НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГІДРОБІОЛОГІЇ

Мехед Ольга Борисівна

УДК [574.64+591.3]:597.54.3

ВПЛИВ ПЕСТИЦИДНОГО ЗАБРУДНЕННЯ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА НА ІХТІОЛОГІЧНІ ПОКАЗНИКИ ТА МЕТАБОЛІЧНІ ПЕРЕТВОРЕННЯ

В ОРГАНІЗМІ КОРОПА

03.00.10 – іхтіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії екологічної біохімії Чернігівського державного педагогічного університету імені Т.Г.Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор ЯКОВЕНКО Борис Володимирович

Чернігівський державний педагогічний університет, професор кафедри хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

АРСАН Орест Михайлович,

Інститут гідробіології НАН України,

завідувач відділу екотоксикології

кандидат біологічних наук, доцент

АЛЕКСІЄНКО Вадим Романович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

доцент кафедри зоології

Провідна установа: Дніпропетровський національний університет, м. Дніпропетровськ

Захист дисертації відбудеться 23 червня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.213.01 Інституту гідробіології НАН України за адресою: 04210, м. Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гідробіології НАН України (04210, м. Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12)

Автореферат розісланий “ 20 ” травня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Гончаренко Н.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток сільського господарства та загальне зростання антропічного впливу на водне середовище загострило проблему виживання водних тварин і, зокрема, риб, в умовах пестицидного навантаження. Забруднення внутрішніх водойм, в тому числі рибогосподарських, гербіцидами є одним з лімітуючих чинників функціонування модельних водних екосистем та їх біопродуктивності. У зв’язку з цим вивчення фізіолого-біохімічних механізмів адаптації на рівні обмінних процесів у риб, а також їх енергетичне забезпечення у відповідь на токсичний вплив пестицидів є однією з головних умов розробки ефективних засобів та способів підвищення стійкості організму риб до змінених умов існування. Знання характеру особливостей надходження, розподілу, накопичення пестицидів в органах та тканинах, біохімічних змін в результаті отруєння може бути використане для пояснення механізмів адаптації риб до токсикантів, виявлення причин загибелі гідробіонтів у природних водоймах та обґрунтування методів контролю забруднення навколишнього середовища.

Роботи Врочинського К.К. (1987) з питань охорони водних ресурсів, Лук’яненка В.І. (1967) з питань іхтіотоксикології, Фреймане Т.Х., Грундуле М.В., Звіргздс Ю.К та співробітників (1971, 1973) стосовно біохімічних змін в організмі риб під впливом гербіцидів, Щербакова Ю.А.(1976), який вивчав патоморфологічні відхилення в органах риб при дії пестицидів надають відомості про окремі зміни в організмі риб при пестицидному токсикозі а також є теоретичною основою обґрунтування токсичності зазначених речовин. Крім того, у більшості випадків для вивчення біохімічних, морфологічних, фізіологічних перебудов автори використовують риб одного віку. Наше дослідження передбачає комплексне вивчення процесів, які відбуваються в організмі коропа різного віку за умови дії таких токсикантів як зенкор (4-аміно-6-третбутил-3-(метилтіо)-1,2,4-триазин-5(4Н)-ОН та амонійної солі 2,4-дихлор-феноксиоцтової кислоти.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є складовою частиною держбюджетної науково-дослідної теми 16/98 “Оцінка комплексного впливу токсикантів та природних фізичних факторів на екосистему малої річки (на прикладі річок Чернігівського Полісся)”, яка виконувалась в межах координаційного плану за фаховим напрямком “Біологія” Міністерства освіти і науки України.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення впливу токсичних концентрацій гербіцидів (зенкору та 2,4-ДА) на регуляцію субстратно-енергетичного балансу, спрямованість і швидкість метаболічних перетворень в організмі риб різного віку.

Для досягнення мети вирішувались наступні завдання:

- вивчити накопичення гербіцидів в організмі коропа різного віку (від ікри до дворічки) при підвищеному вмісті токсикантів у водному середовищі;

- дослідити морфологічні зміни органів риб у відповідь на існування в умовах гербіцидного токсикозу;

- прослідкувати динаміку основних енергетичних субстратів, які беруть участь у забезпеченні процесів детоксикації;

- виявити сезонні, вікові та тканинні особливості функціонування основних ферментних систем енергозабезпечення в умовах гербіцидного токсикозу.

Об’єкт дослідження: короп лускатий (Cyprinus carpio L.).

Предмет дослідження: з’ясування впливу гербіцидів амонійної солі 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та зенкору на іхтіологічні показники та метаболічні перетворення в організмі коропа різного віку.

Методи дослідження: іхтіологічні, гідрохімічні, біохімічні, токсикологічні

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше системно проаналізовано особливості накопичення різних хімічних форм гербіциду 2,4-Д в залежності від тканини та віку риб; на субстратно-метаболічному рівні дана комплексна характеристика процесів, що відбуваються в організмі коропа різного віку за дії токсикантів залежно від пори року; прослідковано ферментну активність в процесі енергозабезпечення організму риб протягом року під впливом сезонних змін температури, освітлення та залежно від віку риб; фізіолого-біохімічні зміни в організмі риб розглянуто в системі з морфологічними та поведінковими порушеннями при дії токсикантів.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі одержаних результатів виявлені ключові показники для оцінки морфо-функціональної адаптації коропа до дії пестицидів: вміст вільних амінокислот, глюкози, кетокислот, співвідношення швидкостей енергозатратних та енергогенеруючих процесів. Запропоновано узагальнену схему участі основних метаболітів у процесах знешкодження токсикантів. Результати роботи можуть стати основою в діяльності дослідницьких та рибогосподарських організацій для розробки підходів зі зниження шкідливої дії чинників водного середовища при проведенні технологічних операцій з вирощування риб.

Особистий внесок здобувача. В отриманні експериментальних даних автору належить провідна роль. Статистична обробка даних, їх обговорення та висновки виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення доповідалися на: ІІІ З’їзді Гідроекологічного товариства України (Тернопіль, 2001); VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); Міжнародній науковій конференції „Фальцфейнівські читання” (Херсон, 2003); Міжнародній науковій конференції “ Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных" (Росія, Саранськ, 2005); Науково-практичній конференції „Суспільно-географічні дослідження природно-господарського комплексу Запорізького краю і суміжних територій” (Мелітополь, 2003)

Публікації. По матеріалам дисертації опубліковано 9 робіт, із них 5 – у фахових виданнях і 4 – в матеріалах конференцій.

Структура і об’єм роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини (4 розділи), підсумків, висновків та списку використаних джерел( 245 найменувань, з них 81 – на іноземних мовах). Робота викладена на 163 сторінках, містить 43 рисунки та 14 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОСОБЛИВОСТІ НАДХОДЖЕННЯ, НАКОПИЧЕННЯ ТА ВПЛИВ ПЕСТИЦИДІВ НА ОРГАНІЗМИ ГІДРОБІОНТІВ

Огляд літератури

В розділі проаналізовано джерела та шляхи потрапляння пестицидів у водойми, закономірності їх накопичення та вмісту в тканинах риб, морфологічні, фізіологічні та біохімічні зміни в організмі гідробіонтів за дії даних токсикантів, а також вплив різних чинників зовнішнього та внутрішнього середовища на детоксикаційні процеси в організмі риб. Аналіз літературних джерел свідчить про недостатнє вивчення механізмів енергетичного забезпечення морфо-функціональної адаптації риб до дії підвищених концентрацій таких пестицидів як амонійна сіль 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-ДА) та зенкор, а наявні дані вимагали уточнення, поглиблення, аналізу та систематизації.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктом дослідження слугував короп лускатий (Cyprinus carpio L.) різного віку (личинка, мальок, цьогорічка, дворічка).

Риб відбирали з природної водойми (зимувальний ставок Чернігівського рибокомбінату). Протягом усього періоду досліджень (1998-2004 роки) гідрохімічний режим води контролювали за допомогою приладу Horiba моделі U-7 (Японія). Вміст кисню у воді ставків коливався в межах 9,6-12,5 мг/л; рН – 7,4-8,4; вміст аміаку – 0,014 мг/л. Вказані умови не викликали розвиток в організмі коропа гіпоксії, гіперкапнії, гіпотермії. За даними іхтіопатологічних спостережень на рибах нашкірних збудників паразитичних хвороб не виявлено. Стрічкових паразитів також не зафіксовано. Досліди з вивчення впливу пестицидів проводили в 200-літрових акваріумах з відстояною водопровідною водою, в які рибу розміщували з розрахунку 1 екземпляр на 40 л води. Маса риб коливалась в межах 40-60г (цьогорічка) та 200-300г (дворічка). В усіх випадках здійснювали контроль і підтримували постійний гідрохімічний режим води. Величина рН складала 7,30±0,27; вміст кисню – 5,6±0,4 мг/л, температуру витримували близькою до природної в залежності від пори року. Дослідження проводили протягом року.

Концентрацію досліджуваних пестицидів (0,2 мг/дм3), що відповідає 2 ГДК, створювали шляхом внесення розрахункових кількостей 10%-ної кристалічної 2,4-Д кислоти (2,4-Д), 40%-ного водного розчину 2,4-Д-амінної солі (2,4-ДА) і розчину 2,4-Д бутилового естеру у льодяній оцтовій кислоті. Концентрація зенкору становила 0,2 мг/дм3 і досягалась внесенням 70%-ного порошку зенкору. При дослідженні дії гербіцидів сумісно з низькими температурами води температурний режим підтримували штучно завдяки додаванню льоду.

Для визначення кількісного накопичення гербіцидів в організмі коропа використовували білі м’язи, печінку, головний мозок, зябра та кишечник риб. Очистку екстрактів тканин та визначення в них пестицидів проводили хроматографічно згідно методичних рекомендацій з визначення мікрокількостей пестицидів в продуктах харчування рослинного та тваринного походження, кормах та зовнішньому середовищі (1977, 1982).

Аналіз амінокислотного складу здійснювали за Пасхіною Т.С. (1964) та Ali A.N. (1983). Вміст глюкози в хлорних екстрактах визначали з о-толуїдиновим реактивом (Ємельяненко та ін., 1988). Визначення вмісту макроергічних сполук у мозку риб здійснювали методом тонкошарової хромотографії за рекомендаціями Маляревської О.Я. та Білик Т.І. (1985) у 8-% хлорних екстрактах.

Вміст лактату і пірувату визначали ферментним методом (Прохорова, 1982). Гомогенати тканин використовували для визначення активності ферментів.

Для визначення можливості утворення в організмі коропа глюкози з невуглеводних компонентів досліджували незворотні реакції глюконеогенезу. Визначення активності глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Фази) проводили за Львовою С.П. (1985), фруктозо-1,6-дифосфатази (Ф-1,6-ДФази) - за Орехович В.Н. (1964). З метою встановлення рівнів активності ферментів енергетичного обміну досліджували глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну (Г-6-ФДГ), лактатдегідрогеназну (ЛДГ) активності у цитоплазматичній фракції, ізоцитратдегідрогеназну (ІЦДГ), малатдегідрогеназну (МДГ) - в обох. Виділення мітохондрій здійснювали по загальноприйнятій методиці (Зініч, 1986), додатково очищували цетрифугуванням у градієнті густини сахарози 0,32-1,2М (Арутюнян та ін., 1978) в горизонтальному роторі. Г-6-ФДГ, ІЦДГ, ЛДГ- та МДГ-азну активності визначали спектрофотометрично при 340 нм. (Biochemica information, 1975). Вміст білку в ферментних препаратах визначали за методом Лоурі і співавт. (1951).

Вимірювання риб проводили згідно методичних рекомендацій Баклашової Т.А.(1990). Розраховували коефіцієнт вгодованості, вимірювали зоологічну та стандартну довжини риб, найбільшу висоту тіла, а також висоту на рівні початку анального плавця, на рівні анального отвору, та висоту хвостового стебла, також визначали масу риб.

Коефіціент Фултона розраховували за Пучковим Н.В. (1954).

Усі результати були оброблені статистично за Ойвіним І.А. (1960). Відмінності між порівнюваними групами вважали достовірними при Р<0,05.

НАКОПИЧЕННЯ ГЕРБІЦИДІВ ГРУПИ 2,4-Д (КИСЛОТА, АМОНІЙНА СІЛЬ, БУТИЛОВИЙ ЕСТЕР) ТА ТРИАЗИНУ (ЗЕНКОР) В ОРГАНІЗМІ КОРОПА ЛУСКАТОГО В УМОВАХ ТОКСИКОЗУ

Рівень накопичення токсикантів у тканинах риби та його вікові особливості має надзвичайно важливе значення в умовах інтенсифікації рибництва. Наші дослідження показують, що здатність до кумуляції в тканинах риб для різних гербіцидів залежить від класу пестицидів, хімічної речовини, якою його представлено (2,4-Д кислота, амонійна сіль чи бутиловий естер), тканини та віку риб. Так, кумуляцію зенкору (представник триазинів) не виявлено у жодній тканині риб жодного віку, на відміну від гербіцидів-представників групи феноксиоцтової кислоти. Порівнюючи здатність до кумуляції в тканинах риб різних форм гербіциду за дії однакових концентрацій токсиканту, можна стверджувати, що найбільший коефіцієнт накопичення має 2,4-Д бутиловий естер. Якщо прийняти за 1 кількість накопиченої кислоти в мозку, то співвідношення 2,4-Д кислота : 2,4-Д амонійна сіль : 2,4-Д бутиловий естер будуть становити 1:1,6:32,8 для мальків, 1:1,35:10,2 для цьогорічок та 1:1:10,03 для дворічок. Крім того, результати досліду з визначення вмісту пестицидів в ікрі та личинках коропа, що перебували у воді з вмістом токсикантів 0,2 мг/дм3, показали, що в ікрі виявляється лише бутиловий естер; 2,4-Д кислота та її амонійна сіль не потрапили у середину ікринок. У личинок виявлено лише сліди цих пестицидів. Щодо 2,4-Д бутилового естеру, то його накопичилась за цей період значна кількість – 0,56 мг/кг маси тіла. Враховуючи концентрацію вказаного токсиканта у воді, в якій перебувала риба (0,2 мг/дм3), можна стверджувати про кумуляцію токсиканта. Наступне потрапляння пестициду у водойму призведе до накопичення додаткової кількості токсиканта на фоні вже наявного та до прояву токсичної дії в результаті синергізму (Врочинський, Маковський, 1979).

Аналізуючи результати дослідів з нагромадження пестицидів в тканинах (мозок, печінка, білі м’язи, кишечник, зябра) коропа різного віку (мальки, цьогорічки, дворічки) можна зробити висновок, що суттєвих відмінностей у рівні накопичення 2,4-Д кислоти у риб різного віку в одних і тих же тканинах не спостерігається: мінімальною кількістю накопиченого токсиканту характеризуються м’язова тканина, кишечник і зябра риб, але у всіх вікових групах цей токсикант в значних кількостях виявляється в печінці (0,55±0,12; 0,40±0,02 та 0,40±0,03 мг/кг тканини у мальків, цьогорічок та дворічок відповідно) та в мозку (0,50±0,08; 0,60±0,16 та 0,61±0,11 мг/кг тканини).

Порівняно з кислотою 2,4-Д амонійна сіль краще проникає в організм риб і акумулюється головним чином в мозку. Взагалі, по здатності різних тканин накопичувати 2,4-ДА їх можна розташувати в такий ряд: мозок печінка м’язи зябра кишечник. Така тенденція по відношенню до цього пестициду спостерігалась у риб всіх вікових груп. На відміну від 2,4-Д кислоти та її солі рівень накопичення 2,4-Д бутилового естеру в тканинах риб різного віку був набагато вищий. Найбільший вміст згаданого токсиканту зареєстровано в мозку мальків, кількість його сягала 16,40±0,93мг/кг тканини, що майже в 3 рази перевищує його вміст в цьому ж органі у цьогорічок та дворічок. Цілком можливо, що більша кількість накопиченого личинками 2,4-Д бутилового естеру у порівнянні з кислотою та її сіллю, обумовлена специфічною формулою молекули, яка здатна проникати через зовнішні покриви тварин. Високі кумулятивні властивості естеру пояснюються функціональною кумуляцією (Павлов, 1986), а накопичення 2,4-Д кислоти поряд з її бутиловим естером при дії лише естеру пояснюється його гідролізом (Щербаков, Полубояринова,1970).

МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ ОРГАНІВ КОРОПА ПРИ ДІЇ ГЕРБІЦИДІВ, ПОВЕДІНКОВІ ЗМІНИ РИБ

В процесі індивідуального розвитку та під впливом токсикантів змінюються морфологічні та поведінкові показники риби. Кожен період життєвого циклу організму характеризується власною системою зв’язків з навколишнім середовищем та своїми основними пристосуваннями до умов життя. Результати дослідження кількісних морфологічних показників екстер’єру риб (коефіцієнт вгодованості, зоологічна та стандартна довжина риби, найбільша висота тіла риби тощо) свідчать, що вони вирогідно не змінюються при перебуванні протягом чотирнадцяти днів в умовах гербіцидного токсикозу (2 ГДК). Однак, у ряді випадків спостерігалась тенденція до кількісного зменшення більшості з досліджуваних показників.

Дослідження луски і шкіри плавців риб виявили велику кількість клітин-меланофорів у коропів, які знаходились в розчині 2,4-ДА. Це дозволяє зробити припущення про знешкодження пестициду шляхом перетворення його в меланін, як це описано для інших токсичних речовин, зокрема скатолу (Пучков, 1954). Значну кількість слизу білого кольору, яку виявлено в акваріумі з рибами, що існували в умовах токсикозу 2,4-ДА, можна пояснити руйнацією верхніх шарів епідермісу та впливом на бокаловидні клітини. Аналогічне явище спостерігається при механічному тиску на тіло риби і руйнації верхнього шару слизових клітин та зернистого шару клітин (Пучков, 1954).

Поведінкові реакції отруєних риб можна використовувати як початкові ознаки порушень нормальної життєдіяльності. Дія зенкору, як і більшості розчинів отрут органічного походження (Лук’яненко, 1983), супроводжувалась бурхливою руховою активністю піддослідних риб, особливо це стосувалось цьогорічок. В той же час коропи, що перебували під впливом 2,4-ДА, проявляли більшу рухову активність лише в перші години інтоксикації, однак у них спостерігали перехід у поверхневий шар води і такий специфічний симптом, як заковтування повітря, а також підвищену чутливість до звукових подразників.

ДИНАМІКА ОСНОВНИХ ЕНЕРГЕТИЧНИХ СУБСТРАТІВ, ЯКІ БЕРУТЬ УЧАСТЬ У ЗАБЕЗПЕЧЕННІ ПРОЦЕСІВ ДЕТОКСИКАЦІЇ В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД ФАКТОРІВ СЕРЕДОВИЩА

У всіх досліджуваних тканинах дворічок спостерігали вирогідно більший вміст вільних амінокислот (за винятком лізину у білих м’язах та аспарагіну, треоніну і аланіну в мозку риб) порівняно з цьогорічками. Це можна пояснити переважанням синтетичних процесів над процесами розпаду під час росту організму, тоді як у зрілому віці встановлюється певна рівновага між цими явищами (Ким, 1987). Виявлено, що у коропа під впливом 2,4-ДА та зенкору значно зменшується вміст вільних амінокислот в м’язах, печінці та мозку, що може призвести до загибелі риб в період зимового голодування. Цьогорічки більш чутливі до дії гербіцидів, ніж дворічки, кількісний склад вільних амінокислот піддається у них більшим змінам. Вільні амінокислоти, поряд з білками, можуть бути субстратом для енергозабезпечення організму риб за дії екстремальних чинників зовнішнього середовища (Сорвачев, 1982; Яковенко, 1993; Курант, 2003). Переважне значення для ендогенного живлення організму риб у зимовий період мають такі амінокислоти як гліцин, цистеїн, аспарагінова і глутамінова кислоти. В умовах токсикозу спостерігали збільшення вмісту глутамінової кислоти в усіх досліджуваних тканинах (за винятком м’язів двохрічок за дії 2,4-ДА). Це узгоджується з відомими фактами про центральну роль глутамінової кислоти на шляху дисиміляції решти амінокислот в процесі їх дезамінування через глутаматдегідрогеназну систему (Хочачка, Сомеро, 1988). Аналогічна закономірність характерна і для іншої дикарбонової кислоти (мозок риб обох вікових груп, печінка дворічок та білі м’язи цьогорічок) – аспарагінової, яка бере участь у трансаміназній реакції. Зменшення рівня фенілаланіну, валіну, гліцину, лізину, лейцину та ізолейцину та інших амінокислот свідчить про посилення катаболізму амінокислот в умовах гербіцидного навантаження, як це описано для риб при інтоксикації фенолом (Сомкина, Кричевская, 1968; Кривопиша, 2001).

Результати досліджень, проведених нами з метою вивчення сезонних змін рівня глюкози в мозку, печінці та білих м’язах свідчать, що у дворічного коропа максимальний вміст глюкози у всіх досліджуваних органах спостерігається у січні (110,31, 32,11 та 33,14 мкмоль/г сирої тканини відповідно у печінці, білих м’язах та мозку), а мінімальний – навесні, у квітні і становить 8,4 мкмоль/г сирої тканини у печінці, 3,81 мкмоль/г сирої тканини в білих м’язах та 3,23 мкмоль/г сирої тканини у мозку).

Нами відмічено загальну тенденцію до зменшення вмісту глюкози в усіх досліджуваних тканинах за дії обох гербіцидів. В залежності від токсиканту, пори року та досліджуваного органа зменшення кількості вуглеводу на грам тканини коливається від 1,33 рази (білі м’язи, під дією зенкору у жовтні) до 2,91 рази у мозку за дії 2,4-ДА у квітні. Порівнюючи вплив гербіцидного навантаження на здатність тканин коропа до накопичення глюкози, можна зробити висновок, що 2,4-ДА викликає більші зміни її вмісту в досліджуваних органах порівняно з зенкором (табл. 1).

Таблиця 1.

Вміст глюкози (мкмоль/г сирої тканини) в тканинах коропа лускатого різного віку при дії гербіцидів (М±m, n=5)

Вік риби | Орган (тканина) | Контроль | 2,4-ДА | Зенкор

Цьогорічки | Білі м’язи | 3,96±0,42 | 2,04±0,38* | 1,82±0,16*

Печінка | 82,60±8,94 | 46,12±6,19* | 38,14±6,83*

Мозок | 5,14±0,69 | 3,40±0,12* | 3,90±0,18

Дворічки | Білі м’язи | 4,18±0,84 | 2,90±0,50 | 3,14±0,59

Печінка | 66,48±4,18 | 31,14±4,10* | 44,87±9,38

Мозок | 4,96±0,83 | 2,17±0,09* | 3,18±0,90

Але зміни рівня глюкози також залежать не тільки від токсиканту, а значною мірою визначаються тканиною та порою року. Із усіх досліджуваних тканин найменших змін зазнав мозок: вирогідні відмінності спостерігали лише у січні (18,3±1,70 проти 33,14±6,16 мкмоль/г тканини, Р<0,05). Зниження рівня глюкози у м’язах та печінці коливалось від 1,33 до 1,90 разів. За однакових умов токсичного гербіцидного навантаження можна стверджувати про більшу вразливість м’язової тканини та печінки молодших риб порівняно з дворічками, але, разом з тим, рівень глюкози у мозку цьогорічок зазнав ще менших змін, ніж у дворічних коропів. Зниження вмісту глюкози в тканинах можна пояснити метаболічними перетвореннями, участю у низці метаболічних процесів, що виявляються у підвищенні активності відповідних ферментів (Грубінко, 2001). Крім того, нами виявлено, що суттєвий вплив на вміст глюкози в досліджуваних тканинах має температурний чинник: при зниженні температури води до 5-6?С токсичність зенкору посилювалась, що викликало значне зменшення рівня вуглеводу в усіх тканинах.

В умовах низьких температур для пойкілотермних тварин зростає важливість наявності глюкози як метаболіту, оскільки вона запобігає замерзанню тканинної рідини, приймає участь в осморегуляції і синтезі проміжних продуктів обміну. Збільшення кількості глюкози відбувається за рахунок реакцій глюконеогенезу, про що може свідчити активізація ферментів даного процесу та зниження рівня вільних амінокислот, зокрема гліцину, аланіну та серину, які за даними дослідників (Rowsell, 1979; Wolton, 1982) для інших видів риб слугують вихідними субстратами для глюкози в реакціях глюконеогенезу. Крім того, джерелом глюкози можуть бути гліцерол і лактат (Mommsen, 1985).

Лактат виступає головним субстратом проміжного обміну глюкози, що відбувається за участю різних органів. За дії гербіцидів відбувається незначне зменшення кількості лактату в усіх досліджуваних тканинах риб, однак зміни невирогідні. Для розуміння механізмів енергозабезпечення функціональної адаптації коропа до дії пестицидів необхідна інформація про стан процесів гліколізу і цикла Кребса в організмі риб, про які можна судити як по рівню активності певних ферментів, так і по зміні концентрації метаболітів цього циклу.

В результаті досліджень виявлено вищий вміст лактату, пірувату, ?-кетоглутарату, оксалоацетату та малату у тканинах коропа дворічного віку порівняно з цьогорічками. Оскільки досліди проводили у жовтні, то можна стверджувати, що в осінній період у цьогорічок коропа не відбувається суттєвого накопичення досліджуваних метаболітів у тканинах, тобто дворічні коропи виявляються краще підготовленими до зимівлі порівняно з цьогорічками.

Результати дослідів свідчать про зниження кількості вищезазначених метаболітів в результаті пестицидного навантаження (2,4-ДА при цьому має більший вплив на зміну рівня метаболітів порівняно з зенкором). Крім того, слід зазначити, що у мозковій тканині спостерігали найменші зміни вмісту метаболітів з усіх досліджуваних тканин. Відомо, що синтез і катаболізм кетокислот, малату і лактату пов’язані відразу з декількома ферментами і торкаються одночасно обміну вуглеводів, жирів, амінокислот та інтеграції перетворення низькомолекулярних сполук в ЦТК (Островський и др., 1984). Однак, очевидно, що в умовах токсикозу відбувається більш інтенсивне перетворення кетокислот та інших метаболітів, пов’язане з енергетичними процесами.

Енергетичний стан організму коропа можна прослідкувати за кількісними показниками вмісту макроергічних сполук, оскільки у риб відмічається більш стабільне підтримання рівня АТФ порівняно з ссавцями (Палладин и др., 1972). Вміст аденілатів в тканинах коропа різного віку коливався в широких межах. Однак загалом відносно більший вміст даних макроергів відмічено в тканинах цьогорічок, що, певно, пов’язано з більш активним протіканням обмінних процесів. Максимальна кількість АТФ у цьогорічки коропа містилась у білих м’язах, найменша – у головному мозку. Однак при дії екстремальних факторів ці співвідношення змінювались: в умовах токсикозу 2,4-ДА вміст АТФ у м’язах зменшувався у 4,77 рази, а під впливом зенкору – у 11,12 разів. Зміни кількості АДФ у м’язах залежали від гербіциду, що застосовувався, а вміст АМФ, незалежно від токсичних умов незначно підвищувався.

У дворічних коропів досліджувані тканини за зменшенням кількості АТФ розташовувались у наступному порядку: „печінка – білі м’язи – мозок”. Картина токсикозу дворічок також дещо інша порівняно з молодшими рибами. Так, у білих м’язах 2,4-ДА викликала зниження рівня всіх досліджуваних аденілових нуклеотидів, у печінці та мозку зміни були неоднозначні: вміст АТФ незначно підвищувався (на 7% та 10 % відповідно), в той час як АДФ та АМФ – знижувався.

Зенкор викликав зменшення кількості АТФ, АДФ та АМФ у білих м’язах та печінці риб, однак у різному ступені. Аналогічно цьогорічкам, найменшого впливу зазнав мозок риб.

Поясненням значного різкого зменшення вмісту макроергів у тканинах є встановлений факт про роз’єднання окислення і фосфорилювання за дії препаратів групи 2,4-Д (Павлов, 1986). Крім того, у випадку дії зенкору можна припустити, що частина енергії АТФ витрачається для його виведення з організму, аналогічно виведенню інших органічних речовин, зокрема фенолу (Флеров, 1977). Зенкор позбавляє організм енергетичних запасів і здатності ресинтезувати АТФ, 2,4-ДА, поряд з підвищенням аденілатного енергетичного заряду, також знижує здатність організму ресинтезувати АТФ, що веде до швидкого виснаження організму.

Порівнюючи дію токсикантів на організм риб різного віку, треба відмітити, що гербіциди при однакових концентраціях, часу дії та інших умовах значно більше впливали на кількісні показники аденілатів у цьогорічок.

Із досліджуваних тканин найменшого токсичного впливу у риб обох вікових груп зазнав мозок, а найбільшого – білі м’язи.

ФУНКЦІОНУВАННЯ ОСНОВНИХ СИСТЕМ ЕНЕРГОЗАБЕЗПЕЧЕННЯ В УМОВАХ ТОКСИКОЗУ

Відомо, що в процесі онтогенезу ферментативні системи тварин зазнають певних змін. Сьогодні це явище широко досліджується як у теплокровних, так і у пойкілотермних тварин. У відповідності до сучасних уявлень, основним механізмом регуляції метаболічних процесів є зміни активності окремих ферментів чи ферментних систем, що забезпечують нормальний хід метаболізму (Gallagher, 1991).

Вивчення біохімічних показників життєдіяльності коропа лускатого різного віку у відповідь на отруєння гербіцидами може бути використане для пояснення вікових змін механізмів адаптації риб до токсикантів.

Отримані нами дані показали, що в організмі цьогорічок коропа порівняно з дворічками більш інтенсивно протікають як реакції гліколізу, так і тканинне дихання. Остання обставина дає можливість більш молодим особинам переключатись з гліколітичного шляху на аеробний для отримання енергії у вигляді АТФ. Такий висновок узгоджується з літературними даними, де показано, що в ранньому онтогенезі риб спостерігаються зміни як рівня так і характеру метаболізму (Озернюк, 1985). Мозкова тканина цьогорічок коропа характеризувалась більш інтенсивними реакціями аеробного обміну. На цьому фоні звертає на себе увагу значна активність ІЦДГ та Г-6-ФДГ порівняно з дворічками. Більша активність Г-6-Фази та Ф-1,6-ДФази в мозковій тканині у цьогорічок свідчить про більш швидке забезпечення мозку глюкозою у молодих особин (табл.2, 3). З віком, по мірі вдосконалення метаболічних шляхів, їх адаптації до умов навколишнього середовища, витрати енергоресурсів стають більш економними.

Таблиця 2

Активність Ф-1,6-ДФази (мкмоль Рi на 1 мг білку за 1 хв) в тканинах цьогорічок та дворічок коропа, (M±m, n=6)

Тканина | Цьогорічки | Дворічки

Білі м’язи | 0,8410,121 | 0,1930,001*

Печінка | 0,2790,083 | 0,1800,032

Мозок | 0,0930,012 | 0,0310,004*

Таблиця 3

Активність Г-6-Фази (мкмоль Рi на 1 мг білку за 1 хв) в тканинах цьогорічок та дворічок коропа (M±m, n=6)

Тканина | Цьогорічки | Дворічки

Білі м’язи | 0,1120,028 | 0

Печінка | 1,2100,051 | 0,2310,003*

Мозок | 0,2010,032 | 0,0460,003*

Під впливом гербіцидів групи хлорфеноксиоцтової кислоти відбуваються певні зміни в обміні речовин коропа, і в першу чергу це стосується активності клітинних ферментів. Ферменти різних шляхів вуглеводного обміну по-різному реагують на пестицидне забруднення, оскільки зміни активності окремих ферментів чи ферментних систем є основним механізмом регуляції метаболічних процесів. Зокрема, лактатдегідрогеназа виявилась менш лабільною в порівнянні з ізоцитратдегідрогеназою, що може свідчити про стабільність функціонування гліколізу в умовах токсикозу. Зміни активності МДГ в умовах токсикозу мають чітко виражений тканинний вплив. Якщо у білих м’язах, незалежно від токсиканту, мінімальні зміни активності ферменту спостерігали у липні (цитоплазма) та жовтні (мітохондрії), а максимальні у жовтні (цитоплазма 2,4-ДА) та січні, то фермент печінки і мозку виявився найменш чутливим у січні та жовтні, а найбільшого впливу токсикантів зазнав у липні (печінка) та квітні (мозок).

Порівняно з МДГ, ІЦДГ виявилась більш чутливою до дії гербіцидів. Фермент цитоплазматичної фракції білих м’язів по-різному реагує на токсичну дію 2,4-ДА та зенкору. Так, якщо перший гербіцид активує дію ІЦДГ (вирогідні відмінності у січні, квітні та липні, максимальні – у квітні – збільшення активності у 3,03 рази), то зенкор викликає пригнічення активності ферменту (найбільший вплив у жовтні, найменший – у липні). ІЦДГ мітохондріальної фракції білих м’язів у відповідь на дію як 2,4-ДА так і зенкору збільшує свою активність. Але, якщо перший гербіцид викликав максимальні зміни у квітні (0,480±0,036 порівняно з 0,220±0,082 мкмоль NADН/ мг білка за хв., Р<0,02 відмінності становлять 2,19 разів), то дія зенкору виявилась найбільшою у січні (збільшення активності у 2,58 разів порівняно з активністю ферменту у риб контрольної групи).

ЛДГ різних органів в умовах гербіцидного навантаження повторює загальну тенденцію змін активності даного ферменту риб у контролі протягом року (рис.1).

У білих м’язах взимку незалежно від умов існування (у риб контрольної групи та тих, що перебували в умовах токсикозу) відмічали зниження активності ферменту, а навесні та влітку – підвищення. У печінці та мозку риб всіх трьох груп активність ферменту збільшувалась з жовтня по квітень, а влітку – пригнічувалась. Стосовно токсичного впливу гербіцидів, то мінімальний він був у всіх досліджуваних тканинах восени та взимку, а максимальний – навесні та влітку, що пояснюється зміною інтенсивності обміну речовин у риб, як пойкілотермних тварин, зі зниженням температури води у водоймі (Никольский, 1974; Моисеев, 1981).

Рис.1. Активність ЛДГази в тканинах коропа протягом року в умовах токсикозу (M±m, n=5)

Зміни активності Г-6-ФДГ у відповідь на пестицидне забруднення носять чітко виражену тканинну залежність. Якщо у білих м’язах та мозку максимальні зміни активності ферменту спостерігали у січні та жовтні, то печінка на токсичний вплив пестицидів відповідала найбільшими змінами у активності Г-6-ФДГ у липні.

Відомо, що однією з функцій ПФШ є утворення відновлених форм НАДФН+Н+ за участю Г-6-ФДГ. Відновлені НАДФН+Н+ далі використовуються у біосинтезі жирів. Останні необхідні організму риб не лише як джерело енергії, а також для біосинтезу глюкози, зокрема в період зимового голодування, коли даний моносахарид відсутній у навколишньому середовищі в період зимівлі (Яковенко, 1991). Враховуючи підвищення лактатдегідрогеназної активності в тканинах коропа, який зазнав дії пестицидів, можна припустити накопичення лактату. Але, як свідчать попередні дані, цього не відбувалось. Така ж тенденція характерна і для пірувату. Тому можна зробити висновок про те, що підвищення активності катаболічних ферментів забезпечує вихідними субстратами процес глюконеогенезу, посилюючи його інтенсивність.

В результаті експериментів виявили, що 2,4-ДА викликає збільшення активності обох досліджуваних ферментів глюконеогенезу (Г-6-Фаза та Ф-1,6-ДФаза), в той час як дія зенкору проявилась неоднозначно. Зокрема, у дворічок зенкор призводив до появи активності Г-6-Фази у м’язах (у контрольної групи риб активність даного ферменту в цитоплазматичній фракції білих м’язів не виявлена) та зростання активності Ф-1,6-Дфази в 3,11 разів порівняно з контролем в цій тканині. У цьогорічок також спостерігали незначне збільшення активності обох ферментів в білих м’язах, але воно було не вирогідним. На відміну від білих м’язів, у печінці та мозку дворічок за дії зенкору спостерігали вирогідне зменшення активності обох досліджуваних ферментів глюконеогенезу.

Таким чином, проведені дослідження можуть бути доказом адаптивних перебудов обміну речовин, направлених на виживання риб в умовах пестицидного токсикозу. Зазначені субстратні та ензимні зміни спрямовані на забезпечення захисту від токсикантів і, загалом, забезпечують гомеостаз функціональної активності органів і систем шляхом регуляції субстратно-енергетичного балансу (рис.2).

ЛІПІДИ | ГЛЮКОЗА | БІЛКИ

Пентозо-фосфатний шлях | протеоліз

Г-6-Ф | Ф-1,6-Дфаза

Г-6-Фаза

Г-6-ФДГ | АМІНОКИСЛОТИ

ФЕП | Формування адаптивного пулу амінокислот

NADPH | ЛДГ | підтримання гомеостазу глюкози | ТРЕ, ЦИС, АЛА, ВАЛ

ПВК

лактат

Ацетил-КоА | енергетичне забезпечення | ЛЕЙ, ФЕН, ГЛІ

Енергетичне забезпечення

МДГ

2Н | ФЕН, АСП

малат | оксалоацетат | енергетичне забезпечення

фумарат | цитрат

2Н

сукцинат | ізоцитрат | АРГ, ГІС, ГЛУ

ІЦДГ | дезамінування

сукциніл-фосфат | б-?етоглутарат

2Н | 2H

АДФ+Фн | АДФ+Фн | АДФ+Фн | 2Н++1/2О2

НАД | ? | флавопротеїн | ? | кофермент Q | ? | цитохром b | ? | цитохром c | ? | цитохром a | ?

АТФ |

АТФ |

АТФ | Н2О

Рис 2. Схема енергетичного та субстратного забезпечення адаптації організма коропа за дії пестицидів

ВИСНОВКИ

1. Накопичення гербіцидів в організмі коропа залежить від хімічної будови токсичної речовини, тканини та віку риб. Максимальне накопичення та кумулятивний ефект спостерігались для 2,4-Д бутилового естеру у печінці та мозку цьогорічок та дворічок коропа. Зенкор не нагромаджувався в організмі досліджуваних риб.

2. Здатність проникати через оболонки ікри та кумулюватись в організмі риби має 2,4-Д бутиловий естер (0,10 мг/кг сирої маси в ікрі та 0,56 мг/кг сирої маси в личинці), на відміну від 2,4-Д кислоти та 2,4-Д амонійної солі.

3. При перебуванні в умовах гербіцидного токсикозу протягом чотирнадцяти днів кількісні морфологічні показники екстр’єру риб вирогідно не змінювались, однак спостерігались якісні зміни в органах та тканинах, зокрема зміни забарвлення, надмірна насиченість водою, жирове переродження печінки, петехії та крововиливи на шкірі та плавцях.

4. Спрямованість та швидкість метаболічних перетворень відіграє провідну роль у визначенні токсикорезистентності організму риб до дії гербіцидів. Більша згубна дія токсикантів зареєстрована у молодших риб (цьогорічка) порівняно з дворічкою, що проявлялось у „розбалансуванні” ферментних систем, зміні аденілатного енергетичного заряду та позначалось на здатності ресинтезу макроергічних сполук.

5. В організмі цьогорічок коропа спостерігався значно менший вміст енергетичних субстратів (амінокислот, ?-кетоглутарату, оксалоацетату, пірувату, лактату, малату) в осінній період порівняно з дворічками, що доводить кращу підготовленість останніх до зимового голодування за рахунок механізмів збереження енергетичного гомеостазу у зимуючої риби.

6. При адаптації коропа до гербіцидів, незалежно від віку риб, спостерігали зменшення вмісту енергетичних субстратів. Найменшого токсичного впливу у цогорічок та дворічок зазнав мозок (при дії 2,4-ДА кількість ?-кетоглутарату у дворічної риби знижується на 42% та 37% відповідно у білих м’язах і печінці, а в мозку – на 19%; пірувату – на 67% у м’язах, на 40% у печінці в той час як у мозку - на 24%).

7. Токсичний вплив пестицидів у великій мірі визначався порою року, оскільки сезонні фактори змінюють спрямування енергетичної ланки метаболізму в організмі риб, впливаючи на активність ферментів та вміст енергетичних субстратів. Максимальну активацію ферментів за дії гербіцидів спостерігали навесні та влітку. У жовтні збільшення активності ЛДГ білих м’язів в умовах токсикозу зенкором становило 12 %, в той час, як у квітні – 73%. Зниження температури водного середовища посилює токсичний вплив зенкору, проявляючи синергічну дію, що проявляється у зменшенні рівня глюкози в усіх досліджуваних тканинах: у 5,9 разів в печінці, у 3,7 разів в білих м’язах та у 2,4 рази в мозку.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мехед О.Б., Яковенко Б.В. Активність ключових ферментів вуглеводного обміну в організмі коропа лускатого в умовах токсикозу // Вісник проблем біології та медицини. – 2003. - №6. – С. 20-25. (здобувач виконав експериментальні дослідження, проаналізував літературу, виконав розрахунки)

2. Мехед О.Б., Яковенко Б.В., Жиденко А.А. Активность некоторых ферментов углеводного обмена в тканях сеголеток и двухлеток карпа в осенний период // Гидробиол. журн. – 2004. - 40, №3. – С. 83-90. (здобувач провів аналіз літератури, виконав експериментальні дослідження, та розрахунки)

3. Мехед О.Б., Яковенко Б.В., Жиденко А.О. Вплив зенкору на вміст глюкози та активність ферментів глюконеогенезу в тканинах коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) при різних температурах // Укр. біохім. журн. – 2004. – 76, №3. – С. 99-103 (здобувач провів аналіз літератури, виконав експериментальні дослідження, та розрахунки)

4. Яковенко Б.В., Мехед О.Б. Концентрація гліцину та інших амінокислот у водоймах // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. Спеціальний випуск: Гідроекологія – 2001. - №3 (14). – С.242-243 (здобувач провів аналіз літератури)

5. Мехед О.Б., Яковенко Б.В. Залежність ізоцитратдегідрогеназної та ізоцитратазної активності в організмі коропа від температури середовища // Укр. біохім. журн. – 2002. – 74, №4б (додаток 2). – С.99 (здобувач виконав експериментальні дослідження, та розрахунки)

6. Яковенко Б.В., Мехед О.Б. Біохімічні зміни в організмі коропа лускатого під впливом гербіцидного забруднення навколишнього середовища // Фальцфейнівські читання. Збірник наукових праць: Матеріали міжнародної наукової конференції 23-25 квітня 2003 року. – Херсон, 2003 – С.395-396 (здобувач виконав експериментальні дослідження, проаналізував літературу, виконав розрахунки)

7. Мехед О.Б., Яковенко Б.В. Вплив пестицидного забруднення, як результату хімізації сільського господарства, на водні екосистеми // Суспільно-географічні дослідження природно-господарського комплексу Запорізького краю і суміжних територій: Матеріали науково-практичної конференції 16-17 жовтня 2003 року. – Мелітополь, 2003. – С. 43-44 (здобувач виконав експериментальні дослідження, проаналізував літературу)

8. Жиденко А.А., Мехед О.Б., Бибчук Е.В. Влияние пестицидов на качественное и количественное содержание аденилатов в тканях карпа // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных: материалы Междунар. науч. конф./ отв. ред. А.Б. Ручин. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2005. – С.68-70(здобувач провів аналіз літератури, виконав експериментальні дослідження, та розрахунки)

9. Жиденко А.А., Мехед О.Б., Близнюк Е.В. Влияние пестицидов на качественный и количественный состав свободных аминокислот в тканях карпа // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных: материалы Междунар. науч. конф./ отв. ред. А.Б.