку, як зараз стає відомим, Ca2+- канали приймають участь у розвитку і протіканні ряду нейрологічних захворювань. Так, було припущено, що вони залучені до протікання таких захворювань та станів, як епілепсія та ішемія/гіпоксія, під час яких внутрішньоклітинний Ca2+ сигнал викликає клітинну загибель або індукує зміни електричної збудливості нейронів, що може призводити до гіперзбудливості та синхронної активності багатьох нейронів. Тому дослідження в цьому напрямку є дуже перспективними.
Найбільш методично зручним для такого роду досліджень є використовування різних модельних систем, кожна з яких має свої переваги. В цьому відношенні використання нервових клітин (нейронів гіпокампу та дорсально-корінцевого ганглію (DRG нейронів) є дуже зручною моделлю для вивчення патологічних станів нервової системи, використання ідентифікованих нейронів молюсків Helix роmatia та гібридних клітин нейробластомигліоми (NG108-15) є вельми привабливими моделями для вивчення процесів регуляції активності Ca2+ каналів і, на кінець, застосування хромафінних клітин, як водночас моделі синапсу та секреторної клітини для вивчення ролі Ca2+ - каналів в синаптичних та секреторних процесах. Унікальну можливість вирішити поставлені завдання дозволяє застосування широкого кола методів, а саме: електрофізіологічних методів в конфігураціях whole-cell та cell-attached для вимірювань інтегрального струму та поодиноких каналів, флуориметричного, полярографічного, амперометричного, імуноцитохімічного, методу трансфекції, електронно-мікроскопічний, конфокальної мікроскопії та інших. Використання цих методів у комбінованих експериментах дають перевагу точно контролювати параметри, які впливають на перебіг досліджуваних процесів, таких як парціальний тиск кисню, концентрація Ca2+, вивільнення трансмітеру та інші.
В наш час дуже актуальною проблемою є вивченя механізмів розвитку паталогічного захворювання мозку – епілепсії та знаходження нових ентиепілептичних препаратів (AED) для лікування цієї хвороби. Серед таких препаратів дуже багато таких, що пов'язані із впливом на іонні канали, в тому числі на Ca2+ канали та внутрішньоклітинний Ca2+ гомеостаз. Існуючі дані про різноманітну природу та форми епілепсії свідчать про дуже велику складність в підборі фармакологічних агентів для лікування цього захворювання, навіть при відомій етіології. Тому в наш час продовжується бурхливий пошук нових фармакологічних препаратів, які б дозволили здійснювати ефективне лікування цієї хвороби. Якщо спочатку нові AED призначалися майже виключно для використовування у складі комбінованого лікування (в поєднанні з іншими антиконвульсантами), то останніми роками вони пропагуються як засіб монотерапії (ізольованого лікування) епілепсії. Крім того, передбачається, що AED другого покоління дозволяють у ряді випадків добитися контролю над нападами епілепсії, яка вважалася раніше рефрактерною. Саме ця обставина є визначаючою в сучасній эпілептології. Так, можна констатувати, що не дивлячись на інтенсивні дослідження в цій області та суттєвий прогрес у відкритті механізмів виникнення епілепсії та її чинників, залишається велика кількість не розв'язаних питань, особливо в галузі фармакології лікування епілепсії.
Таким чином, завдання з'ясування молекулярних механізмів регуляції активності кальцієвих каналів внутрішньоклітинними процесами фосфорилування/дефосфорилування, а також роль Ca2+ каналів в секреторній функції збудливих клітин та їх роль в розвитку та перебігу ряду патологій мозку є вельми актуальною; вирішення її сприятиме формуванню уявлень про фундаментальні принципи функціонування нервових та нейроендокринних клітин, а також може мати велике практичне значення у з?ясуванні механізмів виникнення патологій мозку (ішемія, епілепсія) та ендокринної системи, а також у розвитку нових фармакологічних препаратів, що використовуються в медичній практиці.
Зв’язок роботи із науковими програмами
Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”, а також у відділі біофізики Макс-Планк Інституту Біофізичної Хімії (Гьоттінген, Німеччина), а також у відділі фармакології Лондонського Університету (Лондон, Великобританія) в рамках наукових міжнародних програм Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
Мета
Метою даної роботи було дослідження ролі та регуляції потенціалозалежних Ca2+ -каналів в функціонуванні нервових та нейроендокринних клітин в нормі та патології.
Завдання досліджень
Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:
1. Вивчити представництво та особливості різних типів Ca2+ - каналів в нервових та нейроендокринних клітинах.
2. Встановити механізми регуляції активності Ca2+ - каналів процесами фосфорилування та дефосфорилування.
3. Вивчити морфологічні особливостей хромафінних клітин та їх везикул, що залучені до екзоцитозу.
4. Вивчити роль різних типів Ca2+ каналів в Ca2+-залежному екзоцитозі в хромафінних клітинах.
5. Вивчити роль Ca2+ каналів в протіканні гіпоксичного ефекту в нервових клітинах.
6. Встановити роль Ca2+ каналів в епілептогенезі та механізмів дії антиепілептичної сполуки – леветірацетаму.
Наукова новизна отриманих результатів
Створено та застосовано модифікований полярографічний метод вимірювання парціального тиску кисню в розчині омиваючому клітини, за допомогою платинових електродів в комбінації із електрофізіологічними та мікро флуоресцентним методами досліджень. Розроблені електрохімічні методи вимірювання вивільнення катехоламінів із поодинокої клітини за допомогою карбонових мікроелектродів. Описані біофізичні та фармакологічні особливості типів Ca2+ каналів в гібридних клітинах нейробластомигліоми та вперше встановлений тип каналу, який раніше не був ідентифікований у цих клітинах.
Виявлено механізми зміни активності поодиноких Ca2+ - каналів, викликані їх РК-А-залежним фосфорилуванням. Показано: участь дефосфорилування протеїнфосфатазою кальційнейрином в регуляції активності Ca2+ - каналів і участь різних типів Ca2+ каналів в Ca2+-залежному екзоцитозі в хромафінних клітинах. Розроблено двоступеневу модель Ca2+-залежного екзоцитозу в хромафінних клітинах. Зроблено морфологічний аналіз та досліджено склад везикул в хромафінних клітинах. Досліджено роль Ca2+ каналів в перебігу гіпоксичного ефекту в нервових клітинах. Встановлено роль різних типів Ca2+ каналів в дії антиепілептичної сполуки – леветірацетаму в нейронах гіпокампу.
Теоретичне та практичне значення отриманих результатів
Результати дисертаційної роботи представляють як фундаментальний інтерес, оскільки отримано принципово нові дані про особливості функціонування потенціалозалежних Ca2+ каналів, їх внутрішньоклітинну регуляцію, участь у процесі вивільнення нейротрансмітерів та розвитку ряду патологій мозку, таких, як епілепсія та гіпоксія/ішемія, так і практичне значення. Останнє пов?язано із встановленням молекулярних механізмів дії нової ефективної антиепілептичної сполуки – левотірацетаму (КЕППРА), яка широко використовується в медичній практиці. Отримані дані дають підстави говорити про функціональну роль різних типів Ca2+ каналів в ряді нервових та нейроендокринних клітин ссавців та безхребетних. Результати дослідження представляють інтерес для біофізиків, біологів, фізіологів, фармакологів, ендокринологів, молекулярних біологів, медиків, оскільки розширюють наші уявлення про механізми функціювання та патології нервових та нейроендокринних клітин, а також механізм дії на нервові клітини фармакологічних засобів, вживаних в медичній практиці.
Особистий внесок здобувача
Авторкою даної роботи зроблено основний внесок у всі стадії роботи, включаючи постановку завдань, розробку нових методів дослідження гіпоксії та секреції, проведення переважаючої кількості експериментів, аналізу їх результатів та написання статей.
Апробація роботи
Основні положення роботи були представлені на наукових семінарах секції “Молекулярна нейрофізіологія” Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, а також на наукових семінарах відділу Біофізики Макс-Планк Інституту Біофізичної Хімії (Геттінген, Німеччина) і відділу фармакології Лондонського Університету (Лондон, Великобританія). За роботи присвячені механізмам синаптичної передачі, що увійшли в дисертаційну роботу, авторка разом із групою співробітників Інституту ім. О.О. Богомольця НАН України, була удостоєна Державною Премією України в галузі науки і техніки в 2003 році. Результати доповідалися на ряді конференцій, серед них:
XIV Congress of the I.P. Pavlov Ukrainian Physiological Society, Kiev, 1994; The advanced School of Neurochemistry 2nd Biennial Course, Okazaki, Japan, 1995; Physiological Society Meeting, University College London); 8th International Congress of the Czech and Slovak Neurochemical Society, 1996; XXXIII International Congress of Physiological Sciences IUPS, St.Petersburg, Russia, June 30- July 5, 1997; International Workshop ‘Intracellular Signalling’, 1997, 26-29 July) ; 42nd Annual Meeting of Biophisical Society, 1998, Kansas City, USA); XV Congress of the I.P. Pavlov Ukrainian Physiological Society, Donetsk, 1998; Physiological Society Meeting, Liverpool, 1998, 28 April- 1May 1998) ; Forum of European Neuroscience, 1998, Berlin, 27 June-1 July); 12 Meeting of the European Society for Neurochemistry, St.Pet., Russia, 1998); Ist Ukrainian Neuroscience Society Meetting, Kiyv, 24-26 November, 1998); 2nd FEPS CONGRESS, 1999, Prague; Fifth IBRO Word Congress of Neuroscience. Israel, 1999; International Neuroscience Symposium Cells, Channels and Signals. Kiev, 1999; The Eighth Annual Meeting of the Israel Society for Neurosciences, Isarael, 1999; Physiological Society 1000th Meeting, University of Birmingham, United Kingdom; NATO Workshop, Ca2+ Signaling and Cross-talk, IlCiocco, Italy 2000; III National Congress of Pathophysiologists, 24-27 May, Odessa; Autumn Workshop "Membranes and Signalling", Kiev, September 4-8, 2000; Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc 2000, Gif-sur-Yvette, France, 2000; Physiological Society Meeting, King's College London, UK, December 18-20; Bogomoetz-Nencki Meeting, Sulejow, Poland, 2001; II Conference of Ukrainian Society for Neurosciences with international participation. Dedicated to 70-aniversary of Physiology Department at Donetsk State Medical University. Donetsk, 23-27 May 2001
Joint Meeting of American Epilepsy Society and the American clinical Neurophysiology Society, Philadelphia, USA, 2001; 29th Gottingen Neurobiology Conference and the 5th Meeting of the German Neuroscience Society. 2003; International Scientific Conference of Serbian Physiological Society “Risk factors and health: from molecule to the scientific basis of prevention” 2003. 7-9 Nov. Belgrade, Serbia. 29th Gottingen Neurobiology Conference and the 5th Meeting of the German Neuroscience Society. 2003, Goettingen, Germany. Annual Meeting of the American Epilepsy Society, 2004. Dec 3-7, New Orlean, USA. IBRO Advanced School of Neuroscience, 16-28 Sept, Yalta, Crimea. IV National Congres of Pathophysiologists of Ukraine with International participation. 26-28 May Chernivtsi, Ukraine. First (Inaugural) Congress of Ukrainian Society of Cell Biology. 2004. 25-28 April, Lviv. Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc Gif-sur-Yvette, France 2004. I Congress of NIS Physiologists. 2005. 19-23 Sept., Sochy, Dagomys, Russia.
Публікації
По результатам роботи опублікована 1 монографія, 2 розділи в двох монографіях, 50 статей та 88 доповідей в наукових вітчизняних і закордонних журналах.
Структура та об'єм дисертації
Дисертація складається із вступу та 6 розділів, присвячених: огляду літератури, опису методики, експериментальним результатам і їх обговоренню, висновкам і списку літератури, що містить 930 найменувань. Роботу викладено на на 357 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 5 таблицями і 96 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єкт дослідження
В роботі було використано декілька типів клітин: хромафінні клітини наднирника бика і щура; нейрони гіпокампу і DRG щурів, ідентифіковані нейрони слимака Helix pomatia і гібридні клітини нейробластомигліоми NG108-15.
Виділення окремих хромафінних клітин
Експерименти, описані в даній роботі, проводились на свіжоізольованих хромафінних клітинах наднирників статевозрілих щурів. Нами використовувались дорослі (5-6 місяців) самки білих щурів лінії Вістар масою 180-230 грамів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології Ім. 0.0. Богомольця НАН України. Для отримання свіжоізольованих клітин використовувалась стандартна процедура ферментативної ізоляції. Щура анестезували за допомогою ефіру у спеціальному ексикаторі. Через 10-15 хвилин, коли тварина знаходилась у стадії глибокого сну, її декапітували і проводили операцію по виділенню наднирників. Далі за допомогою тонкої голки через устя вени наднирник промивався стандартним розчином DPBS (9.6гр/літр), що містив фермент колагеназу тип ІА (Sigma, США) в концентрації 0.5мг/мл. для видалення крові, що залишилась в тканині. Ферментативну обробку тканини проводили в цьому ж розчині на протязі 30?50 хвилин при 37°С. Потім під бінокуляром на фільтрувальному папері в чашці Петрі, за допомогою хірургічного леза виділялась більш темна за кольором медулярна частина наднирника, яка розділялась на тонкі частини товщиною 300?500 ?м. Отримані зрізи інкубувались в розчині DPBS, що містив колагеназу в концентрації 0.3мг/мл протягом 50?60 хвилин при 37°С. Надалі зрізи подрібнювались за допомогою спеціальних ножиць на якомога менші частини. Окремі хромафінні клітини отримувались за допомогою м'якого, повільного піпетування з використанням піпеток різного діаметру не менше 15 хвилин.Всі експерименти на тваринах проводились у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин.
Ферментативне виділення окремих DRG нейронів
Експерименти, також проводились на гостроізольованих нейронах гангліїв дорзального корінця білих щурів лінії Вістар віком 1,5-2 місяці, що утримувались на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Для отримання клітин використовувалась стандартна процедура ферментативної ізоляції. Щура декапітували під легким ефірним наркозом. З області хребта хірургічним шляхом видалялась шкіра та м’язи, хребет розсікався навпіл в горизонтальній площині та виділялися грудні та поперекові спинномозкові ганглії, які поміщалися у чашку Петрі з охолодженим до 4 С розчином DPBS з глюкозою. Після 2-3 хвилин охолодження ганглії переносилися у розчин Tyrode, що містив ферменти колагеназу (тип ІА, Sigma, США) в концентрації 0.5 мг/мл та протеазу (тип XIV, Sigma, США) в концентрації 1 мг/мл, в якому витримувалися на протязі 25-30 хвилин при температурі 37С. Для отримання суспензії клітин ганглії піпетувалися за допомогою Пастеровських піпеток різного діаметру у 0.5 мл розчину Tyrode. Отриману суспензію витримували у чашках Перті на протязі 20-30 хвилин для закріплення клітин до дна чашки.
Культура клітин гіпокампу
Первинна культура нейронів гіпокампу готувалася з новонароджені щурів лінії Вістар. Тваринні декапітувались і їх мозок поміщався у фосфатно-буферний розчин Процедура декапитації проводилася при дотриманні правил використовування піддослідних тварин Національної Академії Наук України. Цілий гіпокамп виділявся, зрізи гіпокампу нарізалися завтовшки 450-550 мкм. Після 10-хвилинної обробки 0.025% трипсином у фосфатно-буферному розчині при 34°С, тканина промивалася 4 рази в мінімальному середовищі Ігла (Sigma) з додаванням кінської сироватки (10%) (Gibco). В цьому розчині клітини були механічно дисоційовані за допомогою Пастерівських піпеток. Для електрофізіологічних експериментів ми вибирали, під візуальним контролем, пірамідні нейрони гіпокампу.
Виділення нейронів слимака
Експерименти були виконані на нейронах дорзальної і вентральній поверхні підглоткового комплексу гангліїв виноградного равлика Helix роmatia. Тварини містилися в прохолодних тераріумах віварію. Не менше ніж за тиждень до експерименту молюски переносились в приміщення з температурою повітря +18?+20?C, де вони находились в добре аеруємому вологому боксі. Препарування нейронів равликів здійснювалося безпосередньо перед дослідом і полягало у витяганні навкологлоткового кільця гангліїв. Для видалення щільних сполучнотканинних оболонок, що покривають нейрони, препарат інкубували в нормальному розчині Рінтгера, що містив 1% пронази, на протязі 90 хвилин при температурі 37?С. Пом'ягчені проназою сполучнотканинні оболонки легко віддалялися за допомогою мікропінцету і мікроножиць під контролем бінокулярного мікроскопа. Після відмивання ферменту розчином Рінтгера, клітини поміщалися в холодильну камеру для інактивації дії ферменту і знаходилися там при температурі +4?C до початку експериментів. Нервові клітини такого препарату володіли нормальною активністю і високим опором мембрани.
Ідентифікація педальних нейронів
Разом з використовуванням в дослідах неідентифікованих нейронів, в більшій частині експериментів застосовували ідентифіковані нервові клітини - “педальні нейрони”, отримані по спеціальній методиці. Після звичайної ферментативної обробки препарату навкологлоткового кільця гангліїв, з його вентральної поверхні вирізувалися невеликі ділянки педальних гангліїв. Ці ділянки включали нейрони, прилеглі до групи нервів (VIII - X), розташованих в цій області ганглія (згідно схемі Кіліаса, що виходять. Надалі нейрони, локалізовані в цих фрагментах, після їх механічного виділення, використовувалися для остаточної ідентифікації по наявності стимулюючої дії 5-НТ на ICa вже в ході електрофізіологічного експерименту.
Культивування гібридних клітин NG108-15
Культуральне середовище складалося із 90% MEM, 10% FCS (ембріональна сиворотка теляти), НАТ (хіпоксантін-аміноптерін-тімідін) добавки і пеніцилін-стрептоміціну. За день до диференціаціі NG108-15 клітини були перенесені на скляні скельця. Клітини були диференційовані, використовуючи стандартні процедури, описані раніше шляхом обробки клітин 10 М простагландіном E1 (PGE) і 50 М ізобутілметілксантіном (IBMX) за 3-5 днів до вимірювання. PGE і IBMX були присутні тільки протягом початкової 48 годин диференціації. Пізніше середовище було змінене на MEM + 1% FCS + НАТ добавка. В усіх електрофізіологічних експериментах піпеточний розчин містив 0.1 mM IBMX, щоб запобігти Ca2+-залежну фосфодістеразну активність. Присутність IBMX ніяким чином не впливала на інтерпретацію даних, тому що обидві як недиференційовані так і диференційовані, а також “дикі” типи і трансфековані клітини оброблялися цим інгібітором.
ОСНОВНІ МЕТОДИ
В роботі використовувався ряд методів, а саме: електрофізіологічні методи (фіксація мембранного потенціалу, вимірювання активності поодиноких каналів та вимірювання ємності мембрани), полярографічний та амперметричний методи, імуноблот аналіз, метод трансфекції, імуноцитохімії, конфокальної та електронної мікроскопії, мікрофлуоресцентний метод. Нижче приведено описання основних із них.
Методи фіксації мембранного потенціалу
В даній роботі для реєстрації кальцієвих струмів мембрани нейронів гіпокампу використовувався метод patch clamp в конфігурації whole сеll. Експериментальну камеру з прикріпленими до дна клітинами встановлювали в камеру поміщену на предметному столику інвертованого мікроскопу з оптикою (Olympus, Японія). Скляні мікропіпетки виготовлялися з боросилікатного скла (зовнішній діаметр 1.75 мм), використовуючи витягував піпеток P-97 фірми Sutter Instruments. Після оплавлення піпетки отримували діаметр кінчика 1 - 2 мкм і опір 2 - 3 М при заповненні стандартним "внутрішньоклітинним розчином". Піпетку зєднували до вхідної головки підсилювача Dagan PC-One (Dagan Corp., США) або EPC-9 (HEKA Electronics, Німеччина). Утворення гігаомного контакту контролювали в режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану прямокутні гіперполяризуючі імпульси амплітудою -10 мВ. Після утворення "сеll attached" конфігурації компенсували ємність піпетки. “Whole сеll” конфігурацію одержували, прориваючи мембрану під піпеткою імпульсами негативного тиску, після чого записували ємнісний струм у відповідь на гіперполяризуючий імпульс амплітудою -10 мВ і обчислювали ємність клітини за формулою: Cm = Q/10 де Q - інтеграл струму ємності, Cm - ємність клітинної мембрани.
Сигнал фільтрували при частоті зрізу 3 кГц за допомогою 3-х полюсного фільтру Бесселя і 10 kHz цифровим фільтром. Комп'ютерна система забезпечувала також генерацію командних імпульсів. Збір даних і їх аналіз здійснювався за допомогою програмного забезпечення PULSE (HEKA Electronics, Німеччина). Статистичні відмінності були оцінені дисперсійним аналізом (Анова) з рівнем значущості P.
Вимірювання ємності мембрани
Ємність (Cm) мембрани безпосередньо пропорційна до площі зовнішньої мембрани; тому зміни в Cm відображають процес ексоцитозу. Ми використовували метод Lindau і Neher (Lindau & Neher, 1988) для вимірювання ємності застосовуючи синусоїдний стимул, накладений на DC підтримуємий потенціал - V в режимі whole-cell. 1KHz, синусна хвиля величиною 10 mV до піку генерувалася багатоканальним інтерфейсом (Instrutech, Inc., NY) ITC-16, контрольованим комп'ютером Maкiнтoш Quadra 700. Генерація синусної хвилі як і компенсація основної частини ємності клітини і фазочутлива детекція Cm була досягнута з програмним забезпеченням “Lock-in amplifier”, контрольованим програмним забезпеченням “Pulse” (HEKA Elektronics). Використовувалася різниця в Cm (Cm) до і після деполяризуючих імпульсів, для того щоб виміряти екзоцитоз протягом імпульсів (Neher & Marty, 1982c; Gillis, 1995). Cm був вирахований off-line, тобто після експерименту, як різниця між середніми препімпульсними Cm на протязі 50 ms вікна перед деполяризацією і середньою величиною Cm, виміряною під час 500ms вікна після кінця деполяризації. Аналіз даних виконувався програмним забезпеченням, написаним в коді макрокоманд IgorPro (WaveMetrics, Inc., Like Oswego, орегон) нами (ООЛ), а також використовувався код, написаний доктором K.D. Gillis.
Вимірювання кисню в електрофізіологічних експериментах
В експериментах та медичній практиці часто застосовують безпосереднє вимірювання кисню в тканинах або біологічних розчинах використовуючи електрохімічні методи за допомогою платинового електроду, на якому відбувається відновлення кисню (Рівняння 1).
O2 + 4e- +4H+ 2H2O (1)
Схематичне зображення принципу вимірювань рО2 платиновим електродом під час електрофізіологічного експерименту представлено на Рис.1. Для експериментальних електрофізіологічних досліджень в основному використовується платиновий вимірювальний електрод із скляною ізоляцією діаметром 0.3 0.5 мм. Найважливішою характеристикою платинового електроду є його полярографічна характеристика - полярограма. Полярограма відображає залежність електродного струму (Іе) від прикладеного електродного потенціалу (Ue) і має нелінійну форму із явно вираженим плато, при якому і проводять вимірювання.
Полярограма має складну форму, що пояснюється електрохімічними властивостями електроду та фізичними процесами, такими як формування подвійного електричного шару, ємнісний та Фарадеївський струми та ін. Оскільки амплітуда струму на електроді залежить від вмісту кисню в розчині, то підвищення pO2 приводить до лінійного зростання амплітуди Іе. Таким чином, знаючи коефіцієнт нахилу залежності Іе від pO2,, можна вимірювати абсолютне значення pO2 у розчині. Властивості та характеристики платинового електроду та методів вимірювання pO2 детально описані в ряді робіт (Konovalenko et al., 1975; Lukyanetz & Shkryl, 2003).
Амперометрія
За допомогою конфігурації "амперометрія" ми реєстрували процес секреції з найбільшою часовою роздільною здатністю. При прикладанні постійної напруги 600?800мВ на електрод з карбоновим волокном, який занурений в фізіологічний розчин, виникає електричний струм, що повільно затухає протягом декількох сотень секунд. Цей струм виникає через процес заряджання ємності подвійного шару та окислення певних компонент поверхні електроду. Після приблизно 5 хвилин загальний струм стабілізується та складає звичайно 5?10пА. За таких умов можна розпочинати досліди. Для таких електродів рівень шуму складає в середньому 0.5?1.5пА при ФНЧ (3-полюсний фільтр Бесселя) 3кГц (використовуючи підсилювач ЕРС-9 при коефіцієнті підсилення 20мВ/рА).
Електрод з карбоновим волокном електричне можна представити як резистор, послідовно сполучений з паралельним з'єднанням опору та ємності. Цей послідовний опір складає 100?500к0м та виникає через контакт між карбоновим волокном та розчином електроліту 3М КС1 (опір самого волокна є незначним і складає всього 3?4к0м/см) та ємністю порядку 3?40пФ. Паралельний опір складає 10?100Гом та залежить від степені обрізання кінчика електроду. В якості допоміжного (індиферентного) електроду найкраще всього використовувати хлор-срібний електрод.
Вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію
Для вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Са2+]і) ми використовували кальцій-чутливий барвник Fura-2 AM (Molecular Probes, США), що має здатність проникати через клітинну мембрану (Grynkiewicz et al., 1985). Якщо Fura-2 присутня в досить високій концентрації всередині клітини, вона витісняє всі ендогенні кальцієві буфери і дозволяє вимірювати загальну кількість іонів кальцію, що входять всередину клітини.
Клітини інкубували протягом 30 хв. при температурі 37°С в зовнішньоклітинному розчині, що містив 1?2 M Fura-2 АМ. Після цього клітини відмивались чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в темряві при кімнатній температурі на 30?40 хвилин для завершальної деестерифікації Fura-2 АМ. Чашка Петрі з клітинами розташовувалась в полі зору інвертованого мікроскопу Olympus ІХ70 (Токіо, Японія). Для реєстрації кальцієвих транзієнтів, які виникали внаслідок стимуляції клітини певним розчином, використовувався підсилювач ЕРС-9 (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Керування процесами вимірювання, а також запису даних контролювався за допомогою комп'ютерної програми "Pulse" та „Х-chart” (НЕКА, Ламбрехт, Німеччина). Для зміни зовнішньоклітинних розчинів навколо вибраної клітини була застосована система локальної аплікації. Швидкість зміни розчину складала 0.3 мл/хв. В робочому режимі збудження флуоресцентного зонду здійснюється при довжинах хвилі 360 (F1) та 380 (F2) нм за допомогою монохроматора. Реєстрація емісії зонда проводилась в діапазоні 510 нм за допомогою фотопомножувача. Сигнали з фотопомножувача подавали на вхід ЕРС-9, який в реальному масштабі часу розраховував відношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах R=F1/F2. Отримані експериментальні дані оцифровувались та зберігались на жорсткому диску комп'ютера для наступної обробки.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Ca2+ КАНАЛІВ
Біофізичні властивості Ca2+ каналів на прикладі NG108-15 клітин
Клітинна лінія нейробластомигліоми NG108-15 - це гібридна моноклональна клітинна лінія, штучно сформованої злиттям двох окремих ліній, нейробластоми миші і лінії щурячих клітин гліоми. Після диференціювання клітин за допомогою простагландіну E1, NG108-15 клітини показують електрофізіологічну і фармакологічну схожість до споріднених їм симпатичних нейронів. Завдяки цим властивостям, NG108-15 клітини можуть слугувати зручною модельною системою для дослідження властивостей іонних каналів і як могутній інструмент для експресії чужого генетичного матеріалу, щоб впливати на різні функції нейрону включаючи активність Ca2+ каналів. В цьому розділі ми виконали детальну кількісну оцінку компонентного складу і властивостей LVA і HVA Ca2+ каналів цих клітин, і вперше опиcали петч-клемп дослідження, що показали, що NG108-15 клітини експресують четвертий тип Ca2+ каналів - залишковий компонент, який дуже подібний до LVA струму активацією і кінетикою інактивації, проте, поріг його активації лежить ближче до компонентів HVA струму, і може належати до Q-типу каналів.
Підхід, який звичайно використовується для оцінки внеску компонентів струму – є вимірювання значення піку фармакологічно розділених Ca2+ струмів при потенціалах, що відповідають максимуму I-V кривої. Цей вид аналізу не оптимальний, тому що в багатоскладових струмах асиметрична форма I-V кривих для різних компонентів і відносних переміщень їх максимумів може давати реальні помилки в оцінці їх внеску. Ми, таким чином, оцінювали Ca2+ інтеграл I-V відношення (Ca ) який прямо пропорційний до значення амплітуди Ca2+ струму при даному потенціалі мембрани, і відображає загальну кількість Ca2+, який може входити в клітину під час ремп-деполяризації мембрани. Ми вираховували Ca як інтеграл густини струму, узятий уздовж I-V кривої :
(2)
де ICa є амплітуда Ca2+ струму, Cm - це ємність мембрани, Vo і Vt є початковим і кінцевим значеннями тестового потенціалу і V є потенціал мембрани.
Як можна бачити із Рис.2, що на відміну від недиференційованих клітин, Ca2+ вхід через Ca2+ канали (вирахований як Ca) в клітину під час деполяризації, збільшується близько в 13 разів в сферичних “диференційованих” і близько в 30 разів в клітинах з нейритами.
Підсумовуючи результати можна зазначити, що використовуючи інтеграл вольт-амперних залежностей, як нову оцінку складових компонентів Ca2+ струму в гібридних NG108-15 клітинах ми визначили істотні зміни в значеннях і композиції Ca2+ струмів під час клітинної диференціації (Рис.2). Тільки низькопорогові Ca2+ струми могли спостерігатися в недиференційованих клітинах; після диференціювання клітин з'являлися високопорогові Ca2+ струми і загальний Ca2+ струм збільшувався близько в 30 разів. Застосовуючи фармакологічні і біофізичні методи розділення струмів, ми визначили чотири головні типи Ca2+ каналів в диференційованих клітинах: приблизно 50%, 20%, 17% складали N-, T-, L-типи відповідно і 12% залишковий струм, який позбавлений чутливості до класичних блокаторів LVA і HVA струмів, за винятком CTxMVIIC (Рис.3). Ми встановили, що всі струмові компоненти показали кінетику і фармакологічні властивості, подібні до нейрональних клітин. Ми також встановили істотну Ca2+-залежність дії CTxGVIA для пригнічення N-типу Ca2+ каналів - 10mM Ca2+ в омиваючому розчині зменшував в три рази ефективність токсину до блоку N-каналів. Залишковий компонент, за своїми особливостями підходив до властивостей Ca2+ каналів Q-типу: він був чутливим до CTxMVIIC і був дуже подібним до Ca2+ каналів T-типу кінетикою, проте, поріг активації був ближчим до HVA компонентів (-40mV). Наші результати показують функціональну різноманітність Ca2+ каналів і вперше продемонстрували, що в NG108-15 клітинах експресується ймовірно Q-тип Ca2+ каналів 1A сім'ї, який має біофізичні і фармакологічні властивості, які відрізняються від таких описаних раніше для T-, L- і N-типів в цих клітинах.
Механізми регулювання поодиноких Ca2+ каналів фосфорилуванням
Високо порогові Ca2+ канали грають важливу роль в запуску і модуляціі в більшості метаболічних процесів в нервових клітинах і можуть бути суб”єктом істотного функціонального регулювання з боку широкого кругу різноманітних фізіологічних і фармакологічних агентів. Природні нейротрансмітори є одним з класів агентів, які впливають на активність Ca2+ каналу. В цьому відношенні 5-HT належить до філогенетичних найстаріших із них. Окремі публікації присвячені впливу 5-HT на активність Ca2+ каналу (Lukyanetz, 1991; Kostyuk et al., 1992; Kostyuk & Lukyanetz, 1993), які показали, що 5-HT здатний збільшувати Ca2+ провідність мембрани в нейронах. Наші попередні дані, отримані на педальних мотонейронах слимака Helix pomatia , показали, що 5-HT істотно збільшує амплітуду Ca2+ струму, (ICa) в цих нейронах, тоді як інша більшість нейронів має іншу чутливість (Lukyanetz, 1991; Kostyuk et al., 1992b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993). Попередній аналіз механізму стимулюючоі дії 5-HT на Ca2+ канали педальних нейронів показав залучення cAMP-залежного фосфорилування в цей процес (Kostyuk et al., 1992a;). Проте, молекулярні механізми змін активності поодиноких Ca2+ каналів під час їх фосфорилування до сих пір не ясні. В цьому розділі, ми прагнули проаналізувати ці механізми на рівні функціювання поодиноких Ca2+ каналів під час їх 5-HT-індукованої та опосередкованої сАМР-залежним фосфорилуванням регуляціі в ідентифікованих педальних нейронах, використовуючи їх як модель.
Підсумовуючи цілослідження можна констатувати, що вивчаючи дію серотоніну (5-HT) на активність поодиноких Ca2+ каналів в ідентифікованих нейронах слимака pomatia Неlіх, ми встановили, що тільки один тип Ca2+ каналів із провідністю поодинокого каналу 5pS був визначений в умовах фіксаціїї мембранного потенціалу в конфігурації cell-atached (Рис.4). Кінетичний аналіз показав монотонно спадаюче розподілення часу відкритого стану каналу (OT) з середніми значеннями константи часу 0.2ms. Розподілення часу закритого (CT) каналу описувалось двох-експоненціальною кривою з константами часу 1 і 12ms. Ми встановили, що серотонін 5-HT діє на активність Ca2+ каналу не прямо, а через цитоплазматичні посередники. Ми встановили, що 5-HT подовжував відкритий стан каналу OT (до 0.3ms) і скорочував закритий стан каналу CT пропорційно для обох констант до 0.4 і 6 ms відповідно. Ми зробили висновок, що збільшення Ca2+ макроструму сАМР-залежним фосфорилуванням, визначається змінами кінетики, зростанням числа активних каналів і зростанням вірогідності знаходження каналів у OT. В той же час, 5-HT не впливав на провідність поодинокого каналу .
Роль дефосфорилування в регуляції активності Ca2+ каналів
Кальцинейрин або протеїнфосфатаза 2B (PP2B) є винятковою серед інших протеїнфосфатаз завдяки її високій Ca2+- і кальмодулінній-залежності (Klee & Nirenberg, 1974; Kincaid, 1993). Очевидно, що PP2B відіграє важливу роль у функціонуванні нервових клітин, оскільки вона широко розповсюджена саме в нервовій системі (Usuda et al., 1996). Одна з функцій PP2B може полягати в її участі у внутрішньоклітинній Ca2+ сигналізаціі, і потенціалозалежні Ca2+-канали, можуть бути її мішенню (Armstrong, 1989a; Kostyuk & Lukyanetz, 1993a). Тому було дуже важливо, виявити активність PP2B в нервових клітинах, таких як DRG нейрони і встановити можливу колокалізацію PP2B і Ca2+ каналів в цих клітинах. Для цього ми використовували специфічні антитіла до РР2В (anti-PP2B).
Підсумовуючи ці дослідження можна заключити, що ми детально проаналізували локалізацію кальцинейрину в нейрональних елементах за допомогою використання конфокальної мікроскопії і імуноцитохімічних підходів для вимірювання експресії РР2В в культивованих щурячих нейронах спинних корінців дорзальних гангліїв. Ми встановили, що що імунореактивність кальцинейрину надзвичайно виражена в DRG нейронах і що він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної мембрани (Рис.5). Імунопокрашення цих клітин антитілами anti- субодиниці потенціал-керованих Ca2+ каналів показало, що розподілення -субодиниці Ca2+ каналу і кальцинейрину дуже подібні (Рис.5). Отримані нами дані підтримують припущення, що функція кальцинейрину може бути безпосередньо пов’язана з активністю потенціалокерованих Ca2+ каналів.
Активність Ca2+ каналів в клітинах що оверекспресують РР2В
Ріст цитоплазматичної концентрації Ca2+ ([Ca2+]i ) являється одним із факторів, що запускає та сприяє процесу спаду (run-down) високо-порогових Ca2+ струмів, який спостерігається в петч-клемп дослідженнях. Проте, мало відомо про точний механізм дії Ca2+ на цей процес. Електрофізіологічні дослідження вже повідомляли, що один з шляхів, яким потенціалокеровані Ca2+ канали пригнічуються (down-регулюються) може відбуватися шляхом дефосфорилювання Ca2+ каналів. Декілька протеїн фосфатаз можуть бути задіяні в цей процес. Так, участь Ca2+/кальмодулін залежної фосфатази-2B (Chad & Eckert, 1986; Armstrong, 1989b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993) та протеїн фосфатази типу 1 і 2A в down-регуляції Ca2+ були показані. Серед серін-треонінових фосфатаз, тільки PP2B є Ca2+-активованим ферментом і
таким чином, може виключно відповідати
за Ca2+-залежний компонент канального дефосфорилювання. Як було показано вище, після диференціації, NG108-15 клітини проявляють електрофізіологічні властивості дуже подібні до таких у симпатичних нейронів. Головна перевага цієї клітинної лініі - це ії здатність до гетерогенної експресії чужеродного генетичного матеріалу. Тому ми використовували NG108-15 клітини для оверекспресії в них PP2B і тестували результати змін в активності різних типів Ca2+ каналів представлених у цих клітинах.
Підсумовуючи результати цих досліджень можна зазначити, що в наших експериментах експресія PP2B в NG108-15 клітинах була змінена трансфекцією за допомогою конструкції плазмід, які містили повну довжину cDNA людської PP2B3 в сенс (CN15) та антисенс (CN21) оріентаціях (Рис.6). Конфокальна іммуноцітохімічна локалізація анти-РР2В показала, що в нативному типі клітин, PP2B іммунореактивність однорідно розподілена в не диференційованих клітинах і розміщується на внутрішній поверхні мембрани і нейрітах в диференційованих клітинах (Рис.7). Щоб тестувати Ca2+-залежність Ca2+ каналів, ми використовували високо-частотну стимуляцію (HFS) клітин, і встановили, що амплітуда L-типу і N-типу Ca2+ струмів зменшувалась на 37% і 52% відповідно, тоді як T-тип був тільки незначно чутливий до цієї процедури (Рис.9). FK-506 (2M), специфічний блокатор PP2B, зменшував пригнічення L- і N- типів Ca2+ каналів індуковане HFS на 30% і 33% відповідно. В трансфектних CN-15 клітинах
