АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

НІКОЛАЄВА Валентина Валентинівна

УДК 616-001.8-035-085.21/.22

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ДОЦІЛЬНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ ДОНАТОРА ОКСИДУ АЗОТУ ГЛУТАРГІНУ ТА ЙОГО КОМБІНАЦІЇ З ПІРАЦЕТАМОМ
ПРИ ГЕМІЧНІЙ ГІПОКСІЇ

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільському державному медичному університеті ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Посохова Катерина Андріївна,

Тернопільський державний медичний

університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України,

завідувач кафедри фармакології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Соловйов Анатолій Іванович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник;

доктор медичних наук Маньковська Ірина Микитівна, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів.

Провідна установа

Одеський державний медичний університет, кафедра загальної та клінічної фармакології, МОЗ України, м. Одеса.

Захист відбудеться 21.09.2005 р. о _14____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14.

Автореферат розісланий 16.08. 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Данова І.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук високоефективних способів фармакотерапії гіпоксії залишається актуальним завданням фармакології і патофізіології. Одним із найбільш поширених типів гіпоксії є гемічна гіпоксія (ГГ), при чому її корекція є досить складною і недостатньо дослідженою галуззю цієї проблеми (В.С. Ярочкин, 2004). Подібний тип гіпоксії зустрічається при інтоксикації чадним газом (В.А. Филов и соавт., 1988), при крововтраті (В.С. Ярочкин, 2004). В останньому випадку ГГ обумовлена зменшенням концентрації гемоглобіну та кисневої ємності крові і зниженням хвилинного об’єму крові та швидкості транспорту кисню (відповідно гемічний та циркуляторний компоненти), тому її часто позначають як циркуляторно-гемічну (ЦГГ) (М.М. Середенко, 1987). Крім того, ГГ лежить в основі патогенезу багатьох захворювань, гострих та хронічних отруєнь, термінальних станів, розвивається при хірургічних втручаннях, істотно обтяжуючи перебіг основного патологічного процесу і, нерідко, стаючи причиною смерті таких пацієнтів (Є.Є.Дубініна,1988; Н.В. Павлюк, 1998; В.В. Зінчук, 1999). Це підкреслює важливість даної проблеми для сучасної медицини і надає першочергового значення розробці ефективних методів терапії та профілактики цієї патології. Згідно з сучасними даними, чинником, який відіграє суттєву роль у патогенезі гіпоксичних станів, є система оксиду азоту (NO) (Y. Henry, 1999; S. Deem, 2001; В.В. Зінчук, 2003). Доведено, що в умовах гіпоксії відбувається перемикання дихання з кисневого на нітратно-нітритний тип з використанням продуктів метаболізму NO – нітратів і нітритів у відновних реакціях (В.П. Реутов, 1998; G.C. Brown, 1999). З іншого боку, як внутрішньоклітинний месенджер, оксид азоту здатен викликати експресію ряду факторів, зокрема антиоксидантних ферментів, які відіграють значну роль у процесах адаптації до гіпоксії (В.В. Зінчук, 1999; В.Т. Івашкін, 2000). Таким чином, NO бере участь в регуляції як вільнорадикальних процесів, так і процесів тканинного дихання (І.Ю. Малишев, 1997; А.І. Соловйов, 1998). Водночас, відомості про роль NO у патогенезі ГГ є суперечливими (К.С. Ковальская, А.Ф. Ванин, 1999; С.Ю. Машина, Б.В. Смирин, 2001). Зокрема, пока-зано, що протективний ефект адаптації до гіпоксії може нівелюватись інгібіторами NO-синтази (J. Pedrazachaverii, 1998; Б.В. Смирин, 2000) та посилюватись при застосуванні NO-донорів (J. Assreuy, 1993; S. Gross, 1995). Висловлюються припущення, що засоби, які здатні підвищувати концентрацію NO в тканинах, можуть бути корисними у профілактиці та лікуванні гіпоксичних станів (Т.В. Серебровська, Н.М. Кургалюк, 2001). Тому з’ясування ефективності при ГГ, спричиненій гострою крововтратою та інтоксикацією чадним газом (СО), лікарських засобів, до складу яких входить попередник синтезу оксиду азоту – L-аргінін, зокрема глутаргіну, є актуальним та перспективним завданням. Потребує також подальшого дослідження можливість збільшення ефективності фармакопрофілактики ГГ шляхом комбінованого застосування глутаргіну із антигіпоксантами, наприклад, із пірацетамом.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи кафедр фармакології, медицини катастроф і військової медицини Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горба-чевського, “З’ясування ролі порушень кисневого гомеостазу при патології печінки та центральної гемодинаміки та пошук ефективних способів корекції змін, що виникають”, затвердженої МОЗ України, № державної реєстрації 0101U001317. Дисертант є її співвиконавцем.

Мета роботи і завдання дослідження. З’ясування профі-лактичної ефективності глутаргіну та його комбінованого застосування із пірацетамом при гемічній гіпоксії, що обумовлена крововтратою та отруєнням чадним газом.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Встановити особливості впливу профілактичного введення попередників синтезу оксиду азоту L-аргініну та глутаргіну на деякі показники перекисного окислення ліпідів, системи антиоксидантного захисту, тканинного дихання та вміст нітрит-аніону у печінці, нирках, серці, мозку та крові щурів за умов гострої крововтрати та гострого отруєння монооксидом вуглецю.

2. З’ясувати вплив блокатора NO-синтази N-нітро-L-аргініну при його профілактичному введенні на показники системи прооксиданти-антиоксиданти, активність мітохондріальних ферментів, вміст нітрит-аніону у печінці, нирках, серці, мозку та крові щурів за умов гострої крововтрати та гострого отруєння монооксидом вуглецю.

3. Визначити вплив глутаргіну та пірацетаму на толерантність тварин до фізичного навантаження при гострій гемічній гіпоксії.

4. Встановити профілактичну ефективність комбінованого застосування глутаргіну із пірацетамом при гемічній гіпоксії.

5. Дослідити механізм дії глутаргіну при гемічній гіпоксії.

Об’єкт дослідження: гемічна гіпоксія при гострій крововтраті та гострій інтоксикації монооксидом вуглецю у білих щурів.

Предмет дослідження: профілактична ефективність глутаргіну та пірацетаму при гемічній гіпоксії, викликаній гострою крововтратою та гострою інтоксикацією монооксидом вуглецю.

Методи дослідження: фармакологічні, біохімічні, фізіологічні, математичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Спільно із групою співавторів розроблено нову методику моделювання ГГ за допомогою пристрою для інгаляційного затруєння тварин монооксидом вуглецю (патент на винахід №55682 А від 15.04.2003). Вперше встановлено, що при ГГ, викликаній гострою крововтратою та гострою інтоксикацією СО, порушення у системі прооксиданти-антиоксиданти, окислювальних процесів у мітохондріях печінки, нирок, серця, мозку експериментальних тварин відбуваються на тлі зниження синтезу NO, що підтверджується зменшенням вмісту у внутрішніх органах його стабільного метаболіту нітрит-аніону (NO2-). Вперше доведено, що L-аргінін (LА) та глутаргін здатні попередити вказані зміни при їх профілактичному введенні перед моделюванням даних видів ГГ. При цьому позитивний вплив LА та глутаргіну супроводжується зростанням у гомогенатах внутрішніх органів тварин вмісту NO2-. Вперше встановлено, що блокатор синтази оксиду азоту N-нітро-L-аргінін (NAME) при його профілактичному введенні перед гострими ЦГГ та ГГ сприяє подальшому прогресуванню патологічних змін у внутрішніх органах тварин. Доведено, що комбіноване застосування NАМЕ та глутаргіну перед моделюванням гострої ЦГГ призводить до нівелювання позитивних ефектів останнього, що підтверджує роль активації синтезу NO у механізмі профілактичної дії глутаргіну при гіпоксії. Вперше встановлено, що введення LА та глутаргіну перед гострою інтоксикацією СО сприяє зменшенню вмісту карбоксигемоглобіну в крові тварин. Показано, що комбіноване застосування пірацетаму з глутаргіном перед гострою ГГ за своєю ефективністю перевищує монопрофілактику цими засобами. При профілактичному введенні глутаргіну та його комбінації з пірацетамом при гострій гіпоксії, викликаній СО, через 1 год після затруєння у тварин істотно зростає толерантність до фізичного навантаження. Отримано нові дані щодо розподілу NO2- у внутрішніх органах та у сироватці крові при профілактичному введенні LА, глутаргіну та NАМЕ за умов гострої крововтрати та гострої інтоксикації СО. У першому випадку вміст NO2- зростає у внутрішніх органах, але знижується у сироватці крові, при введенні NАМЕ, навпаки, вміст NO2- зменшується у внутрішніх органах та зростає у сироватці крові.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлення ефективності аргініновмісного препарату глутаргіну як засобу профілактики порушень стану внутрішніх органів, які розвиваються при гострій гемічній гіпоксії, викликаній гострою крововтратою та інтоксикацією чадним газом, створює підґрунтя для глибшого вивчення властивостей препарату при даних видах гемічної гіпоксії з метою подальшого його впровадження в клініці та для пошуку нових ефективних схем фармакопрофілактики проявів гіпоксії із включенням засобів – попередників синтезу оксиду азоту.

Результати досліджень впроваджено в навчальний процес кафедр фармакології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Буковинської державної медичної академії, Луганського державного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно провів патентно-інформаційний пошук, опрацював наукову літературу, спланував та виконав всі дослідження. Облік, аналіз первинного матеріалу, статистична обробка результатів, розробка основних положень та висновків роботи, написання всіх розділів дисертації виконано дисертантом особисто. Спільно із групою співавторів розроблено нову методику моделювання гемічної гіпоксії за допомогою пристрою для інгаляційного затруєння тварин СО (патент України на винахід №55682 А від 15.04.2003). Дисертантом особисто розроблено конструкцію установки, відпрацьовано методику інгаляційного затруєння тварин СО.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на ІІ Національному з’їзді фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє” (Дніпропетровськ, 2001), науково-практичних конференціях “Здобутки клінічної та експериментальної медицини” (Тернопіль, 2001, 2002), V та VI Міжнародних медичних конгресах студентів та молодих учених (Тернопіль, 2001, 2002), підсумковій науковій конференції студентів і молодих вчених-медиків “Молоді науковці – медицині України” (Чернівці, 2002), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Клінічна фармакологія метаболічних коректорів, взаємодія ліків в клінічній практиці” (Вінниця, 2002), Х конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Чернівці, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них 4 – у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 9 – у вигляді матеріалів і тез конференцій, з’їздів, конгресів, 1 патент України на винахід.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 154 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів роботи, висновків. Список літератури містить 277 джерел, з яких 101 – іноземних авторів. Робота ілюстрована 29 таблицями та 13 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проводили на білих нелінійних щурах-самцях з масою тіла 17030 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. У процесі виконання роботи використано 174 тварини.

У ході роботи було застосовано такі речовини і препарати: попередники синтезу оксиду азоту L-аргініну гідрохлорид (“Sigma”, USA) та глутаргін (Фармацевтична компанія “Здоров’я”, м. Харків), неселективний блокатор NO-синтази N-нітро-L-аргініну метиловий ефір (“Sigma”, USA), пірацетам (Фармацевтична фабрика “Дарниця”, м. Київ).

LА вводили внутрішньоочеревинно (в/о) 1 раз на добу протягом 21 дня з розрахунку 25 мг/кг маси тварини у вигляді 2,5% водного розчину (В.Ф. Сагач, 1999). В іншій серії досліджень LА вводили в/о одноразово в дозі 300 мг/кг маси тварини у вигляді 30% водного розчину (Н.М. Кургалюк, 2001). NАМЕ вводили в/о 1 раз на добу протягом 4-х днів у вигляді 1% водного розчину із розрахунку 10 мг/кг маси тіла тварини (В.Г. Башкатова, 1998; Б.В. Смирин, 2000). 4% розчин глутаргіну вводили в/о раз на добу протягом 4-х днів в дозі 100 мг/кг маси тварини (60 мг/кг у перерахунку на L-аргінін) (Ю.В. Меркулова, 1998). 20% розчин пірацетаму вводили в/о 1 раз на добу протягом 4-х днів в дозі 400 мг/кг маси тварини (В.І. Торшин, 1988). Дози цих препаратів не перевищували 1/10 LD50. Тварини контрольної групи отримували в/о відповідну кількість розчинника.

В процесі виконання дисертаційної роботи вивчався вплив даних речовин на систему прооксиданти-антиоксиданти та активність мітохондріальних ферментів у щурів при гіпоксичних станах різного генезу, а саме при ЦГГ та ГГ.

ЦГГ моделювали шляхом гострої крововтрати в об’ємі 20-25% від ОЦК без наступної корекції об’єму втраченої крові (Н.В. Саноцкая, 1992; Б.І. Джурко, 1995). Тварин декапітували (під етаміналовим наркозом; етамінал натрію вводили у вигляді 1% розчину із розрахунку 0,2 мл/100 г маси тварини) через 1 год після початку моделювання гіпоксії. ГГ у піддослідних тварин викликали шляхом гострого інгаляційного впливу на них СО в концентрації 9000 мг/м3, експозиція 15 хв (В.А. Филов и соавт., 1988) за допомогою розробленого нами пристрою для інгаляційного затруєння тварин монооксидом вуглецю. Тварин декапітували через 1 год після припинення впливу СО. Моделювання гіпоксії розпочинали через 23 години після останнього введення досліджуваної речовини. Працездатність піддослідних тварин визначали у тесті з плаванням за методом, запропонованим С.І. Гончаровим та С.Д. Кузьменко (1991).

Дослідження біохімічних показників проводили у гомогенатах печінки, нирок, серця та мозку, а також у крові. Концентрацію ТБК-активних продуктів (ТБКа) визначали за методом Z. Placer (1968), вміст гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) – за методом В.Б. Гаврилова та М.І. Мішкорудної (1983). Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали за методом С. Чеварі та співавт. (1985), активність каталази (КТ) – за методом М.А. Королюк і співавт. (1988). Окислювальні процеси у мітохондріях оцінювали за активністю сукцинатдегідрогенази (СДГ), яку визначали за методом Н. Єщенко та Г. Вольського (1982) та цитохромоксидази (ЦХО), яку визначали за методом В. Орєховича (1977). Вміст стабільного метаболіту оксиду азоту нітрит-аніону (NO2-) визначали за методом Гріса (1994), карбоксигемоглобіну (КБГ) – спектрофотометричним методом за Л.П. Букіною та Л.І. Ушаковою (1979).

Отриманий цифровий матеріал був оброблений методом варіаційної статистики з використанням критерію “t” Стьюдента. Розраховували середні арифметичні величини, похибки середніх арифметичних, а також середні квадратичні відхилення. Зміни вважали достовірними при р<0,05. Для розрахунків використовували комп’ютерну програму Excel (Microsoft, USA).

Результати досліджень та їх обговорення. Зміни показників прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу та активності мітохондріальних ферментів при ЦГГ. При ЦГГ, згідно отриманих нами даних, у щурів активізуються процеси перекисного окислення ліпідів (ПОЛ): зростає вміст ТБКа у печінці на 98%, у нирках на 97%, у серці на 93% та становить при цьому: 10,390,11 ммоль/кг у печінці, 8,720,27 ммоль/кг у нирках, 8,580,12 ммоль/кг у серці. Вміст ГПЛ теж достовірно зростає і становить 7,930,09 ум.од./кг у печінці, 6,000,05 ум. од./кг у нирках та 7,050,07 ум. од./кг у серці, що відповідно на 75%, 36% та 92% більше, ніж у здорових тварин. Вірогідно значимим є зниження активності ферментів антиоксидантного захисту (АОЗ) при ЦГГ у гомогенатах всіх досліджуваних органів, порівняно із відповідними показниками у здорових щурів (табл. 1).

Відмічено також значні зміни активності СДГ та ЦХО. Так, активність ЦХО зростає у мітохондріальних фракціях печінки на 43%, нирок – на 36%, серця – на 120%. Активність СДГ, навпаки, знижується, порівняно із відповідними показниками у здорових щурів (див. табл. 1).

При ЦГГ у внутрішніх органах тварин достовірно знижується вміст NO2-: у печінці на 16%, у нирках на 19%, у серці на 17%, порівняно із такими ж показниками у інтактних тварин (див. табл. 1). У сироватці крові його вміст теж знижується на 17% і становить 9,620,16 ммоль/л.

Таблиця 1

Активність антиоксидантних та мітохондріальних ферментів та вміст нітрит-аніону у внутрішніх органах інтактних щурів та при ЦГГ (Мm)

Показники | Інтактні тварини | ЦГГ (контроль) | печінка | нирки | серце | печінка | нирки | серце | КТ,

кат/кг | 16,22

0,14 | 7,15

0,13 | 2,63

0,09 | 15,61

0,10 * | 5,75

0,10 * | 2,29

0,13 * | СОД,

ум.од./кг | 4,51

0,17 | 3,38

0,15 | 3,36

0,14 | 1,87

0,08 * | 1,25

0,11 * | 1,23

0,04 * | ЦХО, ммоль/(кгхв) | 5,15

0,11 | 5,97

0,14 | 11,54 0,12 | 7,36

0,15 * | 8,15

0,10 * | 25,4

0,11 * | СДГ,

ммоль/(кгхв) | 9,74

0,10 | 9,27

0,13 | 5,58

0,12 | 1,95

0,34 * | 3,13

0,37 * | 3,30

0,54 * | NO2-,

ммоль/кг | 0, 102

0, 017 | 0,136

0, 023 | 0,131

0,018 | 0,087

0,010 * | 0,111

0,021 * | 0,108

0,019 * | Примітка. В цій та наступних таблицях - р < 0,05 відносно інтактних тварин.

При вивченні впливу глутаргіну та пірацетаму на вищевказані показники при ЦГГ, досліджувались також і гомогенати мозку піддослідних тварин. Закономірності змін, що виникали у мозку піддослідних тварин при ЦГГ, не відрізняються від описаних вище.

Дослідження профілактичної активності глутаргіну при ЦГГ. У ході проведених досліджень встановлено, що зміни, які спостерігалися при профілактичному введенні перед ЦГГ як глутаргіну, так і LА, мають однакову спрямованість. Так, вміст NO2- під впливом глутаргіну зростає на 30% у печінці, на 21% у нирках, на 39% у серці, на 36% у мозку, порівняно із контролем. Вміст продуктів ПОЛ – ТБКа та ГПЛ – на фоні попереднього введення глутаргіну зменшується, порівняно із відповідними показниками у тварин контрольної групи, у печінці, нирках, серці та мозку і становить при цьому: 6,220,15 ммоль/кг та 5,220,05 ум. од./кг, 5,140,13 ммоль/кг та 4,900,05 ум. од./кг, 4,660,23 ммоль/кг та 4,530,06 ум. од./кг, 7,050,13 ммоль/кг та 5,330,06 ум. од./кг відповідно. Поруч з цим вірогідно зростає активність КТ на 19% у печінці, на 50% у нирках, на 18% у серці та СОД: у 2 рази у гомогенатах печінки, в 1,7 рази – нирок, у 2 рази – серця, в 1,2 рази – мозку, порівняно з тваринами контрольної групи. Профілактичне введення глутаргіну призвело також до зниження активності ЦХО на 17%, 15%, 36% та 16% у печінці, нирках, серці та мозку відповідно та до зростання активності СДГ в 2, 1,6, 1,4 та 1,6 рази у печінці, нирках, серці та мозку відповідно, порівняно із тваринами, яким перед ЦГГ донатора оксиду азоту не вводили. При цьому вищевказані показники наближаються до таких у інтактних тварин. Такі позитивні зміни при профілактичному використанні глутаргіну перед ЦГГ ми пов’язуємо із захисною дією оксиду азоту при гіпоксії.

Була досліджена також ефективність антигіпоксанта пірацетаму при його окремому та поєднаному із глутаргіном застосуванні щодо попередження змін, що виникають при ЦГГ. Встановлений вищий профілактичний ефект при поєднаному застосуванні глутаргіну із пірацетамом, порівняно з окремим введенням препаратів. Водночас, спрямованість змін досліджуваних показників у вищеперелічених групах була однаковою.

Зміни показників системи прооксиданти-антиоксидантни та активності мітохондріальних ферментів при ЦГГ за умов профілактичного введення NAME. При профілактичному введенні протягом 4 днів NAME перед ЦГГ, у білих щурів на фоні зменшення вмісту NO2- у печінці, нирках та серці (рис.) та підвищення його у 1,5 рази у крові, спостерігається збільшення кількості продуктів ПОЛ – ТБКа на 24% у печінці, на 11% у нирках, на 6% у серці та ГПЛ на 10% у печінці та на 13% у нирках, порівняно із контролем. Одночасно зростає активність КТ: в 1,3, 1,7 та 3 рази у гомогенатах печінки, нирок і серця відповідно та становить при цьому 19,780,13 кат/кг у печінці, 9,520,06 кат/кг у нирках, 6,630,07 кат/кг у серці. Активність СОД теж зростає у всіх досліджуваних органах і становить при цьому 2,380,08 ум.од./кг у печінці, 1,730,07 ум.од./кг нирках та 1,530,03 ум.од./кг у серці. Активність КТ у цій групі тварин в 3 рази зростає також і у сироватці крові. Причиною активації антиоксидантних ферментів у внутрішніх органах та у сироватці крові в даному випадку, можливо, стало посилене утворення перекису водню, викликане як гіпоксією, так і введенням NAME (В.В. Зінчук, 1999). Така активація системи АОЗ, ймовірно, є компенсаторною.

ммоль/кг

Рис. Вплив профілактичного введення L-аргініну, глутаргіну та N-нітро-L-аргініну на вміст нітрит-аніону за умов ЦГГ

Примітки: – р < 0,05 відносно інтактних тварин; ** – р<0, 05 відносно контролю;

1 – здорові тварини;

2 – ЦГГ (контроль);

3 – LA+ЦГГ;

4 – Глу+ЦГГ;

5 – NAME+ЦГГ.

Під впливом NАМЕ різноспрямовано змінюється активність мітохондріальних ферментів: активність ЦХО зменшується і становить 6,360,09 ммоль/(кгхв) у печінці, 7,270,15 ммоль/(кгхв) у нирках, 24,260,19 ммоль/(кгхв) у серці. Активність СДГ, навпаки, зростає і становить 11,500,13 ммоль/(кгхв) у печінці, 11,820,04 ммоль/(кгхв) у нирках, 13,510,04 ммоль/(кгхв) у серці.

За умов гострої гіпоксії відбувається перемикання енергетичного забезпечення на використання субстратів обміну, пов’язаних з переважним окисленням сукцинату. Переважне окислення сукцинату за умов введення щурам блокатора NO-синтетази вимагає більших енергетичних затрат і викликає різке посилення процесів ПОЛ, яке не пов’язане із недостатнім АОЗ (Т.В. Серебровська, 2001). Це твердження, з однієї сторони, пояснює активацію СДГ, а з іншої – зростання кількості ГПЛ та ТБКа у гомогенатах внутрішніх органів при одночасній активації СОД та КТ.

Поєднане введення NАМЕ і глутаргіну нівелює позитивний вплив останнього на показники ПОЛ, АОЗ та перешкоджає відновленню активності мітохондріальних ферментів при ЦГГ, що опосередковано свідчить про зв’язок ефективності глутаргіну при даній патології з його здатністю стимулювати синтез оксиду азоту.

Зміни показників ПОЛ, АОЗ, активності мітохондріальних ферментів та вмісту NO2- і СО при гострій ГГ, викликаній чадним газом. Встановлено, що при гострій ГГ, спричиненій інгаляцією СО, зростає вміст ТБКа та ГПЛ у всіх досліджуваних органах (табл. 2). Одночасно знижується активність КТ і СОД у всіх досліджуваних органах, порівняно із відповідними показниками у здорових щурів (див. табл. 2).

Крім того, встановлено, що при ГГ, викликаній інгаляційним впливом СО, активність СДГ достовірно знижується порівняно із здоровими тваринами. У мітохондріальних фракціях печінки на 35%, нирок на 29%, серця на 19%, мозку на 23% і становить при цьому 3,560,12 ммоль/(кгхв), 2,890,13 ммоль/(кгхв), 2,640,07 ммоль/(кгхв) та 3,890,11 ммоль/(кгхв) відповідно. Активність ЦХО достовірно зростає у мітохондріальній фракції печінки на 25%, нирок – на 13%, серця – на 54% і становить, відповідно, 7,240,10 ммоль/(кгхв), 7,740,11 ммоль/(кгхв) та 25,030,07 ммоль/(кгхв). На цьому тлі у гомогенатах печінки та мозку вірогідно зменшується вміст NO2-: на 11% та 10% відповідно, у серці та нирках спостерігається тенденція до зменшення цього показника. Середній вміст КБГ у крові тварин, які перенесли ГГ, становив 81%.

Таблиця 2

Вміст продуктів ПОЛ та активність антиоксидантних ферментів при гострій ГГ, викликаній чадним газом (Мm) |

Інтактні тварини | Гемічна гіпоксія (контроль) | Показники | печінка | нирки | серце | мозок | печінка | нирки | серце | мозок | ТБКа,

ммоль/кг | 5,63 0,12 | 4,85

0,14 | 4,39

0,04 | 6,85

0,09 | 11,39

0,25 * | 8,48

0,14 * | 7,39

0,17 * | 12,47

0,18 * | ГПЛ,

ум.од./кг | 5,84

0,04 | 5,55

0,03 | 4,57

0,05 | 6,09

0,05 | 7,96

0,05 * | 6,07

0,06 * | 5,87

0,07 * | 8,11 0,08 * | КТ,

кат/кг | 19,03

0,19 | 12,11

0,05 | 3,64 0,03 | 3,81 0,02 | 7,75

0,29 * | 2,49

0,08 * | 1,58

0,10 * | 2,14 0,04 * | СОД, ум.од./кг | 3,78

0,05 | 3,26 0,09 | 3,26 0,04 | 4,17 0,06 | 1,82

0,07 * | 1,35

0,04 * | 1,17

0,04 * | 2,28 0,07 * |

Дослідження профілактичної активності глутаргіну при ГГ. Встановлено, що в результаті профілактичного введення щурам протягом 4 днів глутаргіну перед ГГ на фоні зростання вмісту NO2- у гомогенатах печінки, нирок, серця і мозку та його зниження у сироватці крові, настає покращення процесів тканинного дихання: відновлюється активність СДГ та ЦХО у мітохондріальних фракціях внутрішніх органів. Активність КТ при цьому становить у печінці 14,66±0,09 кат/кг, у нирках 5,49±0,05 кат/кг, у серці 2,49±0,05 кат/кг, у мозку 2,84±0,06 кат/кг. Активність СОД теж зростає і становить 3,740,06 ум.од./кг, 2,910,05 ум.од./кг, 3,280,04 ум.од./кг, 3,970,05 ум.од./кг у печінці, нирках, серці та мозку відповідно. Одночасно знижується вміст ТБКа та ГПЛ і становить при цьому відповідно 5,94±0,17 ммоль/кг та 5,27±0,05 ум. од./кг у печінці, 5,48±0,15 ммоль/кг та 5,03±0,05 ум. од./кг у нирках, 4,99±0,09 ммоль/кг та 4,65±0,05 ум. од./кг у серці, 7,51±0,09 ммоль/кг та 5,41±0,05 ум. од./кг у мозку, порівняно із тваринами контрольної групи. Як і при профілактичному введенні LА, зменшується вміст КБГ в крові до 73%.

Введення пірацетаму та глутаргіну перед гострим отруєнням СО достовірно підвищує толерантність тварин до фізичного навантаження у тесті з плаванням. Тварини, що отримали профілактично глутаргін, пірацетам, чи комбінацію цих препаратів перед ГГ плавали через 1 годину після впливу СО відповідно 142,003,03 с, 135,831,68 с та 153,503,91 с, тоді, як щурі контрольної групи, лише 104,171,68 с. Зростання толерантності до фізичного навантаження є функціональним підтвердженням покращення метаболічних процесів в організмі експериментальних тварин при ГГ під впливом профілактичного введення глутаргіну, пірацетаму чи комбінації цих препаратів. Разом з тим, комбіноване застосування глутаргіну з пірацетамом перед гострим отруєнням СО не має переваги, порівняно із введенням глутаргіну.

Зміни показників системи прооксиданти-антиоксидантни та активності мітохондріальних ферментів при ГГ за умов профілактичного введення NAME. Профілактичне введення NАМЕ перед інгаляційним впливом СО, призводить до інтенсифікації процесів ПОЛ – підвищення вмісту ТБКа та ГПЛ та зниження активності ферментів АОЗ: КТ та СОД, порівняно із тваринами, що перенесли ГГ (табл. 3). Вказані зміни виникають на фоні зниження вмісту нітрит-аніону у гомогенатах печінки, нирок, серця та мозку та зростання його у сироватці крові. Крім того при попередньому введенні NАМЕ при ГГ спостерігається істотніша дестабілізація роботи мітохондріальних ферментів, ніж при ГГ. Вочевидь, при цьому погіршуються і процеси енергозабезпечення.

Ймовірною причиною такого погіршення досліджуваних показників, як і при ЦГГ, під впливом NAME при ГГ є поглиблення дефіциту оксиду азоту. Дане припущення певною мірою підтверджується дослідженнями інших авторів, які вказують на те, що порушення адекватного синтезу оксиду азоту сприяє виникненню кисневої недостатності організму (Cobb J. et al., 1995). Інші вчені дослідили, що NAME значно зменшує здатність тварини виконувати важке фізичне навантаження та повністю попереджує розвиток адаптації до нього (Н.П. Аймашева і співавт., 1998).

Таблиця 3

Вміст продуктів ПОЛ та активність антиоксидантних ферментів при ГГ за введення N-нітро-L-аргініну (Мm)

Показники | N-нітро-L-аргінінГемічна гіпоксія | печінка | нирки | серце | мозок | кров | ТБКа, ммоль/кг | 12,66

0,27 ** | 9,00

0,17 ** | 7,65

0,09 | 12,81

0,12 | - | ГПЛ, ум.од./кг | 8,53

0,08 ** | 6,30

0,05 ** | 5,91

0,06 | 8,28 ±

0,06 | - | КТ, кат/кг | 6,71

0,09 ** | 2,21

0,05 ** | 1,38

0,05 | 1,96

0,04 ** | 0,21

0,01 ** | СОД, ум.од./кг | 1,59

0,02 ** | 1,27

0,02 | 1,08

0,02 | 2,17

0,05 | - | Примітка. ** - р < 0,05 відносно контролю.

Про негативний вплив NAME свідчать також результати поєднаного застосування глутаргіну та NAME при ЦГГ, що описано вище. Отже, механізм профілактичної активності глутаргіну при вивчених видах гемічної гіпоксії зв’язаний не лише з його антиоксидантними і антигіпоксичними властивостями, а й з його здатністю стимулювати синтез оксиду азоту.

Таким чином, нами встановлено, що профілактичне введення NAME сприяє поглибленню негативних змін при ГГ, що викликана гострою крововтратою чи гострою інтоксикацією монооксидом вуглецю, а попереднє введення LA, глутаргіну чи його комбінації з пірацетамом, навпаки, значною мірою попереджує їх розвиток.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено нове вирішення актуального наукового завдання, яке полягає у встановленні можливостей профілактики порушень, які виникають у печінці, серці, нирках та мозку при гемічній гіпоксії, викликаній гострою крововтратою та гострою інтоксикацією монооксидом вуглецю, за допомогою аргініновмісного препарату глутаргіну та його комбінації з пірацетамом.

В результаті вирішення завдання зроблено такі висновки:

1. При ЦГГ та ГГ у білих щурів значно зростає вміст ТБКа та ГПЛ у гомогенатах печінки, нирок, серця та мозку на фоні вірогідного зниження активності ферментів антиоксидантного захисту – КТ та СОД, а також пригнічення активності СДГ та зростання – ЦХО при одночасному зменшенні вмісту нітрит-аніону у гомогенатах печінки, нирок, серця та мозку при ЦГГ та печінки і мозку – при ГГ.

2. Профілактичне в/о введення білим щурам L-аргініну в дозі 25 мг/кг маси протягом 21 доби сприяє зниженню інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, що проявляється вірогідним зменшенням вмісту ТБКа на 45 і 49% у печінці, на 20 і 42% у нирках, на 55 і 37% у серці та ГПЛ на 37 і 34% у печінці, на 10 і 17% у нирках, на 33 і 22% у серці відповідно при ЦГГ і ГГ, зростанню активності ферментів антиоксидантного захисту КТ і СОД, порівняно із тваринами контрольної групи, попереджує зміну активності цитохромоксидази та сукцинатдегідрогенази у гомогенатах досліджуваних органів піддослідних тварин при циркуляторно-гемічній та гемічній гіпоксії на фоні зростання вмісту нітрит-аніону у цих органах та його зменшення у сироватці крові на 67 і 45% при ЦГГ та ГГ відповідно.

3. Введення білим щурам-самцям N-нітро-L-аргініну в дозі 10 мг/кг маси, в/о, щоденно, на протязі 4 діб перед циркуляторно-гемічною та гемічною гіпоксією призводить, у порівнянні із контрольною групою, до зниження вмісту нітрит-аніону в 2,3 рази у печінці, в 1,6 рази у нирках, в 1,7 рази у серці при ЦГГ та на 51% у печінці, на 28% у нирках, на 19% у серці, на 30% у мозку піддослідних тварин при ГГ, зростання його вмісту у сироватці крові у 1,5 рази при ЦГГ та на 50% при ГГ з одночасною активацією перекисного окислення ліпідів та прогресуванням порушень функціонування електронно-транспортного ланцюга мітохондрій; активність ферментів антиоксидантної системи за введення N-нітро-L-аргініну при циркуляторно-гемічній гіпоксії зростає, а при гемічній, навпаки, знижується, порівняно із відповідними показниками у тварин контрольної групи.

4. Попереднє введення білим щурам при циркуляторно-гемічній та гемічній гіпоксії протягом 4 діб глутаргіну в дозі 100 мг/кг маси попереджує розвиток зсуву у системі прооксиданти-антиоксиданти та зміну активності сукцинатдегідрогенази та цитохромоксидази у печінці, нирках, серці та мозку піддослідних тварин на фоні зростання вмісту нітрит-аніону у цих же органах та його зниження у сироватці крові.

5. Введення перед гемічною гіпоксією, викликаною гострою інтоксикацією монооксидом вуглецю, донорів оксиду азоту – L-аргініну в дозі 25 мг/кг маси протягом 21 доби та в дозі 300 мг/кг маси одноразово чи глутаргіну в дозі 100 мг/кг маси впродовж 4 діб – призводить до зниження вмісту карбоксигемоглобіну в крові.

6. Глутаргін та пірацетам при їх профілактичному введенні, окремо чи у комбінації, при гострій гемічній гіпоксії викликають односпрямовані позитивні зміни досліджуваних показників, вірогідно підвищуючи толерантність до фізичного навантаження у білих щурів, але комбіноване застосування обох препаратів є ефективнішим, ніж монопрофілактика глутаргіном чи пірацетамом.

7. Профілактична активність глутаргіну при гіпоксії певною мірою зв’язана з його здатністю стимулювати синтез оксиду азоту, оскільки поєднане введення N-нітро-L-аргініну та глутаргіну нівелює позитивний вплив останнього на показники перекисного окислення ліпідів, антиоксидантного захисту та перешкоджає нормалізації актив-ності мітохондріальних ферментів при циркуляторно-гемічній гіпоксії.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Посохова К.А., Буковська В.В. З липня 2002 р. Ніколаєва В.В. Вплив L-аргініну та N-нітро-L-аргініну на деякі показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в здорових тварин // Вісник наукових досліджень. – 2002.– №1. – С. 100-102.

Дисертантом особисто виконано пошук літератури, біохімічні дослідження, статистичну обробку результатів, оформлено статтю, підготовлено матеріал до друку.

2. Посохова К.А., Буковська В.В. Вплив L-аргініну та N-нітро-L-аргініну на деякі показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу за умов гострої циркуляторно-гемічної гіпоксії // Буковинський медичний вісник. – 2002. – Т. 6, №3. – С. 185-190.

Дисертантом особисто виконано пошук літературних даних, біохімічні дослідження, статистичну обробку результатів, оформлено статтю, підготовлено матеріал до друку.

3. Посохова К.А., Ніколаєва В.В. Вплив глутаргіну та пірацетаму на перебіг експериментальної циркуляторно-гемічної гіпоксії // Ліки. – 2003. – №5-6. – С. 42-46.

Дисертантом особисто виконано пошук літературних даних, біохімічні дослідження, статистичну обробку результатів, оформлено статтю, підготовлено матеріал до друку.

4. Ніколаєва В.В. Вплив профілактичного введення глутаргіну та N-нітро-L-аргініну на деякі біохімічні показники при гемічній гіпоксії, викликаній інгаляцією чадного газу // Медична хімія. – 2004. – Т. 6, №4. – С. 105-107.

5. Посохова К.А., Буковська В.В. Вплив L-аргініну на показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу та функціональну активність мітохондрій у внутрішніх органах здорових тварин // Матеріали ІІ Національного з’їзду фармакологів України. – Дніпро-петровськ, 2001. – С. 200-201.

6. Посохова К.А., Буковська В.В., Олещук О.М. Вплив L-аргініну на деякі показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу при експериментальній циркуляторно-гемічній гіпоксії // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. – 2001. – Вип.6. – С. 88.

7. Буковська В., Олещук О. Вплив L-аргініну на функціональну активність мітохондрій у внутрішніх органах тварин при циркуля-торно-гемічній гіпоксії // Матеріали V Міжнародного медичного конгресу студентів та молодих вчених. – Тернопіль, 2001. – С. 196.

8. Буковська В.В., Олещук О.М., Казанська О.О. Вплив донатора оксиду азоту та блокатора NO-синтази на показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу у печінці в нормі та при експериментальній гіпоксії // Молоді науковці – медицині України: Матеріали 76 підсумкової наукової конференції студентів і молодих вчених-медиків. – Чернівці, 2002. – С. 55.

9. Буковська В.В., Заєць Т.А. Вплив L-аргініну та N-нітро-L-аргініну на функціональний стан внутрішніх органів щурів при циркуляторно-гемічній гіпоксії // Вісник Вінницького державного медичного університету. – 2002. – Т. 6, №1. – С. 134.

10. Буковська В.В., Олещук О.М. Вплив глутаргіну та цитраргініну на деякі показники прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу та функціонування мітохондрій при циркуляторно-гемічній гіпоксії // Матеріали VI Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2002. – С. 294.

11. Зміни деяких біохімічних показників при важкій гемічній гіпоксії, викликаній інгаляцією монооксиду вуглецю / К.А. Посохова, В.В. Буковська, І.М. Кліщ, О.М. Олещук // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. – 2002. – №7. – С. 139.

12. Патент на винахід №55682 А України. МПК G09В23/28. Пристрій для інгаляційного затруєння тварин монооксидом вуглецю / К.А. Посохова, В.В. Буковська, О.В. Гриців, В.В. Дем’яненко (Україна); – 2002043461; Заявл. 25.04.2002; Oпубл. 15.04.2003; Бюлетень №4. – 2 с.

Дисертантом особисто розроблено конструкцію установки, відпрацьовано методику інгаляційного затруєння тварин СО.

13. Ніколаєва В.В. Вплив глутаргіну та пірацетаму на толерантність до фізичного навантаження при гострому отруєнні монооксидом вуглецю // Медична хімія. – 2004. – Т. 6, №3. – С. 161.

14. Ефективність глутаргіну при патологічних станах різного генезу / К.А. Посохова, О.М. Олещук, В.В. Буковська, О.В. Гриців, Т.А. Лєбєдєва, О.О. Казанська, Л.Й. Плосканич // Матеріали Х конгресу світової федерації українських лікарських товариств. – Чернівці, 2004. – С. 516.

АНОТАЦІЯ

Ніколаєва В.В. Експериментальне обґрунтування доцільності застосування донатора оксиду азоту глутаргіну та його комбінації з пірацетамом при гемічній гіпоксії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. Інститут фармакології та токсикології АМН України. Київ, 2005.

Дисертація присвячена вивченню профілактичної активності донаторів оксиду азоту (L-аргініну, глутаргіну) окремо та в комбінації з пірацетамом при циркуляторно-гемічній гіпоксії (ЦГГ), викликаній крововтратою та гемічній гіпоксії (ГГ), викликаній інгаляційним впливом монооксиду вуглецю.

Доведено, що попередники синтезу оксиду азоту – L-аргінін та глутаргін – попереджують розвиток істотних зрушень показників системи прооксиданти-антиоксиданти та активності мітохондріальних ферментів при ЦГГ та ГГ. Комбінація глутаргіну в дозі 100 мг/кг маси із пірацетамом в дозі 400 мг/кг маси чи монопрофілактика глутаргіном (100 мг/кг) виявились ефективнішими у попередженні негативних змін при ЦГГ, ніж застосування з цією ж метою пірацетаму (400 мг/кг). Крім того, профілактичне введення глутаргіну, пірацетаму чи комбінації цих препаратів перед гострим отруєнням СО, підвищує працездатність тварин. Механізм позитивного впливу глутаргіну в значній мірі обумовлений підвищенням вмісту нітрит-аніону у гомогенатах внутрішніх органів. Введення ж перед моделюванням ЦГГ чи ГГ блокатора NО-синтази N-нітро-L-аргініну в дозі 10 мг/кг маси, навпаки, призводить до погіршення всіх досліджуваних нами біохімічних показників.

Ключові слова: L-аргінін, N-нітро-L-аргінін, глутаргін, пірацетам, прооксиданти, антиоксиданти, мітохондріальні ферменти, гемічна гіпоксія.

АННОТАЦИЯ

Николаева В.В. Экспериментальное обоснование целесообраз-ности применения донатора оксида азота глутаргина и его комбинации с пирацетамом при гемической гипоксии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины. Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению профилактической активности предшественников синтеза оксида азота (L-аргинина, глутаргина) как отдельно, так и в комбинации с пирацетамом, при циркуляторно-гемической гипоксии (ЦГГ), вызванной острой кровопотерей и гемической гипоксии (ГГ), вызванной острым ингаляционным влиянием угарного газа.

Показано, что донаторы оксида азота L-аргинин и глутаргин предотвращают развитие существенных отклонений показателей системы