Нацiональна академiя наук України
Нацiональна академiя наук України
Iнститут експериментальної патологiї, онкологiї i радiобiологiї
iм. Р.Є.Кавецького
Міністерство охорони здоров'я України
Український науково-дослідний інститут онкології і радіології
На правах рукопису
Шилiна Юлiя Володимирiвна
УДК 632.118.3:632.35
РАДIОБIОЛОГIЧНI ВЛАСТИВОСТІ РЕАКЦІЇ НАДЧУТЛИВОСТI
У РОСЛИН
03.00.01. - радiобiологiя
Автореферат
дисертацiї на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
Київ - 1999
Дисертацiєю є рукопис.
Робота виконана на кафедрi радiобiологiї Київського унiверситету iм. Тараса Шевченка та у віддiлi бiофiзики та радiобiологiї Iнституту клiтинної бiологiї та генетичної iнженерiї НАН України.
Науковий керiвник - академік НАН України, доктор бiологічних наук, професор
Гродзінський Дмитро Михайлович,
завідувач відділу біофізики та радіобіології Iнституту
клiтинної бiологiї та генетичної інженерії НАН України
Офiцiйнi опоненти: доктор бiологічних наук, професор, член-кор. УААН
Гудков Ігор Миколайович,
Національний аграрний університет УААН,
завідувач кафедри радіобіології;
доктор бiологічних наук, професор
Войціцький Володимир Михайлович,
Київський університет ім. Тараса Шевченка
Міністерства освіти України, професор кафедри біохімії
Провiдна установа - Інститут мікробіології та вірусології
ім. Д.К.Заболотного НАН України
Захист вiдбудеться "__" __________ 1999 року о 13 год 30 хв на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д 26.155.01 в Iнститутi експериментальної патологiї, онкологiї i радiобiологiї iм. Р.Є. Кавецького НАН України (252022, Київ-22, вул. Василькiвська, 45).
З дисертацiєю можна ознайомитись у бiблiотецi IЕПОР НАН України.
Автореферат розiсланий "__" ________ 1999 р.
Вчений секретар
спецiалiзованої вченої ради
доктор медичних наук
І.В.Абраменко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальнiсть теми. Дослідження радіобіологічних ефектів іонізуючого випромінювання в широкому діапазоні доз, визначення типових змін та особливостей радіогенних структурних, а також функціональних порушень в біологічних системах є актуальною проблемою сучасної радіобіології. Прикладом складної біологічної системи динамічного характеру можна вважати систему, яка забезпечує здійснення реакції надчутливості у рослин. Реакцiя надчутливостi рослин (РНЧ) полягає в загибелi клiтин, iнiцiйованій розпізнаванням ними патогену. Це приводить до некротизацiї тканин у мiсцi локалiзацiї патогена та обмеження його зони колонiзацiї [Atkinson, 1993; Klement et al., 1990]. Хоча РНЧ, яка проявляється у прискореній загибелі інфікованих клітин, є одним з найпоширеніших типів захисту рослин від фітопатогенних мікроорганізмів, і її дослiдженню присвячена значна кiлькiсть робiт, але до цих пір ще не створено узагальненої картини розвитку цієї реакцiї. Дослiджені тiльки окремi етапи процесу розвитку РНЧ, якi здебiльшого торкаються її молекулярного рiвня [Kombrink , Somssich , 1995; Levine et al., 1994].
Враховуючи безперечну значимiсть результатiв, якi може дати дослiдження особливостей формування радiобiологiчної реакцiї складної системи, якою є РНЧ, слiд зазначити, що дослідження дозових залежностей радіобіологічних ефектів складних систем дають змогу розкривати їх структурнофункціональну організацію. Частковим вирiшенням цiєї проблеми є виявлення критичних етапів та пов'язаних з ними структур, радiацiйне ураження яких робить основний внесок в радiобiологiчну реакцiю системи. Все це дало пiдстави застосувати iонiзуюче випромiнювання для дослiдження основних етапiв розвитку реакцiї надчутливостi за їх радіочутливістю.
Мета i задачi дослiдження. Метою роботи було дослідити процес розвитку РНЧ, з'ясувати критичнi по вiдношенню до впливу опромiнення етапи розвитку реакцiї за критерієм радіочутливості. В задачi дослiдження входило:
1. Вивчити вплив іонізуючого випромінювання на рiзні етапи розвитку РНЧ, одержати її дозовi та часовi характеристики.
2. Встановити вплив опромінення фітопатогенних бактерiй на процес розвитку РНЧ.
3. Оцiнити ефект комбінованої дiї опромiнення рослин та фітопатогенних бактерiй у формуваннi радiобiологiчної реакцiї в системi, що забезпечує розвиток РНЧ.
Наукова новизна одержаних результатiв. Вперше проведене систематичне дослідження впливу iонiзуючого випромiнювання на процес розвитку РНЧ. Встановлено часовий i дозозалежний характер ефектiв, які спричинені опроміненням рослин на рiзних етапах розвитку реакцiї надчутливостi. Показано, що на розвиток реакцiї надчутливостi впливає опромiнення як рослин, так i бактерiй, визначено дозовi характеристики цього впливу.
За допомогою регресійного аналізу (метод Бокса-Уілсона) одержано статистичну модель радiацiйного впливу на РНЧ, з використанням якої було визначено незалежну компоненту радiацiйного ураження рослин i бактерiй та оцiнено внесок взаємодiї ефектiв опромiнення рослин i бактерiй в процес розвитку РНЧ. Показано, що на етапі індукції реакції фітопатогенні бактерії, які індукували її розвиток, та іонізуюче випромінювання діяли як антагоністи, взаємно послаблюючи вплив одне одного. Це свiдчить про те, що iндукцiя загибелi рослинних клiтин при РНЧ та опромiненнi може вiдбуватися за подібними механiзмами.
Практичне значення роботи полягає в тому, що встановлення критичних етапiв у процесi РНЧ по вiдношенню до впливу опромiнення є важливим шляхом вивчення механiзмiв цiєї реакцiї. Дослідження механiзмів фiзико-хiмiчних, бiохiмiчних та фiзiологiчних процесiв, що розвиваються при контактi фiтопатогена та рослини в ходi цiєї реакцiї, дозволяє активно втручатися у формування стiйкостi рослин та створювати нові, альтернативні засоби захисту рослин. Це набуває особливо важливого значення для територій із значними рівнями радіонуклідного забруднення. Крiм того, розумiння сутностi механiзмiв взаємодiї фiтопатогена та вищої рослини сприяє знаходженню найбiльш придатних критеріїв, що характеризують стiйкiсть рослин, якi можна використати в селекцiйнiй практицi.
Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, статистичній обробці результатів, підборі та аналізі даних наукової літератури, а також - за участю наукового керівника та співавторів публікацій - аналізі та інтерпретації одержаних результатів. При наладці експериментальної установки для вимірювання електроопору зразків автору надавали допомогу співробітники відділу І.Є. Рибалка і Ю.О.Павленко.
Апробацiя результатiв дисертацiї. Основнi положення дисертацiйної роботи доповiдались на II З'їздi радiобiологiв України (Днiпропетровськ,1995); IV Мiжнароднiй конференцiї "Життя та смерть клiтини" (Едiнбург, Англiя, 1996); VI Конференцiї молодих вчених, присвяченiй 50-й рiчницi з дня заснування Iнституту фiзiологiї рослин i генетики НАН України (Київ, 1996); III З'їздi по радiацiйним дослiдженням (Москва, 1997).
Публiкацiї. Основний змiст дисертацiйної роботи викладено у 9 публiкацiях у формi наукових статей та тез доповiдей.
Структура та об'єм роботи. Дисертацiя складається з вступу, огляду лiтератури (3 роздiли), опису матерiалiв та методiв дослiдження, викладення результатiв та їх обговорення (4 роздiли), висновкiв, заключення, перелiку лiтератури (225 джерел, в тому числi - 145 зарубiжних праць). Робота представлена на 184 сторiнках машинопису, мiстить 21 рисунок та 14 таблиць.
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
В якості об'єктів при дослідженні процесів, пов'язаних з патогенезом та стійкістю у рослин і, зокрема, розвитком РНЧ, широко використовують рослини тютюну та фітопатогенні бактерії Pseudomonas syringae [Klement, 1963; Klement et al., 1990]. В дослідах використовували рослини тютюну Nicotiana sanderae та неспецифічний штам фiтопатогенних бактерiй Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 291 (з колекцiї вiддiлу фiтопатогенних бактерiй Iнституту мiкробiологiї та вiрусологiї iм. Д.К.Заболотного НАН України). За люб'язне надання культур та цiннi консультацiї висловлюємо глибоку подяку завiдувачу вiддiлом професору Р.I.Гвоздяку та с.н.с., канд. бiол. наук Л.М.Яковлєвiй.
Рослини тютюну вирощували в умовах теплицi до фази 5-7 розвинутих листкiв. В експериментах використовували розвинуті листки 2-3 ярусів. Бактерiї вирощували на твердому поживному середовищi - картопляному агарi [Бельтюкова и др., 1968]. Пiсля 48 год культивування бактерiальнi клiтини змивали стерильною водою з поверхнi агару i суcпензували. Суспензiї доводили до концентрацiї 108 клiтин/мл.
Для iндукування розвитку РНЧ використовували метод iн'єкцiй-iнфiльтрацiй згідно [Klement, 1963; Кlement et al., 1990] в певній модифікації. Листки тютюну iнфiльтрували суспензiєю живих бактерiальних клiтин та стерильною водопровiдною водою (контроль), вводячи їх за допомогою шприца в мiжклiтинний простiр листкiв. При цьому бактерiї вводили в одну половинку листка, а воду - в iншу.
Метод, який використовували для кількісної характеристики розвитку РНЧ, базується на залежності кількості електролітів, що виходять з рослинних клітин внаслідок зміни проникності клітинних мембран, від ступеню розвитку реакції надчутливості і полягає у визначенні електропровідності елюатів, одержаних з листків протягом певного часу після їх інфільтрації бактеріальною суспензією [Cook, 1973; Stall et al., 1982; Klement et al., 1990]. Для спостереження за динамікою процесу розвитку РНЧ через 1-24-годинні iнтервали робили висiчки з iнокульованих листкiв (у виглядi дискiв дiаметром 1 см), витримували їх протягом 17 год у дистильованiй водi при кімнатній температурі (15 дискiв на 30 мл води), пiсля чого вимiрювали електричний опiр одержаних розчинiв електролiтiв (елюатiв). По значенням електричного опору цих елюатiв вираховували їх питому електропровiднiсть (См.м).
Для вивчення впливу iонiзуючого випромiнювання на розвиток РНЧ рослини тютюну та суспензiї бактерiальних клiтин пiддавали дiї гострого гамма-випромiнювання на установцi "Исследователь" в дiапазонi доз вiд 1 до 600 Гр (60Co, потужнiсть дози 6,3 - 7,5.10-2 Гр/с). В першій серії дослідів рослини тютюну опромінювали в дозах 150, 300 та 600 Гр за 0,5 год до зараження їх бактеріями. В другiй серiї дослiдiв рослини тютюну спершу iнокулювали суспензiєю бактерiальних клiтин i потiм, через певнi часовi промiжки, опромiнювали в дозах вiд 1 до 600 Гр.
Для оцiнки впливу гамма-випромiнювання на виживання бактерiй P. syringae pv. phaseolicola 291 суспензiю 24-годинної культури бактерiй (106 клiтин/мл) опромiнювали в дозах вiд 1 до 100 Гр. Опромiненi суспензiї доводили до концентрацiї 5.103 клiтин/мл i висiвали на тверде поживне середовище. Культивували 48 год при температурi 28 0С, пiсля чого пiдраховували кiлькiсть макроколонiй, що утворилися. Виживання бактерiй оцiнювали по вiдношенню до неопромiненого контролю.
Статистичну обробку результатів проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Плохинский, 1980].
Для дослiдження ефектiв комбінованої дії опромiнення рослин та бактерiй у формуваннi РНЧ був застосований один з методів регресійного аналізу - метод Бокса-Уілсона [Адлер и др., 1976; Бондарь, Статюха, 1976]. Дослiди проводили по стандартній схемі повного факторного експерименту типу 2n (n - число факторiв впливу на систему) для двох факторiв, кожен з яких приймав по два значення. План дослiдiв передбачав одержання експериментальних значень дослiджуваних характеристик при всiх можливих комбiнацiях рiвнiв даних факторiв.
Проведення дослiдiв по такiй схемі дозволяє оцiнити параметри регресiйного рiвняння типу
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b1b2x1x2..
Коефiцiєнти b1 i b2 вказують на незалежний внесок кожного з факторiв у значення дослiджуваної функцiї вiдгуку, а коефiцiєнт b1b2 - на ступiнь взаємодiї цих факторiв.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1. Вплив попереднього опромiнення рослин на розвиток реакцiї надчутливостi
Аналiзуючи дані, що вiдображають змiни в електропровiдностi елюатiв, одержаних з листкiв рослин, опромiнених за 0,5 год до зараження бактерiями, вiдзначали два максимуми зростання електропровiдностi, якi мали подiбний характер для всiх застосованих доз опромiнення (150, 300 і 600 Гр). Рис. 1 вiдображає типову динамiку змiни електропровiдностi елюатiв (доза опромiнення 300 Гр).
Рис. 1 Динаміка електропровідності елюатів при опроміненні рослин ( доза 300 Гр)
до їх інокуляції бактеріями та водою
Перший з максимумiв спостерiгали через одну годину пiсля iнокуляцiї бактерiями опромінених рослин. Вiн мав неспецифiчний характер, оскiльки вiдзначався як у дослiдному (при інокуляції рослин бактерiями), так i в контрольному (iнокуляцiя рослин водою) варiантах. У неопроміненому варіанті цей максимум відсутній.
З третьої години спостерігали зниження електропровiдностi, яке відбувалося, очевидно, за рахунок вiдновлення функцiї мембран рослинних клiтин, і мало дозозалежний характер. Найбiльше зниження електропровідності спостерiгали при дозi 150 Гр, тодi як при дозах 300 i 600 Гр воно було значно меншим. Пiсля третьої (дози 150, 600 Гр) та п'ятої годин (доза 300 Гр) у випадку iнокуляцiї бактерiями спостерiгали друге зростання електропровiдностi елюатiв, яке цього разу мало специфiчний характер i було пов'язане вже безпосередньо з розвитком реакцiї надчутливостi.
При дозах 300 та 600 Гр вже на 9 год електропровiднiсть елюатів була близькою до максимальної, яка визначалася при загибелі клітин на кiнцевому етапі розвитку РНЧ. У неопроміненому варіанті такий стан спостерігали на 24-ту годину.
В табл. 1 наведені відносні величини електропровідності (за 100 % приймали величину електропровідності елюатів, одержаних з неопромінених рослин). При високих дозах опромінення (300, 600 Гр) значення електропровідності на всьому часовому інтервалі значно перевищують 100 %-ний рівень, тобто фактично весь процес розвитку РНЧ проходив на фоні підвищеної проникності мембран і це не могло не вплинути на його динаміку.
Таблиця 1. Динаміка відносних величин електропровідності при опроміненні рослин до інокуляції бактеріями. За 100 % приймали електропровідність елюатів з листків неопромінених рослин, інокульованих РНЧ-індукуючими бактеріями.
Час після інокуляції бактерій, год |
Доза опромінення
150 Гр |
Доза опромінення
300 Гр |
Доза опромінення
600 Гр
1 | 2894 | 5362 | 4072
3 | 1581 | 4232 | 3583
5 | 1434 | 2071 | 3102
7 | 1024 | 1834 | 1953
9 | 1145 | 2122 | 2725
11 | 1038 | 1343 | 1283
24 | 885 | 1004 | 1003
Таким чином, можна констатувати прискорення розвитку РНЧ у випадку попереднього опромiнення рослин в дозах 300 та 600 Гр. Посиленню реакцiї могли сприяти радiацiйно-iндукованi змiни, пов'язанi насамперед зi змiною проникностi мембран та перерозподiлом iонiв, якi вiдiграють регуляторну роль, що приводить до дисбалансу багатьох клiтинних процесів. Вiдомо, що змiни в iонному (насамперед, К+ та Са2+) балансi завжди передують i є необхiдною умовою загибелi рослинних клiтин внаслiдок РНЧ [Kombrink, Somssich, 1995; Atkinson, 1993], а опромiнення могло викликати такі змiни ранiше i ефективнiше, нiж це вiдбувається при активацiї iоннних каналiв внаслiдок iндукцiї РНЧ. Такий підхід виявив синергізм у дії іонізуючого випромінювання та фітопатогенних бактерій, проте не дозволив структурувати процес розвитку реакції.
2. Вплив іонізуючого випромінювання на рiзні етапи розвитку реакцiї надчутливостi
Виходячи зi складностi та багатоетапностi процесу розвитку РНЧ, вiдмiнностей структур та процесiв, що домiнують на рiзних етапах реакцiї, можна припустити різний рівень їх критичностi по вiдношенню до дiї іонізуючого випромiнювання і виділити окремі етапи реакції за критерієм їх радічутливості. З цією метою було проведено дослiдження впливу гамма-випромінювання на РНЧ в рiзнi моменти її розвитку.
Якщо рослини опромiнювали через 5-20 хв пiсля iнокуляцiї бактерiями, то при дозах більше 10 Гр, спостерiгали пригнiчення розвитку реакцiї (рис. 2,1).
Рис. 2 Залежність від дози опромінення електропровідності елюатів при опроміненні рослин через 5-20 хв (1), 30-60 хв (2), 2-5 год (3) після інокуляції рослин РНЧ-індукуючими бактеріями
За 100 % приймали електропровідність елюатів з листків неопромінених рослин, інокульованих РНЧ-індукуючими бактеріями
На 24-ту годину (час повного розвитку РНЧ в контролi) при дозах опромiнення 50-65 Гр значення електропровiдностi елюатiв становило близько 78 % вiд контрольної величини (неопромiненi рослини, iнокульованi бактерiями), а при дозах, що перевищували 85 Гр - приблизно 28 %, що дорiвнювало значенню електропровідності у випадку, коли рослини iнокулювали водою, тобто при повнiй вiдсутностi розвитку РНЧ .
При збiльшеннi часового iнтервалу мiж iнокуляцiєю бактерiями та наступним опромiненням рослин до 30-60 хв iнгiбуючий вплив опромiнення проявлявся при дозах, якi перевищували 65 Гр (рис. 2,2), а при опромiненнi через 2-5 год - 85 Гр i вище (рис. 2, 3).
Аналіз одержаних результатiв свідчить, що обранi для досліджень дози опромiнення є значно нижчими вiд доз, застосованих у попереднiй серiї дослiдiв при опромiненнi рослин до iнокуляцiї бактерiями, і спричинили значний iнгiбуючий вплив на розвиток РНЧ.
Відносно дiї радiацiї на раннiх етапах РНЧ (1-3 год) можна припустити, що iнгiбуючий ефект опромiнення обумовлюється впливом на процеси розпiзнавання та сигнальної трансдукцiї через дiю на самi бактерiальнi клiтини (їх елiситорну активнiсть), метаболiзм сигнальних компонент рослинних клiтин, стан та функцiї клiтинних мембран, активнiсть ряду ферментiв тощо.
Що стосується виявленого iнгiбування реакцiї при дiї радiацiйного фактору на бiльш пiзнiх етапах її розвитку (5 год, зокрема), то можна припустити, що iнгiбуючий ефект опромiнення є результатом впливу на процеси, якi йдуть в самих рослинних клiтинах на пiзнiших стадiях реакцiї, i вже не пов'язанi безпосередньо з взаємодiєю рослинних клiтин з патогеном, як слідує з встановлених фактiв існування перiодизацiї в розвитку РНЧ [Klement, 1971; Klement et al., 1990; Atkinson, 1993]. Особливiстю впливу радiацiйного фактору на цьому етапi є те, що він здатен заблокувати реалiзацiю ряду обумовлених попереднiм ходом подiй процесiв, зокрема, зростання проникностi мембран рослинних клiтин.
3. Внесок опромiнення патогену у розвиток реакцiї надчутливості
Виходячи з виявленого iнактивуючого ефекту, спричиненого гамма-випромiнюванням на раннiх стадiях РНЧ, а також того, що попереднє опромiнення самих рослин, навiть у високих дозах, не приводило до iнгiбування реакцiї, можна припустити, що критичною ланкою в цьому випадку є функцiональна активнiсть патогену - бактерiальних клiтин. З метою дослiдження внеску опромiнення бактерiй у розвиток РНЧ опромiнювали суспензiї бактерiальних клiтин з їх наступною iнокуляцiєю в неопромiненi рослини. В результатi був виявлений iнгiбуючий вплив, який спричинило попереднє опромiнення бактерiй, на розвиток реакцiї надчутливостi.
Рис. 3 Електропровідність елюатів при опроміненні бактерій
За 100 % приймали електропровідність елюатів з листків рослин, інокульованих неопроміненими бактеріями
Аналіз результатів, представлених на рис. 3 свідчить, що при інокуляції рослин бактеріями, опромiненими у дозi 1 Гр, на 24-ту годину спостереження величина електропровiдностi елюатiв з рослинних тканин, за якою, як i в попереднiх дослiдах, характеризували ступiнь розвитку реакцiї , дорiвнювала контрольнiй, а при збiльшеннi дози опромінення бактерій до 10 Гр становила пересічно 39 % контрольної величини. При цьому спостерiгали хлороз iнокульованих зон, що є нетиповим для РНЧ, а некротичнi симптоми проявлялися пiзнiше та слабше, нiж у контролi, який iнфiкували неопромiненими бактерiями.
Якщо застосовували вищi дози опромiнення бактерiй (50, 100, 150 Гр), електропровiднiсть на 24-ту годину становила пересічно 32 % вiд контролю, що вiдповiдало повнiй вiдсутностi будь-яких симптомiв розвитку реакцiї.
Було проведене порiвняння величини виживання бактерiй при опромiненнi та їх здатностi запускати процес розвитку реакцiї надчутливостi.
На рис. 4 наведена залежнiсть "доза-ефект", де в якостi ефекту виступало виживання бактерiй. Аналіз залежності ступеню виживання бактерій від дози опромінення вказує на те, що як i бiльшiсть представникiв роду Pseudomonas [Захаров, Кривинский, 1972], бактерiї P. syringae pv. phaseolicola 291 виявилися досить радiочутливими.
При співставленні ступеню виживання бактерій та електропровідності елюатів, за якою характеризували ступінь розвитку РНЧ, можна бачити, що при дозi опромiнення 1 Гр, коли виживання бактерiй становило біля 76 % ,
Рис. 4 Виживання клітин бактерій P. syringae pv. phaseolicola при їх гамма-опроміненні
електропровiднiсть, що характеризувала розвиток реакцiї, була близькою до контрольних значень. Доза опромiнення бактерiй 10 Гр (виживання до 39 %) обумовлювала розвиток реакцiї з певною затримкою (величина електропровiдностi на 24-ту годину становила близько 46 % контрольної). При дозi 50 Гр (виживання до 15 %), бактерiї втрачали здатнiсть iндукувати РНЧ.
Порiвнюючи ступiнь розвитку РНЧ при опромiненнi рослин, інокульованих бактерiями (рис. 2), і при опроміненні самих бактерій бачимо, що процес розвитку реакцiї характеризувався бiльшою стiйкiстю до впливу опромiнення, нiж у випадку, коли суспензiю бактерiй опромiнювали окремо до iнокуляцiї в мiжклiтинний простiр рослинних листкiв (рис. 3). Навiть при мiнiмальному часовому iнтервалi мiж iнокуляцiєю бактерiй i опромiненням (5-20 хв) ступiнь розвитку реакцiї не вiдрiзнявся вiд контролю (100 %) при дозi 10 Гр, при дозi 50 Гр наближався до 78 % i при дозах, якi перевищували 85 Гр, реакцiя не розвивалась (рис. 2 ). При iнокуляцiї ж опромiнених бактерiй реакцiя не розвивалася, якщо вони були опромiненi в дозi 50 Гр (рис. 3). Можливо, тут має значення стимуляцiя за рахунок контакту рослинних i бактерiальних клiтин, коли структури останнiх ще не зазнали впливу опромiнення, оскiльки бактерiї можуть створювати сигнал для запуску РНЧ з перших хвилин їх контакту з рослинними клiтинами [Huynk et al., 1989; Alfano, Collmer , 1996], а також те, що бактерiальнi клiтини, можливо, зазнали деякої радiозахисної дiї з боку речовин рослинних клiтин.
Виходячи з наведених фактiв, можна припустити, що при дiї іонізуючої радiацiї iнгiбування реакцiї рослин могло вiдбуватися як за рахунок радiолiзу частини молекул, що виконують функцiю елiситорiв (радiостiйка компонента в дозовiй залежностi на рис. 3), так i за рахунок порушення функцiй бактерiальних ферментiв та експресiї генiв авiрулентностi, якi приймають участь у процесах взаємодiї бактерiй з клiтинами рослин-господарiв (радiочутлива компонента). Очевидно, цi iндукованi радiацiєю порушення i вiдiгравали вирiшальну роль у блокуваннi розвитку РНЧ при впливi опромiнення на раннiх етапах її розвитку.
Таким чином, найбiльшою радiочутливiстю характеризувався етап взаємодiї патогена з клiтинами рослини, коли вiдбувається iндукцiя надчутливої вiдповiдi рослини-господаря структурами клiтин патогена.
4. Ефекти комбінованої дiї факторiв опромiнення рослин i бактерiй при розвитку РНЧ
Необхідною умовою розвитку РНЧ є взаємодiя структур рослинних та бактерiальних клiтин. Ці структури можуть зазнавати суттєвих змiн пiд впливом опромiнення рослин або бактерiй. За допомогою методу Бокса-Уілсона було визначено незалежну компоненту радiацiйного ураження рослин i бактерiй та оцiнено внесок взаємодiї ефектiв опромiнення рослин i бактерiй в процес розвитку РНЧ.
Планування дослiдiв проводилось у вiдповiдностi з схемою повного факторного експерименту для двох факторiв, кожен з яких приймав по два значення. Матриця планування експерименту та результати вимiрiв наведенi в табл. 2.
Таблиця 2. Матриця планування експерименту по вивченню ефектiв опромiнення рослин i бактерiй при розвитку РНЧ:
x1 - фактор опромiнення рослин, x2- фактор опромiнення бактерiй, x1x2 - взаємодiя факторiв опромiнення рослин i бактерiй, y - функцiя вiдгуку (величина електропровiдностi елюатiв при опромiненнi у вказаних дозах)
Номер
дослiду | x1 | x2 | x1x2 | y
1 Гр | y
10 Гр | y
50 Гр | y
100 Гр | y
150 Гр | y
300 Гр
1
2
3
4 | -
+
-
+ | -
-
+
+ | +
-
-
+ | 100
100
100
100 | 100
100
45
100 | 100
100
40
100 | 100
100
40
31 | 100
100
40
30 | 100
100
40
30
На їх основi були розраховані коефіцієнти рiвнянь регресії, що характеризують внески кожного з факторiв у процес розвитку реакції в залежностi вiд дози опромiнення та внесок взаємодiї факторiв (рис. 5).
Аналіз залежності величини внеску фактора опромінення рослин (коефіцієнт b1) від дози опромінення показав, що знак впливу цього фактора змiнюється iз зростанням дози опромiнення. Отже, для фактора опромінення рослин виявилася непостiйнiсть його внеску в процес розвитку РНЧ: меншi дози опромiнення (до 50 Гр) сприяли розвитку реакцiї, а великi (вiд 100 Гр) - iнгiбуванню. Стимулюванню розвитку РНЧ у випадку менших доз могли сприяти радiацiйноiндукованi змiни, пов'язанi насамперед зi змiною проникностi мембран та перерозподiлом iонiв, якi вiдiграють регуляторну роль, що приводить до дисбалансу багатьох клiтинних процесів. Iнгiбування перебігу РНЧ при зростаннi дози опромiнення могло бути обумовлене радiацiйним впливом на процеси розпiзнавання та трансдукцiї сигналiв (функцiонування поверхневих рецепторiв та компонентiв полiфосфоiнозитидної сигнальної системи i системи цАМФ, Са2+-, фосфолiпiдзалежних протеїнкiназ тощо), а також процесiв транскрипцiї i трансляцiї в опромiнених рослинних клiтинах. Очевидно, це призвело до антагонiзму у дiї опромiнення по вiдношенню до процесу розвитку РНЧ.
Аналіз залежності внеску опромiнення бактерiй (коефіцієнт b2) від дози опромінення показав, що у всьому застосованому дозовому дiапазонi опромінення бактерій здiйснювало iнгiбуючий вплив на розвиток РНЧ. Цей вплив зростав iз збiльшенням дози опромiнення, спричиняючи повне блокування РНЧ при дозах, що перевищували 100 Гр.
Рис. 5 Залежність від дози опромінення внесків факторів опромінення рослин (b1), бактерій-індукторів РНЧ (b2) та їх взаємодії (b1b2) у розвиток РНЧ
По значенню коефiцiєнта b1b2 (рис. 5) оцiнювали ступiнь неадитивностi комбінованої дiї опромiнення рослин i бактерiй на реакцiю надчутливостi. При менших дозах опромiнення, коли цей коефiцiєнт мав позитивне значення, взаємодiя факторiв мала антагонiстичний характер: опромiнення рослин сприяло розвитку РНЧ, а опромiнення бактерiй, навпаки, обумовлювало її iнгiбування. Знаходження коефiцiєнта b1b2 при збiльшеннi дози (понад 100 Гр) в областi негативних значень означає, що фактори опромiнення рослин i бактерiй, взаємодiючи, здiйснювали негативний вплив на розвиток реакцiї, тобто тут мав мiсце синергiчний ефект.
Виходячи з одержаних у нашiй роботi результатiв, найбiльш критичним по вiдношенню до дii опромiнення слiд вважати етап iндукцiї РНЧ, з котрим пов'язанi процеси розпiзнавання патогену та трансдукцiї сигналiв у клiтинах рослини-господаря, що є визначальним для всього подальшого розвитку реакцiї, який закiнчується загибеллю iнфiкованих клiтин.
Одержані в роботі результати, що стосуються дії гострого опромінення на взаємодію рослини з фітопатогенними бактеріями можуть сприяти формуванню нових напрямків досліджень. Зокрема, в проведених дослідах застосовані дози опромінення приводили до значного зниження життєздатності бактерій, з чим можна насамперед пов'язати порушення процесів розпізнавання рослиною патогену. Проте здається цілком припустимим, що при хронічному опроміненні з низькими потужностями поглинутих доз, існує певний діапазон доз, коли внаслідок індукованих мутаційних процесів та регуляторних порушень, обумовлених дією іонізуючого випромінювання, можливі зміни експресії відповідних генів (зокрема, генів авірулентності) у клітинах фітопатогенів без суттєвого зниження їх виживання. Це може привести до змін у синтезі та експресії патогеном молекул еліситорів, що індукують захисну реакцію рослини. Такі патогени не будуть розпізнаватися рослинними клітинами і матимуть умови для свого розвитку в тканинах рослин, викликаючи патологічний процес.
За допомогою регресійного аналізу було показано, що на етапі індукції реакції фітопатогенні бактерії, які індукували її розвиток, та іонізуюче випромінювання у високих дозах діяли як антагоністи, взаємно послаблюючи вплив одне одного. Не виключено, що при iндукцiї загибелi рослинних клiтин при РНЧ та опромiненнi є задіяними одні і ті ж механізми. Ці механізми можуть бути подібними до апоптозу, який спостерігали в ряді випадків при розвитку РНЧ [Bachmair et al., 1990; Greenberg, Ausubel, 1993; Dietrich et al., 1994; Greenberg et al., 1994; Lamb, 1994; Vaux et al., 1994; Mittler et al., 1995].
ВИСНОВКИ
1. Встановлено, що розвиток реакції надчутливості (РНЧ) прискорюється при опромiненні рослин у високих дозах (50-600 Гр) до інокуляції їх фітопатогенними бактеріями, і затримується при опроміненні рослин після їх інокуляції.
2. РНЧ є найбiльш радiочутливою на початковому етапі взаємодiї рослинних клітин з бактеріями, коли вiдбувається iндукцiя РНЧ (30-60 хв після інокуляції рослин бактеріями). На цьому етапі реакція повністю інгібувалася при опроміненні у дозах, що перевищували 85 Гр.
3. Опромінення бактерій приводить до інгібування розвитку РНЧ, що вказує на залежність перебігу цієї реакції від функціональної активності бактеріальних клітин. Реакція не розвивалася при інокуляції рослин бактеріальною суспензією, опроміненою у дозі 50 Гр, коли виживання бактерій становило приблизно 15 %.
4. Регресійний аналіз результатів дослідів по вивченню комбінованої дії фітопатогенних бактерій та іонізуючого випромінювання показав, що у впливі випромінювання та патогену на етапі індукції РНЧ (1-3 год після зараження рослин бактеріями) має місце антагонізм, а на подальших етапах процесу розвитку реакції - синергізм.
5. Визначальною для розвитку РНЧ є функціональна активність бактеріальних клітин, що виявляють значну чутливість до дії радіаційного фактору.
ПЕРЕЛIК РОБIТ, ОПУБЛIКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦIЇ
1. Шилiна Ю.В., Мiхєєв О.М., Гуща М.I., Гродзiнський Д.М. Застосування радiобiологiчних методiв для дослiдження реакцiї надчутливостi у рослин // Доповiдi НАН України.- 1997. - N 11. - C. 175-177.
2. Шилiна Ю.В., Мiхєєв О.М., Гуща М.I., Гродзiнський Д.М. Застосування радiобiологiчного методу для дослiдження механiзмiв реакцiї надчутливостi до фітопатогенів у рослин // Фiзiологiя i бiохiмiя культурних рослин. -1998.- Т. 30, N 3.- С. 187-193.
3. Шилiна Ю.В., Мiхєєв О.М., Гуща М.I., Гродзiнський Д.М. Застосування iонiзуючого випромiнювання для дослiдження елементiв взаємодiї господар-патоген на прикладi реакцiї надчутливостi у рослин // Мiкробiол. журн. -1998.- Т. 60, N 4. - С. 94-100.
4. Шилiна Ю.В., Мiхєєв О.М., Гуща М.I., Гродзiнський Д.М. Дослiдження впливу iонiзуючого випромiнювання на розвиток стресової реакцiї на прикладi реакцiї надчутливостi у рослин // Актуальнi проблеми фiзiологiї водного режиму та посухостiйкостi рослин. -К.: ТОВ "Мiжнар. фiн. агенцiя", 1997. - С. 35-37.
5. Шилiна Ю.В. Властивостi реакцiї гiперчутливостi у рослин // Збiрник праць студентiв та аспiрантiв Київського університету iм. Тараса Шевченка. Природничi науки. /Випуск 2. - Київ. Ун-т.- Київ, 1995. - С. 19-27.
6. Шилiна Ю.В., Гродзінський Д.М. Вплив гострого гамма-випромi-нювання на реакцiю гiперчутливостi у рослин // II З`їзд радiобiологiв України (Днiпропетровськ, 22-24 вересня 1995): Тез. доп. - Київ. 1995. - С. 199.
7. Shilina J.V., Mikheev A.N., Guscha M.I., Grodzinsky D.M. The influence of gamma-radiation on hypersensitive reaction of Nicotiana sanderae plant // 4th IUBMB Conference "The life and death of the cell" (Edinburg International Conference Centre, 14-17 July 1996): Abstr. //Biochemical Society Transactions.London. -1996.- Vol. 24, Part 4. - P. C83.
8. Шилiна Ю.В. Дослiдження реакцiї надчутливостi рослин iз застосуванням радiобiологiчного методу // Актуальнi проблеми фiзiологiї рослин i генетики.- Київ, 1996. - С. 61-62.
9. Шилина Ю.В., Михеев А.Н., Гуща Н.И., Гродзинский Д.М. Изучение реакции сверхчувствительности растений с применением радиобиологического метода // 3 Сьзд по радиационным исследованиям (Москва, 14-17 октября 1997). - Тезисы докладов.- Пущино, 1997. - Том 1. - С. 169.
Шиліна Ю.В. Радіобіологічні властивості реакції надчутливості у рослин. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 - радіобіологія. -Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Український науково-дослідний інститут онкології та радіології МОЗ України, Київ, 1999.
Дисертація присвячена питанню дослідження радіобіологічних характеристик реакції надчутливості (РНЧ) у рослин тютюну Nicotiana sanderae заражених бактеріями Pseudomonas syringae pv. phaseolicolа. При впливі гамма-випромінювання в дозах 50-600 Гр найбільшою радіочутливістю характеризувався етап взаємодії рослин і бактерій, коли відбувається індукція реакції рослини-господаря. Встановлено, що визначальною ланкою для розвитку РНЧ є функціональна активність бактеріальних клітин, які виявляють значну радіочутливість.
Ключові слова: реакція надчутливості у рослин, гамма-випромінювання, тютюн, псевдомонас, радіочутливість.
Шилина Ю.В. Радиобиологические свойства реакции сверхчувствительности у растений. - Рукопись.
Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 - радиобиология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины, Украинский научно-исследовательский институт онкологии и радиологиии МОЗ Украины, Киев, 1999.
Дисертация посвящена вопросу исследования радиобиологических характеристик реакции сверхчувствительности (СВЧ) у растений табака Nicotiana sanderae зараженных бактериями Pseudomonas syringae pv. phaseolicolа. При воздействии гамма-излучения в дозах 50-600 Гр наибольшей радиочувствительностью характеризовался этап взаимодействия растения и бактерий, когда происходит индукция реакции растения-хозяина. Установлено, что определяющим звеном для развития СВЧ является функциональная активность бактериальных клеток, которые проявляют значительную радиочувствительность.
Ключевые слова: реакция сверхчувствительности у растений, гамма-излучение, табак, псевдомонас, радиочувствительность.
J.V.Shilina. The radiobiology property of hypersensitive reaction of plants.- Manuscript.
Thesis for obtaining scientific degree of Candidate of biological sciences on speciality 03.00.01 - radiobiology. - Institute of experimental pathology, onkology and radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Ukrainian Research Institute of Oncology and Radiology Ministry of Health Care of Ukraine, Kiyv, 1999.
The dissertation is devoted to investigation on radiobiological characteristics of the hypersensitive reaction (HR) of tobacco plants Nicotiana sanderae against Pseudomonas syringae pv. phaseolicolа 291. The time-dependent and dose-dependent nature of gamma-irradiation effects on different stages of the HR development was established. The first stage of bacteria-plant interaction (30-60 min after bacteria inoculation) that induction of the HR was occured, was the most radiosensitive. It is shown that the ingibition effect of radiation on this stage could be conditioned by fall functional activity of baсteria cells which were to be very radiosensitive.
Key words : hypersensitive reaction of plants, pseudomonads, tobacco, gamma-irradiation, radiosensitivity.
