НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

ПАВЛІШКО Галина Миколаївна

УДК 579.87: 577.152.1+602.4

ОКСИДАЗИ МЕТИЛОТРОФНИХ ДРІЖДЖІВ І ЦВІЛЬОВИХ ГРИБІВ: ХАРАКТЕРИСТИКА ТА БІОАНАЛІТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Гончар Михайло Васильович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляторних систем клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Пирог Тетяна Павлівна,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник відділу біології

газоокислюючих мікроорганізмів;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Федорович Дарія Василівна

Інститут біології клітини НАН України,

старший науковий співробітник відділу

молекулярної генетики та біотехнології

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

м. Київ.

Захист відбудеться “9“ грудня 2005 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий “27“ жовтня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ферменти мікробного походження стали незамінним інструментом сучасної аналітичної біотехнології. Важливим джерелом ферментів (як природних, так і рекомбінантних) є деякі види дріджів, цвільових грибів та бактерій. Серед них особливе місце займають метилотрофні дріжджі, які, завдяки наявності унікально сильного промотора алкогольоксидазного гена (pAOX1), стали вигідним організмом-господарем для гетерологічної експресії промислово важливих білків та ферментів, у тому числі й аналітичного призначення [Cregg et al., 1985, Cregg et al., 1993, Rosenfeld et al., 1999].

Метилотрофні дріжджі є джерелом алкогольоксидази (АО) (КФ 1.1.3.13) – ферменту, який завдяки здатності in vitro окислювати первинні аліфатичні спирти, включаючи етанол, має велике біотехнологічне значення. У зв’язку з неспецифічністю дії АО проблема розробки нових методів аналізу, селективних до певного аналіту (метанолу, етанолу), залишається актуальною.

Кількісне визначення вмісту гліцеролу має важливе значення для технологічного контролю процесів бродіння та обстеженні людей на вміст тригліцеридів у крові. Існуючі на сьогодні аналітичні методи для визначення гліцеролу є досить дорогими та практично недосяжними для вітчизняного споживача. Розробка та впровадження аналітичних систем на основі гліцеролоксидази (ГО) дозволили б значно знизити собівартість аналізу вмісту гліцеролу. ГО – фермент, виділений у високоочищеному стані з цвільових грибів родів Aspergillus, Penicillium, Neurospora, з актиноміцетів [Uwajima et al., 1979; Uwajima et al., 1982; Lin et al., 1996], проте відповідний комерційний препарат ферменту відсутній на світовому ринку біотехнологічних продуктів. Тому пошук ефективного продуцента ГО та отримання препарату ферменту дозволить розробити та впровадити нові методи для аналізу гліцеролу, що сприятиме успішній діагностиці і лікуванню захворювань, розв’язувати проблеми контролю і регуляції біотехнологічних процесів.

Серед нових біоаналітичних систем особливого розвитку набули дослідження в області біоелектронних систем аналізу. Для їх впровадження в широку практику необхідні дослідження з конструювання біоелементів з оптимальними аналітичними параметрами, включаючи створення ензимних та мікробних сенсорних елементів з наперед заданими ензимологічними чи метаболічними характеристиками.

Одним із аспектів даної дисертаційної роботи є розробка нових ензиматичних та біосенсорних методів аналізу таких практично важливих аналітів, як етанол, метанол та формальдегід з використанням як аналітичного інструмента АО метилотрофних дріжджів.

Дана дисертаційна робота – результат досліджень, проведених автором на базі Інституту біології клітини НАН України, в якому одним із напрямків досліджень є пошук та генетичне конструювання мікробних продуцентів ферментів аналітичного призначення і розробка ензиматичних та біосенсорних підходів для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі молекулярної генетики та біотехнології Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України та завершена у відділі регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт Інституту біології клітини НАН України (бюджетна тема “Біотехнологічне отримання та функціональна характеристика білків, важливих для діагностики та лікування“ (шифр 2.2.9.15) за комплексною програмою “Фізіолого-біохімічні та молекулярно-генетичні основи функціонування живих систем і розробка принципів керування ними”; бюджетна тема “Вивчення механізмів біоасиміляції перехідних металів у неконвенційних дріжджів і створення на їх основі нових біоаналітичних методів” (шифр: 2.2.9.14); проекти “Розробка біо- та хемосенсорів для моніторингу загальної токсичності та окремих токсичних речовин у навколишньому середовищі” (шифр: 2.2.1.7), “Конструювання ферментних елементів біосенсорів на основі оксидоредуктаз для контролю вмісту лактату і етанолу в біологічних рідинах та бродильних культурах”, “Розробка нових біосенсорних та ензиматичних систем аналізу гліцерину в алкогольних напоях та визначення тригліцеридів у біологічних рідинах” за комплексною програмою фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій”).

Робота виконувалась також у рамках міжнародних наукових грантів INTAS (FOOD CALL 00-0715 “Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme electrodes and kits”, OPEN CALL 03-51-6278 “Novel biosensors and analysis kits based on genetically engineered biomolecules for formaldehyde assay” та NATO Linkage Grant LST.NUKR.CLG 980621 “Novel biological and chemical sensors for formaldehyde monitoring in wastewaters, foodstuffs and pharmaceuticals”.

Мета та завдання роботи. Метою роботи був скринінг мікробних продуцентів оксидаз аналітичного значення (алкогольоксидази та гліцеролоксидази), а також створення на основі алкогольоксидази нових ферментативних і біосенсорних методів аналізу етанолу, метанолу, формальдегіду.

Для виконання роботи необхідно було розв’язати такі завдання:

· розробити оптимальну схему виділення та очистки алкогольоксидази з мутантних клітин надпродуцента ферменту Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX), вирощених на глюкозі;

· отримати в препаративних кількостях гомогенний препарат алкогольоксидази H. polymorpha та провести його фізико-хімічну й ензимологічну характеристику;

· розробити нові ензиматичні підходи для аналізу етанолу, метанолу та формальдегіду з використанням алкогольоксидази H. polymorpha;

· порівняти аналітичні параметри розроблених методів аналізу та апробувати їх на модельних і реальних зразках;

· розробити біензимний амперометричний біосенсор для аналізу етанолу на основі алкогольоксидази і пероксидази з використанням синтетичних редокс-полімерів;

· провести скринінг штамів цвільових грибів за гліцеролоксидазною активністю;

· розробити оптимальну схему виділення та очистки гліцеролоксидази з відібраного продуцента ферменту;

· провести початкову структурну та ензимологічну характеристику гліцеролоксидази.

Об’єктом дослідження були оксидази метилотрофних дріжджів та цвільових грибів, що мають біоаналітичне значення.

Предметом дослідження була розробка методів виділення і очистки алкогольоксидази Hansenula polymorpha і гліцеролоксидази Botrytis allii, їх фізико-хімічна та ензимологічна характеристика, створення нових ензиматичних та біосенсорних аналітичних підходів для аналізу етанолу, метанолу і формальдегіду.

Методи дослідження: скринінг штамів-продуцентів оксидаз, культивування та руйнування клітин, спектрофотометричний аналіз активності ферментів, нативний та денатуруючий електрофорез білків, іонообмінна хроматографія, абсорбційна спектроскопія, спектроскопія кругового дихроїзму, ізоелектрофокусування, хімічні, ензиматичні та біосенсорні методи кількісного аналізу речовин, статистичний і кореляційний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату АО з мутантних клітин надпродуцента метилотрофних дріжджів H. polymorpha К-105 (gcr1 catX), вирощених на глюкозі.

Вивчено фізико-хімічні та ензимологічні характеристики АО з мутантних клітин H. рolymorpha.

Розроблено новий оксидазно-хімічний метод визначення етанолу шляхом супряження алкогольоксидазного перетворення аналіту до альдегіду з наступною його хімічною реакцією з 3-метил-2-бензотіазолінонгідразином (МБТГ).

Показано можливість використання МБТГ для хімічного маскування формальдегіду з метою забезпечення селективності оксидазного методу визначення метанолу у присутності формальдегіду.

Розроблено лабораторний прототип амперометричного біосенсора на основі високоочищеного препарату АО H. polymorpha і пероксидази хрону з використанням осмій- вмісного

полімерного медіатора та вивчено аналітичні характеристики біосенсора.

Проведено скринінг потенційних продуцентів ГО та відібрано кращий продуцент ферменту, розроблено схему виділення і очистки ГО зі штаму цвільового гриба B. аllii 100(5). Проведено початкову структурну та ензимологічну характеристику ГО B. allii.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена схема препаративного отримання АО з мутантних клітин метилотрофних дріжджів H. polymorpha використовується в технологічному процесі виготовлення аналітичного набору “Алкотест” в Інституті біології клітини НАН України.

Алкогольоксидазно-пероксидазний та оксидазно-хімічний методи кількісного аналізу етанолу у винах, виноматеріалах та зброджуваному суслі значно полегшують процедуру визначення алкоголю і можуть замінити використовувані у практиці вітчизняного виноробства денситометричні і рефрактометричні підходи.

Показано можливість використання розробленого оксидазно-хімічного методу для роздільного аналізу метанолу та формальдегіду за їх сумісної присутності у зразках стічних вод.

Розроблено лабораторний прототип амперометричного біосенсора для аналізу етанолу на основі високоочищеної АО H. polymorpha, пероксидази хрону та осмійвмісного медіатора і показано його придатність для визначення алкоголю у винах.

Розроблено схему препаративного отримання очищеного препарату ГО з B. allii.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені в дисертації, отримано здобувачем самостійно (розроблено оптимальну схему виділення та очистки АО з клітин Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX), яку отримано в препаративних кількостях у високоочищеному стані; розроблено нові ензиматичні підходи для аналізу етанолу, метанолу та формальдегіду з використанням АО H. polymorpha; проведено скринінг штамів цвільових грибів за гліцеролоксидазною активністю; розроблено схему виділення і очистки ГО з відібраного продуцента ферменту та проведено початкову структурну й ензимологічну характеристику ГО). За безпосередньої участі здобувача проводилося вивчення кінетичних параметрів та спектральних характеристик АО H. polymorpha у співпраці зі співробітниками лабораторії хімічної ензимології Інституту біохімії ім. Баха (м. Москва, Російська Федерація). Розробка лабораторного прототипу амперометричного біосенсора для аналізу етанолу за використання АО H. polymorpha та вивчення його аналітичних характеристик була проведена за співпраці зі співробітниками лабораторії аналітичної хімії та електросенсорики Рурського університету (м. Бохум, Німеччина).

У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано літературу за темою наукового дослідження. Планування, аналіз та обговорення результатів

досліджень проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були особисто представлені автором на XXI Міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Львів, Україна, 2001), на IV Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (Вроцлав, Польща, 2002), на Першому Українському Установчому з’їзді з клітинної біології (Львів, 2004), на Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), наукових конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України у 2000 - 2003 рр.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 наукових праць, у тому числі 6 статей у співавторстві, та тези 10 доповідей на міжнародних і українських наукових конференціях.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, аналіз і обговорення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 166 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 43 рисунками та 5 таблицями. Список літератури охоплює 194 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури аналізуються сучасні уявлення про таксономічне положення метилотрофних дріжджів, хімізм та ензимологію метилотрофного обміну, висвітлюється модель імпорту та збирання АО в клітинах H. polymorpha. Особлива увага приділена ензимологічній характеристиці та біотехнологічному використанню домінантного ферменту метилотрофних дріжджів – АО H. polymorpha, зокрема її застосуванню в ензиматичному та біосенсорному аналізі спиртів. Проведено аналіз літератури стосовно можливості синтезу деякими мікроорганізмами біотехнологічно важливого ферменту, необхідного для аналізу гліцеролу, – ГО, його виділенню та характеристиці.

Матеріали та методи дослідження. При виконанні роботи використовували безкаталазний штам метилотрофних дріжджів H. polymorpha К-105 (gcr1 catX) зі знятою катаболітною репресією синтезу АО, отриманий раніше в Інституті біології клітини НАН України, термотолерантні штами Saccharomyces cerevisiae, виділені з Еволюційних Каньйонів та передані професором Eviator Nevo (Institute of Evolution, University of Haifa, Ізраїль), штами цвільових грибів Botrytis allii 64, 100(5), 100(7), надані професором О.І. Нетруcовим (біологічний факультет МДУ ім. М.В. Ломоносова, Москва, Російська Федерація) та штами Aspergillus japonicus NRRL 359, NRRL 360, NRRL 1788, надані професором C.P. Kurtzman (Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit, Peoria, Illinois, США).

Клітини мутанта метилотрофних дріжджів H. polymorpha К-105 вирощували у мінеральному середовищi з 0,2 % дрiжджовим екстрактом "Дiфко" та 1 % (w/v) глюкозою до середини експоненційної фази росту. Клітини штамів S. сerevisiae вирощували у середовищі з 7 оБ суслом, а біомасу штамів цвільових грибів A. japonicus NRRL 359, NRRL 360, NRRL 1788 та B. allii 64, 100(5), 100(7) – у мінеральному середовищі з гліцеролом (60 г/л) та мелясою (2 г/л). Пермеабілізацію клітин проводили за використання цетилтриметиламоній броміду (1 мг/мл), що містив 1 мМ ЕДТА, на водянiй лазні при 30 оС при струшуванні упродовж 15 хв.

Високоочищений препарат АО одержували з безклітинного екстракту клітин H. polymorpha К-105 (gcr1 catX), який піддавали дробному фракціонуванню сульфатом амонію. У результаті отримували частково очищений препарат ферменту, який хроматографічно очищали за використання іонообмінної хроматографії на аніоніті DЕАЕ-Тоуеареаrl 650 М (TSK-Gel, Японія).

Препарат ГО одержували з безклітинного екстракту штама Botrytis allii 100(5), який далі очищали, використовуючи іонообмінну хроматографію на аніоніті DЕАЕ -Тоуеареаrl 650 М (TSK-Gel, Японія). Концентрацію білка визначали методом Лоурі. Питому активність ферментів виражали в мкмоль продукту, утвореного за 1 хв у перерахунку на 1 мг білка або сухої маси клітин (мкмольхв-1мг-1) за стандартних умов реакції. Білки розділяли у поліакриламідному гелі (ПААГ) на приладі АВГЕ-1 “Himifil” (Естонія) на пластинах для вертикального електрофорезу. Молекулярну масу субодиниць ГО визначали електрофоретично в ПААГ в присутності SDS за Лемлі з урахуванням лінійної залежності між відносною електрофоретичною рухливістю та логарифмом молекулярної маси білка. Кінетичні дослідження АО для метанолу, етанолу та формальдегіду проводили на приладі Bioanalytical System BAS-CV-50 (США), оснащеному кисневим електродом Кларка. Ізоелектричну точку АО визначали шляхом ізоелектрофокусування в ПААГ з амфолінами з використанням білкових стандартів. Спектр кругового дихроїзму АО отримували на спектрополяриметрі “Jasco”, модель J-715 (Токіо, Японія) при швидкості сканування 20 нм/хв і роздільній здатності 1,0 нм. Обрахунок параметрів спектра кругового дихроїзму АО здійснювали за використання програми “Protein-CD” (Москва, РФ).

Визначення вмісту етанолу проводили алкогольдегідрогеназним (АДГ) методом згідно з інструкцією фірми “Boehringer Mannheim” [Boehringer Mannheim, 1995], оксидазно-пероксидазним (АОП) методом за використання набору “Алкотест” [Гончар і співавт., 1994]. Аналіз формальдегіду в дослідних зразках проводили хімічними методами: за Нешом [Nash, 1953], з використанням 4-аміно-5-гідразино-3-меркапто-1,2,4-тріазолу [Avigad, 1983], МБТГ [Paz et al., 1965], хромотропової кислоти [Polska norma PN-71 C-04568, 1988, Лурье и др., 1974] та АОП-методом. Аналіз метанолу у дослідних зразках проводили газохроматогафічним методом, з використанням перманганату як окисника і хромотропової кислоти як реагента на продукт окислення метанолу – формальдегід [Polska norma PN-71 C-04568, 1988, Лурье и др., 1974], а також оксидазно-хімічним (ОХ) методом з використанням МБТГ.

Алкогольоксидазно-пероксидазний біосенсор конструювали на базі стандартного амперометричного потенціостату за використання трьох електродів: срібло-хлорсрібного електроду порівняння Ag/AgCl/KCl(3 M), допоміжного та робочого графітового електродів. Імобілізацію ферментів на поверхні робочого електроду проводили шляхом електроосадження в шарі полімерів, синтезованих в лабораторії аналітичної хімії та електросенсорики Рурського університету (м. Бохум, ФРН) [Gaspar et al., 2000]: пероксидазу – в шарі анодного Os-місного полімеру АP59-Os, АО – в шарі катодного полімеру CP59. Амперометричні дослідження проводилися за допомогою біпотенціостату (EP 30, Biometra, Геттінген, ФРН), з’єднаного з персональним комп’ютером для реєстрації та обробки результатів.

Графічну та статичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою програм Origin 6,0 та Excel.

Результати досліджень та їх обговорення

Отримання високоочищеного препарату АО з метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, його ензимологічна і фізико-хімічна характеристика. Високоочищений препарат АО було виділено з безкаталазного мутанта метилотрофних дріжджів H. polymorpha К-105 (gcr1 catX) з порушеною глюкозною катаболітною репресією і конститутивним типом синтезу цільового ферменту шляхом двостадійного фракціонування безклітинного екстракту сульфатом амонію та іонообмінною хроматографією на аніоніті DЕАЕ-Toyopearl 650 M (табл.1).

Таблиця 1

Характеристика препаративного виділення та очищення АО з клітин мутантного штаму Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX). Позначення: СА – сульфат амонію.

Вирощування клітин | Вихід клітин з

1 л культури, г

3,0 | Питома активність АО, мкмольхв-1мг-1 | Сумарний вихід АО, од. акт. (%)

1,1 | 3300 (100 %)

Руйнування клітин | Білок в екстракті, мг

825 |

3,0 |

2475 (75 %)

Фракціонування СА |

Білок в осаді 30-60 % від насич. СА, мг

350 | 5,0 | 1750 (53 %)

Хроматографія на DЕАЕ- Toyopearl 650 M | Кількість білка, мг

36 |

23 |

828 (25 %)

Отриманий препарат АО був гомогенним за результатами електрофоретичного аналізу (рис. 1) і володів питомою активністю 23 мкмольхв-1мг-1 білка. Цей препарат ферменту послужив для визначення кінетичних параметрів та ізоелектричної точки, отримання спектрів поглинання та спектру кругового дихроїзму АО.

Рис. 1. Електрофореграми різних препаратів алкогольоксидази штаму метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha K-105 (gcr1 catX) після SDS-(A) і нативного (Б) електрофорезу в 10 % і 6 % ПААГ, відповідно: А) 1 – білкові стандарти; 2 – комерційний препарат АО Pichia pastoris; 3 – безклітинний екстракт; 4 – препарат АО після двоетапного осадження СА; 5 – препарат АО після іонообмінної хроматографії на DЕАЕ-Toyopearl 650 M; Б) 1 – безклітинний екстракт; 2 – препарат АО після двоетапного осадження СА; 3 – препарат АО після іонообмінної хроматографії на DЕАЕ-Toyopearl 650 M; 4 – комерційний препарат АО P. pastoris.

Визначення величин константи Міхаеліса-Ментен (Км) алкогольоксидази для метанолу, етанолу та формальдегіду методом подвійних обернених величин показало, що Км АО для метанолу складає 0,58 мМ, етанолу – 4,86 мМ, формальдегіду – 9,36 мМ (рис. 2).

Визначено ізоелектричну точку (рІ) АО H. polymorpha, яка рівна 6,2. Ця величина дуже близька до рІ, визначеної на основі комп’ютерного аналізу структурного гена АО H. polymorpha (рІ 5,90), що дозволяє припускати про відсутність посттрансляційної модифікації білка АО у клітинах, вирощених на глюкозі.

Рис. 2. Графіки залежності швидкості ферментативної реакції, каталізованої алкогольоксидазою, від концентрації метанолу (А), етанолу (Б), формальдегіду (В).

Спектри поглинання АО в діапазоні хвиль 300 – 700 нм отримували для нативної форми ферменту та його комплексу з азидом натрію. Встановлено, що нативний фермент у видимому спектрі має максимуми поглинання при 388 нм і 453 нм, що характерно для алкогольоксидаз метилотрофних дріжджів [Sahm et al., 1973, Tani et al., 1972]. Для азидного комплексу АО максимуми поглинання зміщуються і виявляються при 367 і 450 нм. До того, реєструється ще один пік при 481 нм. На основі спектрів кругового дихроїзму АО встановлено, що вторинна структура АО характеризується наявністю таких мотивів вторинної структури: ?-H (б-?піраль) – 41,0 %; ?-A (в-?нтипаралельні складки) – 5,0; ?-P (в-?аралельні складки) – 4,0; ?-T (в-?гин) – 11,0; Coil (“котушка”) – 7,0; T1 (?-згин типу T1) – 4,0; PP (згин типу S) – 21,0.

Розробка ферментативних фотометричних методів за використання алкогольоксидази H. polymorpha. Препарат АО H. polymorpha з питомою активністю 5 мкмольхв-1мг-1 білка (див. табл. 1) було використано для розробки фотометричних методів ензиматичного аналізу етанолу, метанолу, формальдегіду та їх сумішей. Нами вивчено можливість використання оксидазно-пероксидазного методу із використанням набору “Алкотест” для аналізу етанолу у пиві, винах, міцних алкогольних напоях. Як видно з рис. 3, АОП-метод визначення вмісту етанолу в алкогольних напоях дав хорошу кореляцію з результатами АДГ-методу: відношення останніх до даних АОП-методу склало в середньому 0,91970,012; R = 0,9983; p0,0001.

Рис. 3. Кореляція між результатами визначення вмісту етанолу в алкогольних напоях двома ферментативними методами: оксидазно-пероксидазним за допомогою набору “Алкотест” і алкогольдегідрогеназним (АДГ).

Ензиматичний набір “Алкотест” був апробований нами і для контролю вмісту алкоголю в зброджуваному суслі та виноматеріалах. Для оцінки надійності АОП-методу було проведено порівняння останнього з методами, які традиційно використовуються у виноробстві, а саме, з рефрактометричним і ареометричним (денситометричним) підходами. Як видно з рис. 4, результати порівнюваних методів добре узгоджуються між собою: коефіцієнти кореляції складають 0,9595 при p0,0001 для ензиматичного і рефрактометричного методів і 0,9384 при p0,0001 для ензиматичного і ареометричного методів.

Отже, АОП-метод з використанням ензиматичного набору “Алкотест” дозволяє з високою

надійністю проводити визначення вмісту етанолу у зброджуваному суслі, виноматеріалах і винах при розведеннях у 2000 і більше разів. Крім того, використання набору дозволяє суттєво полегшити процедуру аналізу етанолу у виноробстві, скорочуючи його час і трудоємність.

Рис. 4. Кореляційна залежність між результатами визначення вмісту етанолу у винах і зброджуваному суслі алкогольоксидазно-пероксидазним методом за використання набору „Алкотест” і стандартними методами (А – рефрактометрія; Б – денситометрія).

На наступному етапі роботи вивчалась можливість заміни пероксидазної реакції при аналізі етанолу на хімічну взаємодію 3-метил-2-бензотіазолінонгідразину (МБТГ) з ацетальдегідом – продуктом оксидазного окислення етанолу – в присутності іонів Fe (III):

СН3СН2ОН + О2 СН3СНО + Н2О2

СН3СНО + МВТГ Азин Ціаніновий барвник.

(max = 350 нм) (max = 670 нм)

Оксидазно-хімічна реакція протікає у два етапи: 1) утворення ацетальдегіду в ензиматичній реакції і зв’язування його в азин гідразонової природи; 2) формування забарвленого кінцевого ціанінового продукту при додаванні хлориду заліза (ІІІ) у кислому середовищі.

Чутливість визначення етанолу ОХ-методом у режимі “фіксованого часу реакції” в його пороговому вираженні (при оптичній густині близько 0,05) дорівнює 4,33 нмоль (0,20 мкг) етанолу в 1 мл фотометрованої суміші в умовах неповної (25 %-ної) конверсії аналіту. Лінійність калібрувальної кривої витримується до оптичної густини 0,7, що відповідає 62 нмоль (2,84 мкг) етанолу в 1 мл фотометрованої суміші. Така чутливість дозволяє тестувати юридично допустимий вміст етанолу (0,5 г/л) у сироватці крові людини, вміст алкоголю у бродильних рідинах при великих розведеннях, що виключає інтерферуючий вплив кетосполук аналізованих зразків (пірувату – у випадку крові, ацетальдегіду і кетокислот – у випадку вин і сусла).

Розроблений ОХ-метод показав високу схожість при порівнянні його аналітичних параметрів з референтними методами: АДГ-методом [Boehringer Mannheim, 1995] та АОП-методом при аналізі вмісту етанолу в алкогольних напоях. Кореляційний зв’язок між результатами тестованого і референтними методами має достовірно лінійний характер (рис. 5). Відповідні коефіцієнти кореляції між результатами тестованого методу порівняно з АДГ- та АОП-методами вищі 0,99 при високій достовірності таких зв’язків (р<0,0001). Відтворювальність результатів аналізу ОХ-методом достатньо висока: коефіцієнт варіації складає 1-5 %.

Рис. 5. Кореляційний зв’язок між результатами визначення вмісту етанолу в алкогольних напоях трьома методами: алкогольдегідрогеназним (АДГ); оксидазно-хімічним; оксидазно-пероксидазним методом (АОП) з використанням набору „Алкотест”. На осях відкладено показники вмісту етанолу в напоях, в г/л.

Приведений аналіз результатів дослідження свідчить про придатність розробленого ОХ-методу для аналізу етанолу в алкогольних напоях, який за багатьма параметрами не поступається АОП-методу: новий метод дає високу чутливість, хорошу лінійність калібрувальної кривої, точність та відтворювальність при паралельних вимірах.

Розроблений ОХ-метод аналізу етанолу був використаний нами для тестування бродильної активності природних термотолерантних штамів S. cerevisiae. Такі штами можуть мати потенційне біотехнологічне значення для здійснення спиртового бродіння при вищій за 30 оС температурі. Показано (рис. 6), що серед досліджених штамів найкращою етанолутворюючою активністю при 42 оС володіє штам 26, який може бути перспективним для спиртовиробництва.

Розроблений ОХ-метод визначення вмісту етанолу у бродильних культурах нами пропонується для швидкого скринінгу штамів дріжджів за їх етанолутворюючою активністю, що важливо для селекції та контролю якості промислових штамів у заводських лабораторіях.

Нами вивчено можливість використання АОП-методу для аналізу формальдегіду. Теоретична можливість такого підходу ґрунтується на властивості формальдегіду переходити у водних

Рис. 6. Зброджувальна активність штамів S. cerevisiae: А) продукція етанолу при зброджуванні 10 % глюкози при 42оС, 40 год; Б) бродильна продуктивність, 10 % глюкоза, 42 оС, 40 год; колонка (?) – клітини, попередньо вирощені при 30 оС; колонка ( ) – клітини, попередньо вирощені при 42 0С. Позначення: Е8, 26N, 42N, 1N – штами з різних каньйонів („Е” – з Каньйону Nahal Oren, „N” – з Каньйону Wadi Keziv), контроль – контрольний штам промислових пекарських дріжджів „Ензим”.

розчинах у гідратовану форму (на 95-99 %), яка структурно нагадує метанол і здатна окислюватись АО з утворенням форміату та пероксиду водню за реакціями [Kirk-Othmer et al., 1993, Hagemeyer, 1991]:

CH2O + H2O HOCH2OH

HOCH2OH + O2 HCOOH + H2O2.

Лінійність калібрувальної кривої для аналізу формальдегіду зберігається до концентрації 0,125 мМ. При цьому аналіз відбувається за схемою неповної реакції з фіксованим часом інкубації, що забезпечує приблизно 7 – 10 %-ну конверсію формальдегіду як аналіту. Режим “плато”, з практично повним окисленням альдегіду, досягається при 5-кратному збільшенні концентрації ферментів в реакційній суміші порівняно зі стандартною методикою. За цих умов лінійність зберігається до концентрації формальдегіду 15 мкМ, а порогова чутливість методу складає 0,75 нмоль формальдегіду в 1 мл реакційної суміші. Останній режим аналізу ферментозатратніший, проте у 10 разів чутливіший. Аналіз у режимі “фіксованого часу” як економніший, можна рекомендувати для масового скринінгу проб на вміст формальдегіду.

Порівняння аналітичних параметрів АОП-методу з хімічними, зокрема за Нешом [Nash, 1953] та з використанням реагенту 4-аміно-3-гідразино-5-меркапто-1,2,4-тріазолу (“Пурпальд”) показало (рис. 7), що найбільш чутливим є ферментативний метод, близький до нього – хімічний метод з

використанням “Пурпальду”. Найменш чутливим є метод Неша.

Рис. 7. Порівняльний аналіз трьох методів визначення формальдегіду: АОП, з використанням реактиву “Пурпальд” та методу Неша. Нахил калібрувальних прямих характеризує чутливість методів;

R – коефіцієнт лінійної регресії.

Для роздільного аналізу метанолу і формальдегіду нами розроблено оксидазно-хімічний метод за використання АО і альдегід-селективного реагенту МВТГ. У даному підході АО служить для окислення метанолу до формальдегіду, а роль МВТГ у пропонованому методі двояка. На першій стадії реакції (нейтральне середовище) МБТГ утворює стабільний безбарвний гідразоновий аддукт (азин) із формальдегідом – як предіснуючим, так і генерованим у процесі ензиматичного окислення метанолу, що запобігає подальшому окисленню формальдегіду АО. На другій стадії реакції відбувається неензиматичне окислення формальдегід-МБТГ-гідразонового комплексу до кольорового продукту – ціанінового барвника тетраазопентаметинового ряду під дією іонів заліза(ІІІ) в кислому середовищі. Таким чином, залежно від стадії, МВТГ служить „маскуючим агентом” для формальдегіду, і реагентом на цей аналіт у наступній колориметричній реакції. Cлушність такого підходу була підтверджена при аналізі модельних сумішей із різним вмістом метанолу і формальдегіду (сумарна концентрація аналітів – 10 мкМ) без внесення АО та при додаванні ферменту у присутності МБТГ. Як видно з рис. 8, при відсутності АО немає впливу зростаючих концентрацій метанолу на результати визначення вмісту формальдегіду (крива А). Крім того, при внесенні АО спостерігається практично однаковий рівень оптичної

Рис. 8. Залежність оптичної густини від вмісту формальдегіду/метанолу (у мольних відсотках) в пробах за використання оксидазно-хімічного методу аналізу: А – за відсутності АО; Б – при внесенні АО.

густини для суміші обох аналітів при різному їх мольному співвідношенні, але однаковій сумарній концентрації (крива Б), що свідчить про повну аддитивність величин оптичної густини, зумовленої наявним формальдегідом та утворюваним з метанолу в процесі оксидазної реакції.

Розроблений ОХ-метод було використано для аналізу вмісту формальдегіду та метанолу у реальних зразках. Результати ОХ-методу добре узгоджуються з результатами двох референтних підходів (коефіцієнти кореляції між результатами визначення формальдегіду оксидазно-хімічним та хімічним методами складає 0,9974, а між результатами визначення метанолу ОХ-методом та газо-рідинною хроматорафією – 0,9456.

Розробка амперометричних біосенсорів на основі АО. Для конструювання амперометричного біосенсора для аналізу етанолу було використано препарат АО H. polymorpha з активністю 23 мкмоль·хв-1·мг-1 білка (див. табл. 1) та пероксидазу хрону. Амперометричні біосенсори конструювали у трьохелектродній конфігурації. Електродом порівняння служив срібло-хлорсрібний Ag/AgCl/3М KCl електрод, допоміжним – платиновий, а робочий електрод формувався на основі графітового стержня (тип RW001, діаметр 3,05 мм). Матрицею для електроосадження ферментів і хімічної „прививки” осмієвого медіатора служили так звані катодні та анодні полімери, синтезовані в лабораторії аналітичної хімії та електросенсорики Рурського університету (м. Бохум, Німеччина) [Gaspar et al., 2000]. Сконструйований біосенсор мав біензимну архітектуру селективного елемента, яка включала два ферментовмісні шари: 1) перший (глибинний) шар містив пероксидазу хрону, інтегровану шляхом електроосадження в Os-вмісний анодний полімер Os-AP59; 2) другий (поверхневий) шар був сформований електроосадженням АО у присутності катодного полімеру CP9. Така структура біоелемента забезпечувала ефективне перенесення електронів з поверхні електроду на окислений активний центр пероксидази за посередництва Os-вмісного редокс-полімеру, зменшуючи імовірність ушкодження АО пероксидом водню. Встановлено (рис. 9), що позірна константа Міхаеліса-Ментен (KM) для етанолу складає 1,94±0,37 мМ, яка дещо відрізняється від величини KM=2,7 мМ, розрахованої для АО в розчині [Woodward et al., 1990] і 4,86 мМ, визначеної нами (див. рис. 2). Швидкість розвитку сенсорного відгуку є високою. Так, 95% від стаціонарного рівня сигналу досягається за 45 с при концентрації етанолу 4 мМ.

При дослідженні специфічності розробленого біосенсора встановлено, що він дає сигнал на первинні спирти – етанол, метанол, н-пропанол, н-бутанол, і на формальдегід, причому чутливість до них падає в ряду: метанол>етанол>н-пропанол>формальдегід>н-бутанол.

Сконструйований біосенсор характеризувався високою операційною стабільністю (константа інактивації сенсора рівна 6,1x10-4 хв-1 ) та стабільністю при зберіганні: при 50 %-ному зниженні сигналу на 7-у добу, сенсорний відгук практично залишався незмінним упродовж більш як 16

наступних днів.

Рис. 9. Динаміка зміни сенсорного сигналу в процесі внесення етанолу та калібрувальна крива для біензимного сенсора з архітектурою HRP/Os-AP59//AO/CP59 на основі графітового електроду (діаметр 3,05 мм). Робочий потенціал: -50 мВ (проти срібло-хлорсрібного електроду).

Надійність та можливість практичного використання сконструйованого біосенсора вивчалась на зразках вин, виготовлених виноробним об’єднанням „Магарач”, у комбінації з методом „повторного додавання стандарту”. Як видно з табл. 2, спостерігалась хороша кореляція між результатами біосенсорного методу аналізу та двох референтних методів.

Таблиця 2

Визначення вмісту етанолу у винах різними методами.

Вина виробництва “Магарач” | Вміст етанолу (об’ємний %)

Біензимний сенсор | Газо-рідинна хроматографія | Оксидазно-пероксидазний метод

„Каберне-Совіньон” (червоне) | 12,5 ± 1,4 | 11,4 | 10,8 ± 1.6

„Шардоне” (біле)” | 10,6 ± 0,4 | 10,9 | 10,8 ± 1.1

„Херес”(біле) | 16,8 ± 0,9 | 18,6 | 18,2 ± 4.3

Скринінг штамів продуцентів, очищення та первинна характеристика ГО цвільових грибів. Проведено скринінг потенційних продуцентів ГО – штамів цвільових грибів Aspergillus japonicus і Botrytis allii на середовищі з гліцеролом як джерелом вуглецю. Встановлено (рис. 10), що штам B. allii 100(5) володіє найвищою питомою активністю ферменту у безклітинних екстрактах, і тому був обраний для виділення ГО.

Виділення і очистку ГО з безклітинного екстракту B. allii 100(5) проводили одностадійно – шляхом іонообмінної хроматографії на аніоніті DЕАЕ-Toyopearl 650M (TSK-Gel, Японія), оскільки використання дробного фракціонування безклітинного екстракту сульфатом амонію чи двостадійного осадження ацетоном не призводило до підвищення питомої активності цільового ферменту. У результаті отримали препарат ферменту з активністю 0,4 мкмольхв-1мг-1 білка.

При визначенні молекулярної маси ГО електрофоретичним аналізом очищеного ферменту в

ПААГ, виявили дві білкові зони з молекулярною масою 76,2 та 63,7 кДа (p<0,02), що добре узгоджується з даними літератури про димерну природу ферменту, наприклад, ГО A. japonicus має дві субодиниці молекулярною масою 85,0 і 65,8 кДа [Uwajima et al., 1982].

При вивченні субстратної специфічності ГО B. allii встановлено, що за присутності у реакційній суміші споріднених до гліцеролу субстратів – етиленгліколю, етанолу чи метанолу, позитивна реакція не розвивалася.

ВИСНОВКИ

У результаті комплексу експериментальних робіт проведено скринінг продуцентів гліцеролоксидази, виділено та охарактеризовано оксидази біоаналітичного значення: алкогольоксидазу з мутантного штаму метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha і гліцеролоксидазу із цвільового гриба Botrytis allii; створено нові ензиматичні та біосенсорні аналітичні підходи для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах з використанням алкогольоксидази.

Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Розроблено оптимальну схему виділення високоочищеного препарату алкогольоксидази (з питомою активністю понад 23 мкмоль·хв-1·мг-1) з клітин надпродуцента ферменту – мутанта термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX).

2. Проведено фізико-хімічну, структурну та ензимологічну характеристику виділеної алкогольоксидази: визначено ізоелектричну точку (рІ=6,2); отримано спектри поглинання та спектри кругового дихроїзму; розраховано вміст окремих структурних мотивів вторинної структури білка; визначено кінетичні параметри ферменту відносно основних субстратів.

3. Розроблено протоколи алкогольоксидазно-пероксидазного методу аналізу, адаптовані для визначення вмісту аналітів у реальних зразках: етанолу (для алкогольних напоїв, виноматеріалів та бродильних культур) і формальдегіду (для харчових продуктів).

4. Розроблено новий ензиматично-хімічний метод одночасного визначення метанолу та формальдегіду в їх сумішах за використання алкогольоксидази та 3-метил-2-бензотіазолінонгідразину і показано придатність цього підходу для аналізу реальних зразків (стічних вод, формаліну).

5. На основі алкогольоксидази метилотрофних дріжджів та пероксидази сконструйовано біензимний амперометричний біосенсор для кількісного визначення етанолу, який, завдяки використанню оригінальної схеми електроосадження ферментів і опосередкування електронного переносу через осмій-вмісний редокс-полімер, має високу операційну стабільність (понад 1000 аналізів) та високу чутливість (до 0,2 мкА/мМ).

6. Проведено скринінг штамів цвільових грибів за здатністю до синтезу гліцеролоксидази, відібрано кращий продуцент ферменту – Botrytis allii 100(5). Виділено гліцеролоксидазу із клітин B. allii та проведено початкову структурну та ензимологічну характеристику ферменту.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Gonchar M.V., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Sibirny A.A. A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages // Food Technol. Biotechnol. - 2001. - Vol. 39, № 1. - P. 37 - 42. (Дисертант брала участь у препаративному отриманні ферменту, провела його електрофоретичний аналіз).

2. Павлішко Г. М., Майдан М. М., Гончар М. В., Сибірний А. А. Новий оксидазний метод визначення лактату // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 2. - С. 134 - 139. (Дисертант провела експерименти по розробці оксидазно-хімічного методу визначення аналіту із заміною пероксидазної реакції на хімічну з використанням МБТГ, який був використаний і для аналізу інших аналітів).

3. Gonchar M., Maidan M., Pavlishkо H., Sibirny A. Assay of ethanol in human serum and blood by the use of a new oxidase-peroxidase based kit // Bісник Львівського університету. - Серія біологічна. - 2002. - Вип. 31. - С. 22 - 27. (Дисертант отримала препарат алкогольоксидази та брала участь у визначенні оптимального складу діагностичного набору).

4. Павлішко Г.М., Гончар Т.М., Гончар М.В. Хімічний та ензиматичний аналіз вмісту формальдегіду у рибних продуктах // Експ. клін. фізіол. біохім. - 2003. - № 4. - С. 56 - 63. (Дисертант отримала препарат алкогольоксидази та провела порівняння аналітичних параметрів різних методів визначення формальдегіду).

5. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар M. Алкогольоксидаза та її біоаналітичне використання // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 3 - 22. (Дисертант особисто опрацювала дані літератури та взяла участь у написанні огляду).

6. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар M. Скринінг штамів продуцентів, очищення та первинна

характеристика гліцеролоксидази із цвільових грибів // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 38. - С. 67 - 73. (Дисертант здійснила скринінг цвільових грибів, провела очистку гліцеролоксидази та вивчила вплив різних речовин на стабільність ферменту).

7. Gonchar M.V., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Sibirny A.A. Bioanalytical applications of metabolically engineered strains of methylotrophic yeasts // Abs. Bio-Forum II. “Polish Biobusiness as a Parther of international Enterprises” (May 10-11, 2001, Lodz, Poland). - P. 99-101.

8. Sibirny V.A., Maidan M.M., Pavlishko H.M., Stasyk O.G., Smutok O.V, Stel’mashchuk S., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Bioanalytical application of ezymes from methylotrophic yeasts // Abs. of 21st International Specialized Symposium on Yeasts (August 21-25, 2001, Lviv, Ukraine). - P. 84.

9. Gayda G.Z., Smutok O.V., Pavlishko H.M., Gonchar M.V. Regulation of synthesis, isolation and bioanalytical application of L-lactate cytochrome c oxidoreductase (flavocytochrome b2) from thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // Abs. 4th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (September 15-17, 2002, Wroclaw, Poland). - P. 84.

10. Павлішко Г.М., Смуток О.В., Гайда Г.З., Гончар М.В. Нові оксидазні методи аналізу етанолу, метанолу, формальдегіду та лактату // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції "БІОХІМІЯ” (21-25 квітня 2003 р., Дніпропетровськ). - 2003.