НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ПАРІЙ

Мирослав Федорович

УДК 633.15 (631.52+575.1)

ГЕНЕТИЧНА СИСТЕМА КОНТРОЛЬОВАНОГО РОЗМНОЖЕННЯ КУКУРУДЗИ НА ОСНОВІ ГЕНІВ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ ЧОЛОВІЧОЇ СТЕРИЛЬНОСТІ

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі генетики, селекції та насінництва Національного аграрного університету

Науковий керівник:доктор біологічних наук Чугункова Тетяна Володимірівна, Інститут фізіології та генетики рослин НАН України,

завідувач відділу генетичних основ гетерозису |

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук Терновська Тамара Костянтинівна, Національний університет „Києво-Могилянська академія”, завідувач кафедри біології |

доктор біологічних наук, професор Бобер Анатолій Федорович, Інститут землеробства УААН,

головний науковий співробітник відділу генетики та селекції кормових культур

Провідна установа:Одеський Національний університет ім. І.І. Мечнікова

Захист відбудеться 24 лютого 2005 р. о 16 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано 21 січня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біодогічних наук Кравець О.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Використання ефекту гетерозису стало основним напрямком селекції кукурудзи. Найбільш поширеним способом забезпечення кросбридингу у кукурудзи є видалення волотей на материнському компоненті, що потребує значних затрат ручної праці. Проблема отримання гібридів з високим рівнем гетерозису при малих витратах на отримання насіння – це проблема практичного використання генетичних механізмів перехресного запилення.

Сукупність генів, що детермінують розвиток всієї системи ознак генеративних органів та процесу запліднення, а також формування та розвиток насіння називають генетичною системою розмноження рослин (Малецкий, 1991). Використання гетерозису передбачає модифікацію генетичної системи розмноження в елементі, який детермінує перехресне запилення – тобто створення генетичної системи контрольованого розмноження (ГСКР). ГСКР, що лежать в основі способів отримання гібридного насіння, повинні забезпечувати константність генотипів компонентів схрещування і напрямків схрещування, забезпечувати виключно перехресне запилення та повноцінний рівень фертильності гібридів першого покоління.

Розроблені сучасні генетичні системи контрольованого розмноження кукурудзи мають недоліки, які природнім чином притаманні цим системам: система на основі ЦЧС та генів відновлення фертильності призводить до уніфікації плазми, що є причиною виникнення епіфітотій. При використанні ядерних генів чоловічої стерильності виникає проблема підтримання стерильних форм. Альтернативним підходом, який позбавлений вказаних недоліків, є використання функціональної чоловічої стерильності (ФЧС). Тобто стерильності обумовленої зміною генеративних органів без порушення генетичних механізмів мікроспоро- та мікрогаметогенезу. Отже, створення генетичних систем контрольованого розмноження кукурудзи на основі ядерних генів ФЧС є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконувалась за Державною тематикою кафедри генетики, селекції та насінництва Національного аграрного університету “Удосконалити генетико-селекційні методи створення адаптованих, високопродуктивних сортів і гібридів зернових культур та розробити технології їх насінництва” (Державний реєстраційний номер 0101U003458) та за проектом Міністерства освіти і науки України 3.99.4 “Створити високопродуктивні з комплексом господарсько-цінних ознак та властивостей ранньостиглі гібриди кукурудзи інтенсивного типу” (Державний реєстраційний номер 0199U000578).

Об’єкт дослідження – генетичні системи контрольованого розмноження кукурудзи.

Предмет дослідження – ядерні гени функціональної чоловічої стерильності (ФЧС).

Мета та задачі дослідження. Мета дослідження полягала в розробленні генетичної системи контрольованого розмноження кукурудзи на основі генів функціональної чоловічої стерильності. В зв’язку з метою досліджень були поставлені такі задачі:

-

-

-

-

-

-

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено генетичну систему контрольованого розмноження кукурудзи на основі генів функціональної чоловічої стерильності, яка включає:

- ген Vg та його домінантний специфічний ген модифікатор Enh(Vg), які детермінують стабільну чоловічу стерильність у інбредних форм кукурудзи;

- гени tk, ad1, Tu, які забезпечують формування пилку у інбредних форм з генотипом VgVg Enh(Vg)Enh(Vg);

- відновлення фертильності у гібридних рослин завдяки високому рівню гетерозиготності.

Розроблена нова генетична система контрольованого розмноження ґрунтується на вперше встановлених автором наступних положеннях:

Експресивність домінантного алеля гена Vg залежить від генетичного фону і не залежить від умов зовнішнього середовища.

Ідентифіковано новий домінантний специфічний ген модифікатор Enhancer(Vg) (Enh(Vg)), який підсилює дію домінантного алеля гена Vg, а саме – детермінує значну редукованість елементів колоску.

Ступінь прояву ознаки „стерильність-фертильність” залежить від рівня гетерозиготності форм з домінантним алелем гена Vg: при однаковій експресивності домінантного алеля гена Vg високий рівень гомозиготності генотипу обумовлює повну чоловічу стерильність, а гетерозиготність сприяє відновленню фертильності.

Ідентифіковано новий рецесивний ген tassel knit (tk), який в гомозиготному стані детермінує деформацію та зростання елементів волоті, що запобігає вивільненню пилку та призводить до функціональної чоловічої стерильності.

В генотипах tktkVg- та ad1ad1Vg- гени мають незалежний прояв. Генотипи tktkVg-, ad1ad1Vg-,Tu- Vg- детермінують морфологічні зміни волоті, при яких умови розвитку частини андроцею близькі до умов розвитку андроцею у рослин дикого типу, що забезпечує формування пилку у рослин з такими генотипами.

У більшості генотипів наявність домінантного алеля гена Vg не призводить до суттєвого зниження висоти рослин, висоти прикріплення качана, насіннєвої продуктивності та вегетаційного періоду. Встановлено зниження рівня збиральної вологості насіння у форм з геном Vg та тривалим вегетаційним періодом в порівнянні з коізогенними формами vgvg.

Практичне значення одержаних результатів. На основі розробленої генетичної системи контрольованого розмноження запропоновано способи отримання гібридного насіння, що ґрунтуються на використанні Vg-стерильних форм (патенти України 40276А, 40277А, 40278А), а також спосіб отримання гібридного насіння на основі гена tk (патент України 56351). Для реалізації цих способів створено аналоги елітних інбредних ліній П346зМVg, П346МVg, П346зСVg, П346СVg, F7зСVg, F7СVg, Гк26зМVg, Гк26МVg, аналоги інбредних ліній цукрової кукурудзи та лінії цукрової кукурудзи з домінантним алелем гена Vg і комплексом господарсько-цінних ознак, які запропоновано використовувати в гібридному насінництві та як донори гена Vg. Запропоновано спосіб селекції кукурудзи на низьку збиральну вологість насіння. Створені аналоги ліній передані в Національний центр генетичних ресурсів рослин України під позначеннями П346зМVg – МП1, П346МVg – МП2, F7зСVg – МП3, F7СVg – МП4, Гк26зМVg – МП5, Гк26МVg – МП6. Ці лінії використовуються в селекційно-насінницький роботі кафедри генетики селекції та насінництва Національного аграрного університету, створені аналоги ліній цукрової кукурудзи Мс-58Vg, Мс-233Vg, Мс-248Vg в секторі біохімічної генетики Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН.

Особистий внесок здобувача. Розробка програми дослідження, проведення досліджень, а також узагальнення результатів дослідження, написання тексту дисертації і формулювання висновків належать авторові.

Апробація роботи. Результати, представлені в дисертації, доповідались на міжнародній конференції студентів та молодих вчених присвяченій 100-річчю генетики “Conference on genetics and molecular biology” (Lviv, 2000), на VII конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (Київ, 2000 р.), на першій Всеукраїнській конференції молодих вчених аграріїв “Сучасні агротехнології та біотехнології, насінництво, захист рослин” (Київ, 2001 р.), на міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків 2001 р.), на міжнародній науково-практичній конференції “Генетические ресурсы культурных растений” (Санкт-Петербург, 2001 р.), на конференції молодих вчених “Актуальні проблеми ботаніки” (смт. Зноб-Новгородське, 2001 р.), на VII з`їзді Товариства генетиків та селекціонерів ім. М.І. Вавілова (2002 р.), на науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Биоразнообразие, экология, эволюция, адаптация”(Одеса, 2003 р.), на ІІ міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків, 2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті, отримано 4 патенти України на винаходи та опубліковано 7 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, восьми розділів, закінчення, висновків та списку використаних джерел.

Роботу викладено на 152 сторінках машинописного тексту, вона вміщує 21 таблицю та 24 рисунки.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В цьому розділі проаналізовано існуючі генетичні системи контрольованого розмноження та показано, що система на основі ген-залежної ЦЧС породжує проблему уніфікації плазми, яка не може бути вирішена при використанні цитоплазматичної чоловічої стерильності, а при використанні ядерних генів чоловічої стерильності невирішеною залишається проблема підтримання стерильних форм. Показано, що використання генів ФЧС може бути альтернативним підходом до створення ГСКР. Запропоновано в загальній класифікації генів кукурудзи виділяти підгрупу генів функціональної чоловічої стерильності. До цієї групи віднесено гени Vg, Tu та ad1.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Дослідження проводили в польових умовах на дослідних полях Агрономічної дослідної станції Національного аграрного університету в період з 1996-2004 рр.

Матеріали: Лінії кукурудзи, які використовуються в насінництві як материнські форми: П346зМ, П346М, П346зС, П346С, F7зС, F7С, Гк26зМ, Гк26М та як батьківські форми: П502МВ, F2зС, Чк62МВ, Чк73СВ, D-Ве42СВ, Со125МВ, лінії цукрової кукурудзи Мс-58, Мс-233, Мс-248. Були використані зразки генетичної колекції ВІР: з геном Vg: С-18, С-19, С-20, С-21, С-29, С-30, С-32, С-33, з геном Tu: С-100, з геном ad1: С-11.

Методи: Створення аналогів та версій ліній проводилось методом беккросів. Генетичний контроль ознак вивчали методом гібридологічного аналізу, результати розщеплення оцінювали за критерієм Пірсона ?2. Ідентифікація алелів проводилась з використанням тесту на алельність. Пенетрантність визначали як відсоток рослин, у яких спостерігався прояв гена, до загальної кількості рослин. Експресивність генів оцінювали через коефіцієнт експресивності (к.е.) як відношення міри ознаки у коізогенних ліній. Оцінку ознаки „стерильність-фертильність” проводили за п’ятибальною шкалою, де 1 бал відповідає повній стерильності, а 5 балів – повній фертильності рослини. Повноту стерильності рослин визначали шляхом порівняння пилку досліджуваних рослин під мікроскопом та шляхом визначення зав’язування насіння при штучному запиленні.

При досліджені впливу домінантного алеля гена Vg на господарсько-цінні ознаки кукурудзи використовували коізогенні форми представлені п’ятим - шостим поколінням беккросу або гібридними рослинами, у яких відбувалось розщеплення за геном Vg. Вивчали не менше 30 рослин кожної форми. Визначали: тривалість періоду від сходів до цвітіння 50 % качанів та 50 % волотей, висоту рослин, висоту прикріплення качану, ураженість хворобами, насіннєву продуктивність та збиральну вологість насіння. Достовірність різниці між середніми значеннями ознаки визначали за критерієм Ст’юдента.

ОЦІНКА ПРОЯВУ ГЕНІВ ФЧС КУКУРУДЗИ

В дослідження були включені гени, які за описом викликають часткову чоловічу стерильність: рецесивний ген adherent1 (ad1) – щільне зростання верхніх листків та волоті, домінантні гени Tunicate (Tu) – колоскові та квіткові луски на суцвіттях мають гіпертрофовану довжину та ген Vestigial glume (Vg) – колоскові та квіткові луски на суцвіттях редуковані (Шмараев, 1984).

Визначали експресивність та пенетрантність генів в зразках, їх здатність детермінувати чоловічу стерильність та оцінували їх придатність до використання в генетичних системах контрольованого розмноження. Ген ad1, за нашими даними, має неповну пенетрантність (32% в зразку С-11 та 82% у лінії F7зС) та характеризується різною експресивністю. Нами показано, що у гомозиготних за цим геном рослин відбувається зростання пиляків внутрішніми сторонами, і це призводить до часткової чоловічої стерильності. Неповна пенетрантність та різна експресивність не дозволяють використати ген ad1 в ГСКР як детермінант чоловічої стерильності. Ген Tu викликає повну чоловічу стерильність, що обумовлено слабким розвитком лодікули. Ген має повну пенетрантність, однак наявність довгих колоскових лусок на качані – господарськонегативна ознака, що робить недоцільним використання гена Tu в ГСКР як детермінанта чоловічої стерильності. Ген Vg обумовлює редукованість лусок на жіночих та чоловічих суцвіттях, виявлено значну мінливість серед зразків за рівнем експресивності гена Vg та за ознакою „стерильність-фертильність”. Ген Vg проявляв повну пенетрантність та стабільну експресивність у ізогенних форм. В подальших дослідженнях гену Vg приділено основну увагу як детермінанту чоловічої стерильності для використання в ГСКР.

В інбредному зразку 103 нашої робочої колекції було виявлено рослини з порушеннями будови волоті (зросла волоть). Змінені чоловічі суцвіття являли собою вісь з потовщенням нижньої половини, яке утворилося внаслідок рівномірного зростання центральної вісі та бічних гілочок волоті (рис. ). У таких рослин крім зміни будови волоті спостерігалися і порушення будови колосків. Колоски зросталися з віссю і несли деформовані колоскові луски, які прикривали більшу частину пиляків. Було проведено гібридологічний аналіз ознаки „зросла волоть” (табл.1).

Таблиця 1

Результати гібридологічного аналізу ознаки “зросла волоть”

Покоління | Кількість рослин | Співвід-

ношення | 2 | Р | дикого типу | з мутантним фенотипом | всього | F1(103 Х П 346 зМ) | 500 | - | 500 | - | - | -

F2 (103 Х П 346 зМ) | 924 | 305 | 1229 | 3:1 | 0.021 | 0,99-0,95

103 Х (103 Х П346зМ) | 602 | 597 | 1199 | 1:1 | 0.020 | 0,99-0,95

Результати свідчать, що в детермінації ознаки бере участь один рецесивний ген. Новий ген нами було названо tassel knit (tk) (зросла волоть). У рослин гомозиготних за геном tk проходить нормальне формування пилку, але пиляки не виходять назовні, що призводить до чоловічої стерильності. Ген віднесено до підгрупи генів ФЧС і запропоновано використовувати для індукції чоловічої стерильності в ГСКР (патент України на винахід № 56351).

ОСОБЛИВОСТІ ПРОЯВУ ДОМІНАНТНОГО АЛЕЛЯ ГЕНА Vestigial glume

Створено аналоги шостого беккросу з домінантним алелем гена Vg всіх материнських ліній, включених в дослідження. Проведено визначення довжини колоскових лусок і зосереджено увагу на лініях, які мають неспоріднене походження та представляють крайні варіанти прояву цієї ознаки (F7зС і Гк26зМ) та лінію із проміжним значенням ознаки „довжина лусок” (П346зМ). Аналіз довжини лусок у форм з домінантним алелем гена Vg показав, що всі аналоги ліній за цією ознакою можна розбити на три групи, характерними представниками яких є лінії F7зС, П346зМ та Гк26зМ (рис. ). На цих аналогах проводилось вивчення рівня експресивності гена Vg. Встановлено, що дія домінантного алеля гена Vg на довжину колоскових та квіткових лусок на різних генетичних фонах має відмінності: спостерігається різний ступінь недорозвиненості елементів колоску у вивчених аналогів ліній (табл. 2).

Ген Vg має неоднакову дію на різні елементи колоску. Максимальна експресивність спостерігається для внутрішньої луски другої квітки, а мінімальна для колоскових лусок. Коефіцієнт експресивності колоскових лусок, які відіграють захисну роль, становить 1,4 - 1,5 для лінії F7зСVg, 1,9 для лінії П346зМVg та 7 для лінії ГК 26зМVg.

Таблиця 2

Експресивність домінантного алеля гена Vg у аналогів ліній

Лінія | Довжина лусок, мм | Довжина

пиляків, мм

колоскових | першої квітки | другої квітки

зовнішньої | внутрішньої | зовнішньої | внутрішньої | зовнішньої | внутрішньої

F 7зС | vgvg | 12,70,05 | 11,70,05 | 10,20,04 | 10,40,04 | 8,9 0,02 | 7,4 0,08 | 8,2 0,03

Vgvg | 9,8 0,08 | 7,9 0,03 | 7,2 0,05 | 5,3 0,08 | 4,9 0,08 | 3,4 0,07 | 6,6 0,20

різниця | 2,9* | 3,8* | 3* | 5,1* | 4* | 4* | 1,6*

к. е. | 1,4 | 1,5 | 1,4 | 2 | 1,8 | 2,2 | 1,2

П346 зМ | vgvg | 10,30,13 | 8,9 0,13 | 8,4 0,14 | 7,9 0,15 | 7,3 0,12 | 6,9 0,09 | 6,9 0,17

Vgvg | 5,4 0,06 | 4,7 0,04 | 3,6 0,08 | 2,8 0,13 | 4,1 0,01 | 2,2 0,06 | 4,9 0,20

різниця | 4,9* | 4,2* | 4,8* | 5,1* | 3,2* | 4,7* | 2*

к.е. | 1,9 | 1,9 | 2,3 | 2,8 | 1,8 | 3,1 | 1,4

ГК26

зМ | vgvg | 9,8 0,11 | 8,4 0,09 | 7,5 0,05 | 6,4 0,04 | 6,0 0,03 | 5,9 0,03 | 6,0 0,08

Vgvg | 1,4 0,05 | 1,2 0,04 | 1,0 0,01 | 0,9 0,01 | 1,2 0,02 | 0,7 0,01 | 3,2 0,09

різниця | 8,4* | 7,2* | 6,5* | 5,3* | 4,8* | 5,2* | 2,8*

к.е. | 7 | 7 | 7,5 | 7,1 | 5 | 8,4 | 1,8

*різниця достовірна при Р 0,01, n = 100

Нами встановлено, що експресивність домінантного алеля гена Vg не залежить від умов вирощування.

Таким чином, мінливість експресивності гена Vg обумовлено тільки генетичним фоном, а у ізогенних форм спостерігається стабільна експресивність гена Vg.

Генетична детермінація ознаки “ступінь редукції елементів колоску”. Для вивчення генетичного контролю ознаки „ступінь редукції елементів колоску” в схрещування були взяті контрастні форми: П346зМ, F7зС та Гк26зМ. За материнську форму, при отриманні гібридів першого покоління, брали рослини аналога лінії з домінантним алелем гена Vg, за батьківську – рослини дикого типу іншої лінії. Друге покоління отримували шляхом самозапилення гетерозиготних рослин Vgvg. В першому поколінні у гібридів П346зМVg Ч F7зC та F7зCVg Ч П346зМ довжина лусок наближувалась до такої у лінії F7зCVg. В другому поколінні не було виявлено чітких фенотипових класів серед рослин з домінантним алелем гена Vg, довжина лусок була близькою до довжини лусок у першого покоління, але з більшим розмахом варіювання, що вказує на полігенний контроль ознаки „ступінь редукції елементів колоску” у ліній F7зC та П346 зМ.

В другому поколінні комбінації Гк26зМVg Ч F7зС серед рослин з домінантним алелем гена Vg відбувалось розщеплення. Нащадки з домінантним алелем гена Vg були представлені двома фенотиповими класами рослин – з сильно вкороченими лусками, як у лінії Гк26зМVg (позначено Vg–), та з лусками, довжина яких сягала половини та більше довжини у рослин з генотипом vgvg (позначено Vg+) (табл.3).

Таблиця 3

Результати гібридологічного аналізу ознаки “довжина лусок” | Комбінація схрещування | Розщеплення | Співвідношення | ч2P | гібридна комбінація | фенотип | генотипи | Vg- | Vg+ | F1(F7зСVgВс5 Ч Гк26зМ) | Vg+ Ч vg | Vgvgmm Ч vgvgMM | 53 | - | - | - | - | F2 (F7зСVgВс5 Ч Гк26зМ) | Vg– Ч Vg–VgvgMm Ч VgvgMm | 73 | 28 | 9: 3 (3:1) | 0,39 | 0,01 | (F7зСVgВс5ЧГк26зМ)Ч F7зС | Vg– Ч vg | VgvgMm Ч vgvgmm | 40 | 43 | 1:1 | 0,11 | 0,01 |

Результати гібридологічного аналізу свідчать, що в контролі ознаки довжина лусок приймає участь ген-модифікатор (М) без самостійного прояву, домінантний алель якого підсилює дію гена Vg. Детермінація фенотипу з сильно вкороченими лусками домінантним геном модифікатором підтверджується і в інших комбінаціях схрещування лінії F7зC із зразками та лініями цукрової кукурудзи з фенотипом Vg–.

Ген-модифікатор було названо Enhancer (Vg) (Enh (Vg)). При реалізації його в генотипі в присутності Vg колоскові та квіткові луски на волоті сильно редуковані. Отже, мінливість ознаки „довжина лусок” у створених аналогів ліній з домінантним алелем гена Vg обумовлено полігенами та дією домінантного специфічного гена модифікатора.

ХАРАКТЕРИСТИКА ФОРМ КУКУРУДЗИ З ГЕНОМ Vg ЗА ОЗНАКОЮ „СТЕРИЛЬНІСТЬ-ФЕРТИЛЬНІСТЬ”

Чоловіча стерильність у форм з домінантним алелем Vg обумовлена дегідратацією андроцею і залежить від експресивності гена Vg (ступеня відкритості андроцею).

В польових умовах проведено вивчення ознаки „стерильність-фертильність” у рослин всіх поколінь беккросу, включаючи шосте покоління. Ступінь відкритості андроцею була близькою у всіх поколінь беккросу однієї лінії.

Лінія Гк26зМVg має генотип Vgvg Enh(Vg)Enh(Vg), який визначає сильне вкорочення лусок (коефіцієнт експресивності 7). В першому поколінні 65 % рослин були напівстерильними (табл. 4). По мірі беккросування відбувалось зменшення кількості фертильних рослин. Починаючи з другого покоління бек кросу, більшість рослин була стерильною. В третьому та подальших поколіннях беккросу всі рослини були повністю стерильними. Такий прояв стерильності характерний для всієї групи ліній з тим же генотипом.

Така ж тенденція спостерігалася і у лінії П346зМVg. Як було визначено раніше, ця лінія за геном модифікатором має генотип enh(Vg)enh(Vg). Лінія П346зМVg характеризує найбільшу групу ліній з генотипом Vgvg enh(Vg)enh(Vg). Коефіцієнт експресивності становив 1,7 у рослин першого покоління та 1,9 у рослин шостого беккросу. Повноцінний пилок формувався тут навіть у рослин четвертого беккросу, але вже в третьому поколінні беккросу кількість стерильних рослин становила 95%. Рослини п’ятого і шостого беккросів були повністю стерильними.

На відміну від інших ліній у F7зСVg слабка експресивність домінантного алеля гена Vg обумовлює відсутність стабільної чоловічої стерильності. Більшість рослин всіх поколінь беккросу, включаючи шосте покоління, відноситься до класу напівфертильних (4 бали) та напівстерильних рослин (3 бали).

Таблиця 4

Розподіл рослин з генотипом Vgvg за ступенем прояву ознаки „стерильність-фертильність” (%)

Лінії | бали стериль-ності | F1Вс1Вс2Вс3Вс4Вс5Вс6

Гк26зМ | 1 | - | 72 | 89 | 100 | 100 | 100 | 100

2 | 19 | 20 | 11 | - | - | - | - | 3 | 65 | 8 | - | - | - | - | - | 4 | 16 | - | - | - | - | - | - | 5 | - | - | - | - | - | - | - | П346зМ | 1 | - | - | 76 | 95 | 98 | 100 | 100

2 | - | 26 | 21 | 5 | 2 | - | - | 3 | 14 | 58 | 3 | - | - | - | - | 4 | 62 | 16 | - | - | - | - | - | 5 | 24 | - | - | - | - | - | - | F7зС | 1 | - | - | - | - | 1 | 1 | 2

2 | - | - | - | 7 | 14 | 14 | 11 | 3 | - | - | 8 | 41 | 32 | 40 | 43 | 4 | 45 | 67 | 81 | 52 | 43 | 45 | 44 | 5 | 65 | 33 | 11 | - | - | - | - |

В польових умовах проведено вивчення дев’яти комерційно-цінних гібридів з геном Vg, компонентами яких були лінії F7зС, П346зМ та Гк26зМ. Всі гібриди мали повноцінний рівень фертильності.

Внаслідок вивчення рівня фертильності у аналогів ліній, проміжних беккросних поколінь та гібридів першого покоління, встановлено, що із збільшенням рівня гомозиготності при беккросуванні гена Vg відбувається зменшення кількості фертильних рослин. І навпаки, високий рівень гетерозиготності гібридних рослин з домінантним алелем гена Vg сприяє відновленню фертильності. Простежується залежність ознаки „стерильність-фертильність” від коефіцієнту експресивності, а значить і від ступеня відкритості андроцею. Лінія F7зСVg має неповну чоловічу стерильність, а лінії Гк26зМVg та П346зМVg характеризуються повною чоловічою стерильністю в польових умовах. Отже, домінантний алель гена Vg в комбінації із специфічним геном модифікатором Enh(Vg) може бути використаний в ГСКР як детермінант чоловічої стерильності, а відновлення фертильності в такій системі буде забезпечуватись гетерозиготністю гібридів першого покоління.

Встановлено, що поєднання домінантного алеля гена Vg з нестабільним молдавським типом цитоплазматичної чоловічої стерильності призводить до стабілізації чоловічої стерильності.

РОЗМНОЖЕННЯ СТЕРИЛЬНИХ ФОРМ З ГЕНОМ Vg

Розмноження функціонально стерильних форм з домінантним алелем гена Vg можливе шляхом технічного відтворення нормальних умов розвитку андроцею. Нами встановлено, що ізоляції волоті, при її виході із розтруба, верхніми листками, з фіксацією їх навколо волоті, дозволяє отримувати фертильний пилок в польових умовах.

Іншим шляхом отримання фертильного пилку є створення генотипів з додатковим геном структури суцвіть, який призводитиме до модифікації морфологічної будови волоті з ізоляцією частини пиляків. Серед генів, що змінюють морфологічну будову волоті, і сприяли б формуванню фертильного пилку, нами було вибрано гени tk, ad1 та Tu. Створено та вивчено генотипи: Vg-tktk, Vg-ad1ad1 та Vg-Tu- (рис 3). У рослин з генотипом Vg-Tu- спостерігається адитивна взаємодія домінантних генів, яка призводить до відновлення нормальної довжини лусок на чоловічому суцвітті і формування повноцінних пилкових зерен. Встановлено що гени tk та ad1 мають незалежний від гена Vg фенотиповий ефект. У рослин з генотипами Vg-tktk та Vg-ad1ad1 частина колосків знаходиться в середині волоті і ізольована від зовнішнього середовища, що призводить до нормального розвитку андроцею цих колосків. Такі рослини є функціонально-стерильними, але нормальний розвиток частини пиляків дозволяє розмножувати їх шляхом примусового вивільнення пилку.

Схема розмноження Vg-стерильних форм з використанням домінантного гена Tu показано на рис. 4. Схема передбачає створення аналогів ліній з генотипами VgVgTutu та VgVgtutu і їх сумісне розмноження, на кінцевому етапі рослини з генотипом VgVgTutu видаляють, а запилення рослин з генотипом VgVgtutu пилком лінії (vgvgtutu) призводить до отримання стерильних форм (Vgvgtutu).

При використанні рецесивного гена tk стерильні форми розмножують примусовим вивільненням пилку, а від схрещування їх з оригінальною лінією отримують стерильні нащадки (рис. 5). Аналогічно використовують ген ad1.

VgVg tutu

стерильні |

Ч | VgVgTutu фертильні | VgVg tktk

стерильні (вивільнення пилку) | vgvg TkTk

фертильні | VgVgTutu

фертильні, видаля-

ються | VgVg tutu

стерильні |

Ч | vgvg tutu

фертильні | VgVg tktk

стерильні |

Ч | vgvgTkTk

фертильні | Vgvg tutu

стерильні | Vgvg Tktk

стерильні | Рис. 4 Схема розмноження Vg-стерильних форм з використанням домінантного гена Tu. | Рис. 5 Схема розмноження Vg-стерильних форм з використанням рецесивного гена tk. |

Використання генів ad1, tk та Tu дозволяє розмножувати форми з домінантним алелем гена Vg.

ПЛЕЙОТРОПНИЙ ЕФЕКТ ГЕНА Vg

Домінантний алель гена Vg впливає на розвиток лігули та лодікули, на висоту рослин та насіннєву продуктивність, що дало підстави для висновку про системний ефект домінантного алеля гена Vg (Tracy, 1993; Galinat, 1993).

При отриманні гібридного насіння з використанням стерильних форм, гетерозиготних за геном Vg, домінантний алель буде присутній у половини рослин, а при використанні гомозиготних форм (VgVg) – у всіх рослин гібридів першого покоління. В зв’язку з цим проводили вивчення його впливу на господарськоцінні ознаки: висоту рослин, висоту прикріплення качану, довжину вегетаційного періоду, ураженість хворобами, збиральну вологість насіння та насіннєву продуктивність.

Коізогенні форми не відрізнялись за спектром та ступенем ураженості хворобами. Вони також не відрізнялись за довжиною вегетаційного періоду.

Нашими дослідженнями встановлено, що у більшості вивчених генотипів коізогенні форми з генотипами Vgvg та vgvg достовірно не відрізняються за висотою рослин та висотою прикріплення качана (табл. 5). Враховуючи, що у коізогенних форм закладання качана відбувається на одних і тих же вузлах, виявляється тенденція до збільшення довжини міжвузль до качана та зменшення довжини міжвузль вище місця прикріплення качана.

Насіннєва продуктивність рослин – основна комплексна ознака, яка формується за участю всіх систем рослинного організму. Отримані дані свідчать про загальну тенденцію до зниження насіннєвої продуктивності у коізогенних форм, однак різниця в більшості випадків була недостовірною.

Проведений аналіз по збиральній вологості насіння показав зменшення вологості у форм з домінантним алелем гена Vg. Достовірне зниження вологості насіння відмічено у ліній та гібридів з тривалим вегетаційним періодом.

Серед причин швидкого висихання зерна у рослин з домінантним алелем гена Vg найімовірнішою є відсутність лусок на качані, тому що за більшістю морфоанатомічних ознак коізогенні форми ідентичні. Швидке висихання зерна у кукурудзи – полігенна ознака, а створення форм з цією ознакою вимагає значних селекційних затрат. Введення домінантного алеля гена Vg методом беккросу в існуючі лінії та гібриди є мало затратним способом створення швидковисихаючих форм кукурудзи з пониженою збиральною вологістю.

Таблиця 5

Порівняння коізогенних Vgvg та vgvg форм за господарськоцінними ознаками

Лінії та гібриди | Висота рослин, см

n=30 | Висота прикріплення качану, см

n=30 | Насіннєва продуктивність, г

n=30 | Збиральна вологість насіння, %

n=10

Генотип | Різниця | Генотип | Різниця | Генотип | Різниця | Генотип | Різниця

vgvg | Vgvg | см | % | vgvg | Vgvg | см | % | vgvg | Vgvg | г | % | vgvg | Vgvg | абсолютних. %

F7зС | 1323,4 | 1282,1 | -4 | 3,0 | 282,3 | 292,1 | +1 | 3,6 | 33,81,8 | 32,41,2 | -1,4 | 4,1 | 28,10,2 | 26,90,9 | 1,2

П346зМ | 1462,2 | 1431,1 | -3 | 2,1 | 521,6 | 541,3 | +2 | 3,8 | 57,11,3 | 56,22,5 | -0,9 | 1,6 | 32,11,0 | 29,71,2 | 1,4

Гк26зМ | 1412,6 | 1393,2 | -2 | 1,4 | 602,2 | 622,3 | +2 | 3,3 | 74,32,2 | 65,53,2 | -8,8* | 11,8 | 36,90,7 | 32,10,9 | 4,9*

П3978 (П346 Ч П502) | 1704,2 | 1562,8 | -14* | 8,2* | 722 | 732,1 | +1 | 1,4 | 254,03,2 | 251,33,5 | -2,7 | 1,1 | 32,50,6 | 31,80,6 | 1,3

Дружба (F7 Ч F2) | 1694,3 | 1643,5 | -5 | 3,0 | 832,1 | 855,3 | +2 | 2,4 | 201,03,6 | 199,03,1 | -2,0 | 1,0 | 28,30,6 | 26,50,6 | 1,8

Гк26 Ч F2 | 1653,2 | 1582,8 | -7* | 4,2* | 752,2 | 754,3 | +0 | 0 | 238,02,9 | 234,03,2 | -4,0* | 1,7 | 35,20,7 | 31,20,6 | 4,0*

П3978 Ч Чк62 | 1673,5 | 1682,5 | -1 | 0,6 | 652,7 | 661,3 | +1 | 1,5 | 212,04,3 | 210,02,5 | -2 | 0,9 | 36,20,8 | 31,30,3 | 4,9*

П3978 Ч Чк73 | 1553,2 | 1522,8 | -3 | 1,9 | 53,22 | 562,2 | +3 | 5,6 | 231,02,6 | 224,05,2 | -7* | 3,0 | 32,40,2 | 30,50,3 | 1,9

П3978 Ч D-Ве42 | 1982,5 | 1914,7 | -8* | 4,0* | 632,7 | 662,0 | +3 | 4,8 | 216,02,5 | 213,04,6 | -3 | 1,4 | 30,01,1 | 27,01,2 | 3,0*

П3978 Ч Со125 | 1932,1 | 1844,0 | -9* | 4,7* | 791,8 | 856,2 | +6* | 7,6 | 193,04,8 | 189,03,8 | -4 | 2,1 | 31,50,5 | 29,90,5 | 1,6

Дружба Ч D-Ве42 | 1864,1 | 1823,9 | -4 | 2,2 | 834,8 | 893,2 | +6* | 7,2 | 247,02,7 | 243,02,3 | -3 | 1,2 | 29,80,7 | 26,60,6 | 3,2*

Дружба Ч Со125 | 1772,5 | 1743,4 | -3 | 1,7 | 786,9 | 834,5 | +5 | 6,4 | 203,04,3 | 200,02,5 | -3 | 1,5 | 27,31,2 | 25,72,3 | 1,6

*Різниця достовірна при Р 0,05

РЕАЛІЗАЦІЯ ГСКР НА ОСНОВІ ГЕНА ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ ЧОЛОВІЧОЇ СТЕРИЛЬНОСТІ Vestigial glume

Проведені дослідження дозволяють запропонувати цілісну генетичну систему контрольованого розмноження та її практичну реалізацію (рис. 6).

Стерильність материнської форми забезпечується наявністю домінантного алеля гена Vg та наявністю домінантного специфічного гена модифікатора Enh(Vg), а також рівнем гомозиготності генотипу. Розмноження стерильних форм проводиться шляхом використання генів, що модифікують морфологію чоловічого суцвіття і дозволяють отримувати пилок у рослин з домінантним алелем гена Vg. Відновлення фертильності у гібридів першого покоління відбувається за рахунок високої гетерозиготності та розщепленням за геном Vg.

Отримання простих гібридів на основі гена функціональної стерильності Vg: гомозиготну за геном Vg стерильну форму А' схрещують з оригінальною лінією А (генотип vgvg), отримана гетерозиготна форма Vgvg є чоловічостерильною і використовується для отримання гібридного насіння (патент № 40276).

Для отримання простого гібриду, гетерозиготного за геном Vg: на ділянках гібридизації використовується як материнська гомозиготна за геном Vg інбредна лінія. Схема може бути використана для отримання гібридного насіння цукрової кукурудзи. Домінантний алель гена Vg викликає недорозвиненість колоскових та квіткових лусок також на жіночому суцвітті. Відсутність лусок на качані цукрової кукурудзи господарськоцінна ознака. Таким шляхом вирішується проблема отримання гібридного насіння та покращення якості (відсутність лусок на качані) цукрової кукурудзи.

ВИСНОВКИ

1. Серед існуючих генетичних систем контрольованого розмноження кукурудзи широке застосування має система на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності та генів закріплення-відновлення, однак її практичне використання призводить до уніфікації плазми, що стає причиною виникнення епіфітотій, використання генетичних систем контрольованого розмноження на основі генів функціональної чоловічої стерильності дозволяє вирішити проблему отримання гібридного насіння без уніфікації плазми.

2. Запропоновано нову генетичну систему контрольованого розмноження кукурудзи на основі генів функціональної чоловічої стерильності, яка включає: ген Vg та його домінантний специфічний модифікатор Enh(Vg), що детермінують стабільну чоловічу стерильність у інбредних форм кукурудзи, гени tk, ad1, Tu, які забезпечують відновлення фертильності у інбредних форм з генотипом VgVg Enh(Vg)Enh(Vg) та відновлення фертильності у гетерозисних гібридних рослин.

3. Експресивність домінантного алеля гена Vg не залежить від умов зовнішнього середовища, але залежить від генетичного фону. Лінії з геном Vg проявляють значну мінливість за ступенем редукції елементів колоску: від сильної (лінія Гк26зМ) до незначної (лінія F7зС) редукції.

4. Ідентифіковано новий домінантний специфічний ген модифікатор Enhancer(Enh(Vg)), який детермінує значну редукованість елементів колоску у форм з домінантним алелем гена Vg, його наявність у інбредних ліній з домінантним алелем гена Vg забезпечує стабільну чоловічу стерильність.

5. Встановлено ефект залежності ступеня прояву ознаки „стерильність-фертильність” у форм з домінантним алелем гена Vg від рівня гетерозиготності. При однаковій експресивності у ліній і гібридів домінантного алеля гена Vg, високий рівень гомозиготності генотипу обумовлює повну чоловічу стерильність, що дозволяє використовувати інбредні лінії як стерильний материнський компонент, а високий рівень гетерозиготності сприяє відновленню фертильності, що дозволяє отримувати фертильні гібриди першого покоління.

6. Встановлено, що у генотипів tktkVg- та ad1ad1Vg- гени мають незалежний прояв та детермінують утворення зрослої волоті з редукованими колосковими та квітковими лусками, частина пиляків знаходиться в середині волоті і формує функціонально активний пилок, що дозволяє розмножувати стерильні форми з домінантним алелем гена Vg. Адитивна взаємодія генів Tu та Vg обумовлює нормальну довжину колоскових лусок на чоловічому суцвітті, що дозволяє розмножувати стерильні форми з домінантним алелем гена Vg.

7. У більшості вивчених нами ліній та гібридів коізогенні форми за геном Vg достовірно не відрізняються за висотою рослин, висотою прикріплення качана, довжиною вегетаційного періоду та насіннєвою продуктивністю, що дозволяє використовувати домінантний алель гена Vg в генетичних системах контрольованого розмноження. Рівень збиральної вологості насіння нижче у форм гетерозиготних за геном Vg, ніж у рецесивних гомозигот (vgvg) на 1-5%, що дозволяє створювати форми кукурудзи зі зниженою збиральною вологістю зерна шляхом введення гена Vg.

8. Ідентифіковано новий ген tassel knit (tk), рецесивний алель якого детермінує деформацію та зростання елементів волоті, в результаті чого не відбувається вивільнення пилку і виникає функціональна чоловіча стерильність, що дає можливість використовувати його як чинник чоловічої стерильності в генетичній системі контрольованого розмноження.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Парій М.Ф. Використання гена Vestigial glume в селекції та насінництві кукурудзи // Науковий вісник Національного аграрного університету.-2001.- № 37.-С. 32-35.

2. Парій М.Ф. Експресія гена Vestigial glume у кукурудзи // Науковий вісник Національного аграрного університету.-2002.- № 48.-С. 171-175.

3. Парій М.Ф. Новий ген структури суцвіть кукурудзи // Цитологія і генетика . – 2002.-Т.36, №6.-С. 35–37.

4. Парій М.Ф. До питання еволюції кукурудзи при доместикації // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. – К: Аграрна наука, 2004. – С. .

5. Патент України на винахід 56351, МПК7 А 01Н1/04. Спосіб отримання гібридного насіння кукурудзи. / М.Ф. Парій, Я.Ф. Парій. -№.2001064153; Заявлено 15. 06. 2001; Опубліковано 15. 05. 2003, Бюл. № 5. 2003.

6. Патент України на винахід 40276, МПК6