НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Маслікова Катерина Павлівна

УДК 635.64:632.481.14

БІОЛОГО-ЕКОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЗБУДНИКА ФІТОФТОРОЗУ ТОМАТА (PHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY)

в умовах ПІВНІЧНОго СТЕПУ УКРАЇНИ

06.01.11 – фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровському державному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, академік УААН,

професор, заслужений

діяч науки і техніки України

Кирик Микола Миколайович,

Національний аграрний університет, завідувач

кафедри фітопатології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Слюсаренко Олександр Миколайович,

Одеський національний університет

ім. І.І. Мечнікова, професор кафедри ботаніки

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Ковбасенко Василь Михайлович,

Київський науково-дослідний центр Інституту овочівництва

і баштанництва УААН, завідувач відділу мікології та захисту рослин

Провідна установа – Харківський національний аграрний університет

ім. В.В. Докучаєва, Міністерства аграрної політики

України, м. Харків

Захист відбудеться “ 29 ” квітня 2005 р. о 10-й год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ–41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ–41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус №4, к.41

Автореферат розісланий “ 28 ” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мороз М.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фітофтороз, або бура гниль є однією з найпоширеніших і небезпечних хвороб томата та картоплі. Її збудник – Phytophthora infestans (Mont.) de Bary (гетероталічний гриб класу ооміцетів) – уражує вегетативні та генеративні органи рослин на всіх етапах їх онтогенезу. Щорічні втрати врожаю від цього захворювання становлять 10–50 %, а в роки епіфітотій – 100 % (Andrivon, 1996).

Протягом ХХ століття розроблено чимало заходів захисту від фітофторозу, до яких передусім належать застосування хімічних засобів та впровадження стійких сортів. Однак створення останніх значною мірою ускладнюється появою нових фізіологічних рас патогену, а ефективність хімічних засобів захисту знижується внаслідок виникнення толерантних до них форм гриба.

Причиною високої варіабельності Ph. infestans є суттєві зміни, що відбуваються у складі та властивостях його популяцій внаслідок міграції нових генотипів і появи статевого процесу в циклі розвитку гриба (Fry, 1993). Тому знання біології та екології збудника фітофторозу на рівні місцевих популяцій дозволить виявити його реальні властивості й на основі цього створити ефективні екологічно безпечні та економічно доцільні системи захисту.

В останні роки популяційні дослідження Ph. infestans є приоритетними. Створюються міжнародні фонди і програми, які підтримують цей напрямок; розширюються комп’ютерні бази даних, що містять характеристики популяцій Ph. infestans різних регіонів світу. Це дає можливість з’ясувати мікроеволюційні зміни патогену, їх причини та механізми.

Аналіз літературних джерел свідчить, що дослідження фітофторозу в Україні в більшості присвячені висвітленню питань його поширеності та шкодочинності, вивченню стійкості сортів і розробці заходів щодо обмеження розвитку хвороби. Дослідження ж біолого-екологічних особливостей збудника фітофторозу та структури його популяцій є дуже обмеженими, а в зоні Північного Степу України ці питання взагалі не вивчались.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися згідно з планом науково-дослідної роботи кафедри загального землеробства Дніпропетровського державного аграрного університету (тема: “Біолого-екологічні особливості збудника фітофторозу томата (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) в умовах Північного Степу України”. Номер державної реєстрації 0105U000340), у рамках міжнародного наукового проекту щодо захисту рослин та застосування пестицидів (ПЗРП) за підтримки Агенції з міжнародного розвитку США (USAID) (тема субгранту: “Розвиток інтегрованих систем захисту томата, що забезпечують стабільні фітосанітарні умови”. Номер державної реєстрації проекту в Україні – 166-02, у США – EPE-G-00-95-00125-00, CR-4838-425277 (4838-1).

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було вивчення біолого-екологічних особливостей збудника фітофторозу томата в умовах Північного Степу України. Для досягнення поставленої мети вирішували такі задачі:

- визначити поширеність та розвиток фітофторозу томата залежно від метеорологічних умов;

- уточнити діагностичні ознаки хвороби;

- з’ясувати ефективність різних методів отримання чистих культур збудника фітофторозу та дослідити його морфолого-біологічні особливості;

- дати характеристику місцевій популяції Ph. infestans за нейтральними маркерами;

- визначити залежність патогенних властивостей Ph. infestans від його біологічних ознак;

- вияснити характер взаємовідносин Ph. infestans з бактеріями родів Burkholderia та Bacillus.

Об’єкт дослідження. Ізоляти збудника фітофторозу (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary), бактерії-антагоністи, районовані та перспективні сорти і гібриди томата.

Предмет дослідження. Біолого-екологічні особливості місцевої популяції збудника фітофторозу; фактори, що впливають на розвиток хвороби; патогенні властивості Ph. infestans та його взаємовідносини з представниками мікробіоти.

Методи дослідження. Мікологічний – вилучення збудника фітофторозу в чисту культуру, вивчення впливу екологічних факторів на морфологічні та культуральні ознаки патогену, дослідження його біології, з’ясування характеру взаємовідносин із представниками мікробіоти. Фітопатологічний – дослідження динаміки розвитку фітофторозу залежно від метеорологічних умов та вивчення реакції сортів і гібридів томата на ураження.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в зоні Північного Степу України проведено моніторинг поширення та розвитку фітофторозу на рослинах томата, встановлено спектр діагностичних ознак ураження збудником захворювання та досліджено його морфологічні особливості.

Вперше в Україні охарактеризовано популяцію Ph. infestans за результатами визначення комплексу нейтральних маркерів (тип статевої сумісності, расова належність, чутливість до феніламідного фунгіциду металаксилу (ридомілу). В результаті встановлено присутність у місцевій популяції Ph. infestans типу сумісності А2, вірулентної раси Т1 та вперше виявлено стійкі до металаксилу ізоляти патогену.

Проведено дослідження щодо встановлення жирно-кислотного складу міцелію Ph. infestans. Уперше доведено можливість використання методу профілювання метилових ефірів жирних кислот (МЕЖК) у популяційних дослідженнях Ph. infestans для його внутрішньовидової диференціації за біологічними характеристиками та патогенними властивостями.

З’ясовано ефективність різних методів виділення Ph. infestans в чисту культуру, виявлено морфологічну різноманітність вегетативних структур патогену, а також вплив умов вирощування на його морфологічні та культуральні ознаки.

Встановлено залежність патогенних властивостей Ph. infestans від його расової належності, типу сумісності, а також сорту рослини-господаря.

Вперше виявлено наявність антагоністичної активності бактерій родів Burkholderia (шт. ВА-7) та Bacillus (шт. ВА-142 і ВА-58) щодо Ph. infestans і обґрунтовано можливість їх використання в біологічному контролі фітофторозу.

Практичне значення одержаних результатів. Дані щодо впливу метеорологічних умов на поширення і розвиток фітофторозу можуть бути використані в прогнозуванні епіфітотій хвороби, а результати уточнення її симптомів та вивчення біолого-екологічних властивостей збудника дозволять достовірно проводити діагностику, оцінювати можливі економічні втрати, розробляти біологічно обґрунтовані, екологічно безпечні заходи захисту.

Чисті культури патогену з установленими біологічними характеристиками можуть бути використані для створення інфекційних фонів при селекції томата на стійкість до фітофторозу, при сортовипробуванні, а також при визначенні ефективності хімічних та біологічних засобів захисту.

Метод профілювання МЕЖК доцільно застосовувати в популяційних дослідженнях для внутрішньовидової диференціації Ph. infestans за його біологічними характеристиками та патогенними властивостями.

Результати досліджень антагоністичних взаємовідносин бактерій родів Burkholderia (шт. ВА-7) і Bacillus (шт. ВА-142 та ВА-58) та Ph. infestans можуть бути використані при створенні біологічних препаратів для захисту пасльонових культур від фітофторозу.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів та їх узагальнення виконані здобувачем особисто. Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговорені на: форумі з підведення підсумків науково-дослідних та навчальних програм у рамках міжнародного проекту щодо захисту рослин та застосування пестицидів за підтримки Агенції з міжнародного розвитку США (м. Київ, 1999); науковій конференції професорсько-викладацького складу Дніпропетровського агроуніверситету (м. Дніпропетровськ, 2001, 2002, 2004); Міжнародній конференції молодих учених, присвяченій 185-річчю ХДАУ ім. В.В.Докучаєва “Рослина і середовище” (м. Харків, 2001); І-му Євроазіатському конгресі з молекулярної біотехнології (м. Трабзон, Туреччина, 2001); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених і спеціалістів з проблем виробництва зерна в Україні (м. Дніпропетровськ, 2002); науковій конференції, присвяченій 80-річчю ДДАУ (м. Дніпропетровськ, 2002); Міжнародних наукових інтернет-конференціях: “Наука і освіта – 2002” (м. Дніпропетровськ, 2002); “Україна наукова – 2003” (м. Дніпро-петровськ, 2003), “Науковий потенціал світу – 2004” (м. Дніпропетровськ, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано навчально-практичний посібник та 13 наукових праць, з них: 5 статей – у наукових журналах, що входять до переліку фахових видань ВАК України, 2 – у збірниках наукових праць, 6 – у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 172 сторінках комп’ютерного тексту, включає 11 таблиць, 47 рисунків (з них 30 фотографій). Вона складається із вступу, 7 розділів, висновків, 8 додатків. Список використаної літератури налічує 345 найменувань, з яких 218 іноземною мовою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури

Висвітлені питання щодо поширеності, шкодочинності та симптомів фітофторозу томата. Проведено аналіз стану вивчення біолого-екологічних характеристик збудника хвороби (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary), його систематичного положення, морфології, життєвого циклу, умов інфекційного процесу, спеціалізації та структури світових популяцій патогену. Виходячи з аналітичного огляду, встановлено напрями досліджень, за результатами яких було б можливо охарактеризувати місцеву популяцію збудника фітофторозу, виявити її біолого-екологічні особливості та тенденції змін з метою використання для прогнозу, уточнення існуючих і створення нових біологічно обґрунтованих та ефективних систем захисту томата від фітофторозу.

Умови та методики проведення досліджень

Наведено загальну агрометеорологічну характеристику зони Північного Степу України з детальним аналізом погодно-кліматичних умов району, де проводились спостереження за розвитком фітофторозу. Встановлено відмінність за роками погодних умов, від яких залежить розвиток і ступінь шкодочинності хвороби – насамперед вологості й температури повітря.

Дослідження включали маршрутні обстеження, лабораторні та лабораторно-вегетаційні досліди. Вони проводились у державних, колективних та фермерських господарствах (включаючи приватні присадибні ділянки) Дніпропетровської області, в Дніпропетровському державному аграрному університеті, Державному університеті штату Огайо (США) та Ататуркському державному університеті (Туреччина) впродовж 1999–2001 рр.

Поширеність та інтенсивність розвитку фітофторозу вивчали за загальноприйнятими методиками (Новожилов, 1985). Ступінь ураженості листків томата визначали з використанням шкали, розробленої проф. S.A. Miller (1999, Державний університет штату Огайо, США). Уражені фітофторозом листки, стебла та плоди томата відбирали з різних полів (по 50–60 з кожного району досліджень).

Вилучення ізолятів Ph. infestans у чисту культуру здійснювали безпосередньо з уражених тканин з наступним культивуванням на житньому насіннєвому агарі, що містив протимікробні речовини (Tooley et al., 1986; Matuszak et al., 1994; Fry, 1998) або перенесенням спороношення патогену на живильне середовище після попереднього витримування уражених тканин у вологій камері (Dorrance, 1999).

Для визначення впливу живильного середовища на ріст міцелію та інтенсивність спороношення Ph. infestans використовували житнє насіннєве (для Ph. infestans), картопляно-декстрозне, вівсяне, горохове, морквяне та очищене томатне агаризовані середовища без і з вмістом стеринів, згідно з методиками, наведеними в праці А. Medina (1999).

Визначення інтенсивності споруляції здійснювали в камері Фукс-Розенталя.

Тип статевої сумісності ізолятів Ph. infestans визначали шляхом їх спарювання з А1 та А2 тест-ізолятами на житньому середовищі в чашках Петрі за методиками, наведеними в працях A. Dorrance (1996) та A. Drenth (1993).

Чутливість до металаксилу вивчали in vitro шляхом розміщення поодиноких агарових блоків з міцелієм двотижневої культури Ph. infestans у чашках Петрі з житнім агаризованим середовищем, що містило 0, 5 та 100 мкг/мл металаксилу.

У дослідах з визначення типу сумісності та чутливості до металаксилу використовували тест-ізоляти Ph. infestans (93–419 (US-1) – A1, MЧ, 501B (US-8) – A2, MC та 110B (US-11) – A2, MC), які були надані нам проф. D. Inglis (Вашингтонський державний університет, США).

Жирно-кислотний склад міцелію Ph. infestans досліджували профілюванням МЕЖК методом газорідинної хроматографії з використанням мікробної ідентифікаційної системи (МІС) з програмним забезпеченням “Sherlock” (MIS; MIDI, Inc. 2001).

Расовий склад ізолятів Ph. infestans визначали за реакцією на ураження сортів-диференціаторів (L. Black, AVRDC, Taiwan, 1998), які були надані нам проф. S. Miller та M. Levis (Державний університет штату Огайо, США).

Патогенні властивості ізолятів Ph. infestans досліджували на рослинах 21-го сорту та гібриду томата за методикою, наведеною в праці S. Kamoun (1999). Для підготовки інокулюму використовували культури двох ізолятів Ph. infestans: 88069 (А1, Т0) та 90128 (А2, Т1). Ступінь агресивності ізолятів рас Т0 та Т1 досліджували на сприйнятливому сорті СХ-4.

Взаємовідносини Ph. infestans з представниками мікробіоти досліджували in vitro: міцеліальні блоки гриба розміщували на полюси чашки Петрі, а бактерії висівали у вигляді штриха, який ділив її навпіл. Для досліду використовували двотижневі культури Ph. іnfestans та чисті культури бактерій Bacillus sp. (шт. ВА-142 і М-58) і Burkholderia sp. (шт. ВА-7). Штами бактерій були надані нам проф. F. Sahin (Ататуркський державний університет, Туреччина).

Усі фотографії, що наведені в розділах експериментальної частини, є оригіналами і виконані автором особисто з використанням фотоапарата “Canon–300”, цифрової камери “EPSON” та фотомікрографічної камери “Olympus–РМ 10SP”, приєднаної до світлового стерео-мікроскопа “Olympus Р–50”.

Результати досліджень

Розвиток та діагностичні ознаки фітофторозу томата

Динаміка розвитку фітофторозу в роки досліджень. У результаті аналізу метеорологічних показників району проведення досліджень упродовж 1999–2001 рр. встановлено взаємозв’язок між інтенсивністю розвитку фітофторозу томата та основними екологічними факторами – вологістю, температурою повітря, кількістю опадів. Установлено, що значна кількість опадів (30–60 мм) та висока (65–85 %) вологість повітря з одночасним зниженням температури до 15–17 оС сприяють розвитку захворювання, яке може починатись з ІІ декади червня до І декади липня (рис. 1). Подальший перебіг хвороби залежно від погодних умов упродовж

вегетаційного періоду може варіювати від 12 (1999 р.) до 45 % (2001 р.) або набува-ти характеру епіфітотії (2000 р.). Установлено також, що навіть у засушливі роки у вересні–жовтні за умови рясних опадів ураженість пізніх сортів томата може сягати 45 % і вище (2001 р.).

Особливості діагностичних ознак. Нашими дослідженнями встановлено, що в умовах Північного Степу України фітофторозом уражуються листки, стебла та плоди томата. Перші ознаки хвороби проявляються на нижньому ярусі листків у вигляді невеликих розпливчастих плям бурого кольору, облямованих світло-зеленою зоною. Плями розташовані переважно по краю листків і за умов підвищеної вологості (65 % і вище) та помірно теплої погоди (18–22 оС) швидко розповсюджуються по листковій пластинці, утворюючи на нижньому її боці наліт спороношення патогену. За умов інтенсивного розвитку захворювання ураження з листкової пластинки у вигляді безперервних поздовжніх коричневих смуг розповсюджується на головну жилку та черешок листка. Здатність Ph. infestans інтенсивно розвиватись уже за вологості повітря 65 % свідчить про пластичність патогену щодо пристосування до несприятливих умов зовнішнього середовища.

Установлено, що стебла уражуються переважно молоді і соковиті; найчастіше симптоми хвороби з’являються в листкових пазухах або верхівках пагонів у вигляді невеликих темних мокнучих плям. За високої вологості останні швидко збільшуються і охоплюють стебло у вигляді коричневих смуг довжиною 2–9 см. Спороношення патогену на стеблах у природних умовах не відмічено.

На уражених фітофторозом плодах утворюються плями неправильної форми від світло- до темно-коричневого кольору, часом удавлені в плід. За результатами наших спостережень у 80 % плодів ураження починається у місці прикріплення плодоніжки і швидко розповсюджується на поверхні плоду. На межі ураженої і здорової тканин плями мають світліший колір, а іноді крапчасте розташування. Спочатку уражені тканини плодів є твердими, а потім, після розвитку в них вторинної бактеріальної інфекції, розм’якшуються і загнивають. У вологу погоду або після витримування плодів у вологій камері плями вкриваються нещільним нальотом міцелію збудника захворювання.

Біолого-екологічні особливості Phytophthora infestans

Способи вилучення Ph. infestans у чисту культуру. Відомо, що процес вилучення збудника фітофторозу в чисту культуру є тривалим і малоефективним [Dorrance, 1996]. З метою отримання достатньої кількості чистих культур для подальших дослідів нами було апробовано ряд методик, які різнились за використаною для знезараження речовиною та способом перенесення спороношення на живильне середовище.

При виділенні ізолятів з поверхневих тканин плодів томата всі використані для знезараження речовини показали позитивний результат як на звичайному, так і на селективному (з додаванням антибіотиків та фунгіцидів) середовищах, хоча їх ефективність значно різнилась (5–45 та 15–80 % відповідно). Найбільший вихід чистих культур спостерігали у варіанті з використанням хлороксу. Ефективність цього способу порівняно із застосуванням марганцевокислого калію (KMnO4) та етилового спирту (CH3CH2OH) була вищою в 1,4 та 3 рази відповідно на селективному середовищі і в 3–9 разів – на звичайному.

Для знезараження внутрішніх тканин плодів етиловий спирт був малоефективним (5–15 %), що зумовлювалося його руйнівним впливом на Ph. infestans: навіть при позитивному результаті колонії гриба характеризувались ослабленим ростом, більш тривалим періодом до спороутворення, а також наявністю випадків абортування вмісту спорангіїв. Ефективність KMnO4 та хлороксу за виходом чистих культур була приблизно однаковою (35–40 %), але спостерігалась пригнічуюча дія останнього на подальший ріст і розвиток Ph. infestans.

Ефективність знезаражуючих речовин за обробки уражених листків та стебел томата не перевищувала 5–10 % або була відсутньою.

При вивченні різних способів перенесення спорангіїв на поживне середовище встановлено, що найефективнішим (у 1,5–4 рази), незалежно від джерела виділення конідій гриба, є застосування стерильного зволоженого фільтрувального паперу. На інтенсивність спороношення чистих культур усі використані способи суттєво не впливали.

Вплив живильного середовища на ріст і розвиток Ph. infestans. Зважаючи на те, що одним із вирішальних факторів, який впливає на ріст і розвиток Ph. infestans, є живильне середовище (Новотельнова, 1974), ми вирішили за доцільне дослідити найбільш поширені його різновиди з метою підвищення ефективності та зручності наших подальших досліджень.

Установлено, що більшість агаризованих живильних середовищ як із вмістом, так і без вмісту ?–сітостерину, забезпечують задовільний розвиток Ph. infestans. Найінтенсивніший ріст міцелію відмічений на картопляно-декстрозному агарі (КДА), на якому діаметр колоній був у 1,5 раза більшим ніж на житньому (ЖА) (рис. 2). На інших живильних середовищах, порівняно з КДА, міцелій розвивався повільніше в 1,7–4 рази. Результати росту гриба на житньому та вівсяному (ВА) агарах майже не відрізнялись, але ВА був недостатньо прозорим для мікроскопічних досліджень Ph. infestans.

Найповільніший ріст міцелію Ph. infestans спостерігали при вирощуванні ізолятів на морквяному (МА) та гороховому (ГА) агарах. Однак слід відзначити, що після додавання ?-сітостерину найбільше прискорення росту гриба відмічено у варіанті з морквяним агаром.

Серед досліджених живильних середовищ найінтенсивніше утворення спорангіїв Ph. infestans відмічено на очищеному томатному агарі (ОТАС) з ?-сітостерином – у середньому 62 тис. спорангіїв/мл. На КДА, навпаки, інтенсивність споруляції була дуже низькою (0,8–1,5 тис. спорангіїв/мл). Усі інші середовища щодо інтенсивності спороношення показали приблизно однакові результати (10–34 тис. спорангіїв/мл).

Морфологія та структура колоній. При вирощуванні чистих культур різних ізолятів Ph. infestans на житньому агарі при температурі 19–20 оС та 12-годинному освітленні, встановлено неоднорідність їх морфолого-культуральних ознак, що проявлялось у різниці швидкості росту, топографії, структурі колоній, здатності їх до лізису, переважному формуванні повітряного або субстратного міцелію та інтенсивності спороношення. Діаметр колоній Ph. infestans варіював від 3 до 9 см. Найбільш контрастно виділялись пухнасті колонії з щільним міцелієм; останній міг бути також ватоподібним, розпушеним чи павутинистим. Окремі ізоляти характеризувались слабким розвитком повітряного міцелію, хоча їх субстратний міцелій був розвинутий добре.

Утворення спорангіїв у Ph. infestans ми спостерігали як на повітряному, так і на субстратному міцелії, але на останньому спорангієносці майже не галузились.

При вивченні культуральних особливостей ізолятів Ph. infestans нами виявлено здатність деяких штамів утворювати зони лізису при рості на агаризованому середовищі. Перші їх ознаки (у вигляді змокрілих плям) відмічали на 5-ту добу; через 8 діб пустих гіфів було вже 30 %, а на 12-ту добу – 85–95 %. У подальшому відбувалось руйнування або склеювання міцелію.

Установлено також значну різницю в часі утворення та інтенсивності споруляції досліджуваних ізолятів. Так, період від висіву до утворення спорангіїв коливався від 5-и до 8-и діб, а інтенсивність спороношення – від 3,2 до 27 тис. спорангіїв на 1 см2.

Морфологія вегетативних структур. На думку деяких дослідників, Ph. infestans є досить пластичним щодо відмінностей морфології його вегетативних структур (Новотельнова, 1974). Припускаючи, що, можливо, це є однією з особливостей гриба на рівні популяцій, ми провели ряд детальних досліджень у цьому напрямку.

В результаті мікроскопічних досліджень ізолятів Ph. infestans установлено, що всі вони мали несептований ценотичний багатоядерний міцелій, гіфи прямі або звивисті, 5–8 мкм у діаметрі, заповнені гомогенною цитоплазмою. При старінні культур усередині гіфів з’являлись вакуолі, жирові включення, утворювались перегородки (септи).

Спорангієносці відходили від міцелію під гострим кутом: гілки 1-го порядку галузились моноподіально, 2-го – симподіально. На їх кінцях, переважно по одному, іноді попарно, утворювались спорангії. Після дозрівання останніх спорангієносці були здатними до подальшого росту, внаслідок чого на їх гілках у місцях прикріплення спорангіїв з’являлись виражені у різному ступені здуття. Зрілі спорангії в більшості залишались прикріпленими до спорангієносців, їх кількість коливалась у межах від 1-го до 10-и.

У наших дослідженнях було відмічено різноманіття спорангіїв Ph. infestans за морфологічними ознаками. Так, за формою, крім класичних лимоноподібних, відмічені також видовжено-овальні, грушоподібні та шароподібні спорангії. В молодих культурах вони були темного кольору, заповнені зернистим вмістом, а при старінні втрачали зернистість, знебарвлювались і ставали прозорими. Розміри спорангіїв варіювали в межах 30–55х19–40 мкм при коефіцієнті співвідношення їх довжини до ширини від 1,1 до 2,1; довжина клітини-ніжки – від 1 до 5 мкм; сосочки на верхівках спорангіїв – від видовжених (до 2 мкм) чи округлих до значно менших приплюснутих (до 0,5 мкм) або майже непомітних.

В умовах in vitro на живильному середовищі як відчленовані, так і прикріплені до спорангієносців спорангії характеризувались гіфогенним або гіфогенно-везикулярним типом проростання.

Характеристика популяції Phytophthora infestans

у Північному Степу України

На сучасному етапі в популяційних дослідженнях Ph. infestans використовується ряд нейтральних маркерів, основними з яких є тип сумісності, чутливість до металаксилу та расова належність (Fry et al., 1993; Hartman, 1995). Результати вивчення популяцій Ph. infestans за вищезазначеними маркерами складають світову базу даних, яка створена з метою порівняння окремих популяцій гриба за рівнем патогенності та прогнозування його міграційних процесів, що є основою для розробки ефективних біологічно-обгрунтованих заходів щодо обмеження розвитку патогену. Метою наших досліджень було охарактеризувати популяцію Ph. infestans Північного Степу України за нейтральними маркерами, а також вияснити можливість використання в популяційних дослідженнях додаткового маркера – жирно-кислотного складу (профілей МЕЖК) міцелію гриба.

Тип сумісності. Серед досліджуваних ізолятів обидва типи сумісності (т.с.) – А1 та А2 були визначені у співвідношенні 70 та 30 % відповідно. Через 7–8 діб інкубації спостерігалося зростання повітряних міцеліїв ізолятів А1 та А2 т.с. з наступним, вираженим у різному ступені, наростанням колоній одна на одну. І, навпаки, зона відштовхування міцеліїв була наявною в більшості випадків при вирощуванні ізолятів однакового типу сумісності.

Ооспори в більшості випадків утворювались в зоні схрещування міцеліїв, де відбувались певні зміни в розвитку вегетативних структур Ph. infestans, а саме: міцелій був слабо-розгалуженим, характеризувався утворенням численних септ, а іноді й деструкцією. Спорангії були поодинокими і значно меншими за ооспори.

Перед заплідненням оогоній міцелію одного типу сумісності в амфігінній конфігурації проростав через антеридій протилежного типу. Після запліднення і утворення зиготи в цитоплазмі оогонія спостерігалось формування жирових тілець та вакуолей. Утворені ооспори були тонкостінними, двошаровими, характерного світло-коричневого кольору (який згодом темнішав), їх розмір варіював від 35 до 45 мкм.

Реакція на металаксил. У результаті досліджень ізоляти Ph. infestans були розподілені на три групи чутливості до металаксилу: чутливі (МЧ), середньостійкі (МСС) та стійкі (МС), які становили відповідно 25; 65 та 10 % загальної кількості досліджуваних ізолятів. При цьому група МЧ включала тільки ізоляти А1 т.с., тоді як МС – лише ізоляти А2 т.с. і МСС – 69 та 31 % ізолятів А1 та А2 т.с. відповідно.

Радіальний ріст МЧ-ізолятів на середовищі з концентрацією металаксилу 5 мкг/мл у середньому був у 1,5 та 2 рази меншим порівняно з МСС та МС групами відповідно. У варіанті з концентрацією металаксилу 100 мкг/мл ріст міцелію ізолятів типу сумісності А1 як МЧ, так і МСС груп, у тому числі і тест-ізоляту US-1, не відмічали. Ізоляти А2 т.с. в цьому разі мали середній радіальний ріст 25,2 та 43,2 % у МСС та МС групах відповідно.

У наших дослідах при вирощуванні Ph. infestans на живильних середовищах, що містили металаксил, були відмічені відхилення від норми в морфології міцелію, спорангієносців та спорангіїв. Це виражалось наявністю вузлуватих потовщень та надмірного галуження міцелію, утворенням у ньому септ і згущенням цитоплазми; нетиповими формами спорангіїв та передчасному абортуванні їх вмісту при прямому проростанні.

Расовий склад. Майже всі досліджувані ізоляти Ph. infestans дали чітку реакцію на сортах-диференціаторах і були ідентифіковані як раси Т0 та Т1 у співвідношенні 77 і 23 % відповідно (табл. 1).

Таблиця 1 _Результати ідентифікації томатних рас Ph. infestans

на тест-сортименті

Кількість досліджених ізолятів, % | Реакція на тест-сортименті* | Раса

TS 19 | TS 33 | W.Va.106 | W.Va.700 | W.Va.63/7 | L 3708

77 | Ч | С | С | С | С | С | T0

23 | Ч | Ч | Ч | Т | Т | С | T1

* Умовні позначення: Ч – чутлива, С – стійка, Т - толерантна

Чутливість до ураження ізолятами раси Т0 спостерігалася тільки на сорті TS 19, який не містив гена стійкості. Ізоляти, визначені як раса Т1, показали себе вірулентними як до сорту TS 19, так і до сортів з геном стійкості Ph1 (TS 33, W.Va.106).

Незважаючи на більш сильні патогенні властивості раси Т1 по відношенню до рослин томата [Дорожкин, 1976], у наших дослідах in vitro вона, порівняно з расою Т0, повільніше росла, колонії були більш компактними, а спороношення в декілька разів слабкішим.

Жирно-кислотний склад (профілі МЕЖК). У результаті газохромато-графічного аналізу в міцелії Ph. infestans визначено 7 різних жирних кислот (ЖК). До їх складу входили 2 насичені (14:0; 16:0), 2 мононенасичені (16:1 Cis 9 (w7); 18:1 Cis 9 (w9) та 3 поліненасичені (18:2 Cis 9,12/18:0a; 20:4 Cis (w6) та 20:5 Cis (w3)) ЖК. Кількісні характеристики визначених ЖК суттєво різнились як між собою, так і за їх вмістом у кожному з ізолятів. Переважали пальмітинова (16:0), лінолева (18:2) та міристинова (14:0) кислоти, вміст яких у середньому становив 27; 19 та 18 % відповідно (рис. 3). Кількість ейкозапентаєнової (20:5) та олеїнової (18:1) ЖК була значно меншою і дорівнювала 15 та 11 % відповідно. Найменшу частку складали пальмітоолеїнова (16:1) та арахідонова (20:4) кислоти – 6 і 4 % відповідно.

Хоча жирно-кислотний склад досліджуваних ізолятів був однаковим, вміст окремих ЖК залежно від ізоляту значно різнився. Більш постійними були показники ейкозапентаєнової, лінолевої та пальмітинової кислот, у той час як кількість міристинової, арахідонової та пальмітоолеїнової кислот різнилась у 2–2,6 раза, а олеїнової – в 3,4 раза.

З метою виявлення кореляції нейтральних маркерів як між собою, так і з жирно-кислотним складом, нами були досліджені 10 ізолятів Ph. infestans, у т.ч. тест-ізолят US-1 (табл. 2).

Таблиця 2 – Характеристика ізолятів Phytophthora infestans, вилучених

із рослин томата

№ ізоляту | Тип сумісності | Чутливість до металаксилу | Расова належність | Вміст ЖК у порядку убування*

US-1

(тест) | А1 | МЧ | Т0 | 3-4-7-5-1-6-2

13 | А1 | МЧ | Т0 | 3-4-1-7-5-2-6

16 | А1 | МСС | Т1 | 3-4-1-7-2-5-6

12 | А1 | МСС | Т1 | 3-4-1-7-2-5-6

19 | А1 | МСС | Т1 | 3-4-1-7-2-5-6

3 | А1 | МСС | Т1 | 3-1-4-7-2-5-6

9 | А2 | МСС | Т0 | 3-5-1-4-7-6-2

4 | А2 | МСС | Т0 | 3-5-1-4-7-6-2

10 | А2 | МС | Т1 | 3-1-4-7-5-2-6

1 | А2 | МС | Т1 | 1-3-4-7-5-2-6

* Кодові номери ЖК: 1 – міристинова (14:0), 2- пальмітоолеїнова (16:1 Cis 9 (w7),

3 – пальмітинова (16:0), 4 – лінолева (18:2 Cis 9,12), 5 – олеїнова, 6 – арахідонова

(20:4Cis (w6), 7 – ейкозапентаєнова (20:5Cis (w3)

Отримані дані свідчать про наявність певного взаємозв’язку між основними нейтральними маркерами, що зумовлюють агресивні якості патогену. При цьому чутливість до металаксилу значною мірою корелює з типом сумісності та расовою належністю. Так, чутливі до металаксилу ізоляти Ph. infestans належали до раси Т0 і т. с. А1, стійкі – до раси Т1 і т. с. А2, а середньостійка група являла собою суміш ізолятів, різних як за типом сумісності, так і за расовою належністю.

Установлено також, що у Ph. infestans існує певна кореляція між кількісним вмістом ЖК, типом сумісності та чутливістю до металаксилу. Так, ізоляти А1 т.с. порівняно з ізолятами А2 т.с. характеризувались більшим вмістом пальмітинової (16:0) та лінолевої (18:2) ЖК – на 5 і 3 % відповідно. В ізолятів обох типів сумісності, в напрямку набуття стійкості до металаксилу, відмічено більший вміст міристинової (14:0) та пальмітоолеїнової (16:1) і менший – олеїнової (18:1) та арахі-донової (20:4) ЖК. При цьому в ізолятів А1 т.с. ця тенденція є значно виразнішою (приблизно в 2 рази) у пальмітоолеїнової (16:1), олеїнової (18:1) та арахідонової (20:4), а в ізолятів А2 – у пальмітоолеїнової (16:1) та арахідонової (20:4) ЖК (рис. 4).

Щодо кореляції між кількісним вмістом ЖК та расовою належністю, виявлено, що ізоляти раси Т1 містять менше (в 1,3–2,5 раза) арахідонової кислоти, яка є активним еліситором стійкості рослин томата до ураження збудником фітофторозу і здатна індукувати відповідну захисну реакцію рослини проти фітопатогенів у вигляді некрозів (Озерецковская, 1994).

Зважаючи на наявність певної гомології між жирно-кислотним складом клітин і генотипом організму (Larkin, 2001) і, базуючись на кількісному вмісті ЖК у досліджених ізолятах, можна зробити припущення про існування в Північному Степу України принаймні чотирьох генотипів Ph. infestans (виділено світлим та темним фоном у табл. 2). При цьому “старий” генотип US-1, який донедавна складав світові агамні популяції Ph. infestans, є відсутнім.

Ймовірно, що ізолят 3 належить до одного генотипу з ізолятами 16, 12, та 19, а ізолят 10 за генотипом є ідентичним з ізолятом 1, оскільки в них різниця вмісту окремих ЖК, які не співпадають у кодовому розташуванні, майже відсутня, а інші визначені маркери при цьому є аналогічними (див. табл. 2).

Аналізуючи отримані нами результати та узагальнюючи літературні дані (Лазарева и др., 1999), можна зробити висновок, що місцева популяція Ph. infestans розвивались за наступною схемою:

A1, MЧ>A1, A2, MЧ >A1, A2, MЧ, МСС, MС.

Залежність патогенних властивостей Phytophthora infestans

від його біологічних особливостей

Метою цього досліду було обґрунтування доцільності дослідження біологічних властивостей збудника фітофторозу, що зумовлюють ступінь його агресивності (расова належність та тип сумісності). Встановлено, що результати штучної інокуляції томата значно різняться залежно від типу сумісності та расової належності ізолятів Ph. infestans. Це виявляється у відмінностях тривалості інкубаційного періоду, строках появи та інтенсивності спороношення, зон некротизації тканин і поширення міцелію (табл. 3).

Таблиця 3 _Ураження листків томата сорту СХ-4 ізолятами Ph. infestans

88069 (Т0, А1) та 90128 (Т1, А2)

Ізолят | Інкубаційний період,

днів | Період розвитку, днів | Зона некротизації тканин | Зона поширення міцелію | Інтенсивність споруляції (кількість спорангіїв на 1 см2 ураженої поверхні)

Середній діаметр, мм

88069

(Т0, А1) | 3 | 5 | 10,2 ± 1,3 | 10,4 ± 1,7 | 0,7 х 104

90128 (Т1, А2) | 2,5 | 3 | 19,9 ± 2,2 | 34,2 ± 3,1 | 2,8 х 104

Установлено також, що ступінь ураження залежить не тільки від патогену, але й від сорту рослини-господаря. Випробувані сорти та гібриди томата показали широкий діапазон реакції на інокуляцію листків ізолятом 88069 (Т0, А1) – від 21 до 100 %. При цьому 100 % ураження спостерігалось тільки на двох сортах (Дар Заволжя і СХ-4). Відносно стійкими виявились сорти СХ-3, Волгоградський 5/95 і Лагідний, які були уражені на 21; 24 та 25 % відповідно. На більшості сортів у місцях інокуляції утворювались некрози без спороношення. Вони мали темно-коричневе забарвлення і за розміром не перевищували інфекційної краплі.

За інокуляції рослин томата ізолятом 90128 найменше уражувалися сорти Волгоградський 5/95 і СХ-3 – 73,3 та 76,6 % відповідно. Сорт Лагідний, який характеризувався як відносно стійкий до ізоляту 88069, був уражений на 80,3 %. Розвиток захворювання на інших сортах сягав 90–100 %, причому 100 % ураження спостерігалося у 10-и з досліджуваних сортів та гібридів томата. Утворені некрози перевищували розмір інфекційної краплі в 2–3 рази, а іноді займали майже всю поверхню інокульованої частки листка. Спороношення патогену було від слабкого до середнього; на деяких сортах воно займало більшу площу ніж некроз і було рівномірним чи більш інтенсивним у місцях інокуляції.

Установлено, що залежно від агресивності використаного ізоляту розвиток хвороби відрізняється як за щодобовим ростом, так і за кінцевим результатом. Найбільша інтенсивність ураження відмічалася на 4–5-й день після інокуляції, причому у випадку з ізолятом 90128 вона була вищою майже у 3 рази.

Взаємовідносини Phytophthora infestans (Mont.) de Bary з

бактеріями родів Burkholderia та Bacillus

Інформація в літературі щодо наявності мікробів-антагоністів Ph. infestans обмежена, хоча цей напрямок вважають одним із найперспективніших у розвитку біологічного захисту рослин від фітофторозу (Kessel, 1995). Вибір для наших досліджень видів Bacillus sp. та Burkholderia sp. базувався на аналізі літературних джерел щодо антагоністичних властивостей цих бактерій до ряду фітопатогенних організмів (Гринько, 1998; Kotan et al., 1999; Sahin et al., 1999).

При спільному вирощуванні in vitro нами встановлений чітко виражений антагонізм штамів бактерій родів Burkholderia (ВА-7) та Bacillus (ВА-142, ВА-58) до Ph. infestans. У всіх дослідних варіантах було наявним значне пригнічення росту колоній Ph. infestans, діаметр яких порівняно з контролем був меншим в 2,5–3 рази. При цьому колонії штамів ВА-142 та ВА-58 вільно розростались, займали більшість площі живильного середовища і навіть переходили на міцелій Ph. infestans, значно пригнічуючи його розвиток; зовнішньо колонії суттєво різнились – рельєфно-смугасті та гілчасто-кучеряві відповідно. Колонії штаму ВА-7 аналогічно сильно пригнічували ріст і розвиток Ph. infestans, але не розповсюджувались на живильному середовищі і до кінця досліду зберігали діаметр штриха (1–2 мм).

При мікроскопуванні колоній гриба встановлено майже повну відсутність спороношення у варіанті з ВА-7. Слабке спороношення (в 10–12 разів менше, ніж у контролі) відмічено у варіантах зі штамами ВА-142 та ВА-58.

На 10-й день досліду спостерігався перехід штамів ВА-142 та ВА-58 на колонії Ph. infestans, причому бактерії викликали не тільки лізис міцелію, але й утворювали на ньому округлі міні-колонії. У варіанті зі штамом ВА-7 спостерігалось незначне (на 0,5–1 мм) збільшення діаметра бактеріальної колонії та слабкий ріст Ph. infestans в напрямку, протилежному розташуванню штриха.

ВИСНОВКИ ТА ПРОПОЗИЦІЇ

1. В умовах Північного Степу України фітофтороз томата є поширеною хворобою, розвиток якої за певних метеорологічних умов набуває характеру епіфітотії. Найбільш сприятливим для ураження ранніх та середньостиглих сортів томата є період наприкінці червня-початку липня. Ураженість пізніх сортів у вересні-жовтні навіть у засушливі роки за наявності опадів сягає 45 % і більше. Фітофторозом уражуються листки, стебла та плоди томата, причому останні – пере-важно (80 %) з базального боку. Спороношення збудника хвороби (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) спостерігається лише на листках і плодах томата.

Результати щодо впливу метеорологічних умов на розвиток фітофторозу та уточнення симптомів ураження рекомендується використовувати в прогнозуванні і діагностиці хвороби, а також при визначенні можливих від неї економічних втрат.

2. Ефективність вилучення Ph. infestans в чисту культуру, залежно від використаної для знезараження уражених тканин речовини та способу перенесення спороношення на живильне середовище, підвищується на 35; 45 та 60 % з плодів, стебел і листків томата відповідно. При ізоляції Ph. infestans з плодів доцільно проводити поверхневу обробку уражених тканин хлороксом з подальшим їх культивуванням на селективному живильному середовищі. Уражені листки та