НУРМУХАММЕДОВ АЛІШЕР КАХРАМОНОВИЧ

УДК 633.63:632.938.1

ПІДВИЩЕННЯ СТІЙКОСТІ ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ
ДО ЗБУДНИКІВ РИЗОМАНІЇ, ГНИЛЕЙ КОРЕНЕПЛОДІВ
ТА КОРЕНЕЇДА СХОДІВ

06.01.11 - фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті цукрових буряків Української академії аграрних наук

Науковий консультант - | доктор сільськогосподарських наук,

професор, академік УААН

Роїк Микола Володимирович,

директор Інституту цукрових буряків УААН

Офіційні опоненти: | доктор сільськогосподарських наук, професор

Положенець Віктор Михайлович,

Державний агроекологічний університет, м. Житомир, завідувач кафедри селекції і фітомедицини

доктор біологічних наук, професор

Пантєлєєв Василь Карпович,

Харківський національний аграрний університет

ім. В. В. Докучаєва, професор кафедри фітопатології

доктор сільськогосподарських наук,

професор, членкор УААН

Михайлов В’ячеслав Григорович,

Інститут землеробства УААН,

завідувач лабораторії селекції сої

Провідна установа - | Інститут захисту рослин Української академії аграрних наук, лабораторія фітопатології, м. Київ

Захист відбудеться “ 25 ” листопада 2005 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою:

03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, аудиторія 

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус 4, кім. 41

Автореферат розісланий “ 8 ” жовтня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради | М.С. Мороз

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останні роки в багатьох регіонах бурякосіяння України спостерігається різке погіршення фітосанітарної ситуації через спалах хвороб коренеплодів цукрових буряків. Активно поширюється небезпечна вірусна хвороба – ризоманія, все частішими стають епіфітотії гнилей коренеплодів та коренеїда сходів.

Поява в Україні ризоманії стала наслідком збільшення імпорту садивного матеріалу (саджанців, живців, цибулин, бульб, кореневищ тощо) та насіння буряків (цукрових, кормових та столових), контамінованих збудником хвороби – вірусом некротичного пожовтіння жилок буряків (ВНПЖБ) з регіонів поширення хвороби (Роїк та ін., 2001). Зростання шкідливості гнилей коренеплодів і коренеїда сходів на посівах цукрових буряків, переважно, є наслідком збільшення кількості інтродукованих сортів та гібридів, в основному, неадаптованих до місцевих умов. Порушення загальних вимог технології вирощування цукрових буряків з причин нестачі матеріальних і технічних ресурсів також сприяло погіршенню фітосанітарної ситуації.

Ефективний контроль розвитку ризоманії, гнилей коренеплодів та коренеїда сходів потребує значного удосконалення елементів системи захисту цукрових буряків, які зменшують ризик економічних і екологічних втрат. Цих вимог можливо дотримуватись за умов постійного фітосанітарного моніторингу бурякової агроекосистеми та контролю популяцій збудників, а також шляхом використання стійких сортів і гібридів цукрових буряків. Для створення високостійких до збудників ризоманії та гнилей коренеплодів селекційних матеріалів необхідним є впровадження в селекційну практику нових польових і біотехнологічних методів їх оцінки та статистичного моделювання. Актуальним є також вивчення і застосування нових способів індукування стійкості цукрових буряків до збудників хвороб.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані у відповідності до річних тематичних планів науково-дослідних робіт Інституту цукрових буряків науково-технічної програми УААН “Цукрові буряки” на 1996–2000 рр. (номер державної реєстрації 0196U012876) і були складовою частиною завдання . “Розробити генетичні та фізіологічно-біохімічні технології створення нових селекційних матеріалів цукрових буряків, стійких до комплексу несприятливих факторів середовища” та завдання . “Розробити адаптовані технології вирощування цукрових буряків, що базуються на використанні нового покоління технічних та хімічних засобів і дозволяють отримувати програмовану продуктивність коренеплодів при мінімальних рівнях собівартості і ресурсозатрат”, а також НТП на 2001-2005 рр. (номер державної реєстрації 0101U001246), завдання 01. “Розробити генетико-фізіологічні основи ідентифікації і маркування генотипів і методи створення толерантних до стресових умов вихідних матеріалів з використанням біотехнологій” та завдання 03. “Розробити й освоїти зональні технології виробництва гібридів, стійких до комплексу шкідливих організмів, високоефективних енерго- і ресурсозаощаджуючих систем обробітку ґрунту, удобрення та захисту рослин”.

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було удосконалення захисних заходів шляхом моніторингу хвороб та впровадження нових прийомів підвищення стійкості цукрових буряків до збудників ризоманії, гнилей коренеплодів і коренеїда сходів.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- провести моніторинг збудників ризоманії, гнилей коренеплодів і коренеїда сходів та вивчити тенденції змін їх популяцій;

- вивчити вплив різних біотичних та абіотичних факторів на темпи поширення ризоманії в Україні;

- розробити методи оцінки та створити стійкі до ВНПЖБ селекційні матеріали цукрових буряків;

- удосконалити методи оцінки стійкості цукрових буряків до гнилей коренеплодів;

- розробити нові способи індукування стійкості цукрових буряків до збудників коренеїда сходів;

- удосконалити захисні заходи від збудників ризоманії, гнилей коренеплодів та коренеїда сходів цукрових буряків.

Об’єкт досліджень – характер взаємодії цукрових буряків та збудників ризоманії, гнилей коренеплодів і коренеїда сходів.

Предмет досліджень – моніторинг збудників ризоманії, гнилей коренеплодів і коренеїда сходів та розробка нових прийомів підвищення стійкості цукрових буряків.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань застосовували фітопатологічні, мікологічні, вірусологічні, біотехнологічні, біохімічні, селекційні методи, а також методи статистичного аналізу досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі моніторингу інфекційних чинників та вивчення патологічного процесу розроблені нові прийоми підвищення стійкості цукрових буряків до збудників ризоманії, гнилей коренеплодів та коренеїда сходів. У зонах бурякосіяння України встановлено ареал ВНПЖБ, який охоплює 72 райони 17 областей і 4 райони АР Крим. Виявлені морфологічні особливості ізоляту вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків, виділеного в Рівненській області і показано відповідність його організації структурі ВНПЖБ. Доведена наявність переносника ВНПЖБ – плазмодіофорового гриба Polymyxa betae практично в усіх типах ґрунтів (69-78% проб), що значно збільшує ризик подальшого поширення ризоманії.

З’ясовано вплив на інтенсивність поширення ризоманії вирощування різних за рівнем стійкості сортів та гібридів цукрових буряків, типу і механічного складу ґрунтів, ґрунтової мікофлори, вмісту в ґрунті рухливих форм деяких металів, обробки насіння біологічними і хімічними засобами, що, в сукупності, є науковою основою для розробки шляхів обмеження поширення хвороби в Україні.

Уточнено шкідливість та видовий склад грибів-збудників, характерний для пунктів досліджень, – серед збудників гнилей коренеплодів домінують види Fusarium spp., Alternaria spp., Penicillium spp., тощо, а серед збудників коренеїда – Fusarium (F.F. gibbosum та ін.), P., A. cochlioides і R.. За допомогою фунгіцидостійких штамів цих грибів змодельовано тенденції змін їх чисельності і вплив даного показника на ураженість цукрових буряків гнилями коренеплодів та коренеїдом сходів.

Для оцінки стійкості генотипів цукрових буряків до ВНПЖБ показані взаємовідносини рослини-живителя і збудника ризоманії. Доведено введення ознаки стійкості до ВНПЖБ за допомогою беккросних схрещувань у вітчизняні комбінаційно-здатні селекційні матеріали цукрових буряків. В результаті проведеного пошуку нових джерел стійкості до ВНПЖБ на інфекційному фоні хвороби з наступною їх оцінкою за допомогою молекулярно-генетичних маркерів відібрано селекційні лінії цукрових буряків, резистентність до ризоманії яких обумовлена геном (генами), відмінним від відомого гена стійкості Rz1.

Встановлено, що реакція калусів та меристем ліній цукрових буряків на чисті культури грибів роду Fusarium Link., культуральні екстракти і фільтрати в культурі in vitro залежить від генотипу рослин. Методами статистичного моделювання виявлена залежність між морфологічними, біохімічними та господарсько-цінними ознаками цукрових буряків та їх стійкістю до гнилей коренеплодів. Встановлено індукування стійкості цукрових буряків до збудників коренеїда сходів при передпосівній обробці насіння оксиароматичними сполуками фенольного ряду.

Практичне значення одержаних результатів Одержано нові селекційні матеріали цукрових буряків: стійкі до збудника ризоманії – від схрещування лінії Я/Пер з донорами стійкості АС 48 та АС 50 – 03-397-1, 03-417-2, 03-393-1, 03-374-10 та інші; стійкі до збудників гнилей коренеплодів – створені шляхом оцінки та добору в культурі in vitro і в польових умовах – К І/10, К І/6, К ХХІІІ/1, 87/1, 206/1, 01-87, 01-91. Стійкість отриманих селекційних матеріалів до зазначених хвороб була на 20-50% вищою, ніж у стандартів. Ці матеріали рекомендовані для використання в дослідно-селекційній мережі Інституту цукрових буряків УААН. Запропоновано методичні підходи моніторингу ризоманії і ряд профілактичних та карантинних заходів, які використовуються Головною державною інспекцією з карантину рослин України для контролю за розвитком хвороби. За результатами досліджень ризоманію переведено з Переліку “І” до Переліку “ІІ” (Карантинні організми, обмежено-розповсюджені на території України).

Для дослідно-селекційних станцій рекомендовано застосовувати метод оцінки стійкості цукрових буряків до ВНПЖБ на інфекційному фоні та в умовах теплиці. Удосконалено методи оцінки стійкості до збудників гнилей коренеплодів: до грибів роду Fusarium в культурі in vitro та спосіб польової оцінки з використанням механічного ушкодження поверхні коренеплодів і зрізання листків. Запропоновано методи статистичного моделювання, які сприятимуть оптимізації процесу добору стійких до гнилей коренеплодів генотипів цукрових буряків. Розроблено регламенти для обробки насіння синтетичними оксиароматичними сполуками фенольного ряду – інфером 2 і інфером 3 для індукування стійкості цукрових буряків до збудників коренеїда сходів.

Особистий внесок здобувача. Обґрунтування нових теоретичних положень, постановка проблеми, розробка програм досліджень, а також узагальнення результатів досліджень і формулювання висновків належать автору. Накопичення первинних матеріалів, проведення серій лабораторних, вегетаційних та польових досліджень з розробки і впровадження нових методів оцінки та способів підвищення стійкості цукрових буряків до збудників ризоманії, гнилей коренеплодів і коренеїда сходів, аналіз та статистична обробка результатів досліджень для моделювання розвитку хвороб коренеплодів, в основному, здійснені автором особисто. З матеріалів наукових експериментів, за узгодженням із співавторами, використано частину спільно одержаних результатів. Ці дані викладено в спільних публікаціях, авторство здобувача в яких складає 20 – 80%.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були апробовані і отримали позитивну оцінку на: звітних сесіях Інституту цукрових буряків УААН (1996-2004); засіданні бюро Президії УААН “Шкодочинність карантинних організмів сільськогосподарських культур та наукові аспекти її мінімізації” (Київ, липень 2002); ІІ (ІХ) з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); міжнародних конференціях “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва” (Харків, 1999); “Сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках” (Санкт-Петербург, 2001); ІІ міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2001); “Селекція, насінництво і технологія вирощування цукрових буряків та інших культур бурякової сівозміни (Київ, 2001); “Repaшstvi 2002” (?рага, 2002); “Первая Всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям” (Санкт-Петербург, 2002); Всеукраїнській нараді “Стан і перспективи наукового забезпечення карантину рослин України” (Чернівці, 2001); Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми (2002); Всеукраїнській конференції “Перспективи забезпечення фітосанітарної безпеки в Україні” (Чернівці, 2004); конференціях молодих вчених “Наукові основи виробництва цукрових буряків та інших культур бурякової сівозміни” (Київ, 1998); “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); “Перспективи і шляхи вирішення проблем у сучасному буряківництві” (Київ, 2003). Автор є лауреатом премії ім. В. Ф. Савицького ІЦБ УААН за завершену НДР: “Виявлення, прогнозування та розробка комплексних захисних заходів проти ризоманії цукрових буряків в Україні” (2003).

Публікації результатів досліджень. Матеріали дисертації опубліковані у 36 наукових роботах, у тому числі, в 1 монографії, 16 статтях у наукових фахових журналах, 6 статтях у фахових збірниках наукових праць, 2 методичних рекомендаціях, 9 матеріалах і тезах конференцій, отримано 2 патенти України.

Обсяг та структура роботи. Дисертація викладена на 390 сторінках машинописного тексту і включає: вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення, висновки і пропозиції виробництву, список цитованої літератури (486 джерел, із них 263 іноземними мовами), містить 70 таблиць, 38 рисунків, 8 фотографій і 6 додатків.

Основний зміст

Огляд літератури

У даному розділі проаналізовані дані щодо збудників ризоманії, гнилей коренеплодів та коренеїда, їх розповсюдженості та шкідливості в Україні та у світі. Представлено дані щодо стійкості цукрових буряків, методи оцінки та добору селекційних матеріалів, стійких до збудників ризоманії, гнилей коренеплодів та коренеїда сходів. Досліджено способи індукування стійкості цукрових буряків шляхом обробки їх еліситорами.

Матеріали і методи досліджень

Дослідження виконували протягом 1995-2004 рр. в Інституті цукрових буряків (ІЦБ УААН), Філіалі ІЦБ УААН (ФІЦБ), Білоцерківській (БЦДСС), Верхняцькій (ВДСС), Ялтушківській (ЯДСС) та Іванівській (ІДСС) дослідно-селекційних станціях ІЦБ УААН, а також у Радивилівському районі Рівненської області, де існує природний інфекційний фон ризоманії. Загальна схема основних напрямків досліджень представлена на рис. .

Рис. 1. Схема основних напрямів досліджень

Матеріалами для досліджень були сорти і гібриди цукрових буряків, дикі форми буряків та вихідні селекційні матеріали, отримані як класичними методами, так і методами біотехнології, ВНПЖБ – збудник ризоманії, переносник хвороби – гриб P., а також комплекс грибів-збудників гнилей коренеплодів та коренеїда сходів, культуральні екстракти грибів Fusarium, оксиароматичні сполуки фенольного ряду (інфер 1, інфер 2, інфер ) та протруйники насіння (сульфокарбатіон-К, апрон тощо).

Основними методами виявлення розповсюдження ризоманії були маршрутні обстеження посівів цукрових буряків і безвисадкових насінників з подальшим аналізом проб коренеплодів та ґрунту на наявність ВНПЖБ і P. (Пожар и др., 1987; Мовчан та ін., 2003). Ідентифікували ВНПЖБ у зразках рослин та ґрунту методом імуноферментного аналізу (ІФА) в модифікації
DAS-ELISA (Henry et.al., 1992) з використанням комерційної антисироватки
ф. Boehringer Mannheim Gmb. Кількісну оцінку ВНПЖБ проводили на імуноферментному аналізаторі SUMAL (ф. Karl Zeiss) при довжині хвилі 405 нм. Вивчення морфологічних особливостей ВНПЖБ проводили методом імуноелектронної мікроскопії з використанням А–білка стафілокока (PA-ISEM) і антисироватки ф.Mannheim Gmb (Shukla і Gough, 1979). Отримані препарати досліджували в електронному мікроскопі УЕМБ  С при інструментальному збільшенні 40000х. Наявність цистосорусів P. betae в ризоїдах цукрових буряків визначали за допомогою світлового мікроскопу (Власов, 1986).

Визначення наявності гена Rz1 у ліній цукрових буряків проводили методом полімеразної ланцюгової реакції за допомогою двох STS-маркерів – B40S і B2S (Сиволап, 1998). Для аналізу поліморфізму ферментів цукрових буряків проводили горизонтальний мікроелектрофорез у крохмальному гелі з подальшим гістохімічним фарбуванням (Левитес, 1986). Активність пероксидази в рослинах та амілази в ґрунті визначали фотометричним способом (Гавриленко та ін., 1975; Починок, 1976).

Виділення грибів-збудників із зразків уражених рослин проводили методом накопичувальної культури у вологій камері (Кириленко, 1982), а ґрунтових – методом серійних розведень (Звягинцев, 1991). Екстрагували культуральні метаболіти грибів Fusarium spp. з використанням етилацетату (Волков, 1992). Структурну різноманітність популяцій грибів-збудників коренеїда сходів та гнилей коренеплодів цукрових буряків вивчали в модельних дослідах за допомогою фунгіцидостійких штамів, одержаних методом поступової адаптації до підвищених доз фунгіцидів (Звягинцев, 1991; Нурмухаммедов, 1998).

Дослідження в культурі in vitro: приготування маточних розчинів та середовищ, введення вихідних матеріалів у стерильну культуру, клональне мікророзмноження, укорінення пагонів, їх акліматизацію і пересадку в ґрунт проводили за методикою ІЦБ УААН (Редько та ін., 1997). Вегетаційні дослідження здійснювали згідно з методичними вказівками ВНІЦ (1983).

У роботі були використані беккросні схрещування для введення ознаки стійкості до ризоманії в кращі комбінаційно-здатні селекційні матеріали, а також помірний інбридинг (сібсові схрещування) та інцухт (інбридинг) – для створення стійких до ризоманії і гнилей коренеплодів селекційних матеріалів. У польових дослідах використовували загальноприйняті для кожної окремої зони бурякосіяння технології вирощування цукрових буряків. Штучні інфекційні фони хвороб цукрових буряків створювали згідно з методичними вказівками ВНІЦ (1985). Оцінку ураженості цукрових буряків та добір стійких до коренеїда селекційних матеріалів проводили за методикою Шевченка (1977). Обробку насіння цукрових буряків виконували з використанням лабораторного устаткування HG (ф. FMC, США).

Статистичну обробку результатів досліджень та розробку математичної моделі розвитку гнилей коренеплодів здійснювали за загальноприйнятими методами статистичного аналізу (Минкевич и Захарова, 1977; Плохинский, 1978, Ермантраут та ін., 1998; Вергунова, 2000) з використанням комп’ютерних програм “Excel for Windows 97”, “Statistica for Windows 5.0”.

Моніторинг збудників ризоманії, гнилей коренеплодів та коренеїда сходів

Встановлення розповсюдженості ВНПЖБ та його переносника Polymyxa betae в Україні. Для моніторингу ризоманії в Україні були розроблені основні методичні підходи, які включають оптимальні норми обстеження посівів цукрових буряків, методи відбору проб з різних об’єктів та ідентифікації вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків і переносника хвороби – гриба P..

За результатами аналізу ризоїдів коренеплодів з основних зон бурякосіяння, наявність P. betae в 2000 році встановлена в 71% проб коренеплодів (табл. 1).У 2001 р. кількість проб, де виявлено P. betae, складала 78%, а в 2002 р. з 46 проб коренеплодів цукрових буряків, цистосоруси P. betae діагностовано в 32 пробах (69%). Таким чином, наявність переносника ВНПЖБ – плазмодіофорового гриба P. встановлена практично у всіх регіонах України, тому при утворенні вірофорних форм переносника існує небезпека швидкого розповсюдження ризоманії.

Таблиця 1 – Наявність цистосорусів Polymyxa betae в пробах коренеплодів цукрових буряків, ІЦБ УААН, 2000-2002 рр.

Роки досліджень | Всього проаналізовано проб, шт. | Кількість проб з цистосорусами P.

шт. | %

2000 | 83 | 59 | 71

2001 | 64 | 50 | 78

2002 | 46 | 32 | 69

Для встановлення розповсюдженості вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків протягом 2000-2004 рр. обстежено посіви цукрових буряків в АР Крим і 18 областях України.

У 2000 році було відібрано 85 проб коренеплодів та 74 проби ґрунту з 11 областей. Результати вивчення коренеплодів методом ІФА довели наявність ВНПЖБ на полях деяких господарств Львівської, Рівненської та Хмельницької областей. У ґрунті вірус був виявлений у 13 пробах. Погодні умови 2000 р. були несприятливими для розвитку P. betae, проте в більшості проб коренеплодів спостерігалися чіткі візуальні симптоми ризоманії.

У 2001 році проаналізовано 88 проб коренеплодів та стільки ж проб ґрунту з 12 областей та АР Крим. За результатами ІФА, позитивна реакція виявлена в 28 пробах ґрунту і у 2 пробах коренеплодів. Кліматичні умови цього року були оптимальними для розвитку хвороби, особливо в західних областях, про що свідчить велика кількість заражених проб ґрунту. У 2001 р. ризоманія вперше була діагностована на безвисадкових насінниках в АР Крим, де кліматичні та ґрунтові умови сприятливі для розповсюдження хвороби.

У 2002 році, відповідно до спеціальної Постанови Бюро Президії УААН, проведено повторне обстеження посівів цукрових буряків спільно зі співробітниками Української науково-дослідної станції з карантину рослин і Укрголовдержкарантину в регіонах, де в минулі роки ідентифіковано ризоманію. Відібрано 19 проб коренеплодів, а також проаналізовано 32 проби ґрунту. ВНПЖБ діагностовано в більшості проб (24 шт.) і, таким чином, було офіційно доведено наявність ризоманії в Україні. Отримані результати слугували обґрунтуванням (документально підтверджено відповідними рішеннями) для переведення ВНПЖБ з Переліку карантинних організмів, які відсутні на території України (Перелік І) до Переліку карантинних організмів, обмежено-розповсюджених на території України (Перелік ІІ).

У 2003 р спільно зі спеціалістами Укрголовдержкарантину обстежено посіви цукрових буряків на площі понад 9500 га. Під час обстеження відібрано 213 проб коренеплодів з 91 району 14-ти областей України і АР Крим. Наявність ризоманії достовірно встановлено в 27 пробах коренеплодів, ще в 12 пробах вміст ВНПЖБ був на рівні стандарту наявності вірусу.

У 2004 р спільно з Укрголовдержкарантином було проаналізовано 172 проби цукрових буряків із 101 району 16 областей. Результати ІФА показали подальше зростання ареалу ВНПЖБ. Наявність ризоманії встановлено в 61 пробі з 39 районів 14 областей. Відзначено зростання абсорбції вірусу в пробах з регіонів, де вірус був ідентифікований у попередні роки – у Львівській, Тернопільській, Івано-Франківській і Хмельницькій областях.

Таким чином, у результаті досліджень встановлено, що поширення ризоманії в Україні відбувається стрімкими темпами (всього за 1997-2004 рр. ВНПЖБ ідентифіковано в 72 районах 17 областей і в 4-х районах АР Крим (рис. 2).

Отримані дані свідчать про істотне розширення ареалу ВНПЖБ у зонах бурякосіяння України. За останні роки вірус діагностовано в більшості районів Львівської, Тернопільської, Хмельницької та Чернівецької областей. Разом із інтенсивним розповсюдженням ризоманії відбувається процес активного накопичення інфекції. Так, у 2002 році в проаналізованих пробах абсорбція ВНПЖБ становила, у середньому, 0,93, тоді як у 1997-1998 рр. цей показник був на рівні стандарту наявності вірусу (0,050) або в незначній мірі перевищував його. Особливо небезпечна ситуація склалася в західних регіонах, процес активного накопичення інфекції спостерігається також в центральних областях і в зоні вирощування безвисадкових насінників.

Рис. 2. Поширення ризоманії в зонах бурякосіяння України
(Інститут цукрових буряків УААН, 1997*- 2003 рр.)

*Примітка: дані про поширення ризоманії у 1997-1999 рр. отримані без участі автора

Дослідження морфології вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків. Збудник ризоманії – ВНПЖБ є РНК-вмісним багатокомпонентним вірусом з розділеним геномом, який складається з 4 (іноді 5) жорстких паличкоподібних віріонів. Діаметр частинок близько 20 нм, а довжина їх варіює у межах від 65 до 400 нм. Вивчення методом імуноелектронної мікроскопії морфологічних особливостей ізоляту з Рівненської області показало відповідність його структурної організації структурі ВНПЖБ (рис. ). Встановлено, що віріони за довжиною розподіляються на 4 класи – 80-90 нм, 100-120 нм, 250-270 нм, 350-400 нм. Серед віріонів переважали короткі частинки довжиною 80-120 нм (48,5%), а довгі частинки – 350-400 нм (6,4%) зустрічалися рідко (рис. ).

Молекулярно-генетичні дослідження рівненського ізоляту ВНПЖБ, переданого нами для аналізу д-ру Koenig (Німеччина), виявили його приналежність до патотипу А.

Вплив біотичних та абіотичних факторів на поширення ризоманії в Україні. Стрімке поширення ризоманії в Україні представляє серйозну загрозу для виробництва цукрових буряків. Проте, дослідження впливу різних факторів на розповсюдженість хвороби досі не проводилися.

На основі вивчення біологічних особливостей ВНПЖБ, переносника хвороби та шляхів поширення ризоманії встановлено, що запобігти подальшому її розповсюдженню неможливо, хоча при здійсненні відповідних заходів вірогідне обмеження цього процесу.

Результати вивчення різних за рівнем стійкості сортів та гібридів цукрових буряків на інфекційному фоні показала істотне зниження врожайності сприйнятливих сортів (на 60-80%) порівняно зі стійким гібридом Rizor. Це відбувається, в першу чергу, через недорозвиненість коренеплодів (маса їх на 50-75% менша, ніж у стійких сортів) та різке зниження густоти рослин, особливо, посушливим літом. Сприйнятливі генотипи слугуватимуть основним джерелом та резерватором інфекції, і тому на заражених ВНПЖБ територіях рекомендовано не вирощувати сорти та гібриди, у яких відсутні гени стійкості до ризоманії.

Встановлено тісну залежність між розвитком ризоманії та гнилей коренеплодів – протягом вегетації у сприйнятливих сортів загнивало і відмирало понад 50% рослин. В ризосфері уражених ВНПЖБ рослин різко зменшувалася чисельність актиноміцетів, а також грибів родів Penicillium, Aspergillus, Trichoderma (табл. 2). Водночас, спостерігалося значне підвищення чисельності грибів роду Fusarium, яка сягала 45% усіх грибів ризосфери уражених коренеплодів.

Дослідження залежності поширення збудника ризоманії від типу ґрунту показали, що ВНПЖБ виявлений, головним чином, у ґрунтах, бідних за вмістом гумусу та у дерново-карбонатних, а також чорноземі на елювії карбонатних порід, де рН є оптимальним для переносника хвороби. Виявлено, що за механічним складом найсприятливішими для ВНПЖБ є легко – і середньосуглинкові ґрунти. Встановлено негативний вплив вмісту в ґрунті іонів деяких металів (кобальту, цинку, марганцю) на розвиток переносника хвороби.

Таблиця 2 – Склад мікрофлори ризосфери здорових і уражених ризоманією коренеплодів цукрових буряків, ІЦБ УААН, 2000-2002 рр.

Прикореневий ґрунт з коренеплоду | Кількість мікроорганізмів, млн/г повітряно-сухого ґрунту

усього | в т. ч.

актино-міцетів | Fusarium | Penicil-lium | Aspergil-lus | Tricho-derma

Здорового | 36,2 | 6,40 | 0,36 | 2,86 | 1,04 | 0,24

Ураженого ризоманією | 2,10 | 0,40 | 1,0 | 0,26 | 0,13 | 0

НІР 05 | 12,6 | 0,34

Вивчено вплив сучасних хімічних протруйників насіння та біологічних препаратів на основі спороутворюючих бактерій Bacillus megaterium на наявність цистосорусів P. betae в ризоїдах коренеплодів цукрових буряків.

Вивчення протруйників насіння показало їх низьку ефективність проти P. betae. Так, протруйник апрон разом з інсектицидом фураданом взагалі не впливав на розвиток гриба – кількість цистосорусів у ризоїдах коренеплодів, у середньому, складала 86 шт., тоді як у контрольному варіанті (без обробки) – 76 шт.; слабку дію проявила також композиція сульфокарбатіон-К + фурадан, (у середньому, 68 шт.). Дослідження можливості використання при обробці насіння біологічних препаратів на основі Bacillus megaterium також довело їх низьку ефективність проти переносника ВНПЖБ. В той же час, така обробка значно сприяла зниженню ураженості сходів коренеїдом, підвищенню врожайності та цукристості коренеплодів цукрових буряків на неінфікованих ризоманією ґрунтах.

Вивчення динаміки чисельності грибів-збудників коренеїда сходів та гнилей коренеплодів. Інформація про шкідливість, поширення та динаміку чисельності збудників особливо важлива при розробці заходів захисту від гнилей коренеплодів та коренеїда сходів.

Вивчення шкідливості гнилей коренеплодів показало, що при ураженні маса коренеплодів зменшується у 1,5-2,0 рази, вміст цукру – на 10-15%, а при ступені розвитку коренеїда 9% врожайність коренеплодів знижується на 2,3 т/га. Серед збудників гнилей коренеплодів домінували представники видів Fusarium spp., Alternaria spp., Penicillium spp., тощо, а серед збудників коренеїда – Fusarium (F.F. gibbosum та ін.), P., A. cochlioides і R..

Звичайно, видовий склад грибів-збудників, які беруть участь у патогенезі коренеїда і гнилей коренеплодів, для даної місцевості залишається незмінним, проте основні показники популяцій всередині біоценозу змінюються протягом вегетації. Тому для встановлення закономірностей патогенезу зазначених хвороб при застосуванні фунгіцидостійких штамів були проведені модельні дослідження динаміки чисельності грибів-збудників і вивчено її вплив на уражуваність цукрових буряків хворобами. Було отримано 9 фунгіцидостійких штамів грибів. Встановлено, що загальний характер динаміки чисельності грибів змінюється стрибкоподібно: спочатку відбувається швидке її зростання, а потім, під дією чинників середовища, які лімітують їх ріст, швидко припиняється. Найвища чисельність грибів-збудників спостерігалася на початку вегетації, а другий пік – перед збиранням коренеплодів. Ступінь розвитку коренеїда і гнилей коренеплодів більше залежав від рівня агресивності виду, ніж від його чисельності в ґрунті. Протягом вегетаційного періоду відбувається поступове зниження патогенності більшості видів збудників. На початкових етапах розвитку агробіоценозу спостерігається розподіл видів за їх чисельністю. Подальше підвищення дії лімітуючих факторів – вікової стійкості цукрових буряків, сезонних змін погоди тощо, призводить до збільшення конкуренції за субстрат між видами грибів.

розробка методів оцінки та створення стійких до збудника ризоманії селекційних матеріалів цукрових буряків

Розробка методів оцінки стійкості селекційних матеріалів цукрових буряків до ризоманії. Створення стійких до ризоманії селекційних матеріалів в Україні раніше не проводилося, тому виникла необхідність таких досліджень. Розроблено методи оцінки стійкості цукрових буряків до ризоманії на природному інфекційному фоні та в тепличних умовах, підібрані оптимальні способи та строки проведення обліків та аналізів в умовах України, запропонована шкала оцінки ураження та стійкості селекційних матеріалів до хвороби (табл. 3).

Таблиця 3 – Шкала оцінки ураження та типу стійкості генотипів цукрових буряків до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків

Бал ураження | Шкала ураження | Бал стійкості | Тип стійкості

1 | Показник ІФА менший за стандарт наявності ВНПЖБ, симптоми хвороби відсутні | 9 | Високостійкі

3 | Показник ІФА менший або на рівні стандарту наявності ВНПЖБ, мінімальні візуальні симптоми | 7 | Стійкі

5 | Показник ІФА перевищує стандарт наявності ВНПЖБ у 1,5-2,0 рази, незначні візуальні симптоми | 5 | Слабостійкі

7 | Показник ІФА перевищує стандарт наявності ВНПЖБ у 2,0-3,0 рази, візуальні симптоми на коренеплодах типові | 3 | Середньо-сприйнятливі

9 | Показник ІФА перевищує стандарт наявності ВНПЖБ більше ніж у 3,0 рази, типові чітко виражені симптоми | 1 | Сприйнятливі

Встановлено, що на природному інфекційному фоні ризоманії сівбу цукрових буряків з метою оцінки стійкості необхідно проводити на 7-10 днів пізніше (у ІІІ декаді квітня), ніж рекомендовано для даної зони, оскільки в цей період створюються найкращі умови для проникнення в рослину і розвитку P.. При оптимальних для росту і розвитку цукрових буряків строках сівби
(в І – ІІ декаді квітня) абсорбція ВНПЖБ у пробах коренеплодів була значно нижчою, ніж при інших строках.

Оцінка стійкості селекційних матеріалів цукрових буряків до ризоманії в умовах теплиці проводиться на 45-60-у добу після сівби в інфікований ґрунт. Даний спосіб можна використовувати для оцінки стійкості сортів або гібридів, а також для попередньої оцінки селекційного матеріалу. Результати ІФА показали, що на 45-у добу абсорбція ВНПЖБ у стійкого гібриду Rizor була у 2,3-3,4 рази нижчою порівняно зі сприйнятливими генотипами, а на 60-у добу, у середньому, в 2,0-2,6 рази.

Стійкість селекційних матеріалів цукрових буряків до збудника ризоманії. Ознаку стійкості до ризоманії в комбінаційно-цінну лінію Я/Пер введено за допомогою беккросного схрещування з донорами АС і АС , які є носіями гена Rz1 від B.subsp. maritima. Оцінка селекційних матеріалів на інфекційному фоні ризоманії показала, що в потомстві першого беккросу кількість високостійких та стійких гібридних комбінацій складала 19%, а кількість сприйнятливих комбінацій – 39,4%. Після добору та другого беккросу кількість стійких матеріалів зросла до 59,7%, а кількість сприйнятливих знизилася до 12% (табл. 4).

Таблиця 4 – Розподіл за стійкістю до ризоманії селекційних матеріалів ВС1 та ВС2, отриманих від схрещування лінії Я/Пер та донорів стійкості АС 48 та АС 50, шт., (АПФ Крупець, Рівненська область, 2001-2004 рр.)

Селекційні матеріали | Тип стійкості та абсорбція ВНПЖБ (А 405)*

високо-стійкі,

< 0,020 | стійкі,

0,021–0,050 | слабо-стійкі, 0,051–0,100 | середньо-сприйнятливі, 0,101–0,150 | сприйнят-ливі,

> 0,150

ВС1 | 19 | 8 | 39 | 20 | 56

ВС2 | 4 | 33 | 12 | 5 | 8

Примітка:

1. Абсорбція ВНПЖБ (А405) – оптична щільність комплексу, який утворюється при взаємодії гомологічних антигена і антитіла, визначається фотометрично при довжині хвилі 405 нм.

2. Стандарт наявності ВНПЖБ – А405 = 0,050

Проведено аналіз успадкування ознаки стійкості до ризоманії в потомствах від схрещування лінії Я/Пер з донорами стійкості. Лінія Я/Пер є сприйнятливою до ризоманії (абсорбція ВНПЖБ А405-0,252). Донори стійкості АС 48 та АС 50 належить до типу високостійких і стійких (А 405 – 0,050-0,080). Гібриди першого покоління (F1) були гетерозиготними і фенотипово стійкими до ВНПЖБ. Гібридні комбінації, отримані від схрещування Я/Пер х АС 50, були більш стійкими, ніж Я/Пер х АС 48, що, вірогідно, обумовлено рівнем стійкості донорів. Потомство першого беккросу (ВС1) було представлено 50% фенотипово стійкими рослинами. Стійкість відібраного для подальшої роботи потомства другого беккросного (ВС2) схрещування залишалася на рівні ліній-донорів (табл. 5).

Таблиця 5 – Стійкість до ризоманії у деяких кращих потомствах F1, ВС1 та ВС2 від схрещування диплоїдної лінії Я/Пер з донорами АС 48 та АС , (АПФ Крупець, Рівненська область, 2001-2004 рр.)

№ п/п. | Селекційний номер | Походження | Абсорбція ВНПЖБ

(А 405)

1 | Я/Пер | 2 x MM | 0,252

2 | АС 48 | B.subsp. maritima WB  x C  | 0,080

3 | АС 50 | B.subsp. maritima x Y  | 0,051

Потомства F1

1 | 99-320-8 | Я/Пер х АС 48 | 0,030

2 | 99-672-9 | Я/Пер х АС 50 | 0,024

3 | 99-672-12 | Я/Пер х АС 50 | 0,005

4 | 99-630 | Я/Пер х АС 50 | 0,030

Потомства ВС1

1 | 01-433-1 | 99-320-8 х Я/Пер | 0,083

2 | 01-439-3 | 99-672-9 х Я/Пер | 0,082

3 | 01-437-8 | 99-672-12 х Я/Пер | 0,051

4 | 01-425-1 | 99-630 х Я/Пер | 0,056

Потомства ВС2

1 | 03-389-2 | 01-433-1 х Я/Пер | 0,013

2 | 03-374-10 | 01-439-3 х Я/Пер | 0,064

3 | 03-397-1 | 01-437-8 х Я/Пер | 0,036

4 | 03-414-2 | 01-425-1 х Я/Пер | 0,035

У ході доборів було вирішене ще одне важливе завдання – досягнуто підвищення показників продуктивності стійких до ризоманії ліній. На інфекційному фоні хвороби лінія Я/Пер давала врожайність на рівні 15% від стійкого гібриду Rizor. У потомства F1 врожайність гібридних комбінацій складала, у середньому, 45%, а ВС2 – в середньому, 80-85% від стійкого сорту. При відсутності інфекції отримані гібридні комбінації за продуктивністю не поступалися стандартному гібриду Ялтушківський ЧС .

Серед потомства ВС2 були добрані селекційні лінії (03-414-2, 03-397-1,
03-417-2, 03-393-1, 03-374-10 та інші), які суміщають високу стійкість із задовільними показниками продуктивності (табл. 6). Дані лінії рекомендовані для використання в селекційних програмах як диплоїдні багатонасіннєві запилювачі.

Таблиця 6 – Продуктивність та ураженість ризоманією кращих селекційних матеріалів ВС2 (АПФ Крупець, Рівненська область, ЯДСС, 2001-2004 рр.)

Селек-ційній номер | Походження | Інфекційній фон ВНПЖБ | Без ураження ризоманією

% від стандарту – Rizor | % від стандарту –

Ялтушківський ЧС 72

абсорбція ВНПЖБ | густота рослин | врожай-ність | врожай-ність | цукрис-тість | збір цукру

03-397-1 | ВС2
(Я/Пер х АС 50) | 56,3 | 97,1 | 84,2 | 125,2 | 101,4 | 126,9

03-414-2 | ВС2
(Я/Пер х АС 50) | 60,3 | 96,0 | 96,2 | 114,1 | 98,6 | 112,5

03-393-1 | ВС2
(Я/Пер х АС 50) | 36,2 | 107,1 | 86,4 | 109,2 | 104,1 | 113,7

03-417-2 | ВС2
(Я/Пер х АС 50) | 50,0 | 100,0 | 83,0 | 119,3 | 103,4 | 123,4

03-374-10 | ВС2
(Я/Пер х АС 50) | 110,3 | 91,4 | 84,9 | 97,4 | 100,0 | 97,4

03-421-1 | ВС2
(Я/Пер х АС 48) | 72,4 | 84,0 | 81,0 | 93,6 | 99,3 | 92,9

НІР 05 | 12,5 | 15,4 | 17,3

Пошук нових джерел стійкості до ризоманії серед вітчизняних селекційних матеріалів. На сьогодні відомі 3 патотипи ВНПЖБ – А, В та Р. Лінії-донори стійкості до ризоманії, які використовуються в нашій роботі, містять ген Rz1 (“Холі”), який обумовлює стійкість до патотипів А та В.

Останнім часом у світі відбувається зростання ареалу патотипу Р, який є більш вірулентним і здатен подолати стійкість, обумовлену геном Rz1. Тому актуальним напрямком селекції цукрових буряків є пошук та впровадження нових джерел стійкості до ризоманії. Нами проведено повторну оцінку селекційних матеріалів з колекції ІЦБ УААН, які у минулі роки проходили попередній добір на інфекційному фоні ризоманії в умовах Киргизстану. У більшості досліджених ліній (AR 19, AR 64 МС, AR 65 mm, AR 100, AR 115) вміст вірусу був нижчим, ніж у гібрида Rizor. Разом із тим, за врожайністю ці матеріали значно поступалися гібриду Rizor. Незважаючи на це, дані лінії представляють інтерес для подальшої роботи – проведений нами повторний цикл оцінки (дворазовий) показує наявність в них генетично-обумовленої стійкості до ВНПЖБ.

Було висловлено припущення про те, що стійкість даних селекційних ліній не обумовлена відомими генами стійкості, зокрема геном Rz1. Тому проведено дослідження ідентичності гена (ів), який (і) визначає (ють) стійкість 10 селекційних ліній ІЦБ УААН, гену Rz1, яке провели за допомогою двох SТS маркерів – B40S і B2S. Дослідження виконували сумісно із д-ром Schneider і д-ром Песцовою з Інституту селекції рослин ім. Макса Планка (Німеччина).

Результати ПЛР-аналізу показали, що селекційні лінії, які зберігаються в ІЦБ УААН, не містять Rz1 гена. Для найближчого маркера (B40S) у цих селекційних матеріалах жодного алеля для Rz1 гена не виявлено. Для маркерного гена B2S, який розташований на відстані 1,5 сМ від Rz1, такі алелі виявлені для ліній AR 51, AR 19, AR 101 і AR 100 (рис. 5).

Рис. 5. Електрофореграма B2S-фрагментів ДНК маркера гена Rz1 досліджених зразків цукрових буряків

Наявність маркерного алеля було встановлено лише в одній рослині лінії AR 19 Отже, стійкість селекційних матеріалів, які зберігаються в колекції ІЦБ УААН, не пов’язана з геном Rz1. Можливо, їх стійкість обумовлена іншим геном (ами) або їх аналогами (RGAs) (Hunger et al., 2003) у зв’язку з цим вони можуть представляти інтерес як нові джерела стійкості до ризоманії.

удосконалення методів оцінки стійкості цукрових буряків
до збудників гнилей коренеплодів

Створення вихідних селекційних матеріалів, стійких до гнилей коренеплодів, за допомогою методів in vitro. Добір калусів та меристем цукрових буряків, стійких до збудників хвороб коренеплодів, проведений в умовах in vitro, сприяє підвищенню ефективності селекційного процесу за рахунок рівномірності та специфічності інфекційного навантаження і скорочення терміну отримання матеріалу. Нами розроблено метод подвійної культури, який полягає у співкультивуванні в умовах in vitro калусів буряків та грибів-збудників гнилей коренеплодів. Цей метод дає можливість диференціювати клонові лінії цукрових буряків за їх стійкістю до грибів роду Fusarium.

Ефективність добору при оцінці методом подвійних культур, головним чином, залежить від генетичних особливостей калусного матеріалу цукрових буряків та агресивності грибів-збудників гнилей коренеплодів. Відносну стійкість до всіх досліджуваних видів Fusarium мали лінії К І/10 (добрана з калусної лінії – К (2х) ОКС-10/96), К