НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Москалюк Анастасія Олександрівна

УДК 577.353.5:612.822

Електрична активність та постсинаптичні струми нейронів культури гіпокампу

03.00.02 – біофізика

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Міжнародному Центрі Молекулярної фізіології та Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор,

чл.-кор. НАН України

Веселовський Микола Сергійович

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідувач відділом фізіології нейронних мереж

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України,

Магура Ігор Сильвестрович

Фізико-технічний Навчально-науковий центр
НАН України,

професор кафедри молекулярної фізіології і біофізики

кандидат біологічних наук,

Любанова Ольга Петрівна

Міжнародний центр молекулярної фізіології
НАН України

науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України.

Захист відбудеться "6" грудня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

Автореферат розісланий листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Однією із властивостей нервових клітин, що забезпечує їхню здатність до передачі інформації, є електрична збудливість. Велика увага в сучасній біофізиці синаптичної передачі приділяється вивченню механізмів електрозбудливості нервової клітини, оскільки імпульсна електрична активність нейронів є тим ініціюючим фактором, який призводить до вивільнення нейромедіатора з синаптичних терміналей і забезпечує, таким чином, синаптичну передачу, яка лежить в основі процесів обробки інформації в нервовій системі. Постсинаптичні струми, які при цьому виникають, змінюють поляризацію мембрани постсинаптичної клітини і, як наслідок, зумовлюють або генерацію та подальше поширення нервового імпульсу, або блокування його проведення. Сумація вхідних збуджуючих і гальмівних сигналів визначає численні функціональні особливості нейрона, в тому числі його інтегративні властивості.

Згідно з сучасними уявленнями гальмівні ГАМК-ергічні інтернейрони є ключовою ланкою у формуванні специфічних для гіпокампу ритмів електричної активності і виконують функцію синхронізації роботи величезної мережі пірамідних нейронів. Показано, що інтернейрони ЦНС здатні генерувати серії потенціалів дії (ПД) у відповідь на тривале (0,5 - 1 с) прикладання деполяризуючого струму. На основі характеристик таких серій ПД інтернейрони поділяють на такі, яким притаманна високочастотна генерація ПД; такі, які генерують викликані ПД ритмічно з низькою частотою, і такі, які демонструють пачечну активність (Erіsіr et al., 1999). Одним із основних факторів, який зумовлює відмінності в параметрах генерації серій ПД, є наявність у цих нейронах різних комбінацій потенціалзалежних K+-каналів (Martіna et al., 1998;Erіsіr et al., 1999).

У більшості робіт з дослідження імпульсної електричної активності гальмівних ГАМК-ергічних інтернейронів увага приділяється вивченню характеристик високочастотних серій ПД. Останні літературні дані дозволяють вважати, що серед гальмівних інтернейронів гіпокампу існують клітини, що здатні генерувати серії ПД з низькою частотою. Опубліковані роботи, однак, не торкаються питання про те, наявністю яких саме типів потенціалзалежних калієвих каналів визначається генерація гальмівними ГАМК-ергічними інтернейронами серій ПД з низькою частотою. Так само невідомо, канали яких типів зумовлюють відмінності в характеристиках генерації ПД між збуджуючими та гальмівними нейронами.

Тому особливий інтерес представляє порівняння імпульсної електричної активності гальмівних і збуджуючих нейронів. Також існує ще багато питань про особливості синаптичної передачі нейронів, які проявляють різні типи електричної активності.

Усе вищезгадане і визначило необхідність дослідження характеристик імпульсної електричної активності та властивостей викликаних постсинаптичних струмів гальмівних і збуджуючих нейронів у комплексі з перевіркою наявності в їхніх мембранах певних типів потенціалзалежних калієвих каналів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках наукових програм Відділу Фізіології Нейронних Мереж Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця “Зміни калієвої провідності в довгостроково культивованих нейронах гіпокампу”, а також наукових тем Міжнародного Центру Молекулярної фізіології НАН України: “Дослідження механізмів гальмівної синаптичної передачі нейронів центральної нервової системи” і “Роль потенціалкерованих калієвих каналів у викиді ГАМК у центральних нейронах”.

Мета дослідження. Метою роботи було визначення параметрів потенціалів дії та викликаних ними постсинаптичних струмів в синаптично зв’язаних парах нейронів культури гіпокампу щура.

Завдання дослідження.

1. Порівняти характеристики серій ПД, що генеруються з високою та низькою частотою гальмівними інтернейронами; серій ПД, що генеруються з низькою частотою збуджуючими і гальмівними нейронами.

2. З’ясувати, який модулюючий білок (соматостатин чи парвальбумін) містять досліджувані нейрони.

3. Визначити, чи співвідноситься здатність клітини генерувати ПД з низькою частотою з наявністю в них одного певного або кількох різних типів потенціалзалежних калієвих каналів.

4. Дослідити в умовах культивування взаємозв’язок між типом пресинаптичного нейрона та характеристиками постсинаптичних струмів, які він викликає.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше на первинній культурі дисоційованих нейронів гіпокампу було показано присутність двох груп ГАМК-ергічних нейронів, які відрізняються за типом імпульсної електричної активності. Використання культури з низькою щільністю нейронів дозволило розглянути взаємодію окремих пар синаптично зв’язаних нейронів і виявити зв’язок кінетичних параметрів постсинаптичних струмів і специфічних (імуноцитохімічних і морфологічних) властивостей пресинаптичних нейронів. У дисертаційній роботі було показано, що параметри серій ПД з низькою частотою відрізняються у гальмівних і збуджуючих нейронів, ці клітини експресують різні комбінації потенціалзалежних калієвих каналів, які забезпечують здатність нейрона генерувати серії ПД з низькою частотою.

Отримані експериментальні дані істотно доповнюють сучасні уявлення про механізми електрозбудливості, що відповідають за здатність нервових клітин генерувати потенціали дії з високою або низькою частотою.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати представляють, насамперед, фундаментальний інтерес, оскільки отримано нові дані щодо експресії калієвих каналів в нейронах культури гіпокампу. Робота показала, що в умовах культивування пресинаптична клітина не тільки безпосередньо викликає постсинаптичний струм і визначає амплітуду цього струму в постсинаптичному нейроні, але й істотно впливає на його кінетику. Крім того, в даній роботі було об’єднано новітні електрофізіологічні методи, математичний апарат і імуноцитохімічні дослідження, що дозволило глибше проаналізувати і зрозуміти відмінності механізмів генерації серій ПД гальмівними і збуджуючими нейронами в гіпокампі.

Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Робота з отримання первинної культури нейронів гіпокампу щура низької щільності, налагодження електрофізіологічної установки і системи локальної аплікації, отримання та обробки експериментальних даних, створення програми для розрахунку кінетичних параметрів потенціалів дії, аналізу і узагальнення результатів досліджень зроблена особисто автором.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на поточних наукових семінарах Відділу Загальної Фізіології Нервової Системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, конференціях “Pharmacology of synaptic transmission in nervous system” (2002, Kиїв, Україна), “First Ukrainian Congress for Cell Biology” (2004, Львів, Україна), IBRO Advanced School Of Neuroscience (2004, Ялта, Україна), International Workshop in Cell Physiology “Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps”, (2004, Санкт-Петербург, Росія), Joint International Meeting of The Physiological Society and FEPS (2005, Брістоль, Великобританія).

Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових фахових журналах та тезах 5 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 193 найменувань. Роботу викладено на 134 сторінках та ілюстровано 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження типів електричної активності, наявності певних типів потенціалзалежних калієвих каналів, властивостей викликаних постсинаптичних струмів, сформульовано мету та задачі дослідження, наведено відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ Огляд літератури присвячений висвітленню основних понять мембранної теорії збудження; опису складу, типів, функцій потенціалзалежних калієвих каналів; складу та властивостей ГАМК- та глутаматних рецепторів.

Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано використані матеріали та методи досліджень, а саме:

1. Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу щура низької щільності і культури нейронів зубчастої борозни гіпокампу щура.

2. Метод внутрішньоклітинної фіксації потенціалу на постсинаптичному нейроні в конфігурації “ціла клітина”.

3. Методика парної реєстрації електричних сигналів від синаптично зв’язаних нейронів.

4. Метод локальної позаклітинної перфузії для аплікації блокаторів гальмівної та збуджуючої синаптичної передачі і селективних блокаторів калієвих каналів.

5. Метод імуноцитохімічного аналізу.

6. Математичні методи обробки даних і результатів.

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу. Новонароджених щурів лінії Вістар декапітували, гіпокамп (при культивуванні гранулярних клітин зубчастої борозни гіпокамп поперечно розрізали на частини 0,5 мм завтовшки і з кожної виділяли лише область зубчастої борозни) виділявся та оброблювався 0,025% розчином трипсину (Sigma, США) на протязі 6 хвилин при температурі 23?C. Після механічної дисоціації клітини висівалися на вкриті полі-L-орнітином та ламініном (Sigma, США) чашки Петрі з щільністю 30 тис. од. на 1 см2. Клітини культивувалися у середовищі, що складалося з середовища MEM, 10% кінської сироватки, 2,3 г/л NaHCO3, 6 мг/мл інсуліну, пеніциліну та стрептоміцину. Для припинення проліферації гліальних клітин на третій день культивування до культурального середовища додавали 5 мкмоль/л цитозин-A-D-арабіно-фуранозиду (Sigma, США) на 24 години.

Об’єкт досліджень. Електрофізіологічні властивості гальмівних ГАМК-ергічних інтернейронів вивчалися на синаптично зв’язаних нейронах культури гіпокампу щурів. Пресинаптичний нейрон відбирався візуально; його ГАМК-ергічність визначалася за наявністю на постсинаптичній клітині викликаних моносинаптичних струмів (за умови присутності в зовнішньоклітинному розчині блокаторів збуджуючої нейропередачі DL-AP5, 20 мкмоль/л і DNQX, 20 мкмоль/л) при стимуляції пресинаптичної клітини. Електрофізіологічні властивості збуджуючих (глутаматергічних) нейронів вивчалися на синаптично зв’язаних парах “гранулярна клітина - постсинаптичний нейрон”. В умовах культури гранулярні клітини ідентифікувалися на основі їхніх морфологічних і електрофізіологічних властивостей. Вивчення збуджуючих постсинаптичних струмів проходило за наявності в зовнішньоклітинному розчині блокатору ГАМКА-рецепторів (бікукуліну метобромід, 10 мкмоль/л).

Електрофізіологія. Електрофізіологічні експерименти проводились на синаптично зв’язаних нейронах культури гіпокампу щурів; здійснювалась одночасна реєстрація від двох клітин в конфігурації “ціла клітина”. Таким чином, ПД відводилися від пресинаптичної клітини в режимі фіксації струму, а викликані струми - від постсинаптичної, в режимі фіксації потенціалу при підтримуваному потенціалі -75 мВ. Для експериментів відбирались клітини, які знаходились в умовах культивування від 14 до 28 днів.

В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного складу (ммоль/л): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза 30. Піпеточний розчин містив (ммоль/л): К-глюконат 100, KCl 50, EGTA 10, MgCl2 5, HEPES 20. Заповнені розчином, піпетки мали опір 8-10 МОм. Експериментальна установка була зібрана на базі інвертованого мікроскопу Axiovert 25 (Carl Zeiss, ФРН), який при використанні фазовоконтрастного об’єктиву забезпечував 320-кратне оптичне збільшення. В експериментах використовувались 2 підсилювача електричних сигналів EPC8 (HEKA, ФРН). Сигнали відцифровувались та записувались за допомогою АЦП Digidata 1322A та програмного пакету pClamp 9.0 (Axon Instruments, США) з частотою дискретизації 50 кГц.

Аплікація блокаторів здійснювалась за методикою швидкої локальної суперфузії (Veselovsky et al., 1996).

Імуноцитохімічний аналіз. Після електрофізіологічних експериментів на вибраних збуджуючих і гальмівних нейронах проводився імуноцитохімічний аналіз для вивчення локалізації на їхніх мембранах потенціалзалежних калієвих каналів Kv1.2, Kv3.1, Kv4.2 типів, а також для визначення наявності модулюючих білків - соматостатину і парвальбуміну.

Скло з нейронами промивали розчином фосфатного буферу (phosphate buffer salіne, PBS), потім клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 30 хвилин при температурі 20-23?С, після чого витримували у PBS, що містив 0,37% гліцину і 0,27% хлориду амонію. Після кількох промивань PBS у клітин збільшували проникність мембран, використовуючи 0,1% розчин Trіton X-100 у PBS протягом 15 хвилин, а потім інкубували протягом 60 хвилин у блокуючому розчині PBS, що містив 2% бичачих сироваткових альбумінів (BSA) та 2% телячої сироватки. Знову промивали препарат PBS та розчином PBS з 1% BSA. Після цих процедур клітини інкубували протягом 16 годин при температурі 4С у розчині з первинними антитілами, розведеними в PBS з 1% BSA. Використані первинні антитіла були поліклональними афінно-очищеними кролячими імуноглобулінами, специфічними до соматостатину і парвальбуміну (1:500), поліклональними цапиними імуноглобулінами проти Kv1.2, Kv3.1, Kv4.2 (1:500; Santa Cruz Bіotechnology, США).

Після інкубації з первинними антитілами клітини промивалися розчином 1% BSA у PBS, а потім витримувались із вторинними антитілами протягом 60 хвилин (при кімнатній температурі, в темряві). Використані вторинні антитіла були кон’юговані з флуоресцентними мітками, які мають максимуми спектрів випромінювання на довжинах хвиль 519 і 573 нм при максимумах поглинання на довжинах хвиль 495 і 556 нм відповідно (Fluorescent Alexa Fluor 488 donkey antі- rabbіt Іg, Fluorescent Alexa Fluor 488 і Fluor 546 donkey antі-goat Іg; 1:1000, Molecular probes, США). Після цього клітини промивалися наступними розчинами: 1% BSA у PBS, чистим PBS, дистильованою водою. Препарат (покривне скло з клітинами) розташовували на предметному склі й вміщували в краплю специфічного середовища, що не перешкоджає флуоресцентному світінню (Daco, Великобританія).

Для того, щоб перевірити специфічність зв’язування антитіл (як первинних, так і вторинних), було проведено контрольні експерименти за відсутності первинних антитіл або з використанням преінкубації з відповідним блокуючим пептидом (Passmore et al., 2003).

Аналіз даних. Кінетичні параметри викликаних постсинаптичних струмів визначались за допомогою програмного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США), кінетичні параметри ПД розраховувались програмою Spike, створеною в середовищі Mathlab 6.0 (MathWorks, США) автором. Для кластеризації даних за внутрішньогруповими середніми використовувався алгоритм k-середніх
(Spath, 1985).

Поріг виникнення ПД визначали як потенціал у момент часу, в який друга похідна зміни потенціалу досягала потроєного значення середньоквадратичного відхилення в момент, що передував виникненню ПД. Амплітуда ПД визначалася як різниця між максимумом цього потенціалу і згаданим значенням порога ПД. Амплітуда постактиваційної гіперполяризації вимірювалась як різниця між пороговим значенням потенціалу і максимальним негативним відхиленням слідового потенціалу. Тривалість ПД вимірювалася на половинному значенні його амплітуди. Максимальні швидкості деполяризації та реполяризації знаходились відповідно як максимум і мінімум першої похідної від зміни потенціалу. Миттєва частота генерації ПД вимірювалась як обернене значення міжімпульсного інтервалу. Максимальна стаціонарна частота генерації ПД знаходилась як результат усереднення миттєвих частот генерації ПД протягом останніх 100 мс прикладання стимулу. Ця частота досягалася при такому значенні стимулу, коли подальше підвищення його амплітуди приводило до втрати клітиною здатності безупинно генерувати ПД протягом 500-мілісекундного подразнення. За цією “максимальною” серією ПД розраховували також характеристику адаптації протягом 200 мс, A200, як відношення різниці миттєвих частот на початку стимулу і через 200 мс до частоти на початку стимулу.

Результати представлені в тексті як середнє значення ± похибка середнього.

У розділі Результати викладено результати досліджень гальмівних ГАМК-ергічних інтернейронів, для яких характерна або високочастотна генерація серій ПД (fast-spіkіng, частота генерації ПД більше 50-70 Гц), або ритмічна генерація ПД з низькою частотою (regular spіkіng, частота генерації ПД близько 25-35 Гц) (Erіsіr et al., 1999), а також збуджуючих нейронів, які генерують ПД низькочастотно. Особливу увагу було приділено вивченню морфологічних властивостей нервових клітин, їхньої електричної активності, експресії модулюючих білків та потенціалкерованих калієвих каналів, а також дослідженню кінетики постсинаптичних струмів, викликаних різними
типами ПД.

Два типи інтернейронів. При дослідженні електрофізіологічних властивостей 49 ГАМК-ергічних інтернейронів було розглянуто розподіл такого характеристичного параметру серії ПД, як максимальна стаціонарна частота генерації ПД. Виявилось, що цей розподіл істотно відрізняється від нормального (тест Шапіро-Уілка, Р<0,001). Це дозволило висунути припущення про наявність у культурі різних типів ГАМК-ергічних нейронів.

Відокремлення різних типів клітин проводилося за трьома параметрами: тривалість ПД, максимальна стаціонарна частота генерації ПД, максимальна швидкість реполяризації. Дані були розділені на групи з використанням алгоритму k-середніх (Spath, 1985), за допомогою якого кожному елементові множини ставиться у відповідність приналежність до кластерів. Елементи кожного кластеру повинні бути настільки близько розташовані один від одного, наскільки це можливо, в той час як самі кластери повинні бути якомога більш віддаленими один від одного.

За результатами кластеризації було виділено дві групи клітин (): одна із порівняно низькою частотою генерації ПД, великою тривалістю ПД і маленькою максимальною швидкістю реполяризації, друга - з малою тривалістю ПД, високою частотою генерації ПД та порівняно великою максимальною швидкістю реполяризації.

Таким чином, ці групи клітин можна класифікувати за загальною термінологією як клітини, що генерують ПД ритмічно з низькою частотою (35 клітин), і такі, що генерують ПД високочастотно (14 клітин).

Рис. Результати кластеризації: елементи першого кластеру позначені , елементи другого -, центри кластерів - .

Центри кластерів мають координати | Стаціонарна частота генерації ПД, Гц | 51,83 | 22,35 | Тривалість 1го ПД, мс | 1,05 | 1,93

Максимальна швидкість реполяризації 1го ПД, мВ/мс | -80,26 | -50,22 |

Інтернейрони, що здатні до високочастотної генерації ПД. Нейрони, які були здатні генерувати високочастотні серії ПД, відрізнялися за морфологічними ознаками від нейронів, що генерували серії ПД з низькою частотою. Для обраних нейронів вимірювали середній розмір клітини (під середнім розміром клітини мається на увазі середнє арифметичне значення великого і малого діаметрів соми) і підраховували кількість відростків. Так, середній розмір соми складав 34,230,62 мкм, середня кількість відростків - 5,170,40. Середній потенціал спокою дорівнював -51,851,69 мВ, середній вхідний опір - 117,178,90 MОм. Електрофізіологічні параметри ПД наведені у Таблиці 1.

Для того, щоб визначити, чи задіяні Kv3 канали в регуляції досліджуваного типу імпульсної електричної активності нейронів, було здійснено прикладання 4-амінопіридину (4-АП) за методикою швидкої локальної суперфузії. Вважається, що саме наявність Kv3.1/Kv3.2 каналів зумовлює здатність нейрона до високочастотної генерації ПД. А 4-АП селективно блокує швидкі калієві канали затриманого випрямлення, істотно зменшуючи частоту генерації ПД.

Аплікація 4-амінопіридину у концентрації 400 мкмоль/л приводила до достовірних зворотних змін кінетичних характеристик і частоти ПД при максимальному стимулі (n=3). Так, 4-амінопіридин збільшував тривалість ПД (для першого ПД у серії - з 1,38±0,14 до 1,60± 0,18 мс, для останнього - з 2,63±0,40 до 4,10±0,54 мс), зменшував миттєву частоту генерації ПД (для першого ПД у серії - з 64,23±2,97 до 49,53±3,77 Гц, для останнього - з 55,32±5,40 до 42,33±5,12 Гц), зменшував максимальну швидкість реполяризації (для першого ПД у серії - з -64,49±4,55 до -54,12±3,19 мВ/мс, для останнього - з -29,91±5,48 до -9,77±4,41 мВ/мс), зменшував максимальну швидкість деполяризації (для першого ПД у серії - з 163,37± 12,55 до 129,60±9,75 мВ/мс, для останнього - з 27,06±10,71 до 7,94±3,76 мВ/мс).

Оскільки при дії 4-амінопіридину в концентрації, що блокує Kv3.1 і Kv3.2 типи каналів, збільшувалась тривалість одиничного ПД, а частота генерації серії ПД значно зменшувалась, було зроблено висновок про те, що у культивованих нейронах механізм генерації ПД із високою частотою, імовірно, опосередковується зазначеними типами калієвих каналів.

Нейрони, віднесені за результатами електрофізіологічних експериментів до таких, які генерують ПД високочастотно, були імуноцитохімічно пофарбовані з метою одержання додаткових даних про розташування різних типів калієвих каналів в їхніх мембранах та про наявність певних внутрішньоклітинних білків.

Такі нейрони демонстрували високий рівень імунореактивності до парвальбумін-специфічного типу антитіл - флуоресцентні мітки чітко визначалися як на нейронних сомах, так і на всіх відростках (n=4). Одночасно вони забарвлювалися й антитілами, специфічними до -субодиниці Kv3.1 типу калієвих каналів з досить високою інтенсивністю - імунні мітки було виявлено в усіх досліджених клітинах (n=5), вони чітко спостерігались як на тілах нейронів, так і на відростках ().

Таким чином, імуноцитохімічні дослідження показали, що нейрони, ідентифіковані за результатами попередніх експериментів як такі, що генерують ПД високочастотно, демонструють високу парвальбумін-імунореактивність і експресують Kv3.1 калієві канали з високою щільністю, що добре узгоджується з електрофізіологічними експериментами, проведеними на цих самих клітинах.

Рис. Мікрофотографія досліджуваних нейронів. А - клітини перед початком електрофізіологічного експерименту, (світловий мікроскоп, фазовий контраст). Б - нейрони, пофарбовані антитілами, специфічними до Kv3.1 калієвих каналів (флуоресценція).

При прикладанні деполяризуючого струму до пресинаптичного нейрону в ньому виникали ПД, а в постсинаптичній клітині реєструвались відповідні викликані гальмівні постсинаптичні струми (вГПСС) ().

Рис. Викликані зміни потенціалів на мембрані пресинаптичної клітини (зверху) і відповідні постсинаптичні струми (знизу). Незначна зміна потенціалу на пресинаптичній клітині не викликає появи ПД. і, відповідно, вГПСС (А). Подальше збільшення потенціалу приводить спочатку до виникнення поодиноких ПД (Б), а при досягненні певного рівня - до високочастотної серії ПД і викликаних постсинаптичних відповідей (В).

Час наростання (часовий інтервал від 10% до 90% пікової амплітуди) викликаних ГПСС варіював в діапазоні від 1,53 до 5,66 мс. Середнє значення цього параметра складало 2,770,39 мс (n=11). Спади всіх викликаних ГПСС добре апроксимувалися за допомогою одноекспоненційного рівняння. Середнє значення постійних часу спаду дорівнювало 26,881,96 мс (n=11). Синаптична затримка (час від початку стимулу до початку ГПСС) не перевищувала 3,41 мс, середнє значення цього параметра становило 2,490,15 мс (n=11).

Потенціал реверсії вГПСС був близький до рівноважного потенціалу для іонів хлору (-23,25 мВ), розрахованого за рівнянням Нернста для розчинів, які використовувались в експериментах. Середнє значення цього параметра дорівнювало -24,823,88 мВ. Вольт-амперна характеристика викликаних ГПСС в діапазоні змін підтримуваного потенціалу від -80 до +30 мВ була практично лінійною (див. )

Рис. Залежність амплітуд викликаних гальмівних постсинаптичних струмів в нейроні від величини підтримуваного потенціалу на мембрані. А – приклади запису викликаних постсинаптичних струмів, Б - вольт-амперна залежність постсинаптичних струмів, що реєструвалися при значеннях підтримуваного потенціалу від -80 до +30 мВ із кроком у 5 мВ.

Інтернейрони з серіями ПД із низькою частотою. Електрофізіологічні експерименти було проведено на 35 гальмівних інтернейронах, які були здатні генерувати ритмічні серії ПД з низькою частотою. Середній потенціал спокою дорівнював -50,940,75 мВ, середній вхідний опір - 319,1627,28 MОм. У клітин було виміряно середній розмір соми і підраховано кількість відростків. Було відмічено, що серед даних нейронів існує залежність між розміром клітини і кількістю відростків. Коефіцієнт кореляції для такої залежності дорівнював 0,80. Ґрунтуючись на існуванні даного лінійного зв’язку і використовуючи алгоритм кластеризації (Spath, 1985), клітини було розділено на дві групи. У першу групу ввійшли клітини із середнім розміром соми
27,9 мкм і 5,1 відростками (n=20), у другу - із середнім розміром соми 17,3 мкм і 3,3 відростками (n =15). Відмінності характеристик ПД між групами не досягали рівня статистичної значимості. Електрофізіологічні параметри ПД наведено у таблиці 1.

Гальмівні інтернейрони, що у електрофізіологічних експериментах були визначені як такі, що генерують серії ПД з низькою частотою, вибірково піддавалися імуноцитохімічному фарбуванню.

З огляду на нестачу літературних даних з питання про наявність модулюючих білків у гальмівних інтернейронах, здатних генерувати ПД з низькою частотою, були проведені імуноцитохімічні фарбування. При цьому використовувались антитіла, специфічні до парвальбуміну (PV) та соматостатину (SS). Жоден нейрон (n=6), як з більшим, так і з меншим розміром соми, не продемонстрував імунореактивності до PV-специфічних антитіл. На препаратах, мічених антитілами до SS, високий рівень імунореактивності демонстрували лише клітини, що мали більший розмір соми (у середньому 27,9 мкм) (n=7). Флуоресцентні мітки чітко визначалися як на їхніх сомах, так і на всіх найближчих відростках. На нейронах, що мали діаметр соми в середньому 17,3 мкм, соматостатинові мітки виявлено не було.

В процесі дослідження наявності калієвих каналів Kv1.2, Kv3.1 і Kv4.2 типів на соматичних мембранах та їхнього розташування на відростках досліджуваних нейронів було встановлено, що гальмівні інтернейрони обох підтипів забарвлювались антитілами, специфічними по відношенню до калієвих каналів Kv1.2 типу. Імунні мітки розташовувалися на сомах і безпосередньо прилеглих до них відростках. На дистальних відростках мітки не виявлялися. Kv3.1- і Kv4.2-специфічного фарбування на досліджуваних нейронах виявлено не було.

Таким чином, імуноцитохімічні дослідження показали, що гальмівні ГАМК-ергічні нейрони, ідентифіковані в електрофізіологічних експериментах як такі, що регулярно генерують ПД з низькою частотою, були імунопозитивними до соматостатину в залежності від морфологічних властивостей та експресували калієві канали Kv1.2 типу.

Викликані постсинаптичні струми відводилися від клітини, з якою був синаптично з’єднаний гальмівний інтернейрон, здатний генерувати серії ПД з низькою частотою ().

Рис. Приклад реєстрації регулярної серії ПД з низькою частотою, яку генерує пресинаптичний інтернейрон у відповідь на стимуляцію поштовхом струму (А) та гальмівних постсинаптичних відповідей при підтримуваному потенціалі -75 мВ (Б).

Викликані ГПСС різнилися за значеннями часу наростання, постійних часу спаду , часу від початку стимулу до початку виникнення викликаного ГПСС, потенціалу реверсії струму. За перерахованими параметрам клітини було розділено на дві групи.

Перша група клітин характеризувалася () середніми значеннями часу наростання 2,39±0,18 мс, постійних часу спаду 22,33±2,12 мс, часу від початку стимулу до початку виникнення ГПСС 3,46±0,12 мс, потенціалу реверсії струму -22,13±1,05 мВ (n=20).

Друга група клітин мала середні значення часу наростання 4,65±0,58 мс, постійних часу спаду 30,37±1,55 мс, часу від початку стимулу до початку виникнення ГПСС 4,62±0,25мс, потенціалу реверсії струму -40,05±1,74 мВ (n=15) (див. ).

Рис. Діаграми середніх значень кінетичних характеристик струмів у двох групах постсинаптичних клітин: часу наростання (А), постійних часу спаду (Б), часу від початку стимулу до початку виникнення ГПСС (В).

Відмінності середніх значень часів наростання, постійних часу спаду , часів від початку стимулу до початку виникнення викликаного ГПСС
(Рис. 6), а також потенціалів реверсії струму (Рис. 7, А) між двома групами виявились статистично достовірними. Для порівняння середніх значень використовувався критерій Ст’юдента (рівень значимості P<0,05). Достовірних відмінностей між амплітудами швидких і повільних вГПСС зареєстровано не було.

Спад як швидких, так і повільних вГПСС добре апроксимувався за допомогою одноекспоненційного рівняння (, Б).

Рис. А - Приклади вольт-амперних залежностей викликаних ГПСС для постсинаптичних клітин двох типів - із швидкою (1) та повільною (2) кінетиками вГПСС. Б - Приклад апроксимації за допомогою одноекспоненційного рівняння спадів швидких (1) та повільних (2) гальмівних постсинаптичних струмів.

Обидва типи постсинаптичних струмів були високочутливими до бікукуліну - селективного блокатору ГАМКА рецепторів.

Оскільки істотної кореляції кінетичних параметрів вГПСС з іншими характеристиками постсинаптичного нейрона (розмір соми, кількість відростків, вхідний опір, відстань між пре- і постсинаптичними клітинами) не відзначалось, ми припустили, що виявлені відмінності між швидкими та повільними струмами можуть бути зумовлені особливостями пресинаптичних клітин. Оскільки пресинаптичні клітини вже було розділено на дві групи відповідно до їхніх морфологічних характеристик, а постсинаптичні клітини - за кінетичними характеристиками вГПСС, то, використовуючи алгоритм k-середніх (Spath, 1985), ми виявили групування досліджених пар нейронів за трьома параметрами: 1) розмір соми пресинаптичної клітини, 2) кількість відростків у цієї клітини, 3) потенціал реверсії вГПСС в постсинаптичній клітині. Центри отриманих кластерів були достатньо віддалені один від одного, а елементи кожного кластеру розташовувалися між собою досить близько. Центри кластерів мали такі значення: для першої групи клітин - розмір соми 24,3 мкм, потенціал реверсії -22,0 мВ, кількість відростків 4,5 для другої групи - 16,8 мкм, -40,6 мВ, 3,1 відповідно.

Такий поділ синаптично зв’язаних пар добре узгоджується з поділами на групи тільки пресинаптичних або тільки постсинаптичних клітин. Таким чином, напрошується природний висновок про наявність істотного впливу пресинаптичного нейрона на кінетику постсинаптичного струму. Для того, щоб підтвердити чи спростувати це припущення, ми розрахували матриці парних коефіцієнтів кореляції R вектора, рядки якого складаються з результатів спостережень (розмір соми, кількість відростків, потенціал реверсії) і рівнів значимості P, використаних при перевірці гіпотези про відсутність кореляції. |

1,0 | 0,8 | 0,5 | 1,000 | 0,000 | 0,009 | R(i,j)= | 0,8 | 1,0 | 0,6 | P(i,j)= | 0,000 | 1,000 | 0,002 | 0,5 | 0,6 | 1,0 | 0,009 | 0,002 | 1,000 | Кожне значення Р тут є значенням імовірності одержати більшу величину коефіцієнту кореляції, ніж її розраховане вибіркове значення під дією випадкових факторів, коли дійсне значення коефіцієнту кореляції дорівнює нулеві. Якщо певне P(і,j) менше за 0,05, відповідне значення коефіцієнту кореляції R(і,j) буде значимим. Як видно, недіагональні значення матриці P(і,j) менші за 0,05, з чого випливає, що недіагональні значення матриці коефіцієнтів кореляції R(і,j) є значимими. Отже, між розміром соми, кількістю відростків пресинаптичної клітини і потенціалом реверсії ГПСС, викликаного в постсинаптичній клітині, існує невипадкова залежність.

Таким чином, можна зробити висновок, що пресинаптична клітина зумовлює не тільки виникнення постсинаптичного струму та визначає його амплітудні характеристики, а й здатна деякою мірою впливати на кінетику таких вГПСС. Окрім того, існує залежність між морфологічними властивостями пресинаптичної клітини та потенціалом реверсії вГПСС.

Гранулярні клітини зубчастої борозни. Культивовані гранулярні клітини характеризувались чітко вираженою краплевидною формою і середнім розміром 13,370,62 мкм. Апікальні відростки гранулярних клітин роздвоювалися, в той час як каудальні були одиночними і практично не мали відгалужень ( А). Середній потенціал спокою таких нейронів дорівнював -52,131,71 мВ, середній вхідний опір – 748,5691,61 MОм.

Для аналізу електрофізіологічної активності було обрано п’ятнадцять гранулярних клітин. Всі вони були здатні генерувати серії ПД, електрофізіологічні параметри яких наведено у таблиці 2.

Для визначення експресії калієвих каналів і наявності білків соматостатина та парвальбуміна було проведено подвійні імуноцитохімічні фарбування клітин з відомими електрофізіологічними характеристиками.

На препаратах, пофарбованих SS-специфічними антитілами, усі досліджені гранулярні клітини (n=9) демонстрували високий рівень імунореактивності до даного типу антитіл. Флуоресцентні мітки чітко визначалися як на нейронних сомах, так і на всіх відростках
( Б, Б). Гранулярні клітини не були імунореактивними до PV-специфічних антитіл.

За результатами імуноцитохімічного дослідження у гранулярних клітин було виявлено присутність потенціалзалежних калієвих каналів Kv4.2 і Kv1.2 типів. Однак інтенсивність флуоресцентного світіння, а також просторовий розподіл міток значним чином відрізнялися: Kv4.2-мітки локалізувалися як на нейронних сомах, так і на нейритах ( В); Kv1.2-імунореактивність чітко визначалася лише на сомах, а по мірі віддалення від останніх
слабшала (, В).

Рис. Мікрофотографія культивованих гранулярних клітин: А - клітина перед початком електрофізіологічного експерименту (світловий мікроскоп, фазовий контраст). На решті знімків - та ж сама клітина, пофарбована антитілами, специфічними до соматостатину (флуоресценція) (Б) та Kv4.2 калієвих каналів (флуоресценція) (В).

Kv3.1-специфічного забарвлення на мембранах культивованих гранулярних клітин виявлено не було.

Рис. Мікрофотографія пари досліджуваних нейронів. А - клітини перед початком електрофізіологічного експерименту, гранулярна клітина вгорі, постсинаптичні - внизу (світловий мікроскоп, фазовий контраст). На решті знімків - ті ж самі клітини, пофарбовані антитілами, специфічними до соматостатину (флуоресценція) (Б) та Kv1.2 калієвих каналів (флуоресценція) (В).

Таким чином, імуноцитохімічні дослідження показали, що гранулярні клітини в умовах культури демонстрували високу SS-імунореактивність і з високою щільністю експресували калієві канали Kv1.2 і Kv4.2 типів, що добре узгоджується з електрофізіологічними експериментами, проведеними на цих клітинах.

Стимуляція гранулярних клітин деполяризуючим струмом викликала в них ритмічну серію ПД з низькою частотою. В результаті на постсинаптичному нейроні такі ПД викликали появу збуджуючих постсинаптичних
струмів ().

Рис. Приклад реєстрації серії ПД з низькою частотою, яку генерує гранулярна клітина у відповідь на стимуляцію поштовхом струму (А) і постсинаптичних відповідей при підтримуваному потенціалі -75 мВ (Б).

Струми, зареєстровані в постсинаптичних клітинах, були розділені на два типи в залежності від їхніх кінетичних характеристик. В одній групі середній час наростання викликаних збуджуючих постсинаптичних струмів (вЗПСС) становив 0,700,10 мс, а середнє значення постійних часу спаду - 3,500,27 мс (n=7). В іншій групі струми наростали і спадали порівняно повільніше: середній час наростання складав 1,530,19 мс; середнє значення постійних часу спаду дорівнювало 10,090,88 мс (n=8), ( А, Б). Середні значення часів наростання і постійних часу спаду в цих двох групах статистично достовірно відрізнялися (критерій Ст’юдента, P<0,001).

Рис. Діаграми середніх значень кінетичних характеристик вЗПСС у двох групах постсинаптичних клітин. A - постійні часу спаду, Б - часи наростання, В - приклад апроксимації спадів швидких (1) і повільних (2) вЗПСС за допомогою одноекспоненційного рівняння.

Спади вЗПСС - як швидких, так і повільних - добре апроксимувалися за допомогою одноекспоненційного рівняння ( В).

В цій серії експериментів час від початку стимулу до початку виникнення викликаного постсинаптичного струму не перевищував 4,52 мс, його середнє значення дорівнювало 3,590,12 мс (n=15). Середнє значення потенціалу реверсії даного струму знаходилось близько 0 мВ, що характерно для збуджуючих іоночутливих рецепторів, здатних пропускати іони Na і К. Вольт-амперна характеристика викликаних постсинаптичних струмів в діапазоні змін підтримуваного потенціалу від -50 до +35 мВ була практично лінійною.

Для того, щоб визначити, який підтип збуджуючих рецепторів опосередковує досліджувані вЗПСС, були використані фармакологічні агенти DL-AP5 та DNQX. В присутності DL-AP5, специфічного блокатора НМДА-рецепторів, у концентрації 20 мкмоль/л, кінетичні характеристики постсинаптичних струмів залишалися незмінними. В той же час антагоніст не-НМДА-рецепторів DNQX (20 мкмоль/л) повністю пригнічував постсинаптичні струми незалежно від кінетики останніх. Отже, зареєстровані вЗПСС опосередковувались збуджуючими не-НМДА-рецепторами.

Порівняльний аналіз електрофізіологічних параметрів різних типів пресинаптичних клітин.

Результати порівняння характеристик ПД гальмівних інтернейронів, здатних генерувати ПД високо- і низькочастотно, наведені в Таблиці 1.

Таблиця 1

Параметри ПД | ГАМК-ергічні з серіями ПД | P | високочастотними | низькочастотними | Амплітуда ПД, мВ | 78,11 | ±2,78 | 80,63 | ±1,58 | Амплітуда постактиваційної гіперполяризації, мВ | -8,73 | ±1,31 | -3,93 | ±0,95 | * | Максимальна швидкість деполяризації, мВ/мс | 205,54 | ±14,57 | 169,35 | ±6,88 | * | Максимальна швидкість реполяризації, мВ/мс | -78,95 | ±4,08 | -58,58 | ±2,41 | ** | Максимальна швидкість реполяризації 2-го ПД, мВ/мс | -48,76 | ±4,14 | -36,55 | ±1,79 | * | Тривалість 1-го ПД, мс | 1,11 | ±0,04 | 1,76 | ±0,05 | ** | Тривалість 2-го ПД, мс | 1,33 | ±0,06 | 2,27 | ±0,09 | ** | Стаціонарна частота генерації ПД, Гц | 50,82 | ±3,13 | 22,68 | ±1,05 | ** | A200 | 0,31 | ±0,05 | 0,51 | ±0,03 | ** |

Рівень значимості критерію Ст’юдента (тобто імовірність помилки прийняти гіпотезу про нерівність середніх, коли в дійсності середні рівні) вказано у стовпчику Р: * P<0,05, ** P<0,01. Як видно, всі середні параметри, за виключенням амплітуди ПД, достовірно відрізняються.

В таблиці 2 порівнюються характеристики ПД гальмівних і збуджуючих нейронів, здатних генерувати ПД ритмічно з низькою частотою. Рівень значимості критерію Ст’юдента вказано у стовпчику Р, * P<0,05, ** P<0,01. Всі середні параметри, за винятком тривалості ПД і стаціонарної частоти генерації ПД, достовірно відрізняються.

Таблиця 2

Параметри ПД | Нейрони з низькочастотними серіями ПД | P

ГАМК-ергичні | Гранулярні

Амплітуда ПД, мВ | 80,63 | ±1,58 | 71,11 | ±3,02 | *

Амплітуда постактиваційної гіперполяризації, мВ | -3,93 | ±0,95 | -10,03 | ±1,18 | ** | Максимальна швидкість деполяризації, мВ/мс | 169,35 | ±6,88 | 117,11 | ±12,39 | ** | Максимальна швидкість реполяризації, мВ/мс | -58,58 | ±2,41 | -42,85 | ±3,66 | ** | Максимальна швидкість реполяризації 2-го ПД, мВ/мс | -36,55 | ±1,79 | -27,51 | ±2,01 | * | Тривалість 1-го ПД, мс | 1,76 | ±0,05 | 1,93 | ±0,15 | Тривалість 2-го ПД, мс | 2,27 | ±0,09 | 2,53 | ±0,22 | Стаціонарна частота генерації ПД, Гц | 22,68 | ±1,05 | 27,67 | ±2,29 | A200 | 0,51 | ±0,03 | 0,24 | ±0,02 | ** | Обговорення. Показано, що наявність калієвих струмів затриманого випрямлення, опосередкованих Kv3-типом каналів, є істотною для генерації високочастотних розрядів ГАМК-ергічними нейронами (Lіen & Jonas, 2003), в той час як канали типу Kv4.2 опосередковують вихідний транзиєнтний калієвий струм (А-типу), і їхня присутність забезпечує генерацію ритмічних серій ПД відносно низкою частоти (Bіrnbaum et al., 2004). Канали типу Kv1.2 опосередковують струм затриманого випрямлення, який повільно активується та інактивується, і це також може зумовлювати специфічний тип генерації ПД (Dodson et al., 2002). В опублікованих роботах, однак, не розглянуті питання про те, наявністю яких саме типів потенціалзалежних калієвих каналів зумовлена генерація гальмівними ГАМК-ергічними інтернейронами низькочастотних серій ПД, а також каналами яких типів зумовлюються відмінності в