НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Маменко

Павло Миколайович

УДК 579.841.3:581.133.1:547.96:633.367

лектини бобових і їхня фізіологічна роль

у формуванні і функціонуванні симбіозу

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Коць Сергій Ярославович,

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України,

завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович,

Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка

НАН України, завідувач відділу

доктор біологічних наук, професор

Антипчук Адель Федорівна,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться “ 17 “ березня 2005 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17).

Автореферат розісланий “ 12 “ лютого 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед заходів поліпшення азотного живлення вирощуваних культурних рослин особливе місце належить використанню результатів теоретичних і практичних розробок, спрямованих на суттєве підвищення існуючого рівня біологічного перетворення азоту атмосфери в органічні азотовмісні сполуки мікроорганізмами  азотфіксаторами і, в першу чергу, бульбочковими бактеріями. При формуванні високоефективних бобово  ризобіальних систем необхідно цілеспрямовано добирати партнерів симбіозу за їх відповідністю один одному. З цих позицій розуміння механізму розпізнавання специфічності рослини  хазяїна в симбіозі бобових рослин і бульбочкових бактерій має важливе теоретичне значення і безперечний практичний інтерес.

Розвиток симбіотичного партнерства між ризобіями та бобовими рослинами проходить серію скоординованих етапів, і одне з найважливіших місць у ньому займає взаємне розпізнавання партнерів симбіозу. Важливу роль у цьому процесі відводять лектинам, і, насамперед, лектинам бобових рослин.

Значна кількість досліджень, присвячених вивченню різних аспектів даного питання, дозволяє стверджувати, що лектини бобових рослин відіграють суттєву роль у встановленні первинних контактів рослини-хазяїна з мікросимбіонтом шляхом їх зв’язування з вуглеводним компонентом поверхні бактеріальної клітини. Проте формування симбіотичної системи не обмежується лише цим одномоментним поєднаннням, а являє собою складний процес подальшої взаємодії партнерів симбіозу.

Вивчення ролі лектинів бобових рослин у функціонуванні бобово  ризобіального симбіозу є дуже важливим, оскільки його результати дозволять з’ясувати напрями дії цього компонента, а також визначити засоби корегування симбіотичних взаємовідносин партнерів, що може мати і практичне значення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідної теми відділу симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України на 2001–2005 рр. “Вивчити процеси взаємодії бульбочкових бактерій з рослиною--хазяїном та розробити заходи підвищення продуктивності бобових культур за рахунок максимального використання біологічного азоту” (р/№ 0101U000627).

Мета і задачі дослідження. Головною метою наших досліджень було визначити роль лектинів у процесах формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу.

Для досягнення мети було поставлено наступні завдання:

- дослідити біохімічні особливості і фізіологічну активність аглютинуючого білка, виділеного з генетично модифікованої сої, нездатної утворювати симбіоз;

- встановити взаємозв’язок між адсорбцією повільно- та швидкорослих ризобій на коренях бобових рослин і їх здатністю інфікувати ці рослини;

- вивчити зміни лектинової активності різних органів бобових рослин залежно від фази їх розвитку, виявити залежність даного показника від інтенсивності азотфіксації штама-інокулянта, а також з’ясувати, чи існує взаємозв’язок між рівнями азотофіксувальної та лектинової активностей;

- дослідити опосередковану модуляторну дію лектинів на симбіотичні властивості ризобій та азотофіксувальну активність утворених за їхньою участю бульбочок;

- підібрати оптимальні концентрації лектину для можливого підвищення азотофіксувальної активності й продуктивності бобових культур

Обєкт дослідження – симбіотичні системи, створені за участю люпину жовтого (Lupinus luteus L.) сорту Промінь і бульбочкових бактерій Bradyrhizobium sp. (Lupinus), штамів 359а, 400 та Bradyrhizobium japonicum, штаму 631, а також сої (Glycine max Merr.) сорту Мар’яна, яка здатна утворювати бульбочки у симбіозі з азотофіксувальними бактеріями (нодулююча), і безбульбочкової – ізолінію сої (Glycine soja L.) сорту Лі (ненодулююча) та бульбочковими бактеріями Bradyrhizobium japonicum штамів 634б і 2110.

Предмет дослідження – фізіологічні процеси, що відбуваються у симбіотичних системах за участю лектину бобової рослини.

Методи дослідження – біохімічні (для визначення азотофіксувальної активності симбіотичних систем, виділення лектину, визначення вмісту фотосинтетичних пігментів), імунологічні (для визначення активності виділеного лектину), фізіологічні (для визначення інтенсивності видимого фотосинтезу і темнового дихання рослин), мікробіологічні (для вирощування біомаси мікроорганізмів, вивчення величини адсорбції), вимірювально–вагові (для визначення біометричних показників рослин) і математично–статистичні (для оцінки вірогідності отриманих результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у препараті лектину сої, що не утворює бульбочок, виявлено дві гемаглютинуючі фракції з різною вуглеводною специфічністю. Одна з них має близьку до комерційного лектину насіння звичайної сої електрофоретичну рухливість. Вперше показано наявність різної гемаглютинуючої активності лектинів у органах люпину та сої в онтогенезі та встановлено залежність даного показника від ефективності мікросимбіонта. З’ясовано, що зміна активності цих молекул може суттєво впливати на ефективність бобово-ризобіального симбіозу, ріст і розвиток рослин. Вперше встановлено взаємозв’язок між азотофіксувальною і лектиновою активностями. Виявлено модуляторну роль лектину у процесах росту і розвитку рослин сої. З’ясовано, що характер дії лектину залежить від його концентрації в бактеріальній суспензії. Показано перспективність застосування обробки насіння лектином у комплексі з досліджуваними мікросимбіонтами для підвищення ефективності утвореного симбіозу та збільшення урожайності бобових рослин.

Практичне значення отриманих результатів. Результати роботи суттєво поглиблюють уявлення про роль лектинів у функціонуванні симбіотичних систем бобових рослин. Враховуючи значну роль, яку відіграють лектини в різних процесах життєдіяльності бобових, дослідження зміни активності цих молекул можуть бути використані для розробки експрес-методу оцінки ефективності утвореного симбіозу. Результати проведених досліджень з використанням комплексної обробки лектином і культурою бульбочкових бактерій є основою для розробки нових елементів технології інтенсивного вирощування бобових культур.

Особистий внесок здобувача полягає в оволодінні методами досліджень, доборі і опрацюванні даних літератури, підготовці і проведенні експериментів, розробці планів досліджень, аналізі, інтерпретації і статистичній обробці результатів, підготовці до друку наукових робіт. Матеріали дисертаційної роботи одержані автором самостійно або спільно зі співробітниками Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Частка особистої участі дисертанта складає понад 70%.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на 20 міжнародній зустрічі „INTERLEC 20” (Копенгаген, Данія, 2002); 17–й Міжнародній конференції з регуляторів росту рослин (Брно, Чеська республіка, 2001); Міжнародній конференції “Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм” (Тернопіль, 2001); міжнародній конференції „Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002); XXXII щорічному симпозіумі Європейського товариства з нових методів у сільськогосподарському дослідженні (ESNA) (Варшава, Польща, 2002); VIII Конференції молодих учених „Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002); 5–й Європейській конференції „Biotechnology of microalgae” (Німеччина, 2003); XXXIIІ щорічному симпозіумі Європейського товариства з нових методів у сільськогосподарському дослідженні (ESNA) (Вітербо, Італія, 2003); конференції молодих вчених із молекулярної біології і генетики (Київ, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 праць, із них 5 статей у провідних фахових виданнях.

Обєм та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 145 сторінках машинописного тексту й складається із вступу, огляду літератури, чотирьох розділів експериментальної частини, висновків та списку використаної літератури (налічує 220 найменувань). Робота містить 14 рисунків та 35 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Даний розділ складається з трьох підрозділів, в яких викладено огляд літератури стосовно особливостей формування і функціонування симбіотичного апарату бобових культур. Подано загальну характеристику лектинам, проведено порівняльну характеристику їх біохімічних та фізіологічних особливостей. Висвітлено питання можливого застосування лектинів у біотехнології. Крім того, проведено аналіз літератури стосовно ролі цих білків у процесах формування бобово-ризобіального симбіозу. На підставі узагальнення літературних даних обґрунтовується необхідність подальшого вивчення участі лектинів у фізіологічних процесах, пов’язаних із функціонуванням симбіозу.

ОБЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У дослідженнях використовували люпин жовтий (Lupinus luteus L.) сорту Промінь, сою (Glycine max Merr.) сорту Мар’яна, яка здатна утворювати бульбочки у симбіозі з азотофіксувальними бактеріями (нодулююча), безбульбочкову ізолінію сої (Glycine soja L.) сорту Лі (ненодулююча) та комерційний лектин звичайної сої (“Лектинотест”, Львів).

У роботі також використовували повільнорослі штами 359а (активний) та 400 (неактивний) бульбочкових бактерій Bradyrhizobium sp. (Lupinus); штами 631 (активний симбіонт сої та люпину) і 634б (активний симбіонт сої) Bradyrhizobium japonicum з колекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, а також штам Bradyrhizobium japonicum 2110 (малоактивний), одержаний з Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Кінцева концентрація бактерій становила 107 клітин у 1 мл суспензії. В усіх дослідах для інокуляції використовували 1 мл бактеріальної суспензії на 80 насінин.

Вегетаційні досліди. Рослини люпину та сої вирощували в 11-кілограмових посудинах Вагнера в піщаній культурі на поживному середовищі Гельрігеля з 0,25 та 1,0 нормами азоту. Перед посівом насіння протягом 20 хв стерилізували 70 %-ним етиловим спиртом і інокулювали згідно схем дослідів різними штамами бактерій роду Bradyrhizobium. Для бактеризації насіння готували інокулят відповідних штамів.

У посудинах вирощували по 4–6 рослин при 60 %-ній вологості і природньому освітленні. Повторність дослідів 7-кратна. У дослідах використовували річковий пісок, промитий водопровідною водою.

Польові досліди проводили в науково-виробничому відділі Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (смт. Глеваха Васильківського району Київської області). Сою висівали із розрахунку 100 кг/га, ширина міжрядь – 45 см. Повторність дослідів – 5-ти разова, облікова площа ділянок 2 м2. У всіх дослідах дотримувались загальноприйнятої агротехніки. Насіння інокулювали штамом B. japonicum 634б, попередньо проінкубованим протягом 20 год з різними концентраціями лектину. Рослини контрольного варіанта інокулювали суспензією бактерій, де розчин лектину замінювали водою. Розміщення дослідних ділянок – рендомізоване.

Активність процесу азотофіксації визначали ацетиленовим методом [Hardy R.W.F. et al., 1968]. Для виділення фітогемаглютинінів різних органів рослин люпину та сої використовували метод елюювання етанолом [Маличенко С.М., Назаренко Н.И., 1994]. Інтенсивність фотосинтезу визначали за допомогою оптико-акустичного аналізатора ГІАМ-5М [Голик К.Н., 1988]. Вміст пігментів вимірювали за методом Починка [Починок Х.Н., 1976]. Визначення вмісту білків в одержаних препаратах здійснювали за методикою Вітакера [Whitaker J.R. et al., 1980]. Розділення препаратів лектинів здійснювали за допомогою градієнтного SDS-ПААГ електрофорезу за методом Лемлі [Laemmli U. K., 1970]. Визначення кількості адсорбованих бактеріальних клітин на коренях бобових рослин проводили за модифікованою методикою Бауера [Bauer W.D., 1982]. Визначення активності лектинів проводили за допомогою реакції гемаглютинації (РГА) [Луцик М.Д., Панасюк Е.H., 1983]. Статистична обробка експериментальних даних виконана за Доспєховим [Доспехов Б.А., 1985].

структурні та біологічні особливості препаратів лектинів нодулюючої і ненодулюючої сої

Електрофоретичний аналіз пулу протеїнів генетично модифікованої сої показав, що кількість смуг на гелевій пластинці була аналогічною до їх кількості, виявленої в насінні звичайної сої. Однак, за кількістю поліпептидів, на що вказує насиченість смуг, обидва типи рослин відрізнялися між собою. Найбільш вираженою така відмінність була у випадку білків, що мали високу молекулярну масу та низьку електрофоретичну рухливість. Кількісне співвідношення протеїнів з високою молекулярною масою була більшою у безбульбочкової сої порівняно зі звичайною. З насіння безбульбочкової сої екстрагувався білок з електрофоретичною рухливістю та субодиничним складом, близькими до комерційного лектину насіння сої. При цьому кількість цієї сполуки в білкових екстрактах обох типів сої була схожою.

За допомогою гель-фільтрації показано, що при низьких значеннях рН суміш білків насіння ненодулюючої лінії сої розділяється на 3 видимі фракції (рис. 1), дві з яких містять білки з високою молекулярною масою, а одна – більш низькомолекулярні. Крива розділення суміші білків сої сорту Київська  має чотири піки.

Результати визначення вуглеводної специфічності найбільш значущих лектинових фракцій ненодулюючої лінії сої показали, що одна з них, яка відзначалася подовженим часом виходу з колонки, специфічно зв’язувала два моносахариди, а саме галактозу і маніт, у той час як білки іншої фракції взаємодіяли лише з галактозою.

Лектинова фракція нодулюючої сої в аналогічних експериментах найактивніше зв’язувала галактозу. Кількість білка в ній, визначена спектрофотометрично, суттєво перевищувала такий же показник у відповідних елюатах екстракту безбульбочкової сої (див. рис. 1). Отримані результати узгоджуються з літературними даними, де зазначено, що насіння безбульбочкової сої містить гемаглютинуючий білок, який проявляє найбільшу специфічність до маніту [Мельникова Н.М., 1997].

Рис. 1. Розділення білкового екстракту насіння безбульбочкової сої (А) та сої сорту Київська (Б) на Sephadex 100 при рН 4,6

Присутність в насінні ненодулюючої лінії сої двох гемаглютинінів з різною вуглеводною специфічністю та біохімічними характеристиками може бути важливим фактором, який визначає певні симбіотичні особливості цієї форми сої. Таким чином, насіння безбульбочкової сої за кількісним співвідношенням білків з високою молекулярною масою суттєво відрізняється від білкового складу насіння звичайної сої і містить дві гемаглютинуючі фракції з різною вуглеводною специфічністю, одна з яких має електрофоретичну рухливість, близьку до комерційного лектину насіння звичайної сої.

адсорбція бульбочкових бактерій корінням специфічних і неспецифічних їм рослин

Встановлено, що адсорбція бульбочкових бактерій значною мірою залежить від тривалості контакту з коренями бобової рослини. Крім того, певний вплив на кількість адсорбованих клітин має і місце прикріплення бактерій. Так, найбільша кількість бульбочкових бактерій люпину (активний штам Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а) адсорбувалась на базальній частині кореня. Найменшою адсорбуючою здатністю характеризувався кінчик кореня. Слід зазначити, що кількість адсорбованих бактеріальних клітин не залежала від активності лектину у певній частині кореня.

У ряді досліджень із швидкорослими штамами ризобій було показано, що адсорбція швидкорослих ризобій, які утворюють бульбочки на коренях рослини-хазяїна, значно інтенсивніша, ніж адсорбція у видів, що не утворюють бульбочки [Коць С.Я. та ін., 2001]. Проведені нами дослідження з повільнорослими штамами бульбочкових бактерій показали, що, незважаючи на те, що Bradyrhizobium sp. ( Lupinus ) 359а, інфікує тільки люпин, коріння люпину і сої адсорбувало майже однакову кількість клітин цього штаму (табл. 1).

Таблиця 1

Взаємозв’язок між здатністю Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а і B. japonicum 634б адсорбуватись на корінні гомо- та гетерологічних їм бобових рослин і їхньою інфекційністю

Ризобії | Люпин | Соя

Кількість клітин, адсорбованих на

1 см кореня х 103 | Інфекцій-ність | Кількість клітин, адсорбованих на 1 см кореня х 103 | Інфекцій-ність

Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а | 33,71 ± 3,22 | + | 23,92 ± 2,34 | -

B. japonicum 634б | 22,42 ± 1,41 | - | 80,31 ± 6,73 | +

Бульбочкові бактерії сої хоча й адсорбуються в значній кількості на неспецифічних їм коренях люпину, одначе на корінні сої їх адсорбується все ж у 4 рази більше. Ці результати збігаються з даними досліджень інших авторів [Bauer W.D., 1982, Pueppke S.G., 1984] стосовно того, що ризобії, які не утворюють бульбочки на сої, також у значних кількостях зв’язуються з її корінням. Адсорбція ризобій на корінні рослин не має чітко вираженого специфічного характеру. Швидше за все це пов’язано з тим, що значний внесок у цей феномен робить фізична адсорбція.

Важливим доказом участі лектинів у прикріпленні ризобій до кореня бобової рослини є результати дослідів із вивчення здатності найспецифічніших до лектинів цукрів – гаптенів зменшувати прикріплення бульбочкових бактерій до кореня рослини-хазяїна. Показано, що інкубація коріння з розчином гаптену лектину люпину – галактозою призводить до значного зниження кількості адсорбованих на поверхні коренів клітин бульбочкових бактерій. Крім того, на кількість прикріплених клітин бактерій впливає і тривалість інкубації. Так, якщо в контрольному варіанті при 1-годинній інкубації у розчині ризобій кількість прикріплених бактерій становила 62,8 тис., то при використанні D-галактози вона складала лише 25,9 тис. Через 2 години інкубації ризобій з розчином гаптену лектину кількість бактеріальних клітин, здатних адсорбуватись на поверхні кореня, знижувалась до 13,8 тис. (табл.2).

Таблиця 2

Вплив гаптену лектину та іонів NO3- на величину адсорбції Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а на корінні люпину

Варіант | Кількість клітин на 1 см кореня, тис.

час інкубації,

1 год | % до контролю | час інкубації,

1 год | % до контролю

Контроль (попередня інкубація коріння у воді) | 62,8 ± 2,3 | 100 | 82,8 ± 2,3 | 100

Попередня інкубація коріння в 15 мМ KNO3 | 50,7 ± 4,2 | 80 | 34,5 ± 5,0 | 41

Попередня інкубація коріння в 0,1 М

D-галактозі | 25,9 ± 1,5 | 41 | 13,8 ± 1,3 | 16

Сполуки азоту також негативно впливають на адсорбцію бактерій, але меншою мірою. У зв’язку з тим, що галактоза є специфічним по відношенню до лектину люпину вуглеводом, вона блокує активний центр лектину, локалізований на поверхні коріння, що перешкоджає зв’язуванню з ним полісахаридів бактеріальної клітини. Це й призводить до зменшення їх адсорбції на поверхні кореня.

Таким чином, адсорбція ризобій корінням бобових рослин не є лише фізичним процесом. Вплив гаптенів лектинів на рівень адсорбції бактерій корінням свідчить про фізіологічну роль рослинних лектинів уже на початковій стадії формування симбіозу і є важливим доказом підтвердження “лектинової” гіпотези розпізнавання партнерів.

зміна активності лектинів різних органів бобових рослин залежно від активності штаму-інокулянта

Лектинова активність різних органів люпину та сої в онтогенезі, залежно від активності штаму-інокулянта. Результати досліджень із визначення лектинової активності різних органів рослин люпину показали (табл. 3, 4), що у коренях при інокуляції штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 400, від яких перед аналізом відокремили бульбочки, мала місце висока аглютинуюча активність досліджуваного білка. Досить високою була активність і у коренях рослин контрольного варіанта. Така тенденція зберігалась протягом усього періоду розвитку рослин. У варіантах з інокуляцією активними штамами аглютинуюча активність білків коріння була високою лише на початку вегетації. При утворенні бульбочок активність лектину в коренях (без бульбочок) поступово повністю зникала.

Оскільки з літератури відомо, що лектини можуть брати участь у транспорті індолілоцтової кислоти [Марков Е.Ю. и др., 1983], логічно було б припустити, що висока активність даних білків у коренях рослин контрольних варіантів і варіанта, де рослини інокулювали неактивним штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 400, пов’язана саме з транспортом даного фітогормону до місця його функціонального призначення. У цих варіантах спостерігається інтенсивніший розвиток кореневої системи. При вирощуванні рослин на 1 нормі азоту, де не виявлено значного приросту маси коріння, аглютинуюча активність виділених білків була на низькому рівні.

Таблиця 3.

Динаміка активності лектину коренів і листків люпину при інокуляції різними за активністю штамами бульбочкових бактерій, ОА*/50 мкл

Варіант | Фаза розвитку рослин

2 справжні

листки | Бутонізація | Цвітіння | Утворення бобів

Коріння

Контроль

(без інокуляції) | 4 | 16 | 4 | 2

Інокуляція штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 400 | 16 | 32 | 8 | 4

Інокуляція штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а | 64 | 8 | 0 | 0

Інокуляція штамом B. japonicum 631 | 64 | 8 | 0 | 0

Листки

Контроль

(без інокуляції) | 8 | 8 | 8 | 2

Інокуляція штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 400 | 16 | 16 | 8 | 2

Інокуляція штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а | 32 | 32 | 16 | 2

Інокуляція штамом B. japonicum 631 | 32 | 32 | 16 | 2

* ОА – одиниці аглютинації

Виявлено певну закономірність щодо активності лектину надземних органів залежно від активності штаму-інокулянта. Протягом онтогенезу рослин аглютинуюча активність білків, виділених із листків люпину, інокульованого активними штамами, була вищою порівняно з контролем (див. табл. 3). Інокуляція неактивним штамом призводила до збільшення активності лише на початкових стадіях розвитку рослин.

Наприкінці вегетації, у фазу утворення бобів, різниця у активності досліджуваного білка у листках була відсутня. Високу гемаглютинуючу активність лектину в листках можна пояснити участю цього білка в процесі фотосинтезу, що підтверджується роботами інших авторів [Martinez-Romero E. et al., 1995]. При формуванні генеративних органів закономірність була схожою (табл. 4). Під час бутонізації і цвітіння активність лектину у бутонах і квітках при інокуляції активними штамами була вдвічі вищою порівняно з контролем. При обробці неефективним штамом лектинова активність у досліджуваних органах була на рівні контролю. Схожими виявились результати і інших дослідів.

Таблиця 4

Динаміка активності лектину генеративних органів люпину при інокуляції різними за активністю штамами бульбочкових бактерій, ОА/50 мкл

Варіант | Бутони | Квітки | Боби

Контроль (без інокуляції) | 4 | 4 | 8

Інокуляція штамом

Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 400 | 4 | 4 | 8

Інокуляція штамом

Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а | 16 | 8 | 8

Інокуляція штамом

B. japonicum 631 | 16 | 8 | 8

Таким чином, результати наших досліджень показали, що інтенсивність азотфіксації бульбочкових бактерій, специфічних до рослини-хазяїна, може бути одним із важливих факторів, який впливає на лектинову активність різних органів рослинного організму. Враховуючи значну роль, яку відіграють лектини в процесах життєдіяльності бобових, зміна активності цих сполук може суттєво впливати на формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу, а також на ріст і розвиток рослин.

Взаємозв’язок лектинової та азотофіксувальної активностей кореневих бульбочок люпину і сої. Аналіз даних щодо лектинової активності бульбочок, утворених штамами різної активності, показав, що аглютинуюча активність даних білків у бульбочках, утворених Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 400, була найнижчою і майже не змінювалась протягом вегетації. У варіантах з інокуляцією активними штамами 359а і 631, навпаки, активність лектину бульбочок була досить високою. Так, у фазу бутонізації при обробці штамом Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а вона становила 32, а штамом B. japonicum 631 – 64 одиниць аглютинації. У фазу цвітіння рослин в обох вказаних варіантах цей показник становив 128 ОА/50 мкл. У фазу утворення бобів показники знову зменшувались і становили 32 та 64 ОА/50 мкл для Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 359а і B. japonicum 631 відповідно.

Порівняльний аналіз азотофіксувальної і лектинової активностей показав, що аглютинуюча активність лектину бульбочок залежить від інтенсивності азотфіксації штаму-інокулянта. Як видно з рисунку 2, при високому рівні азотофіксувальної активності штамів спостерігається і висока аглютинуюча активність виділеного білка. При низькому рівні азотфіксації (штам 400) лектинова активність слабо виражена.

Такий взаємозв’язок азотофіксувальної і лектинової активностей може свідчити про безпосередню участь лектину в процесі азотфіксації.

Рис. 2. Динаміка лектинової (ОА/50 мкл) та азотофіксувальної (мкмоль С2Н4/ (рослину Чгод)) активностей кореневих бульбочок люпину при інокуляції різними за активністю штамами бульбочкових бактерій.

Існують дані, що у деревних культур лектини відіграють активну роль у транспорті вуглеводів флоемою під час весняного руху соків. Цілком імовірно, що лектин відіграє важливу роль у подальших етапах функціонування партнерів бобово-ризобіального симбіозу, зокрема, може переносити вуглеводи, утворені у процесі фотосинтезу, до центрів зв’язування молекулярного азоту.

Таким чином, проведені дослідження показали, що лектинова активність утворених бульбочок взаємопов’язана з їх азотофіксувальною активністю. Отримані результати дозволяють припустити, що лектин бере участь не лише у встановленні контакту між ризобіями і корінням рослин, а й у процесах фіксації азоту у бульбочках.

вплив обробки лектинами ризобій і рослин на симбіотичні властивості та продуктивність бобових

Вплив обробки лектином на розвиток і схожість насіння форм сої, здатних і нездатних утворювати бульбочки. Використання інокуляції активним штамом у поєднанні з обробкою лектинами сприяє збільшенню кількості пророслих насінин, а також маси та довжини проростків рослин сої (табл.5).

Таблиця 5

Вплив різних концентрацій специфічного лектину на схожість насіння (%), масу (г), та довжину проростків (мм) у рослин сої сорту Мар’яна, інокульованої штамом B. japonicum 634б.

Концентрація лектину, мкг/мл бактеріальної суспензії | Маса | Довжина | Схожість

Контроль

(без обробки лектином) | 4,830,15 | 109,568,83 | 84

2 | 5,280,24 | 123,5010,13 | 100

20 | 5,650,28* | 136,5210,36* | 99

200 | 5,250,30 | 132,378,40* | 100

Примітка. * – тут і в інших таблицях різниця у порівнянні з контролем достовірна

У контрольному варіанті, де рослини лише інокулювали, кількість пророслих насінин становила 84. При цьому середня маса проростка становила 4,83 г. Проте, обробка лектинами разом з інокуляцією призводила до збільшення цих показників порівняно з контрольним варіантом. Збільшення маси, довжини та кількості пророслих зерен залежало лише від концентрації даного білка в інокуляційному середовищі. Найефективнішим у даному випадку виявилось використання лектину у концентрації 20 мкг/мл бактеріальної суспензії. При цьому спостерігалось збільшення маси проростків на 0,82 г порівняно з контролем, хоча використання інших концентрацій також призводило до достовірного збільшення маси та довжини проростків. Крім того, спостерігалась тенденція до підвищення схожості насіння. В усіх дослідних варіантах вона становила майже 100Як видно із наведених вище даних, використання обробки гомологічним лектином у поєднанні з інокуляцією активним штамом підвищує схожість насіння та стимулює ріст проростків.

Участь лектинів, специфічних і неспецифічних бульбочковим бактеріям бобових рослин, у формуванні і функціонуванні азотофіксувального симбіозу. Показано, що лектин сої активує азотофіксувальну активність бульбочок, утворених на рослинах сої при інокуляції штамами B. japonicum 634б і 631 (рис. 3). Посилення азотофіксувальної активності бульбочок може бути пов’язано з дією гомологічного лектину рослини-хазяїна на метаболізм бактеріальної клітини, а також на синтез нею ферментів, які беруть участь у процесі фіксації азоту [Антонюк Л.П. и др., 1997; Nadiradze N. et al., 1997]. При доінокуляційній інкубації ризобій з лектинами неспецифічних їм бобових рослин, а саме лектинів насіння квасолі, гороху та конканавалії відмічена супресорна дія цих аглютинінів на азотофіксувальну активність бульбочок (рис. 3). Так, загальна азотофіксувальна активність цих бульбочок зменшувалась на 2 – 40 %, залежно від виду лектину та штаму-інокулянта. Гетерологічні ж лектини майже у всіх варіантах досліду позитивно впливали на масу кореневих бульбочок.

Рис. 3. Вплив специфічного та неспецифічних сої лектинів на азотофіксувальну активність (мкмоль С2Н4/ (рослину Ч год)) її симбіотичного апарату.

Дія різних концентрацій лектину на перебіг фізіологічних процесів та продуктивність рослин ненодулюючої і нодулюючої форм сої. При обробці насіння ненодулюючої форми сої лектином без використання інокуляції спостерігається збільшення в її листках кількості фотосинтетичних пігментів. Так, при використанні 200 мкг/мл лектину вміст хлорофілу а збільшувався майже удвічі, а використання 20 мкг/мл призводило до потрійного збільшення вмісту даного пігменту. Низька доза (2 мкг/мл) лектину виявилась у цьому випадку неефективною. Що стосується вмісту хлорофілу b, то в даному досліді було виявлено, що всі концентрації лектину призводили до незначного, проте достовірного збільшення його вмісту. Різниця між варіантами знаходилась у межах похибки досліду. На збільшення вмісту каротиноїдів у рослинах ненодулюючої лінії сої свій вплив проявив лектин лише у дозі 20 та 200 мкг/мл.

Проведені дослідження інтенсивності фотосинтезу показали, що обробка рослин безбульбочкової сої лектинами у дозі 20 мкг/мл призводить до значної інтенсифікації даного процесу (табл. 6). При цьому спостерігається і незначне підвищення інтенсивності дихання рослин.

Таблиця 6

Вплив різних концентрацій лектину сої на інтенсивність фотосинтезу (ІФ) та інтенсивності дихання (ІД) рослин ненодулюючої лінії сої (фаза бутонізації-початку цвітіння)

Концентрація лектину, мкг/мл бактеріальної суспензії | ІФ | ІД

(мг СО2/рослину · год)

Контроль (без лектину) | 0,92±0,08 | 0,70±0,06

2 | 1,03±0,09 | 0,98±0,07*

20 | 2,19±0,17* | 1,13±0,09*

200 | 1,12±0,14 | 0,77±0,07

Дослідження інтенсивності азотфіксації симбіотичних систем, утворених ризобіями, попередньо оброблених лектином, показали, що найефективнішим є внесення 20 мкг лектину на мл бактеріальної суспензії. У фазі бутонізації-початку цвітіння цей показник був майже у 4 рази вищим порівняно з контролем (табл. 7). Під час утворення бобів різниця була дещо меншою, проте і в цьому випадку показники дослідного варіанту майже удвічі переважали контроль.

Таким чином, лектини як поліфункціональні речовини можуть бути не тільки рецепторами комплементарного зв’язування поверхневих глікополімерів клітин ризобій з коренями рослини-хазяїна, а й слугувати сигнальними молекулами, за допомогою яких регулюється формування та функціонування бобово-ризобіальної системи. Крім того, наявність позитивного впливу екзогенного лектину на рослини сої, не здатної вступати у симбіоз, дає змогу припустити, що його роль не обмежується лише впливом на бактерії. Він бере участь в інших фізіологічних процесах, пов’язаних із ростом і розвитком рослин, зокрема у процесі фотосинтезу. Характер впливу гомологічного лектину на бульбочкоутворення, азотофіксувальну активність та продукційний процес рослин залежить від його концентрації в бактеріальній суспензії і дозволяє розглядати його як ефектор росту і розвитку рослинного організму в цілому.

Таблиця 7

Вплив інокуляції штамом B. japonicum 634б із різними концентраціями лектину на азотофіксувальну активність (мкмоль С2Н4/(рослину Ч год)) сої сорту Мар’яна (вегетаційний дослід)

Концентрація лектину, мкг/мл бактеріальної суспензії | Фаза розвитку рослин

Бутонізація | Цвітіння | Утворення бобів

Контроль (без лектину) | 1,880,17 | 9,840,89 | 27,881,73

2 | 3,980,28* | 20,411,66* | 36,682,95*

20 | 7,620,36* | 40,991,76* | 51,233,77*

200 | 6,330,54* | 28,72,09* | 39,512,92*

Вплив суспензії Bradyrhizobium japonicum 634б та лектину сої на симбіотичні властивості і продуктивність даної рослини в умовах ґрунтової культури. При вирощуванні рослин у польових умовах головним критерієм оцінки дії будь-якого чинника є урожайність культури. Обробка насіння лектином у будь-якій концентрації забезпечила значну прибавку врожаю зерна сої порівняно з контролем (табл. 8). Виявити у даному випадку найкращу дозу лектину неможливо, оскільки достовірної різниці між дослідними варіантами не було.

Таблиця 8

Вплив різних концентрацій специфічного лектину на урожай (ц/га) сої сорту Мар’яна, інокульованої штамом B.japonicum 634б (польовий дослід).

Концентрація лектину, мкг/мл бактеріальної суспензії | Урожай | Приріст урожаю в порівнянні з контролем

ц/га | %

Контроль (без обробки) | 27,91,6––

50 | 32,32,2* | 4,4 | 15,8

100 | 32,71,7* | 4,8 | 17,2

200 | 33,31,9* | 5,4 | 19,4

300 | 34,52,1* | 6,6 | 23,6

НСР05 | 3,9

Слід лише зазначити, що спостерігалась тенденція до збільшення урожаю зерна відповідно до збільшення дози внесеного у бактеріальну культуру лектину. Так, прибавка урожаю зерна від використання 50 мкг/мл лектину склала 15,8а при концентрації 300 мкг/мл кількість зібраного зерна збільшилась на 23,6

Таким чином, проведені польові дослідження показали, що використання лектину разом з інокулюмом бульбочкових бактерій в умовах ґрунту сприяє розвитку та функціонуванню бобово-ризобіального симбіозу, а також підвищує продуктивність самої рослини. Ефективність застосування лектину значною мірою залежить від його концентрації у бактеріальній суспензії. Крім того, в польових умовах для досягнення максимального ефекту від застосування даного білка необхідно використовувати значно вищі його концентрації, ніж ті, що були встановлені в умовах піщаної культури. Результати проведених досліджень можуть бути враховані при створенні більш ефективних бактеріальних добрив, а також стати основою розробки нових елементів технології інтенсифікації вирощування бобових.

Висновки

1. Лектини бобових, як поліфункціональні речовини, є не тільки рецепторами комплементарного зв’язування поверхневих глікополімерів ризобій при первинних контактах із рослиною-хазяїном, але й беруть участь, як сигнальні молекули, у формуванні симбіотичної системи та функціонуванні азотофіксувального нітрогеназного комплексу.

2. За кількістю високомолекулярних білків насіння безбульбочкової сої суттєво відрізняється від насіння звичайної сої. Екстракт білків із насіння сої, що не утворює бульбочок, містить дві гемаглютинуючі фракції з різною вуглеводною специфічністю – одна з яких містить гемаглютинін, здатний взаємодіяти з манітом, а інша специфічна до галактози; остання фракція має близьку до комерційного лектину насіння звичайної сої електрофоретичну рухливість.

3. Адсорбція бульбочкових бактерій на корінні бобових рослин як перша стадія формування симбіозу не має чітко вираженого специфічного характеру; на корінні рослин адсорбуються і гомо- і гетерологічні їм бульбочкові бактерії. Проте гомологічні (специфічні) бобовій рослині ризобії все ж адсорбуються на її коренях у значно більшій кількості.

4. Інкубація коріння проростків люпину, перед інокуляцією Bradyrhizobium sp. (Lupinus) в розчині гаптену лектину люпину (галактозі) призводить до зменшення на 60 – кількості адсорбованих на ньому бактерій, що вказує на фізіологічну роль та безпосередню участь даного білка на початковій стадії формування симбіотичних взаємовідносин між партнерами.

5. Вперше показано, що при інокуляції насіння різними штамами ризобій активність лектинів у різних органах люпину і особливо у бульбочках суттєво відрізняється і залежить від ефективності штаму. Встановлена пряма залежність між лектиновою та азотофіксувальною активностями бульбочок, що вказує на безпосередню участь лектинів у функціонуванні нітрогеназного комплексу.

6. Встановлено, що сумісна дія бульбочкових бактерій та лектинів гомологічних (специфічних) їм рослин позитивно впливає на нодуляційний процес, азотофіксувальну активність бульбочок та продуктивність рослин і залежить від концентрації лектину в інокуляційній суспензії та умов вирощування рослин. Це свідчить про те, що лектини як сигнальні молекули опосередковано, через бактеріальну клітину регулюють процес розвитку симбіотичної системи та активність азотфіксації.

7. Обробка гетерологічними лектинами у поєднанні з інокуляцією не сприяє стимуляції процесу азотфіксації, але збільшує масу бульбочок та масу рослин, діючи при цьому як фітостимулятор.

8. Застосування екзогенних лектинів без інокуляції значною мірою впливає на перебіг фізіологічних процесів у рослин сої, нездатної утворювати симбіоз, зокрема активізує утворення фотосинтетичних пігментів та інтенсифікує СО2 газообмін.

9. Використання комплексної обробки насіння бобових культур суспензією ризобій і лектином призводить до підвищення їх врожайності на 15-23порівняно зі звичайною інокуляцією. Це дозволяє розглядати даний білок як ефектор росту і розвитку рослинного організму в цілому.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кириченко О.В., Титова Л.В., Береговенко С.К., Маменко П.М. Специфіка формування симбіотичного апарату у сої при інокуляції гомо- та гетерологічними бульбочковими бактеріями // Физиология и биохимия культ. растений. – 2002. – Т. 34, № 5. – С. 443-448.

2. Маліченко С.М., Даценко В.К., Маменко П.М., Коць С.Я. Участь лектинів специфічних і неспецифічних бульбочковим бактеріям бобових рослин у формуванні і функціонуванні азотфіксувального симбіозу // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія Біологія. – 2002. – №3 (18). – С. 49-57.

3. Маліченко С.М., Маменко П.М., Коць С.Я. Вплив різних за активністю штамів роду Bradyrhizobium на динаміку лектинової активності кореневих бульбочок та функціонування азотфіксувального апарату люпину // Физиология и биохимия культ. растений. – . – Т. 34, № 6. – С. 511-516.

4. Маменко П.М., Маліченко С.М., Даценко В.К., Коць С.Я. Симбіотичні властивості і продуктивність сої залежно від концентрації її лектину в інокуляційній суспензії // Физиология и биохимия культ. растений. – 2003. – Т. 35, № 3. – С. 215-221.

5. Маменко П.М., Коць С.Я., Якимчук Р.А. Динаміка активності лектинів у різних органах люпину залежно від ефективності штаму-інокулянта // Физиология и биохимия культ. растений. – 2004. – Т. 36, № 2. – С. 139-146.

6. Маліченко С.М., Даценко В.К., Маменко П.М. Адсорбція бульбочкових бактерій корінням специфічних та неспецифічних їм бобових рослин В кн.: Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм. – Тернопіль, 2001. – С. 95–98.

7. Маменко П.М., Береговенко С.К. Вплив інокуляції різними за активністю штамами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) на динаміку лектинової і азотфіксувальної активностей кореневих бульбочок люпину // Тези доповідей VIII Конференції молодих учених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (23–25 жовтня 2002 р.). – К: “Логос”. – С. 21.

8. Mamenko P.N., Malichenko S.M. Lectin and nitrogen fixation activity changes of root nodules of lupine, inoculated with Bradyrhizobium sp. (Lupinus) strains of various activity // 20th Intern. Lectin Meeting "Interlec 20": Abstr. – Copenhagen, 2002. - P. 108.

9. Mamenko P., Beregovenko S., Kots S. The influence of soybean seeds treatment with exogenous homologous lectin on the vegetative mass growth. Nitrogen fixation activity and yield // XXXII Annual Meeting and International Union of Radioecology Working Group Soil-to-Plant Transfer Annual Meeting: Book of Abstracts and Plenary Lectures. – Warsaw, Poland, 2002. – P. 91.

10. Mamenko P.N., Beregovenko S.K., Kots S.Ya. Influence of a miсrosymbionte–lectin complex on nitrogen fixation and productivity of soybeans // Abstracts of International conference “New technologies of isolation and application of biologically active substances”., Alushta, Crimea, Ukraine, May 20–25, 2002. – P. 242.

анотація

Маменко П.М. Лектини бобових і їх фізіологічна роль у формуванні і функціонуванні симбіозу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 –