МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

ДНІПРОПЕТРОВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Пищур Іван Миколайович

УДК 579.26:631.521.54/632.95

“Екологічні особливості інтродукції ПРЕДСТАВНИКІВ МІКРОБОЦЕНОЗУ (pAENiBacillus та Enterobacter) в кореневу СИСТЕМУ культурних рослин в умовах застосування пестицидів”

03.00.16 – екологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Дніпропетровськ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук, м. Чернігів

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор, КАНІВЕЦЬ Віктор Іванович, Чернігівський державний інститут економіки і управління Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри аграрних технологій

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник, ШЕРСТОБОЄВА Олена Володимирівна, Інститут агроекології та біотехнології УААН (м. Київ), завідувач відділу моніторингу та біотехнології мікроорганізмів і вірусів;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, ЧОРНОБАЙ Юрій Миколайович, Державний природознавчий музей НАНУ (м. Львів), директор

Провідна установа: Інститут землеробства УААН, лабораторія ґрунтової мікробіології (смт. Чабани, Києво-Святошинський район, Київської області)

Захист відбудеться 21.10.2005 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 08.804.02 при Дніпропетровському державному аграрному університеті за адресою: 49600, м. Дніпропетровськ 27, вул. Ворошилова, 25, корпус 1, конференц-зал (ауд. 342)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Дніпропетровського державного аграрного університету за адресою: 49600, м. Дніпропетровськ 27, вул. Ворошилова, 25.

Автореферат розісланий 19.09.2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

Мицик О.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З метою підвищення продуктивності землеробства та поліпшення екологічного стану довкілля проводять передпосівну бактеризацію насіння культурних рослин відселекційонованими штамами азотфіксуючих та фосфатмобілізуючих бактерій. Бактеризація дозволяє, зокрема, зменшити дози мінеральних добрив, що відповідає екологічній ідеології. Але в сучасних агротехнологіях обов’язковим заходом є протруєння насіння, що гарантує захист проростків і сходів від хвороб та шкідників. В таких умовах ефективність бактеризації ставиться під сумнів у зв’язку з можливим негативним впливом пестицидів на інокулянт.

В Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН створені бактеріальні препарати альбобактерин та поліміксобактерин, на основі фосфатмобілізуючих бактерій Achromobacter album 1122 і Paenibacіllus polymyxa KB, застосування яких можна поєднувати з протруєнням насіння високоефективними фунгіцидами та інсектицидами [Токмакова Л.Н. та ін., 1997]. Авторами розроблено технологію завчасної інокуляції насіння буряків цукрових цими мікроорганізмами на насіннєвих заводах. Клітини названих культур тривалий час зберігаються на протруєному насінні, оскільки дія пестицидів селективна і спрямована на знищення фітопатогенних грибів та комплексу наземних та ґрунтових шкідників. Та, в цілому, залишається невирішеною ціла низка питань. Зокрема, не вивчені межі неспецифічної дії пестицидів на бактерії, резистентність окремих таксономічних груп мікроорганізмів і відомих агрономічно цінних штамів азотфіксуючих та фосфатмобілізуючих бактерій. Не вивчений вплив на бактерії нових видів протруйників. Недостатніми є дослідження щодо оптимізації умов тривалого зберігання бактерій-інокулянтів на протруєному насінні, характеру впливу пестицидів на приживання інокулянта в ризосфері рослин, не помітно цілеспрямованого пошуку нових резистентних до пестицидів штамів бактерій та не розглядається питання поширеності таких бактерій в природі. Отже, вивчення можливостей і розробка умов поєднання протруєння насіння з бактеризацією є актуальним завданням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках наукової тематики Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН згідно завдання "Розробити систему раціонального використання біопрепаратів фосфатмобілізуючих мікроорганізмів як основи сталого розвитку агроекологічних систем та встановити параметри мікробіологічної активності ґрунтів, що забезпечують екологічно безпечне застосування хіміко-техногенних факторів в інтенсивних системах землеробства і умовах обмеженого ресурсного забезпечення", яке виконувалося в 1996-2000 роках (номер державної реєстрації 0199U003798); згідно завдання Міністерства аграрної політики України: "Розроблення системи застосування біопрепаратів комплексної дії, як основи сталого розвитку сільськогосподарського виробництва в умовах обмеженого ресурсозабезпечення" (номер державної реєстрації 0100U006722), яке виконувалося в 2000-2003 роках; згідно завдання Інституту землеробства УААН за № 140/3. "Розробити високоефективні технології застосування мікробних препаратів у відновлювальних ресурсозберігаючих системах землеробства" за НТП “Родючість ґрунтів”, що виконувалося в 1996-2000 роках (номер державної реєстрації 0196U018391).

Мета роботи – обґрунтувати можливості і умови поєднаного застосування бактеріальних препаратів і протруєння насіння, як основи для широкого впровадження у виробництво екологічно безпечних бактеріальних добрив. Виділити нові резистентні до пестицидів і перспективні штами бактерій для виробництва біологічних екологічно безпечних препаратів.

Для досягнення цієї мети вирішували такі завдання:

· | дослідити дію сучасних пестицидів, які застосовуються для протруєння насіння буряків цукрових та колосових культур, на культурально-морфологічні і агрономічно важливі фізіолого-біохімічні властивості бактеріального інокулюма;

· | вивчити динаміку зберігання життєздатності бактеріального інокулянта на протруєному насінні і роль при цьому адгезивно-активних речовин;

· | вивчити вплив протруйників на приживання інокулянта в ризосфері та розвиток основних еколого-трофічних груп бактерій ризосфери, як біологічного індикатора екологічного стану ґрунту;

· | визначити потенційну активність азотфіксації на корінні ячменю ярого при сумісному застосуванні бактеріального препарату і протруйників насіння;

· | визначити кількісний і якісний склад бактерій-епіфітів, які знаходяться на протруєному насінні буряків цукрових;

· | виділити нові резистентні до пестицидів агрономічно-цінні штами бактерій;

· | провести енергетичну та економічну оцінку ефективності агрозаходів з поєднання бактеризації насіння і його протруєння, та обґрунтувати екологічну доцільність поєднання цих операцій.

Об'єкти досліджень: взаємодія протруйників насіння та біоагентів бактеріальних препаратів та поєднаний їх вплив на урожайність культурних рослин (Beta vulgaris L.v. saccharifera, Hordeum distichum L.v.).

Предмети досліджень: вплив протруйників насіння буряків цукрових та ячменю в технологічних умовах на агрономічно цінні властивості штамів бактерій, що є біоагентами препаратів, зокрема, на Paenibacіllus polymyxa KB (біопрепарат поліміксобактерин), Achromobacter album 1122 (біопрепарат альбобактерин), Azotobacter chroococcum M-70 (біопрепарат БПА), Azotobacter vіnelandіі M-X (біопрепарат БПА), Agrobacterіum radіobacter 204 (біопрепарат діазофіт), Enterobacter aerogenes 30Ф (біопрепарат ризоентерин), Flavobacterіum sp. Л-30 (біопрепарат флавобактерин); культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні властивості штамів бактерій, виділених із протруєного насіння; динаміка чисельності основних еколого-трофічних груп мікроорганізмів в ризосфері буряків цукрових і ячменю ярого під впливом інокуляції цих рослин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше експериментально і теоретично обґрунтовано можливість і умови поєднання бактеризації і протруєння насіння. Встановлено, що штами бактерій Paenibacіllus polymyxa КВ, Achromobacter album 1122 не втрачають життєздатності й агрономічно-цінних властивостей в присутності надвисоких (технологічних) концентрацій пестицидів гаучо і тачигарен протягом місяця і більше; штами бактерій Azotobacter chroococcum M-70 та Azotobacter vіnelandіі M-X не втрачають життєздатності й агрономічно-цінних властивостей в присутності пестицидів адіфур і гаучо протягом місяця і більше; штам бактерій Enterobacter aerogenes 30Ф зберігає життєздатність й агрономічно-цінні властивості в присутності фунгіцидів раксил, вінцит, фундазол протягом місяця і більше.

Встановлено, що резистентні до дії пестицидів адіфур, гаучо, тачигарен, раксил, вінцит, фундазол штами бактерій (Paenibacіllus polymyxa КВ, Achromobacter album 1122, Azotobacter chroococcum M-70, Azotobacter vіnelandіі M-X, Enterobacter aerogenes 30Ф) зберігають високу чисельність життєздатних клітин на насінні буряків цукрових та ячменю впродовж 3-5 місяців.

Інсектициди адіфур і гаучо, фунгіцид тачигарен не суттєво впливають на розвиток ґрунтових фосфатмобілізуючих мікроорганізмів, та на клітини інокулянту в ризосфері. Виключенням є фунгіцид сульфокарбатіон, який тимчасово впливає негативно на фосфатмобілізуючі мікроорганізми в цілому, та інтродуковані бактерії, зокрема.

Вперше показано, що насіння буряків цукрових несе на собі різноманітну і чисельну бактеріальну мікрофлору. Визначено її таксономічний склад.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літературних джерел, розроблення програми досліджень, проведення польових та лабораторних дослідів, статистична обробка експериментальних даних, їх аналіз та теоретичне узагальнення отриманих результатів виконані дисертантом особисто, або при його безпосередній участі. В проведенні досліджень, їх узагальненні, доля автора складає близько 80 %.

Апробація роботи. Результати досліджень щорічно доповідалися й обговорювалися на звітних сесіях Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (1999-2002 рр.), на науково-практичному семінарі молодих вчених "Вчимося господарювати" (м. Київ-Чабани, 1999), конференції молодих вчених ІСГМ (Чернігів, 1999), на ІІ установчому з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), конференції "Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм" (Тернопіль, 2001), на конкурсі робіт молодих вчених і спеціалістів, присвяченому 135 річниці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного (Київ, 2001), конференції молодих вчених і спеціалістів "Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми" (Чернігів, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, в тому числі 5 статей у фахових виданнях, 3 тези, 1 інформаційний листок, 1 рекомендація, оголошено 3 наукові доповіді.

Обсяг і структура роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літературних джерел, основної частини, висновків та списку використаної літератури, який включає 204 першоджерел (з них 63 латиницею).

Загальний обсяг роботи становить 215 сторінок. Робота ілюстрована 33 таблицями і 46 рисунками, включає 11 додатків.

ПЕСТИЦИДНЕ ЗАБРУДНЕННЯ І ОСОБЛИВОСТІ РОЗВИТКУ МІКРОБОЦЕНОЗУ ҐРУНТУ (огляд літератури)

Літературний огляд складається з 5 підрозділів, в яких розглядаються наукові праці попередників з питань впливу пестицидів на фізіологічні групи ґрунтових мікроорганізмів, дії пестицидів на мікробну клітину, процесів симбіотичної азотфіксації при застосуванні пестицидів, деструкції мікроорганізмами хімічних засобів захисту рослин та охорони навколишнього середовища від забруднення пестицидами.

МІСЦЕ, УМОВИ І МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Представлений в дисертації експериментальний матеріал одержано в результаті досліджень, що проводились в 1998-2003 рр. в лабораторії біологічного фосфору та в лабораторії біологічної трансформації азоту і фосфору Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН в лабораторних і польових дослідах в дослідному господарстві ІСГМ УААН та на дослідному полі Харківського НАУ.

Умови проведення вегетаційних та польових дослідів

Вегетаційні досліди проводили в люміностаті в посудинах ємністю 0,5 л в умовах ґрунтової культури при інтенсивності освітлення 20 тис. люкс на рівні зеленого ярусу, з світловим періодом 16 годин при температурі 26±2оС. Повторність в дослідах десятиразова.

Польові досліди проводили згідно методики проведення польових дослідів [Доспехов, 1979] на чорноземі вилугуваному легкосуглинковому в межах землекористування дослідного господарства Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (східна околиця м. Чернігова – Чернігівське опілля), який має такі основні агрохімічні показники: гумус в орному шарі – 3,2-3,4 %, рНвод. – 5,9-6,0, вміст P2О5 за Чиріковим – 14-17 мг/100 г, К2О за Масловою – 12-14 мг/100 г та на дослідному полі Харківського НАУ, чорнозем глибокий середньогумусний на лесовидному суглинку, який має такі основні агрохімічні показники: гумус в орному шарі – 5,9%, рНвод. – 7,3, вміст P2О5 за Чиріковим – 10,1 мг/100 г, К2О за Масловою – 14,4 мг/100 г.

Площа дослідних і облікових ділянок складала 2,7-3,6 м2 в дослідах з ячменем та 20-25 м2 в дослідах з буряками цукровими. Повторення в дослідах п'ятиразове, розміщення ділянок рендомізоване.

В дослідженнях було використано ряд найпоширеніших на сьогодні протруйників насіння сільськогосподарських культур: адіфур, гаучо, тачигарен, сульфокарбатіон, раксил, вінцит, фундазол.

Протруєння насіння буряків цукрових є обов’язковим агрозаходом, яке проводиться на насіннєвих заводах. Технологію протруєння і протруйник насіння зернових культур вибирали за результатами фітоекспертизи насіння

В лабораторних і польових дослідах використовували протруєне та бактеризоване насіння буряків цукрових сорту Білоцерківський 45, ячменю ярого сорту Гонор. Ефективність суміщення бактеризації і протруєння насіння вивчали у вегетаційних та польових дослідах.

Біопрепарати, застосування яких суміщається з протруєнням насіння відбирали за такими критеріями:

· збереження агрономічно цінних властивостей штамів бактерій (біоагентів мікробних препаратів) в рідких та агаризованих поживних середовищах у присутності пестицидів;

· збереження життєздатності бактерій на протруєному насінні;

· приживання бактерій в ризосфері при висіві в ґрунт протруєного і бактеризованого насіння;

· ефективність біопрепаратів у польових умовах.

Доцільність вивчення впливу протруйника на ефективність біопрепарату визначалася сільськогосподарською культурою на якій його рекомендують застосовувати. В зв'язку з цим, вивчали вплив протруйників насіння раксил, вінцит, фундазол на ефективність мікробних препаратів флавобактерин, ризоентерин, діазофіт, тому що вони всі використовуються на зернових колосових культурах. Вплив протруйників насіння адіфур, гаучо, тачигарен, сульфокарбатіон на ефективність мікробних препаратів поліміксобактерин, альбобактерин, БПА, флавобактерин вивчали, тому що вони всі використовуються на буряках цукрових.

На основі результатів цих досліджень в польових умовах доцільним було проведення дослідів з ячменем ярим з включенням таких варіантів:

1. Без обробітку (контроль)

2. Ризоентерин

3. Раксил

4. Ризоентерин + раксил

5. Вінцит

6. Вінцит + ризоентерин

7. Фундазол

8. Фундазол + ризоентерин

На буряках цукрових в польових умовах доцільним було проведення дослідів з включенням таких варіантів:

1. Без обробітку (контроль)

2. Поліміксобактерин

3. Адіфур

4. Адіфур + поліміксобактерин

5. Гаучо

6. Гаучо + поліміксобактерин

7. Тачигарен

8. Тачигарен + поліміксобактерин

9. Адіфур + тачигарен (заводське протруєння)

10. Адіфур + тачигарен (заводське протруєння) + поліміксобактерин

Методи досліджень

Якісну реакцію штамів бактерій на пестициди вивчали методом паперових дисків [Сэги, 1983]. Для вивчення дії пестицидів на життєздатність клітин бактерій при поєднанні протруєння насіння з його бактеризацією, готували суспензію, яка складалась з пестициду і водного змиву бактеріальної маси з агаризованого середовища (1:3). Життєздатність мікроорганізмів контролювали через добу шляхом висіву суспензії на тверді регламентні середовища та за впливом на ріст культури на агаризованому середовищі навколо дисків фільтрувального паперу, змочених в цій суспензії.

Морфологію бактеріальних клітин вивчали у фазовому контрасті за допомогою мікроскопу марки МБИ-10. Титр клітин бактерій і спор визначали за допомогою камери Горяєва.

Активність продукування фізіологічно-активних речовин визначали за методом біотестів Берестецького на проростках кукурудзи [Берестецький, 1972].

Здатність штамів розчиняти трикальційфосфат визначали в рідкому середовищі Муромцева. Вміст фосфору в культуральному середовищі визначали фосфоро-молібденовим методом Ердеї [Erdey, Fleps, Bodor, 1954].

Нітрогеназну активність чистих культур та потенційну активність азотфіксації на корінні ячменю визначали в напіврідкому середовищі Доберейнер та Ешбі [Волкогон, 1997].

Ступінь резистентності штамів бактерій до пестицидів вивчали за методом Зібальського [Методы общей бактериологии, 1984].

Вплив пестицидів на формування колоній штамів бактерій на агаризованому середовищі вивчали при концентрації діючої(их) речовин(и) в середовищі 1 г/л.

Вивчення впливу пестицидів на параметри росту штамів бактерій проводили в умовах періодичного культивування на рідкому поживному середовищі МПБ. [Перт, 1978].

Для вивчення ступеню приживання бактерій в ризосфері та динаміки зберігання інокулянта на насінні застосували метод генетичного маркування популяцій, використовуючи метод поступової адаптації бактерій до підвищеної дози стрептоміцину.

Життєздатність і чисельність клітин бактерій на бактеризованому і небактеризованому насінні контролювали шляхом змиву клітин і висіву їх на відповідне поживне середовище.

В ґрунтах і в ризосфері чисельність мікроорганізмів окремих еколого-трофічних груп і таксономічних груп визначали методом посіву ґрунтової суспензії на відповідні тверді живильні середовища [Звягинцев, 1991] та методом серійних розведень [Мейнел Дж., 1978].

Достовірність дії досліджуваних факторів на чисельність мікроорганізмів розраховувались при значенні критерію істотності (t-розподілу Стьюдента) [Доспехов, 1968].

Ідентифікацію виділених з протруєного насіння штамів бактерій проводили на основі вивчення морфологічних, культуральних і фізіолого-біохімічних ознак, користуючись методичними розробками "Методи загальної бактеріології" [1984] та визначниками бактерій Берджи [1980; 1997].

Виділення активних штамів фосфатмобілізуючих бактерій проводили орієнтуючись по зонах просвітлення навколо колоній на середовищі Муромцева [Методические указания по выделению микроорганизмов, растворяющих труднодоступные минеральные и органические соединения фосфора, Всерос.НИИСХМ, 1981].

Для окремих бактеріальних культур визначили нуклеотидний склад ДНК (Г+Ц, мол.%). Виділення ДНК проводили за методом Мармура [Marmur, 1961]. Нуклеотидний склад ДНК визначали методом теплової денатурації за Манделем і Мармуром [Белозерский, 1970].

Вміст рухомого фосфору в ґрунті визначали методом Чирікова, рухомого калію за методом Маслової, рНвод. і рНсол. ґрунтової витяжки визначали потенціометрично. Цукристість коренеплодів визначали в заводських лабораторіях за стандартним методом.

Погодні умови в роки проведення досліджень

Основні польові дослідження проводили в зоні Полісся, яка характеризується помірним, достатньо вологим кліматом. Притік сумарної сонячної радіації тут менший, ніж в зонах Лісостепу і Степу.

1998 рік за умовами зволоження та температурою майже не відрізнявся від багатосередньорічних даних.

1999 рік за режимом зволоження майже не відрізнявся від багатосередньорічних даних, а за температурним режимом був теплішим.

2000 рік за режимом зволоження майже не відрізнявся від багатосередньорічних даних, але весна була тепліша.

В 2001 році були посушливими липень і серпень. За температурним режимом теплішими були квітень і липень.

В 2002 році випало менше опадів, тепліше було в травні і липні.

2003 рік видався посушливим, травень і липень тепліші.

Вегетаційний період 2003 року в регіоні Східного Лісостепу (дослідне поле Харківського національного аграрного університету) за режимом зволоження і температурним режимом майже не відрізнявся від багатосередньорічних даних.

Таким чином, погодні умови в роки проведення досліджень значною мірою не впливали на урожайність буряків цукрових і ячменю ярого. Чисельність мікроорганізмів в ризосфері рослин в деякій мірі залежала від температури і кількості опадів.

КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГІЧНІ, ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТА КІНЕТИКА РОСТУ ШТАМУ БАКТЕРІЙ PAENIBACІLLUS POLYMYXA KB ПІД ВПЛИВОМ ПРОТРУЙНИКІВ

Селекція штамів бактерій, які не втрачають агрономічно-цінних властивостей під впливом пестицидів, є однією з головних умов вирішення проблеми суміщення операцій протруєння і бактеризації насіння, застосування бактеріальних препаратів в сільському господарстві.

В результаті проведених досліджень встановлено, що протруйники насіння буряків цукрових адіфур, гаучо, тачигарен не чинять значного негативного впливу на життєздатність, мобілізацію Р2О5 в рідкому середовищі, продукування стимуляторів росту рослин штамами бактерій Paenibacіllus polymyxa KB і Achromobacter album 1122. Фунгіцид сульфокарбатіон у технологічних концентраціях діє на ці штами бактерій бактеріостатично. Дані штами бактерій після впливу фунгіциду сульфокарбатіон не змінювали на активності мобілізації Р2О5 в рідкому середовищі. Крім того слід зазначити, що після дії фунгіциду сульфокарбатіон на клітини штаму бактерій Paenibacіllus polymyxa KB, у останнього відмічалась тенденція до зниження продукування стимуляторів росту рослин, а у штаму Achromobacter album 1122 ця властивість зберігалася.

Клітини штамів бактерій Azotobacter chroococcum M-70 і Azotobacter vіnelandіі M-X після дії інсектицидів адіфур і гаучо зберігали всі досліджувані культурально-морфологічні і фізіолого-біохімічні властивості, в тому числі нітрогеназну активність і активність продукування стимуляторів росту рослин. Фунгіциди тачигарен і сульфокарбатіон діяли на ці штами бактерій згубно.

Фунгіциди раксил, вінцит і фундазол не чинили значного впливу на культурально-морфологічні і фізіолого-біохімічні властивості штаму бактерій Enterobacter aerogenes 30Ф, в тому числі на нітрогеназну активність та активність продукування стимуляторів росту рослин. Ці ж фунгіциди не впливали на життєздатність штаму бактерій Agrobacterіum radіobacter 204, але останній втрачав нітрогеназну активність.

Протруйники насіння адіфур, гаучо, тачигарен, сульфокарбатіон, раксил, вінцит і фундазол в різній мірі негативно впливали на життєздатність штаму бактерій Flavobacterіum sp. Л-30.

Вплив протруйників насіння буряків цукрових на параметри росту бактерій Paenibacіllus polymyxa KB в періодичній культурі вивчали при концентраціях діючої речовини 0,01, 0,10 і 1,00 г/л. При концентраціях карбофурану (інсектицид адіфур) 0,1 і 1 г/л та сульфокарбатіону 1 г/л росту не було (бактеріостатична дія). За результатами експерименту за ступенем негативного впливу на штам бактерій P. polymyxa KB протруйники можна розмістити наступним чином: адіфур>сульфокарбатіон>гаучо>тачигарен.

ДИНАМІКА ЗБЕРЕЖЕННЯ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ КЛІТИН БАКТЕРІЙ НА ПРОТРУЄНОМУ НАСІННІ

У виробничих умовах застосування бактеріальних препаратів обмежується труднощами, які нерідко не дозволяють своєчасно висіяти бактеризоване насіння. Зважаючи на це, цінною властивістю бактерій є збереження клітинами життєздатності на насінні тривалий час, як мінімум кілька діб. Особливо привабливою є завчасна (за кілька місяців) бактеризація насіння с.-г. культур, яка притому проведена сумісно з обробкою пестицидами в спеціальних машинах для протруєння.

Вивчення тривалості збереження достатньої чисельності життєздатних клітин бактерій штаму Paenibacіllus polymyxa KB на протруєному і непротруєному насінні буряків цукрових показало, що достатня чисельність інокулянта зберігається протягом 4-5 місяців. Негативна дія протруйників адіфур, гаучо, тачигарен на інокулянт помірна. Фунгіцид сульфокарбатіон швидше зменшує чисельність життєздатних клітин інокулянта (в 2 рази), що скорочує термін використання бактеризованого насіння на місяць (рис. 1). Аналогічну картину спостерігали під час вивчення динаміки збереження життєздатності клітин бактерій Achromobacter album 1122 на протруєному насінні буряків цукрових. Невибагливим до інсектицидів виявився також штам бактерій Azotobacter chroococcum М-70. Інсектициди адіфур і гаучо не впливають негативно на життєздатність клітин цих бактерій на насінні буряків цукрових. Достатньо висока кількість клітин зберігається на протруєному і бактеризованому насінні протягом 6 місяців.

При вивченні збереження клітин бактерій штаму Enterobacter aerogenes 30Ф на протруєному насінні ячменю фунгіцидами раксил, вінцит і фундазол виявилось, що достатня кількість інокулянта зберігається у продовж 2-х місяців (рис. 2).

Рис. 1. Динаміка чисельності життєздатних клітин бактерій P. polymyxa КВ на насінні буряків цукрових

Рис. 2. Динаміка чисельності життєздатних клітин бактерій штаму E. aerogenes 30Ф на насінні ячменю ярого

ВПЛИВ ПЕСТИЦИДІВ НА ЧИСЕЛЬНІСТЬ МІКРООРГАНІЗМІВ ОКРЕМИХ ФІЗІОЛОГІЧНИХ ГРУП БАКТЕРІЙ ТА ІНТРОДУКОВАНИХ БАКТЕРІЙ В РИЗОСФЕРІ БУРЯКІВ ЦУКРОВИХ І ЯЧМЕНЮ ЯРОГО

Ріст і розвиток сільськогосподарських культур залежить від якості середовища ризосфери і прилеглого ґрунту. Важливо знати, як взаємодіють між собою ґрунтові мікроорганізми, протруйники та інокулянт навколо протруєної і бактеризованої насінини, що потрапила до ґрунту після висіву.

Для досліду використали насіння, оброблене інсектицидом адіфур і фунгіцидом тачигарен і оброблене біопрепаратами поліміксобактерин, альбобактерин, азотобактерин. Вплив пестицидів вивчали стосовно групи бактерій, які використовують органічні і мінеральні сполуки азоту, бактерій, що засвоюють фосфат з мінеральних водонерозчинних фосфатів, бактерій олігонітрофілів, азотобактеру. Штами фосфатмобілізуючих бактерій, яким оброблялося насіння, виявляли на сприятливих для них середовищах: Paenibacіllus polymyxa KB – на картопляному середовищі, Achromobacter album 1122 – на МПА, Azotobacter (асоціація двох штамів – Azotobacter chroococcum M-70 і Azotobacter vіnelandіі M-X) на середовищі Федорова.

За отриманими даними в прилеглому до насінини ґрунті хімічні засоби захисту рослин негативно вплинули на загальну чисельність амоніфікаторів та на чисельність олігонітрофілів. Пестициди не пригнічували бактерій, які живляться мінеральними формами сполук азоту та анаеробних бактерій. Через 3 тижні негативний вплив пестицидів припинився. Бактеризація в більшості випадків певною мірою знімає пригнічуючий вплив пестицидів. Виключенням є несприятлива дія вказаних пестицидів на групу амоніфікаторів.

Вищезазначені наслідки негативного впливу протруєння позначились і на мікрофлорі ризосфери проростка. Однак бактеризація великою мірою знімає пригнічуючу дію протруйників. У всіх бактеризованих варіантах зросла кількість бактерій на селективних середовищах, сприятливих для розвитку інокулянта.

Однією з необхідних умов ефективної дії біопрепарату є приживання інокулянта в ризосфері рослин. Як видно з результатів досліджень, передпосівна бактеризація насіння P. polymyxa KB збільшує чисельність фосфатмобілізуючих мікроорганізмів в ризосфері буряків цукрових приблизно на 20 % (1 млн./г ґрунту) в перші етапи органогенезу. В подальші строки різниця між інокульованими і неінокульованими варіантами зменшується і через 2 місяці практично зникає. Це може свідчити про приживання інокулянта в ризосфері.

У разі бактеризації протруєного і непротруєного насіння буряків цукрових стрептоміцинстійким штамом Paenibacіllus polymyxa KB в ризосфері інокульованих рослин виявлено значну кількість стрептоміцинстійких мікроорганізмів (1 млн./г ґрунту) в перший термін досліджень. Чисельність клітин інокулянта поступово зменшувалася на наступних етапах органогенезу і через 2 місяці вирівнялась з фоновою чисельністю стрептоміцинстійких мікроорганізмів у ґрунті (рис.3).

Вплив пестицидів адіфур, гаучо, тачигарен на фосфатмобілізуючі мікроорганізми на початкових стадіях розвитку рослин не є суттєвим, як в умовах розвитку спонтанної мікрофлори, так і при бактеризації. Пригнічуючу дію справляв лише фунгіцид сульфокарбатіон. На наступних етапах органогенезу негативна дія останнього пестициду зникає. Аналогічні дані отримані при дослідженні дії пестицидів на маркований інокулянт.

Рис.3. Динаміка чисельності стрептоміцинстійких мікроорганізмів у ризосфері буряків цукрових, чорнозем вилугованй легкосуглинковий, дослідне господарство ІСГМ УААН, 2000 р.

1 – без бактеризації і протруєння насіння (контроль); далі при бактеризації стрептоміцинстійким шт. Paenibacіllus polymyxa, KB: 2 – контроль; 3 – адіфур; 4 – гаучо; 5 – тачигарен; 6 – сульфокарбатіон; 7 – адіфур+тачигарен (заводське протруєння) |

Рис.4. Динаміка чисельності стрептоміцинстійких мікроорганізмів у ризосфері ячменю ярого, чорнозем вилугованй легкосуглинковий, дослідне господарство ІСГМ УААН, 2000 р.

1 – без бактеризації і протруєння насіння (контроль); далі при бактеризації стрептоміцинстійким шт. E. aerogenes 30Ф: 2 – контроль; 3 – вінцит; 4 – раксил; 5 – фундазол

Отримано також дані приживання стрептоміцинстійкого штаму Enterobacter aerogenes 30Ф в ризосфері ячменю ярого при бактеризації насіння сумісно з протруйниками раксил, вінцит і фундазол. Передпосівна бактеризація насіння викликає збільшення чисельності стрептоміцинстійких бактерій у ризосфері ячменю ярого в перші етапи органогенезу (рис. 4). З часом чисельність клітин інокулянта поступово зменшувалася і через 2 місяці вирівнялась з фоновою чисельністю. Вищевказані фунгіциди не чинили значної негативної дії на інокулянт (рис. 4).

Фунгіциди раксил, вінцит і фундазол не впливають негативно на потенціальну активність азотфіксації мікроорганізмами ризоплани коренів ячменю ярого.

ЕФЕКТИВНІСТЬ СУМІЩЕННЯ БАКТЕРИЗАЦІЇ І ПРОТРУЄННЯ НАСІННЯ ПРИ ВИРОЩУВАННІ ЯЧМЕНЮ ЯРОГО І БУРЯКІВ ЦУКРОВИХ

Дію бактеріальних препаратів на продуктивність буряків цукрових та ячменю ярого в умовах пестицидного навантаження вивчали, оцінюючи інтенсивність наростання біомаси в перші фази розвитку рослин, в період формування врожаю та оцінюючи якість продукції.

У вегетаційному досліді з ячменем ярим попередньо вивчали вплив протруйників раксил, вінцит і фундазол на ефективність дії біопрепарату ризоентерин. Бактеризація насіння, обробленого протруйниками, позитивно вплинула на ріст і розвиток рослин. Зокрема, в порівнянні з протруєним насінням збільшується середня висота рослин (на 8,9-11,3%), підвищується середня вага сухої надземної частини 10 рослин (на 8,4-11,1%). Азотфіксуюча активність ґрунту посилюється в 2-3 рази (з 0,237 до 0,474-0,711 нмоль С2Н4/годину в посудині).

Ефективність застосування біопрепарату ризоентерин сумісно з протруйниками насіння раксил, вінцит і фундазол проводили в мікропольових дослідах протягом 3-х років. В 2000 році дослід проводився без внесення добрив. В 2001 році було внесено N45P60K40. В 2003 році було внесено N40P40K40. Середній приріст урожайності зерна ячменю ярого при застосуванні мікробного препарату ризоентерин по протруєному насінню (за трирічними даними) знаходився у межах 1,6-2,3 ц/га (4,8-7,0%) при середній урожайності 33,0 ц/га в контрольному варіанті. (табл. 1). Найпродуктивнішим було поєднання біопрепарату ризоентерин з протруйником раксил (38,1 ц/га). Слід відмітити також те, що біопрепарат ризоентерин, як з протруйниками, так і без протруйників, сприяв збільшенню середньої ваги 1000 насінин. Середнє збільшення ваги 1000 насінин ячменю ярого при застосуванні мікробного препарату ризоентерин по протруєному насінню (за трирічними даними) знаходився у межах 0,7-1,8 ц/га (1,2-3,2%) при вазі 1000 насінин в контрольному варіанті 55,6 г.

Таблиця 1

Вплив сумісної обробки насіння ячменю ярого протруйниками і ризоентерином на врожайність зерна в мікропольових дослідах на чорноземі вилугуваному легкосуглинковому, дослідне господарство ІСГМ УААН

Варіант | Урожайність, ц/га | Середня

урожайність, ц/га | Приріст | Приріст від бактеризації

2000р. | 2001р. | 2003р. | ц/га | % | ц/га | %

Не оброблене насіння (контроль) | 23,5 | 39,7 | 34,1 | 33,0 | -

Ризоентерин | 26,5 | 41,7 | 37,9 | 35,4 | 2,4 | 7,3 | 2,4 | 7,3

Раксил | 25,9 | 42,9 | 40,1 | 36,3 | 3,3 | 10,0

Ризоентерин+раксил | 26,9 | 45,6 | 41,9 | 38,1 | 5,1 | 15,5 | 1,8 | 5,5

Вінцит | 25,8 | 42,8 | 35,1 | 34,6 | 1,6 | 4,8

Ризоентерин+вінцит | 26,7 | 45,5 | 38,4 | 36,9 | 3,9 | 11,8 | 2,3 | 7,0

Фундазол | 26,1 | 40,8 | 36,3 | 34,4 | 1,4 | 4,2

Ризоентерин+фундазол | 27,3 | 40,9 | 39,7 | 36,0 | 3,0 | 9,1 | 1,6 | 4,8

НІР05 | 1,3 | 2,0 | 3,2

Вивчення ефективності застосування біопрепарату поліміксобактерин на буряках цукрових разом з протруйниками адіфур, гаучо і тачигарен в польових дослідах на чорноземі показало, що протруєння насіння буряків цукрових не веде до зниження ефективності від бактеризації. Так, у варіантах з поєднанням бактеризації і протруєнням приріст урожайності коренеплодів від бактеризації склав в межах 27-36 ц/га (7,6-10,2 %) (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив сумісної обробки насіння буряків цукрових протруйниками та поліміксобактерином на врожайність коренеплодів в польових дослідах (ц/га)

Варіант | Урожайність | Середня

урожай-ність | Приріст | Приріст від бактеризації

2000р. | 2003р. | ц/га | % | ц/га | %

Контроль (необроблене насіння) | 410 | 298 | 354 | -

Поліміксобактерин | 436 | 340 | 388 | 34 | 9,6 | 34 | 9,6

Адіфур | 441 | 326 | 384 | 30 | 8,5

Поліміксобактерин + адіфур | 469 | 356 | 413 | 59 | 16,7 | 29 | 8,2

Гаучо | 428 | 323 | 376 | 22 | 6,2

Поліміксобактерин + гаучо | 461 | 362 | 412 | 58 | 16,4 | 36 | 10,2

Тачигарен | 430 | 329 | 380 | 26 | 7,3

Поліміксобактерин + тачигарен | 460 | 361 | 411 | 57 | 16,1 | 31 | 8,8

Адіфур + тачигарен | 449 | 339 | 394 | 40 | 11,3

Поліміксобактерин + заводське насіння (адіфур + тачигарен) | 475 | 367 | 421 | 67 | 18,9 | 27 | 7,6

НІР05 | 18,2 | 19,2

Застосування бактеріальних препаратів поліміксобактерин і ризоентерин вигідне як із економічної точки зору, так і з біоенергетичної (табл. 3). Умовно чистий прибуток від застосування біопрепарату поліміксобактерин сумісно з протруйниками адіфур, гаучо, тачигарен для буряків цукрових складав 412-527 грн./га, а для ячменю ярого при використанні біопрепарату ризоентерин сумісно з фунгіцидами раксил і вінцит коливався в межах 47-68 грн./га. Коефіцієнт енергетичної ефективності від застосування біопрепарату ризоентерин по протруєному насінні ячменю ярого складав 130,6, а від застосування біопрепарату поліміксобактерин по протруєному насінню буряків цукрових – 25,6-25,7.

Таблиця 3

Умовно чистий прибуток і коефіцієнт енергетичної ефективності застосування бактеріальних препаратів по фону протруйників, 2000 р.

Варіант | Урожайність, ц/га | Приріст, ц/га | Умовно чистий прибуток, грн./га | Біоенергетична оцінка (коефіцієнт енергетичної ефективності)

Не бактеризовано | Бактеризовано

Поліміксобактерин, буряки цукрові

Без протруєння | 410 | 436 | 26 | 412,32 | 25,7

Адіфур | 441 | 469 | 28 | 444,96 | 25,7

Гаучо | 428 | 461 | 33 | 527,10 | 25,7

Тачигарен | 430 | 460 | 30 | 477,60 | 25,6

Адіфур + тачигарен | 449 | 476 | 27 | 428,64 | 25,6

Ризоентерин, ячмінь ярий

Без протруєння | 9,7 | 41,7 | 2,0 | 47,63 | 121,9

Раксил | 42,9 | 45,6 | 2,7 | 68,51 | 130,6

Вінцит | 42,8 | 45,5 | 2,7 | 68,51 | 130,6

Таким чином, застосування мікробного препарату поліміксобактерину ефективне при протруєнні насіння буряків цукрових пестицидами адіфур, гаучо та тачигарен; використання мікробного препарату ризоентерин ефективне при протруєнні насіння ячменю ярого фунгіцидами раксил, вінцит і фундазол.

ВИСНОВКИ

В дисертації теоретично обґрунтовано та експериментально доведено можливість поєднання бактеризації насіння буряків цукрових і ячменю з його протруєнням, що значно розширює можливості застосування бактеріальних добрив – біологічно-безпечного заходу, який сприяє оптимізації екологічного стану ґрунтів, підвищенню врожайності сільськогосподарських культур та поліпшенню якості продукції без зайвого хімічного навантаження на агроекосистему. Проведені дослідження дають можливість стверджувати:

1. Серед агрономічно-цінних представників бактеріального ценозу грунту, а також епіфітної бактеріальної мікрофлори існують штами, які толерантні до дії відомих сучасних протруйників насіння: адіфур, гаучо, тачигарен, сульфокарбатіон, раксил, вінцит та фундазол.

2. Штами фосфатмобілізуючих бактерій Paenibacіllus polymyxa KB (біоагент препарату поліміксобактерин) і Achromobacter album 1122 (біоагент біопрепарату альбобактерин) резистентні до дії інсектициду гаучо та фунгіцидів тачигарен і сульфокарбатіон, що надає можливість їх сумісного застосування з протруєнням насіння буряків цукрових.

3. Встановлено, що біоагенти біопрепарату БПА Azotobacter chroococcum M-70 та Azotobacter vіnelandіі M-X зберігають життєздатність і функціональну активність в присутності інсектицидів адіфуру і гаучо на інокульованому насінні буряків цукрових більше 6-ти місяців.

4. Не виявлено негативного впливу при застосуванні протруйників адіфур і тачигарен на епіфітну бактеріальну мікрофлору насіння буряків цукрових. Після місячного терміну зберігання протруєного насіння спостерігається висока чисельність на ньому епіфітних бактерій (100-140 тис./насінину), які належать до родів Bacillus, Cellulomonas, Enterobacter, Erwinia, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas та ін.

5. З поверхні насіння буряків цукрових, протруєного інсектицидом адіфур і фунгіцидом тачигарен, виділено резистентний до дії протруйників і ефективний штам фосфатмобілізуючих бактерій Enterobacter sakazakii T6A, який здатний мобілізувати фосфор з мінеральних та органічних фосфатів.

6. Протруйники адіфур і тачигарен, попадаючи в ґрунт з насінням, справляють помітний негативний вплив на чисельність амоніфікуючих, фосфатмобілізуючих та азотфіксуючих мікроорганізмів, які знаходяться на відстані до 3 мм від насінини та в ризосфері проростків. Проте, мікробне угрупування грунту повертається у вихідний стан за 3 тижні.

7. Протруєне насіння ячменю можна бактеризувати біопрепаратом ризоентерин, адже штам бактерій Enterobacter aerogenes 30Ф, як діюча основа біопрепарату ризоентерин, резистентний до дії фунгіцидів раксил, вінцит і фундазол.

8. Біопрепарат ризоентерин підвищує потенційну нітрогеназну активність на корінні ячменю насіння якого протруювалось фунгіцидами раксил, вінцит і фундазол. У фазу колосіння вона збільшувалася в 2-3 рази і знаходилася в межах 1600 – 5200 нмоль С2Н4/г коріння /годину.

9. Вразливими до дії протруйників раксил, вінцит і фундазол є клітини штамів бактерій Agrobacterіum radіobacter 204 (біопрепарат діазофіт), Flavobacterіum sp. Л-30 (біопрепарат флавобактерин). На останній негативно впливають також протруйники адіфур, гаучо і тачигарен, тому застосування цих бактеріальних препаратів на протруєному насінні ячменю і буряків цукрових є недоцільним.

10. Середній приріст урожайності зерна ячменю ярого при застосуванні мікробного препарату ризоентерин по протруєному насінню фунгіцидами раксил, вінцит і фундазол (за трирічними даними) знаходився у межах 1,6-2,3 ц/га (4,8-7,0%) при середній урожайності 33,0 ц/га в контрольному варіанті. Приріст урожайності буряків цукрових від застосування біопрепарату поліміксобактерин по протруєному насінню пестицидами адіфур, гаучо, тачигарен склав 26-33 ц/га (6,0-7,6%) при урожайності 410 ц/га в контрольному варіанті (в досліді на чорноземі вилугуваному легкосуглинковому), та 28-39 ц/га (8,2-11,5%) при урожайності 298 ц/га в контрольному варіанті (в досліді на чорноземі глибокому середньогумусному).

11. Умовно чистий прибуток від застосування біопрепарату поліміксобактерин сумісно з протруйниками адіфур, гаучо, тачигарен для буряків цукрових складав 412-527 грн./га, а для ячменю ярого при використанні біопрепарату ризоентерин сумісно з фунгіцидами раксил і вінцит коливався в межах 47-68 грн./га. Коефіцієнт енергетичної ефективності від застосування біопрепарату ризоентерин по протруєному насінні ячменю ярого складав 130,6, а від застосування біопрепарату поліміксобактерин по протруєному насінню буряків цукрових – 25,6-25,7.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

При підготуванні насіння буряків цукрових на насіннєвих заводах рекомендується проводити його бактеризацію мікробними препаратами альбобактерин і поліміксобактерин поєднано з протруєнням інсектицидами адіфур, гаучо та фунгіцидом тачигарен за 2-3 місяці до висіву, але не більше ніж за 5 місяців. Бактеризацію протруєного насіння ячменю ярого біопрепаратом ризоентерин слід проводити за умови використання фунгіцидів раксил, вінцит і фундазол не раніше ніж за 2 місяці до висіву.

Список опублікованих праць.

Роботи опубліковані у фахових виданнях:

1. Пищур І.М. Вплив протруєного насіння цукрових буряків на мікрофлору ґрунту і роль при цьому бактеризації // Бюлетень Інституту с.-г. мікробіології (м. Чернігів). – 1999. – №5.
– С.8-10.

2. Пищур І.М. До питання про збереження бактерій на протруєному насінні // Бюлетень Інституту с.-г. мікробіології (м. Чернігів). – 2000. – №6. – С.61-62.

3. Канивец В.И., Пищур И.Н. Бактериальная микрофлора протравленных семян сахарной свеклы // Микробиология (Росія). – 2001. – Т.70, №3. – С. 370-373. (Особистий внесок: 50 % виконаної роботи (визначено чисельність бактерій та проведено виділення та ідентифікацію штамів бактерій)).

4. Пищур І.М. Вплив поліміксобактерину на чисельність фосфатмобілізуючих мікроорганізмів у ризосфері цукрового буряка при застосуванні пестицидів // Агроекологічний журнал (м. Київ). – 2002. – №4. – С.49-51.

5. Пищур І.М. Вивчення життєздатності Bacillus polymyxa KB у різних екологічних умовах // Екологія та ноосферологія. – 2004. – Т. 15, № 1-2. – С. 119-128.

Тези доповідей:

6. Пищур І.М., Гусєв О.В. Вплив протруювачів насіння зернових на ефективність бактеризації азотфіксуючими бактеріальними препаратами // Матеріали науково-практичного семінару молодих вчених та спеціалістів “Вчимося господарювати”, 22-23 листопада 1999 року, Київ. – Чабани. – С.24-25. (Особистий внесок: 90 % виконаної роботи (планування роботи, її проведення і узагальнення даних; написання тез)).

7. Пищур І.М., Гусєв О.В. Вплив протруйників зернових на ефективність бактеризації біопрепаратами на основі азотфіксувальних асоціативних бактерій // Матеріали міжнарод. наукової конференції “Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм” 1-4 жовтня 2001 р., Тернопіль. – С.198-202. (Особистий внесок: 90 % виконаної роботи (планування роботи, її проведення і узагальнення даних; написання тез)).

8. Пищур І.М., Овчарова О.П. Резистентність бактерій до дії фунгіцидів та інсектицидів// Матеріали Х з’їзду Товариства мікробіологів України. – 15-17 вересня 2004 р. –Одеса: Астропринт, 2004. – С.297. (Особистий внесок: 95 % виконаної роботи (планування роботи, її проведення і узагальнення даних; написання тез)).

Методичні роботи опубліковані по темі дисертації:

9. Патыка В.Ф., Токмакова Л.Н., Тарарико Ю.А., Канивец В.И., Щербатый А.А., Пищур И.Н., Ларченко И.В. Микробиологические препараты альбобактерин и полимиксобактерин для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур