Українська академія аграрних наук

Селекційно-генетичний інститут – Національний центр

насіннєзнавства та сортовивчення

МОЖАРЕНКО Михайло Миколайович

УДК 575::575.17:57.017.3

Використання гордеїнів як маркерів ступеня зимостійкості озимого ячменю

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Одеса – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Селекційно-генетичному інституті – Національному центрі насіннєзнавства та сортовивчення

Науковий керівник: кандидат сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

Попереля Федір Олександрович,

Селекційно-генетичний інститут – Національний центр

насіннєзнавства та сортовивчення,

завідувач відділу генетичних основ селекції

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Лях Віктор Олексійович,

Запорізький національний університет

Міносвіти і науки України,

завідувач кафедри ботаніки та генетики рослин

кандидат біологічних наук, доцент

Герасименко Володимир Пилипович,

Одеський державний аграрний університет

Мінагрополітики України,

завідувач кафедри селекції, генетики та захисту рослин

Провідна установа: Харківськиий національний університет

ім. В.Н.Каразіна Міносвіти і науки України (м.Харків)

Захист відбудеться “30” вересня 2005 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.363.01 при Селекційно-генетичному інституті – Національному центрі насіннєзнавства та сортовивчення УААН за адресою:

63036, м. Одеса, Овідіопольська дорога, 3

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту за адресою:

63036, м. Одеса, Овідіопольська дорога, 3

Автореферат розісланий “8” серпня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.І. Січкар

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Найважливішою статтею експорту зерна України є фуражне зерно. Вагома частка цього потоку формується зерном озимого ячменю, вирощуваного у степовій зоні України. Підвищити його конкурентноздатність порівняно з іншими фуражними культурами можна при створенні сортів, що мають поліпшені характеристики стійкості до абіотичних чинників середовища. Створення таких сортів стає можливим тільки при використанні комплексного вивчення вихідного матеріалу. Подібні дослідження селекційного і генетичного матеріалу ячменю неможливі без використання генетичних маркерів. Дорожнеча і складності у підготовці досліджуваного матеріалу у даний час обмежують спектр застосування молекулярно-генетичних маркерів. Більш дешевими і простими у застосуванні є білкові маркери ячменю — як ізоферменти, так і запасні білки. Стосовно останніх розроблено численні методики електрофорезу і каталоги, які не відповідають сучасним вимогам. Протиріччя існуючих каталогів, недосконалість методик аналізу і класифікації запасних білків за принципом їх розчинності в різних розчинниках призводять часом до неоднозначних, а подекуди і суперечливих результатів. Крім того, недостатньо вивченим залишається зв’язок між алелями гордеїнкодуючих локусів і кількісних ознак ячменю. Наявні літературні дані є розрізненими і, найчастіше, недостатніми й неоднозначними, особливо це стосується досліджень морозо- і зимостійкості озимого ячменю. Форма подання даних не дозволяє активно використовувати їх у селекційному процесі та насінництві.

Таким чином, на даний час в Україні і світі назріла необхідність розробки нової методики електрофорезу запасних білків ячменю (гордеїнів) з поліпшеними характеристиками. З огляду на важливість поставленої сучасністю задачі, дана робота присвячується розробці нового каталогу алелей гордеїнкодуючих локусів, який базується на новій методиці і відповідає основним сучасним вимогам. Це і визначає актуальність розглянутої роботи. У роботі також дається оцінка актуальної, але поки що недостатньо дослідженої проблеми зимостійкості озимого ячменю.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною науково-тематичного плану відділу генетичних основ селекції Селекційно-генетичного інституту – Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН „Теоретичні основи селекції та насінництва сільскогосподарських культур,” реєстраційний №03.04-МВ/322-97 від 26.06.1997р.

Мета і задачі дослідження. Метою було встановлення теоретичної і практичної можливості використання проламінів озимого ячменю для маркірування ступеня його зимостійкості. Для досягнення поставленої мети, вирішувалися такі задачі:

·

·

·

створення системного каталогу основних блоків компонентів (алелей) гордеїнкодуючих локусів ячменю для умов України.

встановлення зв’язку алелей гордеїнкодуючих локусів ячменю зі ступенем його зимостійкості на прикладі поліморфного за цими локусами сорту, матеріалі конкурсних сортовипробувань і колекційному розсаднику.

Об’єкт дослідження – вплив алельного складу гордеїнкодуючих локусів озимого ячменю на ступінь його зимостійкості.

Предмет дослідження – окремі питання методології оцінки алельного складу гордеїнкодуючих локусів та їх зв’язок з величиною стійкості озимого ячменю до несприятливих чинників зими.

Методи дослідження: польовий – регіональний підхід при визначенні ступеня стійкості озимого ячменю до несприятливих чинників зими; лабораторний – визначення алельного складу гордеїнкодуючих локусів ячменю електрофорезом запасних білків; розрахунково-аналітичний – аналіз та оцінка експериментальних результатів методами математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів

Удосконалено відомий метод електрофорезу проламінів злаків у кислому поліакриламідному гелі з метою поліпшення параметрів поділу білка.

Розроблено просту і логічну концепцію класифікації блоків компонентів (алелей) гордеїнкодуючих локусів ячменю.

На підставі запропонованої концепції класифікації створено повноцінний каталог алелей гордеїнкодуючих локусів ячменю України, який має повне графічне відображення.

Для поліпшення методології оцінки зв’язку “гордеїн – ступінь зимостійкості” уперше використовувався адаптований нами метод побудови картограм поверхні відгуку.

Уперше визначено залежність між алельним складом гордеїнкодуючих локусів озимого ячменю і ступенем його зимостійкості на прикладі сортів, форм і колекційних зразків. Представлено імовірнісні моделі цих зв’язків залежно від умов перезимівлі.

Визначено серії алелей по кожному з трьох гордеїнкодуючих локусів, пов’язані із формуванням високої, середньої і низької зимостійкості.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено картограми поверхні відгуку зв’язку “гордеїн – ступінь зимостійкості озимого ячменю”, які мають високу інформативність що дозволяє більш надійно оцінювати вихідний матеріал у селекційній практиці. Їх використання підвищить ефективність аналізу ступеня зимостійкості селекційного матеріалу у польових умовах.

Встановлений внутрішньосортовий поліморфізм за ступенем зимостійкості та його зв’язок з біотиповим складом сорту за алелями гордеїнкодуючих локусів. Це відкриває перспективу для швидкого удосконалення селекційних форм і одержання нових шляхом елімінації біотипів, які впливають негативно або нейтрально.

Висока роздільна здатність, простота і можливість здійснення масового аналізу дозволяють використовувати запропоновану методику електрофорезу гордеїнів у генетичній, селекційній і насінницькій практиці. Розроблена методика у поєднанні зі створеним для умов України каталогом алелей гордеїнкодуючих локусів дозволяє здійснювати такі операції:

- надійно ідентифікувати відомі алелі;

- виявляти нові, не каталогізовані, алелі гордеїнкодуючих локусів;

- з високим ступенем надійності встановлювати батьків і родовід сортів, біотипний склад, чистоту сортового матеріалу і технологічних партій зерна як самостійно, так і у сполученні з іншими методами оцінки.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто проаналізував агрометеорологічні умови півдня України, спланував дослідження і склав програму роботи. Разом із науковим керівником розроблено методику електрофорезу гордеїнів у кислому ПААГ і створено концепцію їх класифікації. Здобувач особисто проводив експерименти, проаналізував, інтерпретував та узагальнив їх результати, пов’язані із проведенням польових і лабораторних досліджень, вивчив зв’язок алелей гордеїнкодуючих локусів зі ступенем зимостійкості озимого ячменю залежно від умов перезимівлі. Написання статей у співавторстві виконувалося з особистою участю автора. У дисертації не використовувалися ідеї співробітників, що сприяли виконанню роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати дисертації були повідомлені на міжнародній конференції 75 years Institute of Barley – “Barley and oat breeding, and technology of field crops” (Karnobat, Bulgaria, 2000), міжнародній конференції молодих учених “Сучасні проблеми генетики, біотехнології і селекції рослин” (Харків, 2001), Міжнародній конференції “Молекулярні механізми генетичних процесів і біотехнологія” (Москва, Мінськ, 2001), конференції молодих учених і фахівців “Проблеми виробництва зерна в Україні” (Дніпропетровськ, 2002), всеукраїнській конференції молодих учених “Досягнення молодих учених у галузі агроекології та біотехнології” (Київ, 2002).

Публікації. Основні положення дисертації висвітлені у 12 публікаціях, з яких 6 – у фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, чотирьох розділів, загальних висновків, списку використаних джерел і додатків. Матеріали роботи викладені на 156 сторінках, містять 19 таблиць, 29 малюнків, 3 додатки і 236 найменування у списку використаних джерел, у тому числі 101 іноземне.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для проведення досліджень використовувався матеріал озимого ячменю, наданий відділом селекції та насінництва ячменю Селекційно-генетичного інституту УААН (СГІ). Дослідження проводилися пртягом 1995-2000рр. на сортах і формах озимого ячменю, які висівалися в колекційному розсаднику. Загалом для вивчення алельного складу гордеїнкодуючих локусів ячменю було проаналізовано 326 номерів, у конкурсному сортовипробуванні (КСВ) – 544 номера. Крім того, було проаналізовано 106 сортів озимого ячменю, наданих відділом інтродукції. Для створення повноцінного каталогу алелей гордеїнкодуючих локусів було проаналізовано 118 зразків ярого ячменю.

Вивчення успадкування алелей гордеїнкодуючих локусів проводилося на F2, одержаного від схрещування між собою контрасних сортів КСВ Фермер, Манас, Росава, Тамань, Одеський 165, Синтез.

Для дослідження алелей гордеїнкодуючих локусів використовувалася методика електрофорезу в кислому ПААГ, розроблена у відділі генетичних основ селекції СГІ.

Для ідентифікації алелей гордеїнкодуючих локусів ячменю використовували розроблену методику і спрощені положення класифікації. Ідентифікували три гордеїнкодуючих локуси – Hrd А, В, С, що контролюють повільно-, середньо-, і швидкорухливі групи відповідно.

При написанні формули гордеїну в тексті пропонується опускати назви локусів, припускаючи, що в кожному випадку зберігається такий порядок локусів – Hrd А, Hrd В, Hrd С. При цьому алелі різних локусів розділяються крапкою. Наприклад, формула гордеїну сорту Манас має такий вигляд: 2.4.4. Якщо сорт представлений кількома біотипами по гордеїнкодуючих локусах, то різні алелі одного локусу розділяються знаком “плюс”, наприклад, 2+8.4.4. Показані вище положення класифікації гордеїнів у кислому ПААГ і спосіб запису особливостей того чи іншого генотипу проламінів ячменю ліг в основу побудови каталогу блоків компонентів і всієї наступної роботи. Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за двома напрямками. Перший з них – обробка результатів гібридологічного аналізу – проводився за допомогою стандартних методів. Другий напрямок – метод багатокритеріальної оптимізації, для виявлення залежності “гордеїн – ступінь зимостійкості”.

Для обробки результатів гібридологічного аналізу застосовувалася комп’ютерна програма Map maker. При розрахунку відстані між гордеїнкодуючими локусами нами були задані наступні вихідні критерії: максимальна відстань 30 сМ, відношення правдоподібностей LOD 6. Такий підхід забезпечує високу достовірність результатів аналізу.

При обробці даних, одержаних внаслідок дослідження алельного складу і ступеня зимостійкості форм колекції, КСВ, а також модельного сорту Тайна, використовувався пакет прикладної статистики STAT.

СИСТЕМАТИЧНІ І ГЕНЕТИЧНІ АСПЕКТИ ВИКОРИСТАННЯ ГОРДЕЇНІВ

Каталог алельних варіантів гордеїнкодуючих локусів ячменю для умов України. Розробка нової методики єлектрофорезу гордеїнів у кислому ПААГ дозволила розпочати дослідження цих білків на новому, більш якісному рівні. Результати досліджень алельного складу робочих колекцій ячменю відділу селекції і насінництва ячменю СГІ і колекції озимого ячменю відділу інтродукції дозволили скласти каталог блоків компонентів (алелей) гордеїнкодуючих локусів ячменю для кислого ПААГ. На рис. 1 і рис. 2 представлені графічні зображення нашого каталогу алелей гордеїнкодуючих локусів у вигляді рисунка і фотографії відповідно

У колекційному матеріалі було ідентифіковано 16 алелей за локусом Hrd А, 18 алелей за локусом Hrd В і 4 алелі за локусом Hrd С. Результати багаторічних досліджень колекційних зразків підтвердили висновки про малу значимість мінорних гордеїнкодуючих локусів Hrd С, D, E, G (за класифікацією Поморцева А.А. 1980). Проте, у відповідних блоках компонентів створеного нами каталогу, мінорних менделюючих компонентів не було виявлено (рис. 1 і рис. 2).

Рис.1. Каталог основних алелей гордеїнкодуючих локусів ячменю для умов України

Поліморфізм алельного складу гордеїнкодуючих локусів колекції озимого і ярового ячменю України значно нижчий, ніж у світовій колекції. Це пояснюється відсутністю в робочих колекціях алелей, що мають дуже низькі частоти зустрічаємості у світовій колекції. Як правило, генотипи з такими алелями мають невеликі ареали поширення і пристосовані тільки до окремих специфічних умов. Деякі з цих алелей зустрічаються також і у вітчизняних колекціях. У табл. 1 представлені частоти зустрічаємості алелей гордеїнкодуючих локусів у колекційному матеріалі озимого і ярового ячменю. Як було показано нами, понад 80% поліморфізму робочої колекції озимого ячменю України визначається малим числом алелей.

Найбільшу частоту має алель Hrd А2, частота зустрічаємості якого в матеріалі озимого ячменю становить 44,04%. Разом з тим, цей алель має дуже низьку частоту у колекції ярового ячменю – 0,86%. Очевидно, це пов’язано з адаптивним значенням цього алеля для озимого ячменю. Алель Hrd А9 має другу частоту серед алелей цього локусу в колекції озимого ячменю – 27,06%.

Рис. 2. Каталог основних алелей гордеїнкодуючих локусів ячменю для умов України (фотографічний)

Таблиця 1.

Частоти алелей гордеїнкодуючих локусів Hrd А, Hrd В, Hrd С в сортах озимого і ярового ячменю робочих колекцій України.

Hrd А | Hrd В | Hrd С

алель | Озимий ячмінь

n = 375 | Ярий ячмінь

n =118 | алель | Озимий ячмінь

n = 375 | Ярий ячмінь

n =118 | алель | Озимий ячмінь

n = 375 | Ярий ячмінь

n =118

1 | 1,35 | 1,29 | 1 | 2,97 | - | 1 | 43,23 | 63,35

2 | 44,04 | 0,86 | 2 | 1,52 | 11,61 | 2 | 36,30 | 32,86

3 | - | 0,86 | 3 | 37,73 | 26,91 | 3 | 0,37 | 3,70

4 | 7,85 | 2,84 | 4 | 19,36 | - | 4 | 20,10 | -

5 | 7,04 | 9,89 | 5 | 0,93 | 5,59 | - | - | -

6 | - | 3,70 | 6 | 26,49 | - | - | - | -

7 | 1,67 | 0,86 | 7 | 5,00 | 15,26 | - | - | -

8 | 10,06 | 8,17 | 8 | 1,90 | 12,68 | - | - | -

9 | 27,06 | 57,96 | 9 | 1,30 | 13,76 | - | - | -

10 | 0,37 | 11,18 | 10 | 0,74 | 10,32 | - | - | -

11 | 0,56 | - | 11 | - | 0,86 | - | - | -

12 | - | - | 12 | 0,19 | 0,86 | - | - | -

13 | - | - | 13 | 0,19 | 1,29 | - | - | -

14 | - | 0,86 | 14 | - | 0,86 | - | - | -

15 | - | 0,86 | 15 | 0,19 | - | - | - | -

16 | - | 0,43 | 16 | 0,19 | - | - | - | -

- | - | - | 17 | 1,11 | - | - | - | -

- | - | - | 18 | 0,19 | - | - | - | -

Итого | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100

Проте, походження сортів озимого ячменю, які мають цей алель, показує, що їх центри походження знаходяться в зонах з м’якими умовами зимівлі. Інші алелі локусу Hrd А значно менш специфічні, а їх адаптивне значення менш виражене. За локусом В було виявлено три алелі Hrd В3, 4, 6, що мають дуже високу частоту зустрічаємості в колекції озимого ячменю – 37,73%, 19,36%, 26,87% відповідно. Алель Hrd В3 неспецифічний, має високу частоту і серед ярових сортів – 26,91%. Слід підкреслити, що в колекції ярового ячменю спостерігається більш рівномірний розподіл частот зустрічаємості алелей локусу Hrd В2, 7, 8, 9, 10. Ми вважаємо, що це вказує на рівноцінність цих алелей для селекції ярового ячменю.

При аналізі алелей локусу С виявлено тільки чотири їх типи: Hrd С1, 2, 3, 4. Виконані дослідження також показують, що алелі трьох досліджуваних локусів, які мають частоту в колекції менше 2%, дуже рідко виявляються в КСВ. Очевидно, ці алелі елімінують на ранніх етапах селекційного процесу і не мають серйозної селекційної цінності.

Аналітичними дослідженнями встановлено, що на частоту зустрічаємості алелей значно впливають умови перезимівлі. Так, умови зимівлі у початковий період 1997/1998 року були дуже суворими. Це призвело до сильного вимерзання та ушкодження практично всіх генотипів. Найменше зазнали шкоди генотипи, що мали алель Hrd А2. Частота зустрічаємості цього алеля в КСВ 1998/1999 року різко зросла до більш ніж 50%. Відзначено падіння частот зустрічаємості інших алелей цього локусу. Зима 1998/1999 року була дуже м’якою, що не сприяло сильному ушкодженню зимуючих рослин. Внаслідок цього зросла частота алелей Hrd А4, Hrd А8, Hrd А9 і знизилася частота зустрічаємості алеля Hrd А2 (див. рис. 3).

Динаміка зміни частот зустрічаємості алелей локусу Hrd В показала подібність ситуації за локусом Hrd А. Як зазначалося вище, для КСВ є характерним дуже вузький поліморфізм порівняно з колекційним матеріалом. Не став виключенням і розглянутий локус. При аналізі його зустрічаємості були виявлені лише два екзотичних алелі цього локусу Hrd В2 і Hrd В9, що мали близькі до колекційного частоти зустрічаємості (див. рис. 4).

Рис. 3. Динаміка зміни частоти зустрічаємості алелей гордеїнкодуючого локусу Hrd А.

Після загибелі значного числа зразків узимку 1997/1998 року, алель Hrd В9 елімінував з КСВ до 1999 р., а частота алеля Hrd В2 знизилась практично до нульової. Зміни частот основних алелей 1, 3, 4, 6 локуса Hrd В по роках наших досліджень мали таку динаміку. Так, у 1995 р. частоти алелей Hrd В3, 4, 6 були близькі до відповідних для колекційного матеріалу( див табл.1, рис 4), а частота зустрічаємості алеля Hrd В1 зросла у два рази порівняно з колекцією. До 1998 р. відбувалося його накопичення у матеріалі КСВ. Паралельно спостерегалося зниження зустрічаємості алеля Hrd В6 за вказаний період. Частота алеля Hrd В3 у 1996 р. незначно збільшувалась, але у наступні роки досльджень відбувалося зниження цього показника. Частота зустрічаємості алеля Hrd В4 до 1998 р. залишається стабільною.

Рис. 4. Динаміка зміни частоти зустрічаємості алелей гордеїнкодуючого локусу Hrd

Випадіння ж форм у 1997/1998 р. привело до зниження частот всіх алелей цього локусу за винятком Hrd В4 і Hrd В6. Сильне падіння частоти спостерігалося також і в алеля Hrd В1 – з більш ніж 20% до практично нульової. У КСВ 1999 р. наші дослідження показали повернення на колишні позиції алелей Hrd В1 і Hrd В4, зростання до 30% частоти алеля Hrd В6 і подальше зниження частоти алеля Hrd В3 (рис. 4). Сильний зв’язок між алелями Hrd B і Hrd C, виявлений на зразках колекційного розсадника, простежувався також у матеріалі КСВ. Частота алелей Hrd C4 і Hrd C2 має такий самий характер, що і для алелей Hrd В4 і Hrd В6. Зміна ж частоти алеля Hrd С1 мала дещо інший вигляд, ніж у алеля Hrd В3, що можна пояснити впливом зв’язку цього алеля з алелем Hrd В1 (рис. 4, 5).

Алель Hrd С3 (колекційний розсадник і КСВ) мав близьку до нульової частоту зустрічаємості. У сортах та зразках він самостійно не представлений і нами не розглядався.

Рис. 5. Динаміка зміни частоти зустрічаємості алелей гордеїнкодуючого локусу Hrd С.

У роботі показано, що в селекційній практиці озимого ячменю використовується лише незначна частина від виявленого поліморфізму. Це пов’язано з елімінацією на ранніх етапах селекції під дією як штучного, так і природного відбору, екзотичних алелей з низькими частотами (див. табл. 1). Крім того, така динаміка розподілу алелей гордеїнкодуючих локусів у КСВ, з урахуванням погодних умов перезимівлі, вказує на можливий зв’язок групи алелей розглянутих локусів зі складною багатофакторною ознакою “зимостійкість”.

Успадковування алелей гордеїнкодуючих локусів озимого ячменю. Для підтвердження правильності наведених вище висновків щодо успадкування алелей гордеїнкодуючих локусів було зроблено гібридологічний аналіз зерновок F2, одержаних від схрещування сортів Фермер ? Манас, Росава ? Тамань, Фермер ? Одеський 165 і Манас ? Синтез. Батьківські сорти мали наступний алельний склад за гордеїнкодуючими локусами: Фермер – 9.1.1., Манас – 2.4.4., Росава – 8.4.4., Тамань – 4.6.2., Одеський 165 – 4.3.1., Синтез – 2.3.1.

При аналізі зерновок F1 спостерігалася наявність компонентів обох батьків з перевагою материнських блоків компонентів. Це обумовлено кодомінантним типом спадкування алелей гордеїнкодуючих локусів. Висока якість одержуваних електрофореграм дозволила чітко визначати дозовий ефект генів, який спостерігається при аналізі триплоїдного ендосперму, а розрахунково-аналітична оцінка великої вибірки гібридної популяції досліджуваних рослин дозволила зробити висновок про наявність чотирьох типів спектрів (фенотипічних класів) за кожною комбінацією алелей відповідних локусів.

Два типи спектра – спектри батьківських форм, третій – подвійна доза материнського гена й одна батьківського, відповідна F1 від прямого схрещування, четвертий – одна доза материнського гена плюс дві батьківського, відповідна F1 від зворотнього схрещування. Рекомбінації між відповідними алелями одного локусу не виявлено. Результати гібридологічного аналізу компонентного складу гордеїнів по локусах Hrd А, Hrd В, Hrd С показують, що числові відношення фенотипових класів по вивчених локусах близькі до розщеплення при кодомінантному типові успадкування 1 : 1 : 1 : 1. При цьому існує можливість об’єднання другого і третього класів без урахування дози гена. Розщеплення при такому типі обліку результатів розщеплення буде відповідати 1 : 2 : 1. Висока значимість критерію оцінки 2 , Р > 0,75 в усіх варіантах дослідження, вказує на високу достовірність одержаних даних. Також було показано, що у вивчених комбінаціях схрещування компоненти гордеїнів А, В і С сортів Фермер, Манас, Росава, Тамань, Одеський 165 і Синтез контролюються складними поліцистронними гордеїнкодуючими локусами Hrd А, Hrd В і Hrd С відповідно.

Для звірення даних, одержаних у крохмальному гелі та ПААГ, була проведена оцінка величини зчеплення гордеїнкодуючих локусів Hrd А, Hrd В, Hrd С. Робота проводилася на тому ж матеріалі схрещувань Фермер ? Манас, Росава ? Тамань, Фермер ? Одеський 165, Манас ? Синтез у зерновках F2, на яких здійснювався аналіз успадкування у межах одного локусу. Як показано в таблиці 2, по всіх досліджених локусах існує зчеплене успадковування. Найбільша величина відстані між локусами становила 14,20 сМ і спостерігалась між алелями А9, А2 ? С1, С4 у F2 від схрещування Фермер ? Манас. Висока величина картуючої функції виявлялась у всіх варіантах схрещування у локусів А і В, А і С. При цьому величина рекомбінації між алелями локусів А і С була завжди вищою, ніж між алелями локусів А і В.

Таблиця 2

Оцінка величини картуючої функції локусів Hrd А, Hrd В і Hrd С в F2 у досліджуваних комбінаціях

Символы алелей локусів Hrd | вибірка | Картуюча функція сМ

Фермер (9.1.1.) Ч ?анас (2.4.4.)

Hrd A9.В1. Ч Hrd A2В4. | 600 | 12,85 2,73

Hrd A9.С1. Ч Hrd A2С4. | 600 | 14,20 3,19

HrdВ1.С1. ? Hrd В4С4. | 600 | 1,39 0,13

Росава (8.4.4.) ? Тамань (4.6.2.)

Hrd A8.В4. Ч Hrd A4.В6. | 600 | 11,70 2,4

Hrd A8.С4. Ч Hrd A4.С2. | 600 | 13,45 2,95

Hrd B4.С4. ? Hrd B6.С2. | 600 | 2,68 0,31

Фермер (9.1.1.) ? Одеський 165 (4.3.1.)

Hrd A9.В1. Ч Hrd A5.В3. | 360 | 8,95 2,11

Hrd A9.С1. Ч Hrd A5.С1. | 360 | -//-

Hrd В1.С1. ? Hrd В3.С1. | 360 | -//-

Манас (2.4.4.) ? Сінтез (2.3.1.)

Hrd A2.В4. Ч Hrd A2.В3. | 280 | -//-

Hrd A2.С4. Ч Hrd A2.С1. | 280 | -//-

Hrd В4.С4 ? Hrd В3.С1. | 280 | 1,60 0,22

Оцінка величини зчеплення між алелями локусів В і С показала, що вони практично зчеплені. Максимальна величина функції не перевищувала 2,68 сМ, а найменша величина відстані між розглянутими локусами була рівною – 1,39 сМ.

За деякими варіантами комбінації аналіз не здійснювався через відсутність поліморфізму, що добре видно з локусу Hrd С у схрещуванні Фермер ? Одеський і з локусу Hrd А у схрещуванні Манас ? Синтез.

Аналіз величин рекомбінації у розглянутих сортів дозволяє судити про взаємне розташування досліджуваних локусів. Складний поліцистронний локус Hrd В знаходиться між складним поліцистронним локусом Hrd А та локусом Hrd С.

Таким чином, встановлено, що: 1) алелі гордеїнкодуючих локусів мають складний поліцистронний характер і зберігають свій стан незалежно від умов; 2) рекомбінація всередині локусу не виявляється; 3) спадкування алелей за кожним з вивчених локусів здійснюється кодомінантно; 4) надійність методу електрофорезу і його непогана роздільна здатність дозволяють з високим ступенем надійності ідентифікувати нові алелі гордеїнкодуючих локусів без застосування гібридологічного аналізу; 5) величина рекомбінації між гордеїнкодуючими локусами свідчить про їх зчеплене успадковування, особливо Hrd В і Hrd С; це можна використати при аналізі зв’язків між гордеїнкодуючими локусами і господарсько-цінними ознаками.

ВИВЧЕННЯ ЗВ’ЯЗКУ АЛЕЛЕЙ ГОРДЕЇНКОДУЮЧИХ ЛОКУСІВ

ЗІ СТУПЕНЕМ ЗИМОСТІЙКОСТІ ОЗИМОГО ЯЧМЕНЮ

Зв’язок алельних варіантів гордеїнкодуючих локусів зі ступенем зимостійкості на прикладі сорту. Для встановлення зв’язку і вивчення його характеру між алельним станом гордеїнкодуючих локусів та ступенем зимостійкості був обраний сорт Тайна. На момент початку досліджень біотипи за гордеїнкодуючими локусами у матеріалі КСВ мали різні частоти зустрічаємості. Для облік даної ознаки застосовували метод пробних ділянок у чотирьохкратній повторності, що дозволило отримати об’єктивні дані. Недостатня диференціація біотипів за досліджуваною ознакою у 1998–1999 рр. не давала чіткої уяви про зв’язок “гордеїн – ступінь зимостійкості”, тому ми обмежилися лише результатами контрасног за погодними умовами1997 / 1998 року та даними за весь період досліджень.

Як видно з представлених рисунків 6, 7, одержані кореляційні поля при статистичній обробці масиву даних дозволяють наочно показати виучувану залежність за окремими локусами.

Так, з локусу Hrd А видно, що біотипи сорту Тайна, що несуть алель Hrd А2, мають більш високий ступінь зимостійкості у досліджуваному році, ніж біотипи, що несуть алель Hrd А8. Кореляційне поле має високий ступінь достовірності, кореляційне відношення – 0,7555 при рівні значимості теоретичному – 2,007, емпіричному – 9,080. Порядок апроксимуючого полінома дорівнює 1.

Рис. 6. Кореляційне поле зв’язку алелей Hrd А (вісь Х) – ступінь зимостійкості (вісь Y) на прикладі сорту Тайна за 1997–1998 рр. досліджень

Алелі локусів Hrd В і Hrd С досліджувалися у сукупності. Їх кодування здійснювалося за запропонованою методикою. Модель зв’язку гордеїнкодуючих локусів Hrd В і Hrd С зі ступенем зимостійкості, представлена кореляційним полем аналогічним рис. , та мала низьке кореляційне відношення, рівне 0,3798. Спостерігалася незначна перевага біотипів з алелями Hrd В3 Hrd С1 над біотипами з іншими комбінаціями алелей. Аналітичні дослідження дозволили виявити високий ступінь зв’язку зимостійкості – алелі локусу Hrd А, алелі локусів Hrd В Hrd С. Коефіцієнт множинної кореляції склав 0,851 при високому рівні надійності. Частка впливу алелей локусу Hrd А – 57,229, алелей локусів Hrd В Hrd С – 15,222. Такий розподіл частки впливу на величину досліджуваної ознаки показує, що у формуванні складної багатофакторної ознаки “зимостійкість”, крім контрольованих алелей, беруть участь і інші чинники як генотипу, так і навколишнього середовища.

Наведені результати демонструють достовірний взаємозв’язок між алельним складом гордеїнкодуючих локусів і ступенем зимостійкості сорту Тайна. При цьому, якщо алелі локусів Hrd В і Hrd С у біотипів досліджуваного сорту забезпечують зону стабільних показників, що незначно відрізняються один від одного, то алель Hrd А2 забезпечує максимальне вираження ступеня зимостійкості у цього сорту.

Розрахунково-аналітичний аналіз трирічних досліджень по сорту Тайна базується на результатах 200 спостережень. Кореляційне поле зв’язку алелей гордеїнкодуючого локусу Hrd А зі ступенем зимостійкості для цього сорту має кореляційне відношення 0,4350 при теоретичному рівні значимості 1,979 і практичному 6,797 відповідно й ступенем апроксимуючого полінома, рівним 1. Характер кореляційного поля зв’язку “гордеїн – ступінь зимостійкості” залишається незмінним. Так само, як і за результатами 1997/1998 року, біотипи, що несуть алель Hrd А2, мають більший ступінь зимостійкості, ніж біотипи, що несуть алель Hrd А8. Однак змінюється різниця ступеня зимостійкості між біотипами з різними алелями, що, очевидно, пов’язано з досить м’якими умовами перезимівлі в зимові періоди 1998/1999 і 1999/2000 рр. і не дозволяє повною мірою диференціювати досліджувані біотипи за ступенем прояву досліджуваної ознаки.

Результати, що відображують зв’язок між алелями гордеїнкодуючих локусів Hrd В Hrd С зі ступенем зимостійкості біотипів сорту Тайна за весь досліджуваний період, є аналогічними результатам, одержаним у контрольному році. Кореляційне відношення представленого поля становить 0,270.

При дослідженні методом множинної кореляції зв’язку “ступінь зимостійкості – алелі локусу Hrd А, алелі локусів Hrd В Hrd С” коефіцієнт множинної кореляції склав 0,473 при високому рівні надійності. Частка впливу алелей локусу Hrd А – 18,284, алелей локусів Hrd В Hrd С – 4,079. Наведені дані свідчать про зниження впливу контрольованих алелей на досліджувану ознаку за весь період досліджень і про збільшення впливу неконтрольованих факторів – як генетичних, так і навколишнього середовища.

Високі показники достовірності одержаних кореляційних полів дозволяють зробити наступні висновкі: 1) біотипи сорту Тайна, що несуть алель Hrd А2, мають перевагу за ступенем зимостійкості над іншими біотипами цього сорту; 2) у дослідженого сорту алелі локусу Hrd А мали більший вплив на формування високої зимостійкості, ніж алелі локусів Hrd В і Hrd С; 3) можливо маркірувати біотипи за ступенем зимостійкості шляхом дослідження алельного складу гордеїнкодуючих локусів; 4) найвища ступінь достовірності такого маркірування буде досягатися в несприятливі за умовами перезимівлі роки.

Зв’язок алельних варіантів гордеїнкодуючих локусів озимого ячменю зі ступенем його зимостійкості в матеріалі конкурсних сортовипробувань 1995–2000 рр. З метою перевірки результатів досліджень, одержаних при роботі з модельним сортом Тайна, вивчення зв’язку “гордеїн – ступінь зимостійкості” продовжили на матеріалі КСВ. За контрольний рік було обрано 1997 рік посіву. Щоб мати повну картину взаємозв’язку алелей гордеїнкодуючих локусів зі ступенем зимостійкості, було використано метод парної кореляції з побудовою кореляційних полів, рис. 7 і 8. Коректування вихідної вибірки здійснювали за представленою методикою.

Рис. 7. Кореляційне поле зв’язку “алелі локусу Hrd А (вісь Х) – ступінь зимостійкості (вісь Y)” після коректування (1997-1998рр.)

Кореляційне поле зв’язку “алелі Hrd А – ступінь зимостійкості”, побудоване на основі відкоректованої вибірки, має наступні показники: кореляційне відношення дорівнює 0,6152, критерій оцінки ступеня значимості теоретичний – 2,024, емпіричний – 4,970. Порядок полінома дорівнював 4 Кореляційне поле дозволяє продиференціювати біотипи з різними алелями за локусом Hrd А за ступенем зимостійкості. Алель Hrd А2 був пов’язаний з найвищими показниками середньої зимостійкості більше 7,5 балів.

Рис. 8. Кореляційне поле зв’язку “алелі локусів Hrd В Hrd С (вісь Х) – ступінь зимостійкості (вісь Y)” після коректування (1997-1998рр.)

Біотипи з алелем Hrd А8 мають також непогані середні показники зимостійкості, на рівні 6 балів. Третю позицію за ступенем зимостійкості посідають біотипи з алелем Hrd А7. Дуже низькі показники за досліджуваною ознакою виявилися у біотипів з алелями Hrd А4, 5, найгірші – з алелем Hrd А9, близько 4 балів, рис. 8.

Щільність зв’язку для кореляційного поля Whвизначається кореляційним відношенням r ,5648, критерій оцінки ступеня значимості теоретичний – 2,024, емпіричний – 4,508, рис. 8. Порядок полінома дорівнював 4. Високий ступінь зимостійкості мали біотипи з алелями Hrd В6 Hrd С2. На другу позицію за розглянутою ознакою змістилися біотипи з алелями Hrd В9 Hrd С1. Така зміна, можливо, пов’язано з дуже низькою частотою зустрічаємості цих біотипів. Поганими показниками ступеня зимостійкості виділялися біотипи з локусами Hrd В1 Hrd С1 та Hrd В2 Hrd С2. Характер взаємодії алелей різних гордеїнкодуючих локусів та їхній вплив на формування ступеня зимостійкості досить адекватно встановлюються методом багатокритеріальної оптимізації. Одержана регресійна тематична модель зв’язку представлена наступним рівнянням:

Wh = f (A,BC) = 0,252 + 1,935 A + 21,688 (BC) + 24,011 A2 – 64,419 A(BC) + 8,243 (BC)2 – 22,553 A3 + 36,907 A2(BC) + 28,999A(BC)2 +28,193(BC)3 .

Щоб найбільш повно виявити “приховані” закономірності зв’язку “гордеїн – ступінь зимостійкості”, використовувався метод картування (рис. 9). Показник кореляційного відношення картограми поверхні відгуку дорівнює 0,730. З поданої картограми випливає, що високі значення зимостійкості, рівні або переважаючі 7 балів, будуть мати біотипи 2.6.2., 2.4.4. Біотип 2.3.1. (зимостійкість 6,5 – 7,0 бала) елімінує з групи з високою зимостійкістю. Зона стабільно високих значень ступеня зимостійкості на рівні 6–7 балів можлива у біотипів з алелями Hrd В6 Hrd С2 і Hrd В4 Hrd С4 при кожному з алелей за локусом Hrd А. Для біотипів з алелями Hrd В3 Hrd С1 зона значень з алелями локусу Hrd А лежить у межах 5–7 балів. Біотипи з алелями Hrd В9 Hrd С1 при кожному із представлених у КСВ алелей локусу Hrd А можуть демонструвати ступінь зимостійкості на рівні 5,0–6,5 балів. Дуже низькі значення зимостійкості показують біотипи Hrd В1 Hrd С1 у сполученні з будь-яким алелем локусу Hrd А, крім Hrd А2, їх показники знаходяться на рівні, меншому або рівному 4 балам.

Рис. 9. Карта поверхні відгуку для ступеня зимостійкості Z = f (x, y) залежно від алелі локусу Hrd А (вісь Х), алелі локусів Hrd В Hrd С (вісь Y) за 1997–1998 рр.

Аналогічно вибірці, одержаній у 1997/1998 році, здійснювалася апроксимація даних за весь досліджуваний період. При цьому число спостережень зменшилося з 544 до 236. Модель зв’язку “алелі гордеїнкодуючих локусів – ступінь зимостійкості” за цей період має такий вигляд:

Wh = f (A,BC) = 7,142 – 5,531 A + 5,925 (BC) + 9,949 A2 – 4,385 A(BC) -

- 7,138 (BC)2 – 6,838 A3 + 8,247 A2(BC) – 3,144A(BC)2 +2,927(BC)3;

Така модель має кореляційне відношення - 0,617. При переході від приватної моделі одного 1997/1998 року до загальної моделі всього досліджуваного періоду не трапилося великих змін у значимості досліджуваних залежностей, тому графічна модель мала вигляд подібний рис.9.

Таким чином, дослідження зв’язку “алелі гордеїнкодуючих локусів – ступінь зимостійкості” дозволяють зробити такі узагальнення: 1) існує надійний взаємозв’язок між алельним станом гордеїнкодуючих локусів озимого ячменю і ступенем зимостійкості досліджуваного матеріалу; 2) на формування ступеня зимостійкості впливають як алелі локусу Hrd А, так і алелі зчеплених локусів Hrd В і Hrd С. При цьому якщо алелі локусів Hrd В і Hrd С забезпечують середній прояв ступеня вивченої ознаки, то алелі Hrd А забезпечують його максимальний або мінімальний ступінь прояву; 3) найбільш зимостійкими будуть сорти і біотипи, що мають алелі 2.3.1. і 2.4.4.; 4) Середні показники ступеня зимостійкості будуть забезпечувати алелі Hrd В3 Hrd С1 і Hrd В4 Hrd С4, при будь-якому алелі локусу Hrd А; 5) На формування ознаки “зимостійкість” впливає значна кількість чинників як генотипу, так і навколишнього середовища, що обумовлює середній рівень кореляційних залежностей наших моделей Найвища вірогідність одержаних моделей буде спостерігатися тільки в роки з несприятливими умовами перезимівлі.

Зв’язок алельних варіантів гордеїнкодуючих локусів озимого ячменю зі ступенем його зимостійкості у сортах колекційного розсадника 1995–2000 рр. Результати вивчення зв’язку “гордеїн – ступінь зимостійкості” на сортах КСВ, адаптованих до конкретних умов вирощування, показали високий ступінь вірогідності. Для забезпечення об’єктивності одержаних результатів необхідно було перевірити їх на сортах колекційного розсадника. Вихідна вибірка колекції була відкоректована за методикою, запропонованою нами і випробуваною на сортах КСВ. Крім подібних для колекції і КСВ критеріїв, за якими здійснювалося відсівання викидів, були введені ще дві обмежуючі умови. Оскільки сортовий склад колекційного розсадника змінювався за роками, одним із обмежень стала наявність не менше трьох років досліджень, другим – наявність у вихідній вибірці результатів 1997/1998 року. Це давало найбільш повну і достовірну картину середніх значень зимостійкості.

При оцінці взаємозв’язків досліджуваних ознак використовувався метод багатокритеріальної оптимізації. Математична модель дослідженого зв’язку мала вигляд рівняння:

Wh = f (A,BC) = 7,948 – 2,629 A + 4,519 (BC) + 2,56 A2 + 4,088 A(BC) -

- 16,460 (BC)2 – 1,165 A3 + 0,051 A2(BC) – 3,344A(BC)2 +11,417(BC)3.

Графічне відображення результатів аналізу показане на рис. 11 у вигляді картограми поверхні відгуку. Одержана