НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ПІРКО Надія Миколаївна

УДК 575:581.4:582.475.2(477)

ПОПУЛЯЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНА МІНЛИВІСТЬ ЯЛИЦІ БІЛОЇ

(ABIES ALBA MILL.) В УКРАЇНСЬКИХ КАРПАТАХ

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі промислової ботаніки Донецького

ботанічного саду НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Коршиков Іван Іванович,

Донецький ботанічний сад НАН України,

завідувач відділу промислової ботаніки.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Терновська Тамара Костянтинівна,

Національний університет “Києво-Могилянська академія”,

завідувач кафедри біології;

кандидат біологічних наук

Морозов-Леонов Святослав Юрійович,

Інститут зоології ім. І.І. Шмальгаузена НАН України,

науковий співробітник.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

м. Київ

Захист відбудеться "_28_" _квітня__ 2005 р. о _14_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано "_24_" __березня___ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О. А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У вивченні біологічної різноманітності видів популяційний рівень є одним з ключових, оскільки дозволяє з’ясувати фактори й умови спадкової стійкості головного елементу виду – його популяцій. В наш час, коли популяційні системи багатьох видів рослин зазнають катастрофічного зменшення площ, змін чисельності, вікової та просторової структури завдяки прямій або опосередкованій господарській діяльності людини, особливого значення набувають дослідження незайманих популяцій, де ще зберігся еволюційно сформований оптимум генетичної різноманітності виду (Алтухов, 2003). Визначення особливостей генетичної структури популяцій виду в межах ареалу або в контрастних еколого-ценотичних умовах його частини, а також в різних демографічних елементах популяцій дозволяє отримати інформацію про рівень генетичної різноманітності виду, унікальність генофонду окремих популяцій, встановити напрямок розвитку в них генетичних процесів та з’ясувати, наскільки їм загрожує інбредна депресія – один з головних чинників генетичної ерозії популяцій (Айала, 1984; Алтухов та ін., 1996; Коршиков та ін., 2002; Politov, Krutovsky, 2004). В цьому напрямку найбільшої уваги потребують головні лісоутворюючі цінні види, які в останні роки зазнають надмірної господарської експлуатації. До таких видів належить і ялиця біла (Abies alba Mill.), площі природних популяцій якої в Українських Карпатах за останні століття значно скоротились і потребують охорони та відтворення (Мілкіна, 1983; Швиденко, 1985; Голубець, 1988; Тереля, 1989).

Якщо паралельно з дослідженнями індивідуальної та популяційної генетичної мінливості вивчати репродукційну біологію виду, його потенціальну та фактичну насіннєву продуктивність, систему схрещування, то це дозволяє закласти теоретичне і практичне підґрунтя для розробки необхідних заходів щодо збереження і відтворення стійких і продуктивних насаджень. В цілому пошук зв’язків між моногенною та полігенною мінливістю видів є першочерговим завданням сучасної генетики (Созінов, 1985; Алтухов,1989; Глазко, 2001; Парій, 2004). Стосовно третьої лісогосподарської породи в Українських Карпатах – A. alba, то визначення рівня генетичної мінливості виду, з’ясування ступеня відтворення генетичної структури материнських дерев в зародках їх насіння, аналіз системи схрещування, пошук зв’язку між гетерозиготністю і кількісними полігенними показниками рослин вивчалось фрагментарно або зовсім не аналізувалось (Longauer et al., 1996, 2002; Гончаренко, 1999).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі промислової ботаніки Донецького ботанічного саду НАН України. Дослідження є складовою частиною бюджетних тем: “Вивчення популяційно-генетичних механізмів стійкості хвойних у зв’язку з проблемами охорони їх генофонду, лісорозведення, фітомоніторингу в Україні” (1998 – 2002 рр.), № ДР 0198U002101, “Дослідження генного різноманіття та факторів генетичної стійкості популяційних систем головних лісоутворюючих видів України з метою їх збереження в екологічно кризових регіонах та селекційного поліпшення” (2002 – 2006 рр.), № ДР 0102U004909, “Дослідження внутрішньовидової генетичної різноманітності рідкісних, зникаючих та інтродукованих видів родини Pinaceae Lindl. в Україні” (2003 – 2007 рр.), № ДР 0103U004181.

Мета та завдання дослідження. Мета – дослідити популяційно-генетичну структуру і фенотипічну мінливість A. alba в Українських Карпатах та особливості відтворення генетичної різноманітності материнських рослин цього виду у зародках насіння, а також з’ясувати вираженість деяких морфологічних ознак і репродуктивних показників залежно від гетерозиготності рослин. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження. Об’єктом дослідження була популяційно-генетична мінливість природних популяцій A. albа в Українських Карпатах.

Предмет дослідження. Генетична структура та диференціація популяцій A. albа, взаємозв’язок між гетерозиготністю рослин та показниками, що характеризують їх статеву репродукцію.

Методи дослідження. Електрофоретичне розділення у поліакріламідному гелі 11 ферментів з ендоспермів та 4 ферментів із зародків насіння A. albа. Кількісний аналіз індивідуальної та популяційної мінливості репродуктивних показників. Статистичні методи популяційної генетики.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено генетичний контроль 11 ген-ферментних систем та зчеплення алозимних локусів A. alba. Вперше в межах природного ареалу в Українських Карпатах проведено аналіз популяційно-генетичної мінливості A. аlba та вивчено особливості генетичної структури восьми популяцій, їх підрозділеність та диференціацію, досліджено генетичні аспекти статевої репродукції. Встановлено дефіцит гетерозиготних генотипів у насіннєвому потомстві цього виду, що є наслідком високого рівня самозапилення. Відмічено, що висока гетерозиготність рослин у A. alba не є основним чинником, що обумовлює високий вихід порожнього насіння. Проведено пошук зв’язків між мінливістю генетичних (ізоферментні локуси) та морфологічних (полігенних) ознак, що може бути використано в подальшому для виділення селекційно перспективних дерев та селекційного насінництва A. alba. Встановлено, що групи рослин ялиці білої, що відрізняються за розрахунковими індексними характеристиками, мають і певні генетичні відмінності. вперше для A. alba виділено феномаркери, за якими диференціація популяцій була подібна до тієї, що отримано на основі аналізу генетичних ознак.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведеного моніторингу генетичної структури популяцій A. alba на територіях Українських Карпат, що охороняються, доцільно використовувати при розробці нових комплексних державних і регіональних програм щодо збереження та штучного відтворення деревостанів цієї важливої лісогосподарської породи. Отримані дані стосовно індивідуальної мінливості A. alba за насіннєвою продуктивністю та системою схрещування, а також їх залежність від генетичних особливостей рослин можуть бути використані в генетико-селекційних дослідженнях цього виду.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним завершеним дослідженням, вона базується на особисто зібраних матеріалах та виконаних експериментальних дослідженнях протягом навчання в аспірантурі в 2000 – 2003 рр., опрацьованих і проаналізованих автором впродовж 2000 – 2004 рр. З коллективно надрукованих робіт в дисертації використано матеріали, що отримані автором самостійно. Права співавторів публікацій не порушені при викладанні дисертації та автореферату.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи апробовано на конференції “Рослини та промислове середовище” (м. Дніпропетровськ, 17-20 вересня 2001), на міжнародній конференції аспірантів і студентів “Охорона навколишнього середовища та раціональне використання природних ресурсів” (м. Донецьк, 16-18 квітня 2002), на науковій конференції “Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно змінених територіях” (м. Кривий Ріг, 13-16 травня 2002), І Міжнародній науковій конференції “Відновлення порушених природних екосистем” (м. Донецк, 24-27 вересня 2002), на II Міжнародній конференції з анатомії та морфології рослин (м. Санкт-Петербург, 14-18 жовтня 2002), VIII конференції молодих учених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (м. Київ, 23-25 жовтня 2002 ), II конференції Московської спілки генетиків та селекціонерів “Актуальные проблемы генетики” (м. Москва, 20-21 лютого 2003), на науковій конференції студентів, аспірантів і молодих учених “Биоразнообразие, экология, эволюция, адаптация” (м. Одеса, 28 березня – 1 квітня 2003), IV Міжнародній конференції “Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” (м. Донецьк, 17-19 вересня 2003); на науково-практичній конференції “Збереження біорізноманітності на південному сході України” (м. Донецк, 14 вересня 2004), а також на засіданнях відділу промислової ботаніки і Вченої ради Донецького ботанічного саду НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових праць, включаючи 10 статей у періодичних фахових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів, висновків, списку використаних джерел (397 публікацій, в тому числі – 179 іноземних) та додатку. Дисертацію викладено на 260 сторінках машинопису, з яких 86 сторінок займають 45 таблиць, 21 сторінку – 33 ілюстрації, 43 сторінки – список використаних джерел, 57 сторінок – додатки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

(огляд літератури)

Огляд літератури складається з двох підрозділів, в яких розглядаються проблеми використання генетичного поліморфізму білків та мінливості морфологічних ознак у популяційно-генетичних дослідженнях різних видів рослин.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В Українських Карпатах під час самостійних експедиційних обстежень у 2001-2002 рр. для досліджень було визначено вісім популяцій A. alba в основних місцях розповсюдження цього виду від Старого Самбору (Львівська обл.) до Берегомета (Чернівецька обл.) (рис 1). В дослідженнях використовували найбільш старі дерева висотою 25 – 35 м, які випадково відбирали в цих популяціях (табл. 1). Всього було задіяно 315 дерев. З кожного дерева збирали до 5 нормально розвинутих жіночих шишок, у яких вивчали мінливість морфологічних ознак насіннєвих лусок і насінин з середньої частини кожної шишки, а також визначали кількість фертильних лусок, повного, порожнього, а також повномірного та неповномірного насіння. Для визначення генотипу дерева використовували сукупність зібраного здорового повного насіння.

Рис. 1 Схема розташування досліджених популяцій Abies alba Mill. в

Українських Карпатах (лініями виділений ареал виду)

Таблиця 1

Характеристика досліджуваних популяцій Abies alba Mill.

Назва популяції | Місцезнаходження | Роль

A. alba у деревостані | Середній вік рослин,

роки | Кіль-кість дерев у вибірці, шт.

повна | скоро-чена назва | область | висота над рівнем моря, м

Самбірська | САМ | Львівська | 600-650 | домінант | 100 | 29

Сколівська | СКЛ | Львівська | 500 | субдомі-нант | 140 | 40

Осмолодська | ОСМ | Івано-Франківська | 700-750 | субдомі-нант | 150 | 50

Делятинська | ДЕЛ | Івано-Франківська | 750-800 | субдомі-нант | 190 | 39

Бредулецька | БРД | Івано-Франківська | 850 | асектатор | 125 | 44

Говерлянська | ГОВ | Івано-Франківська | 1000 | асектатор | 125 | 40

Вижницька | ВИЖ | Чернівецька | 600 | домінант | 100 | 43

Міжгірська | МІЖ | Закарпатська | 850 | субдомі-нант | 180 | 30

В якості генетичних маркерів використовували ізоферменти 11 ферментів, що екстрагувалися бідистильованою водою з восьми ендоспермів насіння кожного дерева. Зчеплення алозимних локусів вивчали, використовуючи ізоферменти 6 (GOT, ADH, ACP, EST, MDH, ME), а систему схрещування – 4 (GOT, ADH, ACP, EST) ферментних систем. Для цього проводили одночасно електрофоретичний аналіз ізоферментів ендосперму та зародка насінини. Електрофоретичне розділення ферментів виконували на приладі ЕЛФ-2 конструкції К. А. Трувеллера, М. Н. Нефедова (1974) у вертикальних пластинках 7,5%-ного поліакріламідного гелю за методикою Б. Девіс (1964) в модифікації В. Д. Сафонова і М. П. Сафонової (1971). Гістохімічне проявлення зон ферментативної активності проводили за стандартними методиками (Корочкин и др., 1977; Левитес, 1986; Гончаренко и др., 1989). Для визначення генотипу аналізували ферменти 6-20 і більше ендоспермів насіння, а для оцінювання генетичної структури в зародках і системи схрещування використовували не менше 5 зародків з кожного дерева. В аналізах рівня генетичної мінливості і диференціації популяцій використовували найбільш уживані методи та показники, що застосовуються у популяційно-генетичних дослідженнях (Алтухов, 1989; Животовский, 1990; Гончаренко и др., 1992). Оцінку параметрів системи схрещування проводили за допомогою комп’ютерної програми MLTR (Ritland, 2002).

УСпадкування алозимів та зчеплення ізоферментних локусів у ABIES ALBA Mill.

Генетичний контроль ізоферментних систем. У результаті електрофоретичного розділення ізоферментів 11 ферментних систем A. alba виявлено 75 алельних варіантів – продуктів 24 алозимних локусів. Генетичний контроль цих алелів встановлено на основі їх розщеплення в гаплоїдних ендоспермах гетерозиготних дерев. Алелі, що траплялися у цього виду з найбільшою частотою, позначали як 1,00, а електрофоретичну рухомість усіх інших алелів визначали відносно алелів 1,00 (Prakash, 1969).

Аспартатамінотрансфераза (GOT, К. Ф. 2.6.1.1). Цей фермент проявлявся на гелевих пластинках у вигляді чотирьох зон активності, що кодуються трьома локусами: Got-1, Got-2, Got-3. Локуси Got-1 та Got-2 представлені на гелях поодинокими, а Got-3 – двома синхронно мігруючими смугами активності. У A. alba в локусі Got-1 визначено 3 алелі, а в локусах Got-2 і Got-3 – 4 алелі.

Глутаматдегідрогеназа (GDH, К. Ф. 1.4.1.2). При гістохімічному забарвленні проявляється одна зона активності ферменту, що контролюється одним локусом – Gdh. У ялиці білої він виявився слабополіморфним.

Діафораза (DIA, К. Ф. 1.6.4.3). Електрофоретичний спектр цього ферменту складається з чотирьох зон активності, що контролюються чотирма локусами Dia-1, Dia-2, Dia-3 та Dia-4. В локусі Dia-1 виявлено 4 алелі; у Dia-2 і Dia-3 – по три алелі, а Dia-4 – 2 алелі.

Малатдегідрогеназа (MDH, К. Ф. 1.1.1.37). На електрофоретичній пластинці відмічено багато зон активності ферменту, що кодуються чотирма локусами – Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3 та Mdh-4. Локуси Mdh-1 та Mdh-3 проявлялися нестабільно, тому не аналізувалися. В локусі Mdh-2 виявлено 3, а у Mdh-4 – 1 алельні варіанти.

Малік-ензим (МЕ, К.Ф. 1.1.1.40). На електрофореграмах проявлялося багато зон активності, найбільш стабільними з них були ті, що контролюються локусами Ме-2 та Ме-4. Локус Ме-2 був представлений 5 алелями, а Ме-4 – двома.

Супероксиддисмутаза (SOD, К. Ф. 1.15.1.1). На електрофореграмах цей фермент представлений чотирма зонами активності, що кодуються чотирма локусами Sod-1, Sod-2, Sod-3 та Sod-4. У A. alba локуси Sod-1 та Sod-4 проявлялися нестабільно, тому були виключені з аналізу. Локус Sod-2 у цього виду виявився мономорфним, а Sod-3 мав два алелі.

Форміатдегідрогеназа (FDH, К. Ф. 1.2.1.2). При проявленні цього ферменту на гелевих пластинках відмічено одну зону активності, що кодується одним локусом – Fdh. Визначено 4 алелі цього локусу.

Алкогольдегідрогеназа (ADH, К. Ф. 1.1.1.1). Цей фермент на гелевих пластинках мав дві зони активності, що кодуються двома локусами Adh-1 та Adh-2. У локусі Adh-1 виявлено 3 алелі, а у локусі Adh-2 – 4 алелі.

Кисла фосфатаза (ACP, К. Ф. 3.1.3.2). При гістохімічному забарвленні на гелевих пластинках проявляється до п’яти зон активності ферменту, що кодуються трьома локусами: Аср-1, Аср-2 та Аср-3. Спектри локусів Аср-1 та Аср-3, на відміну від Аср-2, були представлені двома синхронно мігруючими смугами. У локусі Acp-1 виявлено три алелі, а в Аср-2 та Аср-3 – по чотири.

Лейцинамінопептидаза (LAP, К. Ф. 3.4.11.1). У A. alba цей фермент проявлявся у вигляді багатьох зон активності, що контролюються в цілому трьома локусами: Lap-1, Lap-2 та Lap-3. Локуси Lap-2 та Lap-3 на електрофореграмах проявлялися нестабільно, тому в подальшому не аналізувалися. В локусі Lap-1 виявлено 3 алельні варіанти.

Естераза (EST, К.Ф. 3.1.1.1). У переважній більшості випадків проявляється чотири зони активності фермента, що кодуються локусами Est-1, Est-2, Est-3, Est-4. Зона, що кодується локусом Est-3, проявлялась нестабільно, тому в подальшому не аналізувалась. Локус Est-1 виявився мономорфним. В локусі Est-2 ідентифіковано 4 алельні варіанти, а в Est-4 – п’ять.

Аналіз сегрегації електрофоретичних варіантів гетерозигот підтверджує, що виявлені алелі кожного локусу у A. alba успадковуються як моногенні ознаки (Коршиков, Морозова, Пірко, 2003).

Зчеплення алозимних локусів У A. alba досліджено зчеплення між 12 алозимними локусами: Got-1, Got-2, Got-3, Acp-1, Acp-2, Acp-3, Est-2, Est-4, Adh-1, Adh-2, Mdh-2, Me-2. З 66 можливих пар комбінацій ізоферментних локусів було проаналізовано 51. Вісім пар локусів були представлені в популяціях поодинокими деревами, 13 – двома, 30 – трьома і більшою кількістю дерев. Аналіз сумісної сегрегації алелів за досліджуваними парами локусів дає підставу стверджувати про ймовірне зчеплення локусів: Adh-1 : Adh-2; Acp-2 : Acp-3; Mdh-2 : Me-2 з частотами рекомбинації 0,300±0,031, 0,253±0,022 та 0,214±0,045. У пари локусів Acp-2 : Acp-3 відмічено гетерогенність сегрегаційних відносин алельних варіантів, що свідчить про наявність у цих локусів різних фаз зчеплення. Тісно зчеплені локуси небажано використовувати в аналізі системи схрещування A. alba.

генетична структура та диференціація популяцій

Abies alba Mill. в українських карпатах

В загальній вибірці з 315 дерев A. alba визначено 75 алельних варіантів і 107 генотипів досліджених 24 алозимних локусів. Три локуси: Mdh-4, Sod-2, Est-1 були мономорфними. Найбільш мінливі у A. alba локуси: Got-3, Adh-1, Est-2, Est-4, Adh-2, Acp-2 і Acp-3, середня наявна гетерозиготність яких в досліджених популяціях варіювала від 29,2 до 58,7%. У всіх популяціях за всіма локусами, за винятком окремих випадків за локусами Аср-2 та Аср-3, частота алеля 1,00 була вище 0,500. Згідно з оцінками за стандартним 2-тестом міжпопуляційна алельна гетерогенність властива для 12, а генотипів – для 7 з 21 поліморфного локуса. Найбільший внесок у генетичну гетерогенність популяцій A. alba здійснюють локуси Dia-4, Adh-1 і Acp-2. Наявний розподіл генотипів у переважній більшості локусів відповідає очікуваному, згідно закону Харді-Вайнберга, за винятком 1 – 2 локусів. В цілому таке тестування показало, що шість популяцій знаходяться в стані генетичної рівноваги, а дві (ОСМ, ВИЖ) мають істотні відхилення. На підставі аналізу 24 локусів у досліджених популяціях A. alba було розраховано основні показники генетичного поліморфізму (табл. 2). Частка поліморфних локусів A. alba за 99%-ним критерієм в середньому становила 66,8%, середня кількість алелів на локус (А) – 2,15, генотипів (Pg) – 2,71, а середньозважені оцінки НО та НЕ були відповідно 0,1590,004 і 0,1620,004. На східній межі ареалу A. alba найбільш генетично різноманітними були популяції брд, гов, виж, скл, а значно менший рівень мали дві популяції – осм та між. Ступінь підрозділеності популяцій A. alba був незначним. Параметри FST і GST мали дуже близькі та невисокі значення – 0,018 і 0,019. Це свідчить, що 98% всієї генетичної мінливості A. alba в Українських Карпатах припадає на внутрішньопопуляційну і тільки 2% – на міжпопуляційну мінливість. Коефіцієнт інбридингу особини відносно популяції

Таблиця 2

Значення основних показників генетичного поліморфізму в природних популяціях Abies alba Mill. Українських Карпат

Назва популяції | Частка полі-морфних локусів,

Р99 | Середня кількість генотипів на локус,

Pg | Середня кількість алелів на локус,

А | Середня

гетерозиготність | Індекс фіксації Райта,

F

очікувана,

HЕ | наявна,

HО

Самбірська | 0,667 | 2,33 | 2,00 | 0,1610,012 | 0,1630,012 | -0,012

Бредулецька | 0,792 | 2,92 | 2,42 | 0,1720,010 | 0,1660,010 | 0,035

Говерлянська | 0,667 | 3,00 | 2,38 | 0,1680,010 | 0,1540,010 | 0,083

Осмолодська | 0,583 | 2,42 | 1,88 | 0,1450,008 | 0,1550,008 | -0,069

Вижницька | 0,625 | 2,96 | 2,38 | 0,1790,010 | 0,1760,010 | 0,017

Делятинська | 0,708 | 2,63 | 2,21 | 0,1480,010 | 0,1510,100 | -0,020

Сколівська | 0,708 | 2,96 | 2,21 | 0,1780,010 | 0,1640,010 | 0,079

Міжгірська | 0,583 | 2,33 | 1,83 | 0,1460,011 | 0,1420,011 | 0,027

Середнє* | 0,668 | 2,71 | 2,15 | 0,1620,004 | 0,1590,004 | 0,019

В цілому для виду | 0,667 | 4,46 | 3,14 | 0,1670,004 | 0,1590,004 | 0,048

* – середньозважені оцінки

(FІS) становив в середньому 0,009, а коефіцієнт інбридингу особини відносно комплексу популяцій (виду) (FIT) дорівнював 0,026.

Незважаючи на різні еколого-фітоценотичні умови, генетична структура всіх восьми популяцій A. alba дуже близька. Це підтверджують малі значення коефіцієнту генетичної дистанції Нея (1972), який коливався у діапазоні від 0,002 до 0,009 і в середньому для 8 популяцій склав 0,006. На основі значень генетичних дистанцій Нея методом UPGMA побудовано дендрограму (рис.2), з якої видно, що шість популяцій A. alba (БРД, ГОВ, ОСМ, СКЛ, МІЖ, ДЕЛ, ВИЖ), які належать до суцільної смуги ялицево-букових лісів Українських Карпат, об’єдналися в одну групу, однак бутстрепаналіз показав, що тільки дві групи (МІЖ – ДЕЛ, БРД – ГОВ) популяцій A. alba можна вважати статистично вірогідними. Простежується тенденція об’єднання популяцій в групи в залежності від ступеня домінування ялиці білої в лісових екосистемах, від висоти місцезнаходження популяцій над рівнем моря, а також віку досліджених дерев (див. табл. 1). Який саме з факторів є у цій ситуації домінуючим, судити важко, скоріш за все, тут має місце їх спільний вплив.

Рис. 2 Дендрограма подібності восьми популяцій Abies alba Mill. в Українських

Карпатах, побудована на підставі коефіцієнтів генетичної дистанції Нея. Числами

(80, 59, 47, 27 і т.д.) на дендрограмі вказано частку дерев (дендрограм), у яких був

відмічений даний кластер при проведенні 1000 бутстрепів за дослідженою

сукупністю локусів.

Таким чином, на основі отриманих нами даних щодо генетичного поліморфізму та наявних літературних даних можна стверджувати, що на східній межі природного поширення A. alba в цілому відтворюється рівень генетичної мінливості, який притаманний цьому виду в інших частинах ареалу на території Європи (Fady, Conkle, 1993; Longauer et. al., 1996, 2002; Ducci, 1999).

ВІДТВОРЕННЯ ГЕНетичної різноманітності ABIES ALBA Mill. В ПРИРОДНИХ ПОПУЛЯЦІЯХ УКРАЇНСЬКИХ КАРПАТ

Аналіз системи схрещування. Частка перехресного запилення (ts) рослин у досліджених популяціях за однолокусною оцінкою варіювала від 0,436 до 0,578, склавши в середньому 0,476 (47,6%) (табл. 4), що суттєво відрізняється від наведених у літературі результатів, згідно яких частка ауткросингу у хвойних, яка

Таблиця 4

Одно- (ts) та мультилокусна (tm) оцінки перехресного запилення в природних популяціях Abies alba Mill. в Українських Карпатах

Популяція | Кількість проаналізо-ваних зародків | ts | tm

Бредулецька | 220 | 0,497±0,042 | 0,691±0,043

Делятинська | 185 | 0,578±0,068 | 0,749±0,059

Самборська | 120 | 0,486±0,059 | 0,627±0,066

Говерлянська | 200 | 0,436±0,026 | 0,643±0,034

В цілому | 725 | 0,476±0,023 | 0,669±0,027

встановлена за однолокусним методом, варіювала від 63% до 99% (Политов, Крутовский, 1990). Багатолокусна оцінка частки перехрестного запилення (tm) в цілому для A. alba склала 66,9%, що також виявилася нижчою, ніж зазначено у літературі для представників родини Pinaceae Lindl. Наявність різниці між tm та ts вказує на існування інших форм інбридингу, наприклад, спорідненого схрещування. Таким чином, можна стверджувати, що в досліджених популяціях від 64 до 75% зародків утворюються в результаті ауткросингу, а всі останні – це результат інбридингу.

Порівняльний аналіз алозимного поліморфізму материнських рослин та їх насіннєвого потомства. У насіннєвому потомстві популяцій ялиці білої стабільно відтворюється алельна різноманітність. Це підтверджує порівняльний аналіз складу і частот алелів зародків материнських рослин і пулу батьківських гамет. Суттєва алельна гетерогенність між рослинами та їх насіннєвим потомством виявлена тільки в двох популяціях A. alba за 1-2 локусами. Вибірки рослин і відповідні популяційні вибірки зародків істотно не відрізнялися за рівнем очікуваної гетерозиготності (НЕ). Однак, середні значення наявної гетерозиготності (НО) були вірогідно нижче у всіх вибірках зародків, ніж у вибірках рослин на 23,2-44,7 % (табл. 5). Якщо у рослин

Таблиця 5

Основні показники генетичної мінливості дорослих рослин та зародків насіння в природних популяціях Abies alba Mill.

Популяція * | Обсяг вибір-ки, шт. | Частка полі-морфних локусів,

Р99 | Середнє число на локус | Середня гетерозиготність | Індекс фіксації Райта,

F

алелей,

A | гено-типів, Pg | очікувана,

НЕ | наявна,

НО

САМ | Мр | 24 | 0,800 | 2,30 | 3,00 | 0,2790,025 | 0,3000,026 | - 0,075

Зн | 120 | 0,800 | 2,40 | 3,60 | 0,2540,011 | 0,1660,010 | 0,346

БРД | Мр | 44 | 0,900 | 2,60 | 3,40 | 0,2790,019 | 0,2820,020 | - 0,011

Зн | 220 | 0,900 | 2,70 | 4,60 | 0,2780,009 | 0,1980,008 | 0,288

ГОВ | Мр | 40 | 0,700 | 2,80 | 4,00 | 0,2870,020 | 0,2600,020 | 0,094

Зн | 200 | 0,700 | 3,00 | 5,50 | 0,2930,009 | 0,1860,008 | 0,365

ДЕЛ | Мр | 39 | 0,900 | 2,90 | 3,80 | 0,2570,019 | 0,2540,020 | 0,012

Зн | 185 | 0,900 | 3,00 | 5,00 | 0,2620,009 | 0,1950,009 | 0,256

В цілому | Мр | 147 | 0,847 | 2,69 | 3,60 | 0,2810,011 | 0,2710,011 | 0,036

Зн | 725 | 0,828 | 2,81 | 4,79 | 0,2800,005 | 0,1890,004 | 0,325

* Мр – материнські рослини; Зн – зародки насіння

відмічено невеликий надлишок – 1,1-7,5% гетерозигот, або їх нестачу – 1,2-9,4%, то для вибірок зародків був характерний значний дефіцит гетерозигот, який склав 25,6-36,5%. Останнє пов’язано із значним зменшенням кількісного представництва гетерозигот у зародків за високомінливими локусами. На формування дефіциту гетерозигот у зародків A. аlba не впливає гетерозиготність материнських рослин. Дефіцит гетерозигот на ранній онтогенетичній стадії (зародки), скоріш за все, викликаний спорідненим схрещуванням та самозапиленням рослин, про що свідчать раніше наведені значення tm та ts.

Взаємозв’язок алозимної мінливості з варіабельністю морфологічних ознак та репродуктивних показників у

Аbies ALBA Mill.

Насіннєва продуктивність та її зв’язок з алозимною мінливістю у А. alba. В середньому кількість насіння в шишках A. alba складає 273 – 331 шт., з якого повне насіння становить 56 – 184, а порожнє – 68 – 196 шт., що приблизно складає 35% і 45% від його загальної кількості у шишці. Близько 20% припадає на неповномірне насіння, яке ймовірно є результатом партеноспермії (Некрасова, 1978). Порівняння груп дерев A. alba з низьким (0 – 0,083) і високим (0,250 – 0,333) рівнем індивідуальної гетерозиготності показало, що висока гетерозиготність рослин не є обов’язковою умовою надлишкового утворення порожнього насіння для цього виду. Про це також свідчить близький рівень гетерозиготності груп дерев з високою (0,161±0,013) та низькою (0,178±0,015) продуктивністю порожнього насіння. Основні показники генетичної різноманітності та ауткросингу групи рослин з високою продуктивністю порожнього насіння виявилися близькими до середньопопуляційних для цього виду в Українських Карпатах, що можливо є загальною характеристикою A. alba. Встановлено, що вибірки дерев з найвищою продуктивністю повного насіння та найнижчою продуктивністю неповноцінного характеризуються більшим рівнем наявної гетерозиготності і більш високим значенням коефіцієнта перехресного запилення (tm), ніж альтернативні вибірки дерев.

Морфологічна мінливість насіння та насіннєвих лусок A. alba. У 313 дерев ялиці білої в Українських Карпатах були визначені довжина насіння з крильцями, довжина та ширина крилець, довжина, ширина та товщина насіння, а також довжина, ширина насіннєвих лусок. Виявлено вірогідні відмінності за цими показниками для більшості популяцій, виключення склала хіба що товщина насіння. Всі досліджені метрічні показники насіння та лусок, згідно з класифікацією С.А. Мамаєва (1973), можна віднести до ознак з дуже низьким, низьким та середнім рівнями мінливості, коефіцієнт варіювання яких не перевищував 18%.

У восьми популяціях A. alba виявлено, за шкалою А. С. Бондарцева (1954), шістнадцять кольорів забарвлення крилець насіння, що зберігається протягом всього життя рослин (Мамаєв, 1973). Для з’ясування генетичної обумовленості забарвлення крилець в популяціях порівнювали дві групи дерев з темними та світлими крильцями. Не встановлено вірогідної різниці між цими двома вибірками рослин за частотами алелів і генотипів та основними показниками генетичного поліморфізму (табл. 6), за винятком очікуваної гетерозиготності. Генетична дистанція Нея (1972) для цих двох груп рослин склала всього 0,002. У випадку аналізу ферментних систем з відносно вузькою внутрішньоклітинною субстратною специфічністю, які переважно відповідають за ключові біохімічні процеси, встановлено, що група дерев з темнозабарвленими насіннєвими крильцями за локусами, що кодують ці ферменти, має значно більшу кількість гетерозиготних генотипів.

Таблиця 6

Показники генетичної мінливості груп дерев з різним забарвленням насіннєвих крилець у Abies alba Mill. в Українських Карпатах

Групи дерев за забарвленням насіннєвих крилець | Частка поліморфних локусів | Средня кількість алелів на локус, А | Середня гетерозиготність

Р95 | Р99 | НЕ | НО

Світлозабарвлені | 0,33 | 0,67 | 2,54 | 0,1550,007 | 0,1480,007

Темнозабарвлені | 0,46 | 0,67 | 2,67 | 0,1730,008 | 0,1520,008

Ферменти з відносно вузькою субстратною специфічністю

(GOT, GDH, MDH, DIA, ME, FDH)

Світлозабарвлені | 0,07 | 0,53 | 2,20 | 0,0400,006 | 0,0410,006

Темнозабарвлені | 0,20 | 0,53 | 2,27 | 0,0600,007 | 0,0610,007

Припускаючи, що гетерозиготні генотипи є більш стійкими до екстремальних умов середовища, можна погодитися з К.К. Смаглюком (1972), що “темношишкова” форма ялиці, за аналогією з “червоношишковою” формою ялини європейської, можливо є більш стійкою до несприятливих умов високогір’я.

Популяційно-генетичні аспекти оцінювання внутрішньовидової різноманітності A. alba за морфометричними розрахунковими індексами. У ялиці білої в Українських Карпатах було досліджено морфологічну мінливість генеративних пагонів (жіночих шишок) та 8 розрахункових індексів, що характеризують співвідношення лінійних розмірів лусок та насіння з крильцями. Зроблено спробу використання цих індексів для оцінювання структури виду та пошуку зв’язків між фенотипічою та генотипічною мінливістю A. alba. Проведення кластерного аналізу показало, що кластеризація вибірок за частотами трапляння дерев з різним індексом форми луски (ІФЛ – відношення довжини насіннєвої луски до її ширини) в певній мірі відтворює закономірності кластеризації на підставі аналізу частот алелей ізоферментних локусів. Це створює передумови використання цього феномаркера для оцінювання диференціації популяцій ялиці білої.

В Українських Карпатах було виділено три морфотипи A. аlba: з грибоподібною (ІФЛ>1), конусоподібною (ІФЛ=0,92-0,99) та еліпсоподібною (ІФЛ?0,91) формами лусок. За основними параметрами генетичної мінливості вибірки дерев, що належать до різних морфотипів, суттєво не відрізнялися між собою. Однак, вони мали різну кількість поліморфних локусів та відзначались вірогідною алельною та генотипічною гетерогенністю за локусами Acp-2, Acp-3, Lap-1 та Est-2. Індекс форми лусок як окремо, так і в сукупності з іншими досліджуваними індексами може бути використаний для оцінювання фенотипічної різноманітності популяцій за Л.А. Животовським (1991), що може виявитися корисним в генетико-селекційних дослідженнях A. alba.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено генетичний контроль ізоферментів ADH, GOT, GDH, SOD, FDH, MDH, DIA, LAP, ACP, EST, ME у Abies alba, ідентифіковано алельні варіанти 24 генних локусів, які в подальшому були використані для визначення основних параметрів генетичної мінливості, системи схрещування та пошуку зв’язку між індивідуальною гетерозиготністю та насіннєвою продуктивністю у 8 природних популяціях ялиці білої в Українських Карпатах; аналіз 51 пари генних локусів 6 ферментних систем виявив зчеплення тільки трьох пар локусів: Adh-1:Adh-2, Acp-2:Acp-3, Mdh-2:Me-2.

2. Середні значення основних показників генетичного поліморфізму ялиці білої в Українських Карпатах були такими: P99=66,7%, HО=0,159, HЕ=0,167, Pg=4,46, A=3,13. Виявлений рівень гетерозиготності в популяціях A. alba у дослідженому регіоні знаходиться в межах значень, що описані для популяцій цього виду із інших частин ареалу. Більшість вивчених популяцій ялиці білої знаходяться у стані генетичної рівноваги згідно закону Харді-Вайнберга.

3. В Українських Карпатах популяції характеризуються низькою підрозділеністю. Близько 98% генетичної мінливості припадає на внутрішньопопуляційну і тільки 2% – на її міжпопуляційну складову. Внесок окремих поліморфних локусів у генетичну диференціацію популяцій був нерівнозначним: від 0,9% за локусами Got-1 та Fdh-1 до 3,5% за локусом Acp-1.

4. Для гірських популяцій A. alba на межі природного ареалу характерний низький рівень генетичної диференціації. Генетична дистанція Нея між популяціями варіювала від 0,002 до 0,009, склавши в середньому 0,006, що вказує на високу схожість їх генетичних структур. Кластеризація популяцій за даними генетичних дистанцій свідчить, що шість популяцій A. alba, які належать до суцільної смуги ялицево-букових лісів Українських Карпат, об’єднуються в єдину групу.

5. У зародків насіння 4 досліджених популяцій A. alba відтворюється алельна та генотипова різноманітність, що характерна для материнських рослин. Але наявна гетерозиготність у зародків насіння була в середньому на 30,3% нижче, ніж у дерев. Для зародків насіння притаманний значний надлишок гомозигот.

6. Аналіз системи схрещування 147 дерев у чотирьох популяціях A. alba показав, що за багатолокусною (9 локусів) оцінкою частота ауткросингу (tm) варіювала від 62,7 до 74,9% і в цілому для виду не перевищувала 67%.

7. Ялиця біла в Українських Карпатах характеризується досить низькою продуктивністю повного насіння – приблизно 35% від загальної кількості насіння у шишці, а 45% припадає на порожнє насіння, останні 20% – неповномірне. Визначено, що вибірки дерев з найвищою продуктивністю повного насіння та найнижчою продуктивністю неповноцінного насіння характеризуються більшим рівнем наявної гетерозиготності і більш високим значенням коефіцієнта перехресного запилення (tm), ніж альтернативні вибірки дерев. Висока гетерозиготність рослин не є основною причиною утворення в їх шишках великої кількості порожнього насіння.

8. Встановлено дуже низький (СV=6,1–6,6%), низький (СV=7,5–11,6%) та середній (СV=12,6–17,9%) рівні варіювання морфометричних показників насіннєвих лусок, насіння з крильцями та їх розрахункових індексів у 313 дерев ялиці білої. З восьми індексів – індекс форми луски (ІФЛ) виявився найбільш придатним для оцінки фенотипічної мінливості та диференціації популяцій A. alba.

9. Дерева з альтернативним забарвленням насіннєвих крилець (світле – темне) мають певні генетичні відмінності. Показники, що характеризують генетичну та фенотипічну мінливість A. аlba, можуть бути використані в программах з селекційного поліпшення цієї важливої для України лісогосподарської породи.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.