МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

МИРОШНИКОВА МАЙЯ ІВАНІВНА

УДК 616-022-053.2:578.825.13:[612.017.1:57.04:615

КЛІНІКО-ІМУНОЛОГІЧНА ДІАГНОСТИКА АКТИВНИХ ФОРМ ЕПШТЕЙНА-БАРР ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ

У ДІТЕЙ З ГІПЕРПЛАЗІЄЮ ЛІМФОЇДНОЇ ТКАНИНИ

ТА ОБГРУНТУВАННЯ ІМУНОТЕРАПІЇ

14.03.08 –Імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті ім.О.О.Богомольця

Науковий керівник:

Доктор медичних наук, професор

Казмірчук Віра Євстафієвна

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, кафедра клінічної імунології та алергології з курсом

дитячої клінічної імунології

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор, Лісяний Микола Іванович, зав. відділом нейроімунології Інституту нейрохірургії АМН України.

Доктор медичних наук, Нікольський Ігор Сергійович, зав. лабораторією імуногенетики наукового Центру радіаційної медицини АМН України.

Провідна установа:

Інститут геронтології АМН України, м. Київ

Захист відбудеться “_21” квітня 2005 року о 15.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 в Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця за адресою: 01023, м. Київ, вул. Шовковична 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий “18” березня 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук,

професор Свирид С.Г.

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема дітей, які часто хворіють та мають гіперплазію лімфоїдної тканини верхніх дихальних шляхів, залишається актуальною в педіатрії. За останні роки доведена важлива роль лімфоглоткових утворень в діяльності місцевого та загального імунітету слизової оболонки верхніх дихальних шляхів. Як етіологічний фактор хронічних запалень мигдаликів розглядають бактеріальну флору та аденовіруси [Д.І.Заболотний, О.Ф. Мельников, 1999]. Виходячи з того, що вірус Епштейна- Барр (ВЕБ) вражає назофарінгеальний епітелій та літературні дані про лімфопроліферативну і імуносупресивну його активність, можна було б вважати про причетність вірусу до гіперплазії лімфоїдних утворень глотки [Возіанова Ж.І. 2000, Лобзин Ю.В. 2001, Yefrey I.Cohen 2000].

Відома роль Епштейна-Барр вірусу як онкогенного чинника [Epstein M.A. 1964, Jones M 1988, Гуревич В.Е 1999]. Під впливом імуносупресивних факторів (забруднення радіонуклідами, стреси, тощо) відбувається більш раннє інфікування вірусом та збільшується вірогідність хронізації ВЕБ патології, яка вимагає проведення довготривалого нагляду за станом специфічного імунітету до цього вірусу. Таке динамічне спостереження сприяло б своєчасному виявленню осіб із симптомами прогресуючої імунодепресії та передвісниками неопластичних захворювань [Титов Л.П. 1998].

Сучасні методи лікування активних форм ВЕБ –інфекції, що є далекими від достатньої ефективності, включають у 80% випадків застосування медикаментозної терапії (ацикловір та ганцикловір) [Van der Horst 1991, Tunell E, Aurelius E 1996, Хахалин Л. Н 1996]. Розробка нових противірусних препаратів не покращила контроль за герпетичними інфекціями. В публікаціях останніх років з’явились повідомлення про можливу причину неефективності застосування ганцикловіру та ацикловіру для лікування ВЕБ –інфекції, що полягає у відсутності впливу ВЕБ-тимідінкінази на фосфорилювання ацикловіру [Tunell E, Aurelius E. 1996, Gustafson EA 1999]. Зважаючи на уявлення про ВЕБ- інфекцію, як опортуністичну, цілком доречно було б дослідження імунного та цитокінового статусу у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини. Такі дані в літературі відсутні.

Таким чином, не вирішеними залишаються питання щодо ролі ВЕБ-інфекції у розвитку гіперплазії лімфоїдної тканини у дітей і стану у них імунного та цитокінового статусів, а також потребує удосконалення метод лікування ВЕБ- інфекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами кафедри. Напрямок досліджень цієї роботи пов’язаний з планами кафедри клінічної імунології та алергології з курсом дитячої клінічної імунології Національного медичного університету. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної загальної тематики кафедри “Особливості імунного статусу хворих на рецидивуючу герпетичну інфекцію та імунотропні препарати в комплексній терапії” (№ державної реєстрації науково-дослідної роботи– 0101U002010, УДК 618.1+616.6+ 616 -053.2] : 616.523-08 : 612.017 579.882.11: 57.083.3).

Мета роботи: Розробити критерії діагностики та імунологічного моніторингу активних форм Епштейна-Барр вірусної інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини для обґрунтування призначення імунотропної терапії.

Для досягнення мети були визначені такі завдання:

1. Вивчити інформативність в діагностиці певних форм ВЕБ-інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини полімеразної ланцюгової реакції та визначення специфічних антитіл різних класів імуноферментним методом.

2. Дослідити субпопуляційний склад клітин імунної системи у дітей з активними формами ВЕБ-інфекції (CD-3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-22,) та рівні імуноглобулінів (sIgA, сироваткових IgG, IgA, IgM).

3. Визначити сироваткові рівні інтерлейкінів (ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-10, ІЛ-12, -ІФН) у дітей з активною ВЕБ-інфекцією та сироватковий рівень кортизолу.

4. Сформулювати показання та обґрунтувати схеми призначення імунотропної терапії у дітей з активними формами ВЕБ-інфекції з урахуванням отриманих даних імунологічних досліджень.

5. Визначити клініко–імунологічну ефективність запропонованого способу імунотерапії у дітей з активними формами ВЕБ-інфекції.

6. Обгрунтувати принципи клініко - імунологічного моніторингу ВЕБ -інфекції у дітей.

Предмет дослідження— вивчення взаємозв’язку між індукованою вірусом Епштейна-Барр інфекцією та клініко-імунологічними особливостями реакції організму дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини.з розробкою на зазначеній основі клініко-імунологічного моніторингу та імунотерапії.

Об’єкт дослідження Клініко-імунологічний стан у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини та наявністю або відсутністю даних про інфікованість ВЕБ (142 дитини).

Методи дослідження - імунологічні (з визначенням цитокінового профілю та імуноферментним аналізом сироваткового кортизолу)– для дослідження особливостей імунної відповіді та оцінки ефективності проведення імунотерапії; полімеразна ланцюгова реакція для виявлення ВЕБ в слині хворого; клінічні – для вивчення особливостей перебігу активних та латентних форм ВЕБ-інфекції; статистичні – для оцінки обґрунтованості та вірогідності отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведеного дослідження в динаміці та катамнестичного клінічного спостереження отримано низку нових даних.

Вперше встановлена інфікованість Епштейна-Барр вірусом у 89,4% дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини, однак тільки в 47,9% випадків виявлена активна форма ВЕБ –інфекції. Показано, що латентна інфекція не проявляється клінічно і характеризується відсутністю або незначною кількістю ВЕБ в слині та присутністю IgG VCA та IgG EBNA антитіл. Реактивована та хронічна форми інфекції характеризуються клінічними проявами, в першу чергу гіперплазією лімфоїдної тканини, високим вмістом вірусу в слині та наявністю антитіл до EA-, VCA-, та EBNA антигенів. Вперше встановлено, що у дітей з ознаками ВЕБ-інфекції спостерігається тимомегалія у 82,4% випадків. Гіперплазія лімфоїдної тканини у них супроводжується значним зниженням рівня кортизолу. Вперше встановлено у дітей з реактивованою формою ВЕБ–інфекції вірогідні зміни в субпопуляційному складі лімфоцитів: підвищення рівней CD16+, CD22+ клітин та зниження CD8+клітин. Вперше показано, що при реактивованій формі ВЕБ-інфекції продукується підвищена кількість ІЛ-1, ФНО-?, ІЛ-4, ІЛ-10, вміст сироваткових ІЛ-6, ІЛ-12 та -ІФН суттєво не змінюється. Вперше запропоновано імунопатогенетичну класифікацію ВЕБ-інфекції та схему патогенезу реактивованої форми цієї інфекції. Вперше розроблена і обґрунтована схема імунотерапії з використанням специфічного до ВЕБ імуноглобуліну та лаферону для лікування активних форм ВЕБ-інфекції у дітей. Вперше встановлена ефективність імунотерапії специфічними імуноглобулінами та лафероном для пригнічення реплікації ВЕБ та клінічного видужання у 88,2% випадків реактивованої форми ВЕБ-інфекції у дітей.

Пріоритетність отриманих результатів підтверджена патентами на винахід: “Спосіб лікування активних форм Епштейна-Барр вірусної інфекції у дітей” 47298 А Україна МКІ А61К38/00; “Спосіб прогнозування активних форм Епштейна—Барр вірусної інфекції” 52447 А Україна МКІ А61К35/78.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Теоретичне значення роботи полягає у створенні класифікації клінічних форм ВЕБ –інфекції на основі власних та літературних даних, а також у формуванні нових уявлень про імунопатогенез реактивованої форми ВЕБ-інфекції і значення у ньому змін окремих елементів імунного та цитокінового статусів. Основні положення роботи впроваджені в учбовий та лікувальний процес кафедри клінічної імунології та алергології з курсом дитячої клінічної імунології НМУ імені О.О. Богомольця та однопрофільних кафедр вищих медичних закладів України.

Скринінгові тести для виявлення дітей з лімфопроліферативними симптомами та можливими активними формами ВЕБ-інфекції впроваджено в практику усіх поліклінічних відділень дитячих медичних територіальних об’єднань. З 1999 року проводиться постійний клініко-імунологічний моніторинг дітей міста Києва, що перенесли інфекційний мононуклеоз для вчасного прогнозування активних форм інфекції.

Вперше обґрунтовано, апробовано в клініці та впроваджено: спосіб лікування активних форм Епштейна-Барр вірусної інфекції; спосіб прогнозування активних форм Епштейна-Барр вірусної інфекції у дітей.

Особистий внесок здобувача. Ідея дисертаційної роботи запропонована керівником. Дисертантом особисто проведені всі клінічні спостереження та узагальнені отримані результати, проведений їх аналіз та математична обробка. Імунологічні дослідження проведено спільно з співробітниками кафедри.

Автором особисто написані всі розділи роботи, спільно з науковим керівником сформульовані основні висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційного дослідження були повідомлені на конференціях та з’їздах: І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Питання імунології в педіатрії”-Київ, 2001 р.; ІІІ, ІV, V, VI міждисциплінарних науково-практичних конференціях ”Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідійних та TORCH-інфекцій”- 2001, 2002, 2003 2004 роки, Київ; І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Імунотропні препарати в клінічній практиці”-Київ, 2004 р.

Публікації. Результати дисертації повністю відображені у 6 наукових працях, в наукових журналах (в тому числі у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України - 4), 2 патентах України, 8-ми матеріалах наукових конференцій, з’їздів.

Обсяг та структура дисертації. Робота складається із вступу, огляду літератури, 3 розділів, у яких викладено власні дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Робота виконана на 144 сторінках принтерного тексту, ілюстрована 28 таблицями, 18 рисунками та 2 схемами. Список використаних джерел містить 74 вітчизняних та 59 публікацій іноземних авторів.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Під нашим наглядом перебувало 142 дитини у віці від 4 до 15 років, які були направлені педіатрами на консультацію до імунолога. Всі діти мали гіперплазію лімфоїдної тканини носоглотки у формі гіпертрофічного тонзиліту, фарингіту або аденоїдних вегетацій, що супроводжувалась збільшенням підщелепних та шийних лімфовузлів. Окрім вказаної патології у хворих були виявлені наступні симптоми: гарячка неуточненого генезу—у 39 (27,5%), астенічний синдром—у 35 (24,6%), генералізована лімфоаденопатія—у 57 (40,1%), рецидивуючий паротит—у 4 (2,8%), тромбоцитопенія—у 6 (4,2%), гепатит—у 3 (2,1%). У більшості пацієнтів спостерігались часті респіраторні захворювання. Всі наведені клінічні симптоми можуть бути властиві для ВЕБ -інфекції [Ж.І.Возіанова 2000, Ю.В.Лобзин 2001, Yefrey I.Cohen, 2000].

Для виявлення групи дітей з підвищеною секрецією вірусу ми провели обстеження слини на наявність ДНК ВЕБ напівкількісним методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для підтвердження активності ВЕБ -інфекції в сироватці крові визначали антитіла IgG до ранніх, капсулярних та нуклеарних антигенів (відповідно IgG EA- EBV, ІgG VCA, IgG EBNA).

Після обстеження дітей розподілили на три групи. Перша група—дослідна (гр.Д)—68 хворих з гіперплазією лімфоїдної тканини носоглотки та активною секрецією ВЕБ в слину. Друга група—контрольна (гр.К) включала 74 хворих з гіперплазією лімфоїдної тканини та низькою або негативною секрецією ВЕБ в слину. Третю групу (15 осіб) склали здорові діти у віці від 6 до 10 років (гр.З). Імунологічне обстеження проводили виключно дітям груп Д, К та З у віці від 6 до 10.

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення На підставі клінічних критеріїв діагностики, даних визначення ДНК вірусу в слині та специфічних серологічних тестів встановлено, що інфікованість ВЕБ характерна для 89,4% дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини носоглотки, з них у 68 випадків (47,9%) виявлена активна форма інфекції з високим та середнім рівнем інфікованості слини. В таблиці 1 представлені результати виявлення різних форм ВЕБ- інфекції.

Таблиця 1

Серологічні профілі при ВЕБ -інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини у співставленні з даними про наявність ДНК вірусу в слині

Форми ВЕБ-інфекції | Серологічний профіль | Результат визначення ДНК | Кількість дітей у групах

Відсутність інфікованості | IgG VCA (-)

IgG EBNA (-) |

ДНК ВЕБ (-) |

15 (10,6%) | Латентна ВЕБ-інфекція | IgG VCA (+)

IgG EBNA (+) | ДНК ВЕБ (-)

ДНК ВЕБ(+)-19 |

59 (41,5%) | Реактивована

ВЕБ-інфекція | IgG VCA (+)

IgG EBNA (+)

IgG EAEBV(+) |

ДНК ВЕБ (++,+++,++++) |

62 (43,7%) | Хронічна ВЕБ-інфекція | IgG VCA (+)

IgG EBNA(-/+)

IgG EAEBV(+) |

ДНК ВЕБ (+++,++++) |

6 (4,2%)

Серед активних форм ВЕБ –інфекції хронічна форма виявлена в 6 випадках (4,2%). Високий та середній рівень інфікованості слини ВЕБ (++,+++,++++) за результатами напівкількісного методу ПЛР є діагностично значущими для виявлення активних форм ВЕБ –інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини. У 15 дітей (10,6%) з гіперплазією лімфоїдної тканини на момент обстеження не було виявлено інфікованості ВЕБ.

Імунологічні обстеження дітей віком від 6 до 10 років з реактивованою (38 дітей гр.Д) та латентною формами ВЕБ-інфекції (42 дитини гр.К) показали наступні результати. При визначенні рівня сироваткових імуноглобулінів встановлено, що у дітей групи Д рівень Ig G в сироватці вірогідно вищий у порівнянні з групою К та групою З. В обох групах Д та К виявлено знижений сироватковий рівень Ig A. Вірогідної різниці в показниках Ig M в усіх групах не виявлено. Визначення секреторного IgA в слині показало вірогідну різницю (р0,05) рівнів цього показника в дослідній групі (98,414,6 мкг/мл) та в контрольній –(136,28,2 мкг/мл).

При співставленні середніх значень вмісту sIgA та результатів напівкількісного методу ПЛР встановлено, що при відсутності ДНК ВЕБ в слині рівень sIgA найнижчий—97,011,4 мкг/мл, при наявності до 50 копій ДНК ВЕБ в 100 мкл слини—122,528,3 мкг/мл, при 50 копій—113,619,4 мкг/мл. Найвищим середній показник sIgA (126,739,4 мкг/мл) ми отримали при високому рівні інфікованості слини. При визначенні коефіцієнта кореляції Спірмена rs =0,9 доведено позитивний кореляційний зв’язок (р>0,05) рівня інфікованості за даними ДНК ВЕБ та рівня sIgA.

Для вивчення гормональної функції кори наднирників ми визначали сироватковий рівень кортизолу у дітей обох груп. Обстеження показало вірогідне (р0,05) зниження сироваткового рівня кортизолу в дослідній групі (10,783,44 мкг/мл) у порівнянні із контрольною групою (36,53,76 мкг/мл). Встановлено, що реактивація ВЕБ –інфекції у дітей гр. Д часто розвивається на тлі зниження функції наднирників при наявності тимомегалії.

При визначенні показників клітинного імунітету у дітей показано, що в групі Д вірогідно знижений рівень цитотоксичних клітин (CD8+), тоді як за даними літератури клітинному імунітету належить домінантна роль в захисті організму від ВЕБ [Возіанова Ж.І. 2000, Jeffrey I.Cohen 2000, Rickinson 2001, Лісяний М.І. 2002]. В той же час наші дослідження показали, що активація ВЕБ -інфекції супроводжується підвищеною кількістю натуральних кілерів (CD16+ клітин), що, ймовірно, відображає реакцію неспецифічних механізмів захисту на реплікацію вірусу. Відомо, що ВЕБ персистує в В-лімфоцитах [Van der Horst 1991, S.S.Long 1997, Возіанова Ж.І. 2000,] та блокує апоптоз цих клітин. Цим феноменом можна пояснити вірогідно (р0,05) підвищений рівень CD22+лімфоцитів (В-клітин) у крові дітей з активними формами ВЕБ–інфекції. Такі результати збігаються з опублікованими в літературі даними [Thorley-Lawsоn 1998, Jeffrey I.Cohen 2000, Лісяний М.І. 2002].

Для вивчення регуляторних механізмів ми визначали рівень концентрації сироваткових цитокінів, що продукуються переважно клітинами моноцитарно-макрофагального ряду: ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-12, ФНП-. Середній показник ІЛ-1 (Mm) в групі Д становив 446,9220,6 пкг/мл, в групі К—92,5234,1 пкг/мл.

Для статистичної обробки було використано непараметричний критерій Манна-Уїтні (zт) Отримали вірогідні дані про те, що рівень ІЛ-1 в сироватці у дітей групи Д перевищує такий показник у групі К (р0,05). Визначення сироваткового рівня ІЛ-12 показало, що у дітей з активними формами інфекції рівень цього інтерлейкіну низький –15,9±3,23 пкг/мл. Таким чином, схильність до реактивації ВЕБ –інфекції можливо формується вже на моноцитарно-макрофагальному етапі імунної відповіді і залежить певною мірою від того, який ІЛ буде переважно продукувати макрофаг—ІЛ-1 чи ІЛ-12.

Отримано вірогідну різницю рівнів сироваткового ФНП- у дослідній (230,7±124,6 пкг/мл) та контрольній группах (24,17±15,3) zт =5,3, p<0,05. Низький рівень цього цитокіну виявлений у 38,5% обстежених. Підвищений сироватковий рівень ІЛ-1 та ФНП- може свідчити про активний запальний процес у обстежених дітей. Ми не отримали широких діапазонів коливань показників ІЛ-6 у дослідній та контрольній групах. Результати рівня ІЛ-6 в групі Д (42,55,48 пкг/мл) та в групі К (30,87,26) вірогідно не відрізнялись (р>0,05).

Ми визначали рівень сироваткового ІЛ-2 та -ІФН, які продукуються переважно Тх1 клітинами. Результати представлені в таблиці 2.

Таблиця 2

Рівень сироваткового інтерлейкіну 2 та -ІФН (Mm) у дітей досліджуваних груп (пкг/мл)

Показник | Група З

n=15 | Група К

n=23 | Група Д

n=18 | ІЛ-2 | 10,51,0 | 38,712,6 | 51,1716,3*

-ІФН | 52,5 | 3,551,72 | 0,20,03

*вірогідна різниця у порівнянні з групою З (р0,05)

З таблиці 2 видно, що у дітей дослідної групи середній рівень сироваткових -ІФН та ІЛ-2 вірогідно не відрізнявся від показників групи контролю, але є суттєве підвищення у порівнянні із здоровими дітьми. Рівень -ІФН у групі Д є дуже низьким.

Для вирішення питання щодо ролі у розвитку неадекватної імунної відповіді у дітей з активними формами ВЕБ- інфекції переважаючої активації Тх2 замість Тх1 ми визначали рівень сироваткового ІЛ-4 у дітей групи Д та К. Були отримані показники в діапазоні від 30,9 пкг/мл до 289 пкг/мл у групі Д (М±m=98,24±30,7), в групі К показники були в межах від 22,2 пкг/мл до 40,4 пкг/мл (М±m=29,15±2,41). При порівнянні даних дослідної та контрольної груп критерій вірогідності zт (при Т=59) склав 2,39 (p<0,02). Таким чином, при активній формі ВЕБ –інфекції виявлено вірогідно підвищений сироватковий рівень ІЛ-4, що продукується Тх2.

Особлива роль в імунній відповіді на ВЕБ надається ІЛ-10, аналог якого продукує сам вірус [Thorley-Lawsоn 1988, Возіанов А.Ф., Бутенко А.К.1998, Носик Н.Н 2000,]. Середній показник ІЛ-10 в групі Д склав 864±221,6 пкг/мл, в групі К—123,58±42,14 пкг/мл (p<0,05).

За даними різних джерел [Возіанов А.Ф., Бутенко А. К. 1998, Чередеєв А.Н. 1996] ІЛ-1 переважно запускає активацію Тх-2, а ІЛ-12, відповідно—Тх1. Наші дослідження показали, що при ВЕБ-інфекції відбувається гіперпродукція ІЛ-1 при низькій продукції ІЛ-12, тобто виявлена спрямованість інтерлейкінів на активацію переважно Тх2. Зміщення цитокінового профілю у бік, що забезпечує переважаючу активність Тх2 підтверджено і при визначенні сироваткових ІЛ-4 та ІЛ-10. Враховуючи дані імунологічних досліджень: зниження кількості CD8+ лімфоцитів, зміни у цитокіновому профілі, що забезпечує наявність активної форми інфекції на фоні підвищеної кількості NK-клітин та імуноглобулінів класу G, ми прийшли до висновку про необхідність імунотерапії для пригнічення реплікації та персистенції ВЕБ. На нашу думку специфічні до ВЕБ імуноглобуліни можуть активувати антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність NK-клітин і тим самим підвищити їх роль у боротьбі з інфекцією. Доповнення терапії лафероном допоможе активувати клітинний імунітет та забезпечити прямий противірусний вплив.

Для вибору тактики лікування ми призначали 10 хворим дослідної групи ацикловір та 10 хворим імунотерапію. Ацикловір призначався у дозі 1,0 г на добу тривалістю 10 днів. Клінічна ефективність терапії ацикловіром склала 10%, а імунотерапії—70%.

Особливістю перебігу хвороби на фоні лікування ацикловіром було швидке відновлення реплікації ВЕБ в слині після закінчення противірусної терапії. Низька терапевтична ефективність ацикловіру при активних формах ВЕБ-інфекції та поява в літературі повідомлень про відсутність впливу ВЕБ-тимідінкінази на фосфорилювання ацикловіру [Gustafson EA,1999], спонукала нас до відмови від подальшого застосування цього синтетичного противірусного засобу для лікування дітей дослідної групи. До призначення імунотерапії в групі Д та К проводилась санація хронічних вогнищ інфекції, лікування супутньої патології.

Показання для призначення імунотерапії були наступні:

1. Виразна гіперплазія лімфоїдної тканини у поєднанні з іншими симптомами ВЕБ –інфекції та високий ступінь інфікованості слини (++++) за даними ПЛР.

2. Підвищення титру антитіл Ig G EBNA та IgG VCA в динаміці при наявності клініки лімфопроліферативих симптомів, гарячки, паротиту, увеїту, гепатиту.

3. Хронічна форма інфекції клінічно та відсутність антитіл IgG EBNA та IgG EA-EBV при виявленні антитіл IgG VCA .

4. Середня та висока ступінь інфікованості слини (++,+++) у поєднанні з клінікою та наявністю антитіл IgG EA-EBV.

5. Зміни в імунному статусі: високий рівень NK та IgG в сироватці, гіперпродукція сироваткового ІЛ-1, ІЛ-4, ІЛ-10 при зниженому рівні ІЛ-12 та кортизолу.

Схема лікування активних форм ВЕБ –інфекції, яка була використана в дисертаційній роботі була такою:

1. В перший день вводили домязово імуноглобулін з підвищеним титром антитіл до ВЕБ (1:5120) в дозі 6,0 мл.

2. З наступного дня починали курс терапії препаратом лафероном у дозі 500 тис--1 млн МОД домязево з інтервалом 48 годин. Сумарна курсова доза складала від 5 до 10 млн МОД лаферону залежно від віку дитини.

Враховуючи клінічні симптоми, дані ДНК діагностики та імунологічні обстеження, імунотерапія була призначена 43 хворим. Імунотерапія лафероном в комплексі із специфічними до ВЕБ імуноглобулінами призводила до пригнічення вірусної реплікації в 100% випадків та до клінічного видужання у 88,2% випадків реактивованої форми ВЕБ-інфекції у дітей. Тривалість ремісії залежала від давності захворювання. Рецидиви реактивації ВЕБ—інфекції ми спостерігали в 8 випадках (11,8%). Термін диспансерного нагляду 3 роки.

Після терапії було проведено повторне обстеження показників імунітету. Рівень Ig M знизився з 1,140,2 до 0,990,1 г/л, але невірогідне (р>0,05), нормалізувався вірогідно (р 0,05) рівень IgG,

була тенденція до підвищення рівню IgА (р>0,05).В наших дослідженнях ми спостерігали хворих з різним терміном перебігу активної форми ВЕБ –інфекції. Хворі з коротким терміном ВЕБ –інфекції мали лабораторно гіпергамаглобулінемію G, а з тривалим терміном—гіпогамаглобулінемію. Ми вважаємо, що імунотерапію із застосуванням антитіл з підвищеним титром антитіл до ВЕБ можливо застосовувати і при гіпогамаглобулінемії, і при гіпергамаглобулінемії. Лаферон у поєднанні із специфічними до ВЕБ імуноглобулінами має імуномодулюючий ефект та можливо попереджує розвиток набутої форми дефіциту гуморальної ланки імунітету. Вміст основних субпопуляцій лімфоцитів до і після імунотерапії в динаміці відображено в таблиці 3.

Таблиця 3

Вміст основних субпопуляцій лімфоцитів (%) в сироватці крові у обстежених пацієнтів дослідної групи до і після імунотерапії

Показник | CD3+ | CD4+ | CD8+ | CD16+ | CD22+

Норма | 63,4±1,6 | 38,8±0,9 | 21,3±1,6 | 11,6±0,9 | 9,3±0,5 | До лікування | 59,2±2,6 | 39,4±3,6 | 19,9±1,8 | 26,4±5,5 | 23,0±3,0 | Після лікування | 67,8±3,8 | 48,6±5,1 | 18,65±3,9 | 22,3±7,8 | 10,1±3,6* | *дані вірогідні (p<0,05)

Оскільки аналог ІЛ-10 продукується самим вірусом, пригнічення вірусної реплікації могло призвести до зниження рівня ІЛ-10 в сироватці крові. Ми визначали рівень ІЛ-10 в сироватці крові дітей з реактивованою формою ВЕБ-інфекції до і після лікування (відповідно 864,0±221,6 і 449,9±112,5 пкг/мл). Рівень ІЛ-1 до терапії теж був високий (446,9±220,6 пкг/мл). Після імунотерапії відбувалось вірогідне зниження концентрації цього інтерлейкіну до 214,42± 95,03 пкг/мл (p<0,02).

На підставі отриманих клініко-імунологічних та лабораторних, а також даних літературних джерел ми запропонували імунопатогенетичну класифікацію ВЕБ-інфекції.

Схема 1

Класифікація ВЕБ-інфекції

З схеми 1 видно, що первинне інфікування може дати латентну форму ВЕБ-інфекції та клініку інфекційного мононуклеозу у імунокомпетентної особи або хронічну форму при первинному ураженні імунної системи. Реактивована ВЕБ-інфекція розвивається внаслідок вторинного імунодефіциту, а первинними можуть бути нейроендокринні розлади.

Підсумовуючи результати власних досліджень та наукових джерел [Ивановская Т.Е. 1996, Нікольський І.С. 1998, 2004], ми уявляємо собі патогенез захворювань, що розвиваються при реактивації ВЕБ –інфекції наступним чином (схема 2).

При наявності у хворого поєднання нейровегетативних або ендокринних розладів із лімфопроліферативними симптомами та імунними дисфункціями, можна запідозрити активну форму ВЕБ-інфекції. Активація цієї інфекції призводить до подальшого пригнічення імунної системи. Поряд з імунними порушеннями у дітей з реактивованою формою ВЕБ –інфекції (82,4%) було виявлено при ультразвуковому дослідженні тимомегалію, яка супроводжувалась Т-залежною імунною недостатністю та зниженим рівнем сироваткового кортизолу.

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової проблеми, що стосується ролі вірусу Епштейна-Барр і змін в імунному та цитокіновому статусах у підтриманні гіперплазії лімфоїдної тканини у дітей та розроблено на основі отриманих даних класифікацію ВЕБ -інфекції, схему імунопатогенезу та імунотерапевтичний підхід для лікування і моніторингу активних форм ВЕБ-інфекції .

Висновки

1. Інфікованість Епштейна-Барр вірусом встановлена у 89,4% дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини. В 47,9% випадків виявлена активна форма ВЕБ–інфекції. Латентна інфекція характеризується відсутністю або незначною кількістю ВЕБ в слині та присутністю IgG VCA та IgG EBNA антитіл. Клінічно маніфестовані форми хвороби характеризуються клінічними проявами, в першу чергу гіперплазією лімфоїдної тканини, високим вмістом вірусу в слині та наявністю антитіл до EA-, VCA-, та EBNA антигенів.

2. У дітей з ознаками ВЕБ—інфекції у 82,4% випадків спостерігається тимомегалія. Гіперплазія лімфоїдної тканини у них супроводжується значним зниженням рівня кортизолу.

3. У дітей з реактивованою формою ВЕБ –інфекції виявлені вірогідні зміни в субпопуляційному складі лімфоцитів: підвищення рівней CD16+ і CD22+ клітин та зниження кількості CD8+клітин. Спостерігається підвищений рівень сироваткового IgG та знижена кількість sIgA в слині. За коефіцієнтом кореляції є пряма пропорційна залежність між кількістю ВЕБ та рівнем sIgA в слині.

4. При реактивованій формі ВЕБ—інфекції в сироватці крові виявляється підвищена кількість ІЛ-1, ФНО-?, ІЛ-4, ІЛ-10, вміст сироваткових ІЛ-6, ІЛ-12 та -ІФН суттєво не змінюється.

5. Розроблений метод комплексної імунотерапії імуноглобулінами з підвищеним титром антитіл до ВЕБ разом з препаратом інтерферону лафероном показав 100% її ефективність у пригніченні реплікації ВЕБ та клінічне видужання у 88,2% випадків реактивованої форми ВЕБ—інфекції у дітей. При цьому знижується до норми рівні CD16+ та CD22+ клітин, нормалізується продукція сироваткових IgG, а також відбувається нормалізація кількості ІЛ-1 та ІЛ-10.

6. Отримані дані свідчать, що клінічно маніфестованим формам ВЕБ-інфекції у дітей притаманні лімфопроліферативні процеси на тлі порушень клітинної та гуморальної імунної відповіді та зниження рівня кортизолу. За таких обставин є зрозумілою висока клінічна ефективність запропонованого імунотерапевтичного підходу без включення до схеми лікування антивірусних препаратів.

Практичні рекомендації

1. Запропоновано спосіб диспансерного нагляду за дітьми з активними формами ВЕБ-інфекції за допомогою розробленого клініко-імунологічного моніторингу.

2. Впроваджено напівкількісний метод полімеразної ланцюгової реакції у комплексі з даними визначення специфічних до вірусу сироваткових антитіл для діагностики активних форм ВЕБ-інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини.

3. Розроблена та впроваджена схема лікування активних форм ВЕБ-інфекції із застосування імуноглобуліну з підвищеним титром антитіл до ВЕБ (1:5120) в дозі 6,0 мл одноразово у комбінації із лафероном від 500 тис. до 1 млн ОД, на курс 10 ін’єкцій при введенні з інтервалом 48 годин.

Список основних публікацій за темою дисертації

1. Мирошникова М.И., Казмирчук В.Е. Выявление осложнений Эпштейна – Барр вирусной инфекции // Перинатологія та педіатрія. - 2002. - №4. - С. 51-58.

2. Казмірчук В.Є., Мирошникова М.І. Лікування ускладнених форм Епштейна-Барр вірусної інфекції // Сучасні інфекції. - 2002. - №4. - С. 12- 19.

3. Казмірчук В.Є., Мирошникова М.І. Етіологічний чинник саркоїдозу Епштейна-Барр вірусна інфекція // Ліки України. – 2003. - №10. – С.55-61.

4. Казмирчук В.Е., Гуменюк Н.А., Мирошникова М.И., Плахотная Д.В., Друганов С.Д. // Выявление и верификация иммунозависимой патологии у детей (возможности и перспективы) // Імунологія та алергологія. - 2002. - № 3. - С. 17-22.

5. Мирошникова М.І., Казмірчук В.Є. Деклараційний патент України “Спосіб прогнозування ускладнених форм Епштейна-Барр вірусної інфекції” 52447 А G01N33/68, А61В10/00 // Промислова власність.-2002.-№12.

6. Казмірчук В.Є., Мирошникова М.І., Деклараційний патент України “Спосіб лікування ускладнених форм Епштейна-Барр вірусної інфекції” 47298 А А61К38/00 // Промислова власність.-2002.-№6.

7. Казмірчук В.Є., Мирошникова М.І. Імунний статус у дітей з Епштейна-Барр вірусною інфекцією // Перинатологія та педіатрія. – 2001. - №3. –С. 34.

8. Мирошникова М.І., Казмірчук В.Є. Клинико-иммунологический мониторинг Эпштейна – Барр вирусной инфекции у детей // Імунологія та алергологія. - 2001. - № 4 - С. 42.

9. Мирошникова М.І. Роль цитокінів у розвитку ускладнених форм Епштейна-Барр вірусної інфекції // Імунологія та алергологія. –2002. - №3. - С. 68.

10. Мирошникова М.І., Казмірчук В.Є. „Сучасна діагностика, інтерпретація та класифікація Епштейна-Барр вірусної інфекції” // Імунологія та алергологія. - 2004. - №4. - С. 47.

АНОТАЦІЯ

Мирошникова М.І. Клініко-імунологічна діагностика активних форм Епштейна-Барр вірусної інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини та обгрунтування імунотерапії.—Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.08 –імунологія та алергологія. Національний медичний університет, Київ, 2004.

У 89,4% дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини встановлено інфікованість Епштейна-Барр вірусом (ВЕБ), з них --в 68 випадках (47,9%) виявлено активну форму ВЕБ –інфекції. З'ясовано, що реактивація ВЕБ –інфекції у дітей з гіперплазією лімфоїдної тканини розвивається на тлі тимомегалії та зниженого рівня сироваткового кортизолу. Отримані вірогідні зміни в імунному статусі: підвищення рівня CD16+клітин та зниження CD8+клітин; підвищений рівень sIgA в слині, В-лімфоцитів та сироваткового IgG. Доведено, що порушення імунної відповіді при активній формі ВЕБ –інфекції індукується на рівні моноцитарно-макрофагального ряду клітин, які продукують підвищену кількість ІЛ-1, ФНО-? та запускають активацію переважно Тх2 (за даними рівня ІЛ-4 та ІЛ-10). Обгрунтовано доцільність застосування імунотерапії лафероном (в межах від 500 тис. до 1 млн ОД) у дозі 10 млн ОД на курс у комбінації із імуноглобулінами з підвищеним титром антитіл до ВЕБ в дозі 6,0 мл одноразово. Доведено клінічну та імунологічну ефективність запропонованої імунотерапії.

Ключові слова: діти, Епштейна-Барр вірусна інфекція, порушення імунітету, цитокіни, імунотерапія.

АННОТАЦИЯ

Мирошникова М.И. Клинико-иммунологическая диагностика активных форм Эпштейна-Барр вирусной инфекции у детей с гиперплазией лимфоидной ткани и обоснование иммунотерапии.—Рукопись

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.08 – иммунология и аллергология. Национальный медицинский университет, Киев, 2004.

Работа посвящена выявлению и лечению активных форм Эпштейна-Барр вирусной (ВЭБ) инфекции у детей с гиперплазией лимфоидной ткани. Для диагностики активной формы ВЭБ –инфекции наряду с клиническими данными определяли ДНК ВЭБ в слюне методом полимеразной цепной реакции и специфические к ВЭБ антитела (IgG EA-EBV, IgG VCA, IgG EBNA) иммуноферментным методом.

У 89,4% детей (из 142 обследованных) с гиперплазией лимфоидной ткани выявлена инфицированность ВЭБ, при этом активная форма инфекции доказана в 47,9% пациентов обследованной групы в возрасте от 4 до 15 лет. Хроническая форма инфекции была у 4,2% детей, а латентная—в 41,5% случаев. Проведено изучение иммунного статуса у детей с активной и латентной формой ВЭБ –инфекции. При исследовании гуморального звена иммунитета доказано снижение уровня сывороточного и секреторного иммуноглобулинов А и повышение сывороточных иммуноглобулинов G. При хронической ВЭБ – инфекции у 6,9% пациентов установлено гипогаммаглобулинемию G в пределах от 1,0 до 5,3 г/л, нормальный уровень IgG был от 6,5 до 12,0 г/л у 41,6 % обследованных. Высокий уровень IgG составлял от 15,0 до 34,0г/л. Выявлена положительная корреляция между степенью инфицированности слюны и уровнем sIgA. Анализ результатов субпопуляционного состава лимфоцитов показал достоверное повышение уровня NK- клеток и В-лимфоцитов, уровень Т-лимфоцитов (CD3+) был снижен. Исследование сывороточных цитокинов продемонстрировало достоверное повышение ИЛ-1 и ФНО?., которые продуцируются преимущественно клетками моноцитарно-макрофагального ряда.

Определение уровня цитокинов (ИЛ-2, -ІФН), которые продуцируются в основном Тх1 лимфоцитами, подтвердило снижение активности клеточного звена иммунной защиты. Преобладание активности Тх2 клеток выявлено при исследовании уровней сывороточных ИЛ-4 и ИЛ-10. Изучение анамнестических данных и результатов определения сывороточного кортизола показало, что реактивации ВЭБ-инфекции способствуют тимомегалия и низкий уровень кортизола крови.

Предложена иммунопатогенетическая классификация разных форм Эпштейна-Барр вирусной инфекции. На основании результатов собственных исследований и литературных данных разработана схема патогенеза болезней, которые развиваются при реактивации ВЭБ- инфекции. При наличии у больного сочетаний нейровегетативной либо эндокринной патологии с лимфопролиферативными симптомами и иммунными дисфункциями, можно предположить наличие активной формы ВЭБ-инфекции. Активация этой инфекции приводит к дальнейшему угнетению иммунной системы.

Разработан способ иммунотерапии активных форм ВЭБ-инфекции с использованием специфических к ВЭБ иммуноглобулинов (титр 1:5120) в комбинации с препаратом ?-ИФН (лаферон от 500 тыс. до 1 млн ЕД). Иммунотерапия показала 100% эффективность в подавлении репликации ВЭБ и клиническое выздоровление в 88,2% случаев активной формы ВЭБ-инфекции. Рецидивы реактивации инфекции отмечено у 11,8% пациентов. Доказано, что иммунотерапия приводит к снижению уровня CD16+, CD22+кліток, цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-10), нормализует продукцию IgG.

Полученные данные свидетельствуют о том, что клинически манифестированным формам ВЕБ -инфекции у детей свойственны лимфопролиферативные процессы вследствие нарушений клеточного и гуморального иммунного ответа, а также снижения уровня сывороточного кортизола. Учитывая данные обстоятельства, понятна высокая клиническая эффективность иммутерапевтического подхода без использования в схеме лечения антивирусных препаратов.

Ключевые слова: дети, Эпштейна-Барр вирусная инфекция, нарушения иммунитета, цитокины, иммунотерпия

Resume

Myroshnykova M.I. Clinico-immunological diagnosis of active forms of Epstein-Barr viral infection in children with lymphoid-tissue hyperplasia and substantiation for their immunotherapy. – Manuscript.

Thesis for candidate’s degree in medicine by specialty 14.03.08 – immunology and allergology. – The O.O. Bogomolets National Medical University, Kyiv, 2004.

The infection with Epstein-Barr virus (EBV) was revealed in 89.4% of children with lymphoid-tissue hyperplasia; moreover, the active form of EBV-infection was diagnosed in 68 (47.9%) cases. It was established that EBV-infection reactivation in children developed against a background of thymomegaly and lowered serum cortisol. In children with active forms of EBV-infection, such significant changes were noted in immune status as elevated CD16+ cells and lowered CD8+ cells; elevated levels of salivary sIgA, blood B-lymphocytes and serum IgG. Immune-response impairments in children with active forms of EBV-infection were shown to be induced at the level of monocyte-macrophage line of cells, which produced IL-1 and TNF–? in elevated amounts and triggered activation of mostly Tx2 (judging from IL-4 and IL-10 levels). Expediency of using immunotherapy with laferon was substantiated (within a range of 500 thousand to 1 million U) in a dose of 10 million U per course in the combination with immunoglobulins having elevated titers of antibodies against EBV in a single dose of 6.0 ml. Both clinical and immunological efficacy of the immunotherapy proposed was proved in practice.

Key words: children, Epstein-Barr viral infection, impaired immunity, cytokines, immunotherapy.