НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

_____________________________________________________________

ПУРНИНЬ ОЛЕНА ЕДУАРДІВНА

УДК 577.352.5:577.354:612.822:611.89

ФАРМАКОЛОГІЧНІ властивостІ ТА

альфа-субодиничний склад нікотинових

ацетилхолінових рецепторів нейронів вегетативних гангліїв щура

03.00.02 – біофізика

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фізіології вегетативної нервової системи

Інституту Фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Наукові керівники: | академік НАН України, доктор біологічних наук, професор,

завідувач відділу фізіології вегетативної нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Скок Володимир Іванович ,

доктор біологічних наук, завідувач лабораторією синаптичної передачі Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Фєдулова Світлана Анатоліївна

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор,

провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Шуба Ярослав Михайлович,

кандидат біологічних наук, провідний науковий співробітник

відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України Пархоменко Микола Тимофійович.

Провідна установа: | Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біофізики біологічного факультету

Захист відбудеться " 21 " червня 2005 р. о " 14 " годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ,

вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий " 16 " травня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що автономна (вегетативна) нервова система підтримує серцево-судинну, терморегуляторну, шлунково-кишкову та нейроендокринну функції. Нейрони вегетативних гангліїв містять переважно нікотинові ацетилхолінові рецептори (НХР), які відіграють головну роль у передачі сигналів у периферичній нервовій системі та є місцем дії багатьох лікарських препаратів. За останнє десятиліття було відкрито значне різноманіття в структурі та фармакології типів нейронних НХР, що є ліганд-залежними іонними каналами, які побудовані з пентамерної комбінації певних субодиниць, дванадцять з яких було ідентифіковано. У вегетативних гангліях виявлені нейронні НХР, що містять тільки 3, 4, 5, 7, 2 та 4 субодиниці. Холінорецептори різного субодиничного складу мають специфічні кінетичні та фармакологічні властивості.

НХР нейронів вегетативних гангліїв почали ретельно досліджувати, в основному, у зв’язку з пошуком нових гіпотензивних лікарських засобів. Так, мекаміламін (МКМ), розроблений як гіпотензивний препарат, що знижує кров’яний тиск in vivo, діє як антагоніст нейронних НХР. МКМ може мати клінічно важливі терапевтичні властивості, тому актуальним є розуміння його фармакологічної дії, а саме вивчення механізму блокування НХР нейронів вегетативних гангліїв.

У літературі досить багато робіт присвячено дії іонів свинцю - стійкого неорганічного нейротоксина, що впливає на різні підтипи нейронних НХР центральної нервової системи, але актуальним залишається вивчення механізму блокування іонами свинцю НХР різного субодиничного складу нейронів вегетативних гангліїв, оскільки це питання практично не досліджене.

Зміни субодиничного складу НХР вегетативных гангліїв є результатом патологічних механізмів і призводять до різних розладів, що часто мають руйнівні наслідки. Зокрема, таке захворювання, як аутоімунна периферична нейропатія - тяжка форма вегетативного розладу, впливає на функціонування симпатичної, парасимпатичної та ентеральної нервових систем. У більшості пацієнтів з цим синдромом, поряд із шлунково-кишковою дисфункцією, у сироватці крові у високих титрах виявлені специфічні антитіла проти гангліонарних нейронних НХР або певних субодиниць НХР (Vernіno S., Low P.A., et al., 2000; Balestra B., et al. 2000).

У зв'язку з цим досить актуальним є з'ясування субодиничного складу нейронних НХР вегетативних гангліїв. На сьогоднішній день різними групами дослідників здійснюються спроби визначити субодиничний склад НХР у нейронах вегетативних гангліїв. І якщо питанню про субодиничний склад НХР верхнього шийного ганглія (ВШГ) у науковій літературі присвячено досить багато робіт, і про субодиничний склад НХР нейронів інтракардіальних гангліїв можна також знайти окремі публікації, то роботи присвячені субодиничному складу НХР нейронів підщелепного ганглія відсутні. Слід зазначити, що використання різних видів тварин різного віку, різних об'єктів дослідження, і різних способів одержання досліджуваного матеріалу, а також різних методів ідентифікації субодиничного складу НХР у різних лабораторіях, значно ускладнюють можливість порівняння отриманих результатів. Тому ми вважали за доцільне провести комплексне дослідження субодиничного складу НХР нейронів вище перелічених вегетативних гангліїв у тварин одного виду та віку. При цьому ми використовували як основний інструмент досліджень моно- і поліклональні антитіла до синтетичних пептидів, що відповідають фрагменту, який зв’язує агоніст, чотирьох різних -субодиниць нейронного НХР, бо раніше було показано (Tamamіzu S, et al., 1996), що антитіла, специфічні до домену, який зв’язує агоніст, можна використовувати як селективні блокатори певних підтипів НХР, подібно до специфічних конкурентних антагоністів (Dwoskіn L.P., Crooks P.A., 2001).

Беручи до уваги сказане вище, дослідження субодиничного складу НХР нейронів вегетативних гангліїв є актуальним як для фундаментальної, так і для прикладної науки.

Зв’язок із науковою тематикою організації. Роботу було виконано в рамках наукових програм відділу фізіології вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Вивчення зв’язку між субодиничним складом нікотинових холінорецепторів нейронів вегетативних гангліїв та їх функціями”, “Електрофізіологічні та фармакологічні властивості нейронних нікотинових холінорецепторів з різним -субодиничним складом симпатичних та парасимпатичних гангліїв”, а також “Субодиничний склад молекули нікотинового холінорецептора нейронів вегетативних гангліїв”.

Мета і завдання дослідження. Основною метою даної роботи було визначення якісного -субодиничного складу НХР нейронів вегетативних гангліїв щура – верхнього шийного, підщелепного та нейронів субепікардіального сплетення, а також з’ясування механізмів блокуючої дії мекаміламіну та азотнокислого свинцю.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. З використанням методу внутрішньоклітинного відведення ацетилхолін-викликаних потенціалів (АХ-потенціалів) нейронів субепікардіального сплетення щура, використовуючи антитіла, що є специфічними до агоніст-зв’язуючого центру 3-, 4-, 5- та 7-субодиниць НХР (амінокислотні залишки 181-192) встановити -субодиничний склад НХР даних парасимпатичних нейронів.

2. На нейронах підщелепного ганглія щура з’ясувати -субодиничний склад НХР соми та постсинаптичної мембрани шляхом порівняння змін амплітуд збуджуючих постсинаптичних потенціалів (ЗПСП), що отримані при подразненні прегангліонарного нерва, та потенціалів, що отримані при іонофоретичній аплікації АХ на сому клітини на тлі прикладання -специфічних антитіл.

3. На недисоційованих нейронах ВШГ щура дослідити механізм блокуючої дії мекаміламіну та азотнокислого свинцю.

4. Визначити -субодиничний склад соми та постсинаптичної мембрани нейронів ВШГ щура, використовуючи в якості конкурентних блокаторів різні -специфічні антитіла та азотнокислий свинець.

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Вперше шляхом комплексного дослідження визначено -субодиничний склад нейронів декількох вегетативних гангліїв щура.

2. Показано, що азотнокислий свинець пригнічує АХ-викликані трансмембранні струми недисоційованих нейронів ВШГ щура, при цьому змінюється форма наростання струмів, що викликані активуванням НХР. За механізмом блокуючої дії азотнокислий свинець визначений як конкурентний блокатор зворотної дії.

3. Вперше показано характер дії іонів свинцю на ЗПСП нативних нейронів симпатичного ганглія. У фазних нейронах ВШГ аплікація азотнокислого свинцю призводила до пригнічення синаптичних відповідей, що викликані подразненням прегангліонарного нерва, тоді як у тонічних нейронах спостерігалося зростання даних відповідей. Крім того, виявлено дві групи фазних нейронів на підставі розходження концентрацій половинного пригнічення амплітуд ЗПСП нейронів ВШГ азотнокислим свинцем.

4. Показано, що на недисоційовані нейрони ВШГ щура мекаміламін у наномолярних концентраціях діє як конкурентний блокатор незворотної дії.

5. Вперше проведено якісне дослідження -субодиничного складу НХР нейронів симпатичного і двох парасимпатичних гангліїв щура з використанням методу послідовного блокування окремих -субодиниць НХР специфічними антитілами.

6. Вперше проведено порівняльне дослідження субодиничного складу НХР соми і постсинаптичної мембрани нейронів підщелепного ганглія щура. Показано, що як позасинаптична, так і постсинаптична мембрани нейронів підщелепного ганглія містять НХР, що утворені більш ніж одним підтипом -субодиниць.

7. Показано, що нейрони різних вегетативних гангліїв помітно різняться за -субодиничним складом своїх НХР. Кожен окремий нейрон ганглія, як симпатичного, так і парасимпатичного, експресує гетерогенні НХР.

Теоретичне та практичне значення.

Дане дослідження має фундаментальне значення та суттєво розширює уявлення про -субодиничний склад НХР нейронів вегетативних гангліїв. Отримані результати розкривають особливості -субодиничного складу НХР нейронів верхнього шийного і підщелепного гангліїв, а також нейронів субепікардіального сплетення щура. Згідно результатів даного дослідження, нейронні НХР гангліїв, що досліджені, несуть на собі всі -субодиниці, відкриті у вегетативній нервовій системі, поза залежністю від того які органи вони іннервують. -Субодиничний склад НХР нейронів відрізняється як від ганглія до ганглія, так само і від нейрона до нейрона.

Результати дослідження із з’ясування -субодиничного складу НХР нейронів симпатичних і парасимпатичних гангліїв мають і прикладне значення. Вони створюють теоретичну основу для пошуку вибірково діючих лікарських і біологічно активних препаратів для ефективної і цілеспрямованої корекції різних патологічних станів вегетативної нервової системи, що пов’язані зі зміною або порушенням -субодиничного складу НХР вегетативних гангліїв.

Особистий внесок здобувача.

Автор самостійно розробила методики виділення повноцінних препаратів підщелепного ганглія та субепікардіального сплетення щура. Освоїла метод внутрішньоклітинного відведення потенціалів від нейронів ВШГ, підщелепного ганглія і субепікардіального сплетення щура у відповідь на стимуляцію прегангліонарного нерва, або іонофоретичну аплікацію ацетилхоліну на сому нейрона, а також метод "patch-clamp" для реєстрації струмів цілої клітини, що викликані іонофоретичною аплікацією ацетилхоліну. Самостійно провела більшу частину експериментів, аналіз, статистичну обробку та узагальнення результатів.

Деякі експерименти на нейронах ВШГ були проведені разом з іншими авторами опублікованих робіт - співробітниками відділу фізіології вегетативної нервової системи: к.б.н. Рємізовим І.М. та к.б.н. Войтенко С.В.. Теоретичний аналіз моделі конкурентної взаємодії азотнокислого свинцю з рецептором був проведений за участю н.с. Маслова В.Ю. та м.н.с. Рихальського О.В..

Апробація результатів дисертації. І симпозіум Богомолець-Ненські "Molecular and physіologіcal approaches to neuronal plastіcіty" (Сулейов, Польща, 7-9 травня 2001), 4-а Конференція Чеського товариства нейронаук (Прага, Чехія, 26-27 жовтня 2001), XVІ з'їзд Українського фізіологічного товариства (Вінниця, Україна, 28-30 травня 2002), Міжнародна школа-семінар "Фармакологія синаптичної передачі в нервовій системі" (Київ, Україна, 16-18 червня 2002), ІІ міжнародний симпозіум "Фізіологія та біофізика гладких м'язів" (Київ, Україна, 28-31 жовтня 2003), Конференція молодих вчених Інституту фізіології ім. А.А.Богомольця НАН України "Перспективні напрями сучасної фізіології" (Київ, Україна, 17-18 листопада 2003).

Публікації. За результатами роботи опубліковано п'ять статей у провідних вітчизняних і закордонних журналах і п'ять тез.

Структура та об’єм дисертації. Дисертація містить список скорочень, вступ, огляд літератури, розділ об’єктів і методів досліджень, розділ результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки та список використаних джерел. Робота викладена на 150 сторінках, містить 4 таблиці та ілюстрована 24 рисунками. Перелік використаної літератури включає 277 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Результати були отримані в експериментах на ізольованих препаратах верхнього шийного, підщелепного ганглія та субепікардіального сплетення щурів (126 тварин віком 21 день). В роботі дана морфологічна характеристика цих об’єктів досліджень. Піддослідних тварин наркотизували ефіром та видаляли серце (препарати ВШГ і підщелепного ганглія) або декапітували (препарат субепікардіального плетива) для знекровлення. Після препарування ганглії розміщували у робочій камері (об’єм 1мл) та приколювали до її дна. Через камеру пропускали розчин Кребса зі швидкістю 2 мл/хв.

Для приготування препарату ВШГ його видаляли і очищали від сполучнотканинної капсули. Для експериментів в режимі фіксації потенціалу ВШГ додатково обробляли 0,5% розчином колагенази протягом 30 хв. (“Sigma”, США, тип 1А) для видалення залишків сполучної тканини.

Для приготування препарату підщелепного ганглія з вентрального боку шиї по середній лінії робили розтин, розрізали та видаляли щелепно-під’язиковий м’яз. Тоді відкривався доступ до підщелепної та великої під’язикової залоз і слинних протоків. Слинні протоки, язиковий нерв та сполучну тканину між ними видаляли з тварини і переносили в робочу камеру.

Для приготування препарату субепікардіального сплетення спочатку готували серцево-легеневий препарат, переносили його у ванночку з фізіологічним розчином і вимивали залишки крові охолодженим до +4С фізіологічним розчином. Після цього поетапно акуратно видаляли легені, бронхи, відрізали легеневі вени як найближче до легень, вирізали передсердя і приколювали дорсальною стороною вгору. Акуратно видаляли судини і жирові подушечки. Вирізали шматочок тканини серця між краніальною і каудальною порожнистими венами разом з областю міжпередсердної перегородки і частиною лівого передсердя. Перевертали м'язовою стороною вгору й обережно видаляли весь м'язовий шар. Отриманий препарат, що містить ганглії субепікардіального сплетення, переносили в робочу камеру і ретельно приколювали зовнішньою стороною догори 20 - 30 вольфрамовими голочками до дна камери.

Препарати підщелепного ганглія та субепікардіального сплетення, що розташовуються в тонкому шарі сполучної тканини, злегка розтягували. Важливим моментом був певний ступінь розтягування препаратів при закріпленні на дні камери. Через сильне розтягування препарату, при якому тіла клітин втрачали об'ємну форму, електричні властивості нейронів різко погіршувалися.

Внутрішньоклітинне дослідження нейронів проводили під візуальним контролем (диференціальний інтерференційний мікроскоп Bіolar (Польща, з об'єктивом водної імерсії, х40 (числова апертура 0,75, робоча відстань 1,6 мм), загальне збільшення х400-600)). Застосовуючи інтерференційну оптику Номарського, можна було відрізняти ушкоджені в ході препарування нейрони від живих, а також приблизно оцінювати стан живих нейронів.

Для проведення маніпуляцій мікропіпетки розташовували під кутом 20-30 до поверхні ганглія. У зв'язку з різним призначенням мікропіпеток, піпетку для внутрішньоклітинного відведення змін мембранного потенціалу в режимі фіксації струму далі будемо називати мікроелектрод, а для роботи в режимі фіксації потенціалу - петч-піпетка. Петч-піпетки витягували із заготовок без внутрішнього капіляра (зовнішній діаметр - 1,65мм, внутрішній - 1,15мм, компанії Garner Glass, США) на машинці МЭ-4 в один етап. Кінчик піпетки (діаметр кінчика 1-2 мкм) оплавляли, що поліпшувало наступний контакт із клітиною. Штучний внутрішньоклітинний розчин, яким заповнювали петч-піпетку, містив (мкмоль/л): KCl-140; CaCl2-1; EGTA+KOH-11;HEPES+KOH-10 (pН=7,2). Після заповнення внутрішньоклітинним розчином, піпетки мали опір постійному струму від 2МОм до 5МОм. Мікроелектроди виготовляли на горизонтальній витяжці М-10 у два етапи із заготовок з внутрішнім капіляром (зовнішній діаметр - 1,5мм, внутрішній - 0,84мм, компанії WPІ, США), заповнювали 2моль/л розчином KCl, при цьому опір кінчика був 100-250 МОм.

Мікропіпетки для іонофорезу заповнювали ацетилхоліном-хлоридом (1-2моль/л). Опір піпетки становив близько 50МОм. Іонофоретичну стимуляцію здійснювали від джерела струму прямокутними імпульсами тривалістю від 0,5с до 1,5с і амплітудою від 2нА до 200нА, що задавалися з цифро-аналогового перетворювача (ЦАП). Для запобігання спонтанної дифузії речовини з кінчика піпетки постійно пропускали "замикаючий струм" протилежного напрямку 2-7нА.

Метод "patch-clamp" (конфігурація "ціла клітина") застосовувався для реєстрації струмів цілої клітини викликаних іонофоретичною аплікацією ацетилхоліну (АХ). Трансмембранні струми (АХ-струми) підсилювалися підсилювачем із смугою пропускання по частоті 0-1 кГц. Посилений сигнал подавався на вхід аналогово-цифрового перетворювача (АЦП) і оцифровувався з частотою 100 Гц. Дані в цифровій формі вводили в пам'ять ЕОМ і записували на магнітний диск для подальшого аналізу. Вимір амплітуди АХ-струмів здійснювали в напівавтоматичному режимі з використанням спеціальної програми.

При мікроелектродній реєстрації внутрішньоклітинні потенціали одержували як при ортодромній стимуляції нерва (ШСН або язикового нерва) - ЗПСП, так і при аплікації АХ на сому нейрона – АХ-потенціали. Експерименти проводилися у напівавтоматичному режимі на електрофізіологічній установці, що була зібрана на базі ЕОМ ІBM 486DX4-133. Мікроелектрод був включений в одне плече містка Уінстона. Індиферентний електрод розташовували в робочій камері і з'єднували з землею. Внутрішньоклітинну стимуляцію здійснювали подачею з ЦАП на місток Уінстона прямокутних імпульсів напруги тривалістю від 20 мс до 200 мс і амплітудою від 0,5 В до 0,9 В, що відповідало току поляризації клітини 250 - 450 пА (опір у плечі містка - 2 ГОм). Стимуляцію нервів здійснювали хлор-срібними електродами, що були розташовані у піпетці для всмоктування нерва, через ізолюючий пристрій прямокутними імпульсами тривалістю 0,1 - 0,5 мс, амплітуду яких можна було змінювати від -25 В до +25 В. Робочі режими стимуляцій задавалися комп'ютером через ЦАП. Різницю потенціалів, що знімалася з моста, подавали на підсилювач постійного струму. Потім сигнали оцифровувалися і записувалися на магнітний диск для подальшого аналізу. Вимір амплітуд ЗПСП і АХ-потенціалів здійснювали в напівавтоматичному режимі спеціальною програмою.

Статистична обробка даних виконувалася за допомогою програми Origin5.0 (Microcal Software Inc.). Результати представляли як середні значення та похибка середнього.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Роботу по з’ясуванню субодиничного складу НХР нейронів вегетативних гангліїв ми розпочали з дослідження механізму блокуючої дії мекаміламіну (МКМ). За ефективністю дії МКМ і його стереоізомери були визначені як блокатори 34, 32, 7 і 42 НХР людини, а також НХР м'язового типу в дорослих мишей (Papke R.L., et al., 2001). За нашими даними концентрація половинного пригнічення (IC50) АХ-струмів МКМ становила (2,70,3)10-10 моль/л (n=5). На Рис.1 представлені оригінальні записи АХ-струмів при підтримуваному мембранному потенціалі –50мВ, що отримані від одного з нейронів ВШГ у контролі (а), через 20 хв. перебування в розчині, що містив МКМ (б), і через 15 хв. після початку відмивання препарату (в). В наших експериментах МКМ зменшував АХ-викликаний струм майже однаково на всьому діапазоні підтримуваних мембранних потенціалів, тобто ступінь поляризації мембрани клітини практично не впливала на блокуючу активність МКМ (Рис.2). Відомо, що конкурентний механізм дії характеризується зменшенням блокуючого ефекту із зростанням дози агоніста. В наших дослідах

Рис. 1. АХ-струми, що зареєстровані від нейрона ВШГ в контролі (а), при дії МКМ (б) і при відмиванні препарату (в).

Горизонтальною рискою над записами позначено час іонофоретичної аплікації АХ.“

витіснення” МКМ із місць зв’язування при підвищенні концентрації АХ спостерігалося як при підтримуваному мембранному потенціалі -50 мВ, так і при -90 мВ. Наші дані про блокування МКМ НХР ВШГ відповідають результатам, що були отримані на нейронах підщелепного ганглія щура (Ascher P., et al., 1979).

Таким чином, виходячи з отриманих результатів, на підставі того, що блокуюча дія МКМ на НХР нейронів ВШГ не залежить від мембранного потен-

ціалу та послаблюється з підвищенням концентрації агоніста, можна стверджу-

Рис. 2. Залежність від мембранного потенціалу блокуючої дії МКМ на амплітуду АХ-викликаних струмів.

Оригінальні записи, що зроблені від одного нейрона в контролі (А) та в присутності МКМ (Б) при різних рівнях підтримуваних мембранних потенціалів.

Внизу – графік усередненої по 6 нейронах вольт-амперної залежності АХ-струмів,

контроль,

мекаміламин.

Дані нормовані до відпо-

відних значень при під-

тримуваному мембранно-

му потенціалі –50мВ.

вати, що даний препарат спричинює переважно конкурентний блокуючий вплив на НХР нейронів симпатичного ганглія. За літературними даними дія МКМ на НХР нейронів вегетативних гангліїв є чи конкурентною (Ascher P., et al., 1979, Gurney A.M., Rang H.P., 1984), чи неконкурентною (Fieber L.A., Adams D.J., 1991). Така різниця, можливо, пов’язана з різним субодиничним складом цих рецепторів. Навіть в одній і тій самій тканині, а саме в люмбальних паравертебральних гангліях жаби-бика (Shen W.-X., Horn J.P., 1998), МКМ спричиняв різні типи блокування рецепторів в залежності від досліджуваної клітини. Хоча МКМ блокує різні підтипи НХР, його дію неможна назвати селективною по відношенню до даних підтипів НХР.

В той же час, за літературними даними, іони свинцю селективно блокують НХР, що містять 7- та 34-субодиниці. Так, свинець в мікромолярних концентраціях блокував АХ-струми в нейронах гіпокампу, НХР яких мали 7-субодиниці (Ishihara M., et al., 1995). А в ооцитах, в які були експресовані 32-субодиниці НХР, свинець в тій самій концентрації викликав збільшення АХ-струмів (Zwart R., et al., 1995). Оскільки дія іонів свинцю на нативні нейрони вегетативних гангліїв залишається недослідженою, ми дослідили механізм блокуючої дії іонів свинцю на недисоційовані нейрони ВШГ щура, використовуючи метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”. Попередні дослідження показали, що іони свинцю зменшували амплітуду АХ-струмів, а IC50 склала біля 410-5 моль/л (n=3) при підтримуваному мембранному потенціалі –50мВ. Тому всі подальші експерименти цієї серії ми проводили саме при цій концентрації.

Наявність іонів свинцю в омиваючому розчині призводила до зміни форми АХ-струмів, що викликані активуванням НХР, і до зменшення амплітуди струмів в середньому на (47,24,6) % (n=10) від контрольного рівня при підтримуваному мембранному потенціалі –50мВ. Під впливом іонів свинцю в складі переднього фронту таких струмів з’являвся добре помітний повільний компонент. Обидва ці ефекти частково відмивались (Рис.3.). В дисертації обговорюються можливі причини виникнення цього компонента.

Рис. 3. Записи АХ-струмів, зареєстровані від одного з нейронів ВШГ щура в контролі (а), в присутності іонів свинцю (б) та під час відмивання (в).

Для вивчення механізму блокування ми досліджували вольтамперну залежність блокуючої дії іонів свинцю на НХР нейронів ВШГ. Ми не одержали достовірної різниці вольтамперних характеристик нейронів в контролі та в присутності блокатора, що вказує на потенцаіл-незалежне блокування (Рис. 4). Окрім того, ми дослідили залежність ефекту блокування НХР нейронів ВШГ іонами свинцю від дози ацетилхоліну, що аплікували на сому клітини. Цю залежність доза-ефект перевіряли при двох рівнях підтримуваного мембранного потенціалу -50 мВ та -90 мВ. Результати виявилися однаковими при різних рівнях підтримуваних потенціалів, отже ми можемо говорити про конкурентний механізм блокування НХР ВШГ іонами свинцю.

За літературними даними відомо, що іони свинцю в різних концентраціях специфічно впливають на певні підтипи НХР. При цьому автори робіт відзначили високу індивідуальну варіабельність чутливості до свинцю різних клітин. Так, Ішихара із співавторами (Ishihara K., et al., 1995) дійшли висновку, що НХР найчутливішої до свинцю групи нейронів містять у собі 7-субодиниці НХР, в той час, коли НХР іншої групи нейронів містять комплекси 42 чи 34 субодиниць. На думку авторів, вказані розбіжності в чутливості нейронів пов’язані з неоднаковим субодиничним складом НХР досліджених нейронів (McGhee, Role I.F., 1995, Oortgiesen M., et al., 1997).

Рис. 4. Залежність від мембранного потенціалу блокуючої дії іонів свинцю на трансмембранний струм, що викликаний іонофоретичною аплікацією АХ.

А - Оригінальні записи, що зроблені від одного нейрона в контролі (зверху) та в присутнос-

ті іонів свинцю (знизу) при різних рівнях підтримуваних мембранних потенціалів. Б - графік усередненої по 5 нейронах вольт-амперної залежності АХ-струмів в контролі і в присутності іонів свинцю. Дані нормовані до відповідних значень при підтримуваному мембранному потенціалі –50мВ.

Ми вирішили перевірити чи існує залежність постсинаптичних відповідей нейронів ВШГ від концентрацій іонів свинцю. Наші дослідження впливу цих іонів в мікромолярних концентраціях на ЗПСП нейронів ВШГ щура дозволили виділити три групи нейронів цього ганглія, що відрізняються за чутливістю до іонів свинцю та за направленістю їх дії. Показано (Cassell JF, 1986), що подаючи безпосередньо на нейрони симпатичного ганглія супрапорогові деполяризуючі поштовхи струму, можна викликати в них як поодинокі імпульси (у фазних нейронах), так і серію імпульсів (у тонічних нейронах). За нашими даними, присутність іонів свинцю в перфузаті пригнічувала синаптичну передачу у всіх фазних нейронах ВШГ. При цьому чутливість до іонів свинцю у двох групах фазних нейронів різнилася більше ніж на порядок. В першій групі IC50 для ЗПСП, що викликані стимуляцією ШСН, в середньому склала (2,2 0,2) 10-6 моль/л, а у другій – (3,55 0,29) 10-5 моль/л. На відміну від фазних нейронів, де азотнокислий свинець блокував синаптичну передачу, в тонічних нейронах ВШГ амплітуда ЗПСП під дією іонів свинцю збільшувалась. Як було показано раніше (Zwart R., et al., 1977, 1995), при експресії саме такого комплекса субодиниць в ооцитах Xenopus спостерігалася потенціація АХ-струмів після додавання у зовнішній розчин азотнокислого свинцю. Таким чином, наші дані свідчать про те, що у ВШГ щура існує як мінімум три групи нейронів, які суттєво розрізняються за характером ефектів, що викликані дією іонів свинцю. НХР на мембранах “низько чутливих” фазних і тонічних нейронів цього ганглія, очевидно, побудовані за участю субодиничних комплексів 34 та 32, відповідно. НХР першої групи (фазних “високочутливих”) нейронів ВШГ щура, можливо, містять 7-субодиницю. Вважають (Bibevski S., et al., 2000), що саме групи згаданих даних рецепторних субодиниць опосередковують синаптичну передачу через вегетативні ганглії ссавців. Дані, що подані вище, свідчать про гетерогенність нейронів ВШГ за підтипами НХР.

Наступна частина роботи була проведена з метою прямої ідентифікації субодиничного складу НХР нейронів цього симпатичного ганглія і порівняння його з таким в інших (парасимпатичних) гангліях. Як інструмент досліджень ми використовували антитіла, які були вироблені та надані групою пров. н.с. Інституту біохімії ім. Палладіна НАН України, к.б.н. Скок М.В. Дані антитіла, що отримані проти агоніст-зв’язуючого сайту, є конкурентними блокаторами НХР (Fels G., et al., 1986). Хоча амінокислотні залишки, що формують цей сайт, високо консервативні, сусідні пептиди відрізняються у різних -субодиниць. Це дозволяє отримувати антитіла з різною специфічністю до різних підтипів НХР. Імуноцитохімічні експерименти, які проводили з клітинами РС-12 та культуральними нейронами вегетативних гангліїв показали, що (181-192)-специфічні антитіла зв’язуються з нативними НХР (Skok M.V., et al., 1999). Антитіла проти 3-, 4-, 5- та 7-субодиниць додавали в зовнішній розчин у насичуючих концентраціях, що були визначені в попередніх дослідах і становили 30-60 мг/л.

В експериментах на ВШГ щура методом patch-clamp антитіло проти 4-субодиниці НХР блокувало амплітуду АХ-струму в середньому до (48,46,4)% (n=5) від контрольного рівня. Ми жодного разу не отримали повного пригнічення відповіді, що дало підставу припустити наявність інших підтипів субодиниць НХР на досліджених нейронах.

У попередніх дослідах ми спостерігали додатковий ефект другого антитіла, яке подавалося разом із першим. Нами показано, що після аплікації антитіла проти 7-субодиниці, яка призводила до зменшення амплітуди АХ-струму до (67 6)%, послідовне додавання до перфузійного розчину антитіла проти 3-субодиниці приводило до подальшого зменшення амплітуди АХ-струму до (48 8)% (n = 6). Раніше було показано (Smolen A.J., 1983), що антитіло проти 3 пептиду не зв’язується з іншими пептидами. В даному випадку ми припускаємо, що одна клітина несе на собі обидві субодиниці НХР, які локалізовані достатньо далеко одна від одної, тому антитіло проти 7-субодиниці не перешкоджає зв’язуванню антитіла проти 3-субодиниці з НХР. До цього часу 7- та 3-субодиниці не були знайдені в межах одного рецептора нативних клітин. Додатковий блокуючий ефект другого антитіла добре ілюструє Рис.5, де видно, що амплітуда АХ струму стабілізувалася у присутності антитіла проти 7-субодиниці, а після додавання антитіла проти 3- субодиниці, амплітуда відповіді почала зменшуватись і через 10 хвилин вийшла на стаціонарний рівень. Отримані нами результати дозволяють припустити, що, принаймні, частина нейронів ВШГ, що мають 3- і 7-субодиниці, імовірно, належить до різних НХР.

При використанні в якості блокатора іонів свинцю, ми показали наявність 7-, 32- та 34-субодиниць НХР на нейронах ВШГ щура, які, за літературними даними (Papke R.L., 2001), блокує МКМ, а дані, що були отримані з використанням специфічних антитіл проти 3-, 4- та 7-субодиниць, підтвердили присутність цих субодиниць НХР.

Рис. 5. Вплив парної аплікації антитіл проти 7- та 3-субодиниць НХР на АХ-струми в нейроні ВШГ щура.

А- записи АХ-струмів, що були зареєстровані під час експерименту.

Б-зміна амплітуди АХ-струму в ході експерименту.

Отримані на ВШГ дані свідчать як про гетерогенність субодиничного складу НХР, що представлені на окремих нейронах, так і про різноманітність нейронів в межах одного ганглія. Для того, аби оцінити наскільки можна такі характеристики застосовувати до інших гангліїв (тобто чи є це загальною властивістю для вегетативних гангліїв), ми дослідили за допомогою подібного підходу нейрони субепікардіального сплетення щура.

За нашими даними, нейрони субепікардіального сплетення експресують функціональні НХР, що містять a3-, a4-, a5- та a7-субодиниці, що співпадає з імуно-цитохімічними даними (Skok M.V., et al., 1999). При аплікації окремих антитіл, 3- та 4-субодиниці були знайдені на 56-57 % нейронів, тоді як 5- та 7-субодиниці спостерігали на 77-78 % нейронів. Ці значення дещо відрізняються від тих, що були отримані в імуно-цитохімічних експериментах, де 3-субодиницю спостерігали на 32% нейронів, 4- - на 47 %, 5- - на 14 %, а 7-субодиницю – на 22 % інтракардіальних нейронів (Smolen A.J., 1983). Імовірно така різниця пояснюється тим фактом, що ми працювали з нативними гангліями, а не з культуральними нейронами, як у статтях, що цитуються. Треба зазначити, що наші дані узгоджуються з результатами як генетичного, так і фармакологічного підходів. Так, Пос із співавторами показали (Poth K., et al., 1997), що інтракардіальні нейрони, які ізольовані із передсердь новонароджених щурів, експресують гетерогенну сукупність мРНК, що кодують різні субодиниці НХР. Для того аби визначити в якій комбінації субодиниці НХР знаходяться на інтракардіальних нейронах, ми аплікували послідовно два, три, чи чотири антитіла проти -субодиниць НХР. Кожне наступне антитіло ми додавали в перфузійний розчин коли АХ-потенціал досягав плато.

3-Субодиниця НХР була знайдена на 56% нейронів, що досліджені. В комбінації чи то з 5-, чи то з 7-субодиницею дана субодиниця була присутня на 50-53 % нейронів, а в комбінації з 4-субодиницею чи з (4 + 7), (a5+a7) та (a4+a5) субодиницями - на 33% нейронів (див. Таблицю 1). Ці дані наштовхують на думку, що всі 3-вмісні нейроні також мають чи то 7-, чи то 5-субодиницю, і щонайменше половина з них також має 4-субодиницю.

Таблиця 1.

Наявність блокуючого ефекту -специфічних антитіл в окремих нейронах

субепікардіального сплетення щура

Нейрон | Антитіло специфичне до:

3-субодиниці | 4-субодиниці | 5-субодиниці | 7-субодиниці

1 | + | не визначали | +

2 | + | + | не визначали | +

3 | не визначали

4 | + | не визначали | +

5 | не визначали

6 | + | + | не визначали | +

7 | + | + | + | +

8 | + | + | +

9 | + | + | +

10 | + | +

11 | + | +

12 | +

3-субодиниця є суттєвим компонентом НХР нейронів вегетативних гангліїв (Balestra B., et al., 2000). За даними Верніно та співавторів (Vernino S., et al., 2000) швидка синаптична передача через вегетативні ганглії виконується переважно завдяки 3-вмісним НХР. Інші автори показали, що у інтракардіальному ганглії собаки функціональна синаптична передача через ганглії здійснюється переважно завдяки 3-вмісним НХР. Часто 3-субодиниця може бути знайдена в комбінації з 5-субодиницею. В нижньому брижовому ганглії морської свинки 35-вмісні НХР відповідали за синаптичну передачу (Коваль О.М., 2003). Ми спостерігали 5-субодиниці НХР на більшій кількості нейронів, ніж 3-субодиниці (77 % в порівнянні з 56 %). Це надає підстави для припущення, що вони можуть бути включені в структуру інших, не 35-вмісних НХР.

За припущенням Нельсона та Ліндстрома (Nelson M.E., LindstromJ., 1999), 5-субодиниці є необхідним компонентом НХР для отримання швидких ЗПСП у вегетативних гангліях. А інша група дослідників (Wang N., et al., 2002) на мишах показала, що дефіцит 5-субодиниці підвищував чутливість до низьких концентрацій гексаметонія і спричиняв майже повну блокаду брадикардії у відповідь на стимуляцію вагуса.

НХР, що містять 7-субодиницю є другим найбільш розповсюдженим підтипом НХР, що був знайдений як у центральній, так і периферичній нервових системах (Glushakov A.V., 2004, Khiroug S.S., et al., 2002, Poth K., et al., 1997). При базуванні на чутливості АХ-викликаних струмів цілої клітини до -Bt (Cuevas J., Berg D.K., 1998) та експресії мРНК 7-субодиниці (Poth K., et al., 1997) було показано, що близько 80 % нейронів інтракардіальних гангліїв експресують 7-субодиницю. Це добре співпадає з результатами наших експериментів, згідно з якими біля 77 % нейронів, що досліджені, були чутливими до антитіла проти 7-субодиниці НХР. Хоча багато інтракардіальних нейронів експресують 7-ген, раніше на даних нейронах були знайдені клітини, що не є чутливими до -Bt (Selyanko A.A., Skok V.I., 1992). Можливо цей феномен пов’язаний з тим, що частина НХР, що експресує 7-субодиницю, є гетеромерними.

Знайдено (Cuevas J., Berg D.K., 1998), що 7-вмісні НХР свіжодисоційованих нейронів інтракардіальних гангліїв поводять себе не так як такі ж НХР у нейронах гіпокампа щура та клітин РС12. Було висунуто припущення, що 7-генний продукт може бути змішаний із ще неідентифікованими субодиницями, і тому можуть існувати гетерогенні рецептори з різними властивостями. За нашими даними 7-вмісні НХР були знайдені на тих самих нейронах, що і 3- чи 3- та 5-вмісні НХР. Теж саме було показано раніше для ВШГ (Skok M.V. et al., 1999, Voitenko L.P., 2001). Близько половини 7-вмісних НХР нейронів (33% в порівнянні з 77%) містять також 5-субодиницю. Отже, 5-субодиниця може міститися в гетеромерних 75-НХР.

Донедавна присутність 4-вмісних НХР в вегетативних гангліях вважалась малоймовірною, але вони були знайдені на нейронах інтракардіальних гангліїв (Poth et al., 1997). Нами показано, що більше ніж 50 % від усіх досліджених нейронів є чутливими до антитіла проти 4-субодиниці. Ця субодиниця присутня більше ніж на половині (33% в порівнянні з 56%) із 3-вмісних НХР нейронів і 7-вмісних НХР нейронів (41% в порівнянні з 77%). На відміну від цього, комбінація 4+5+7 субодиниць була знайдена тільки на 17% клітин (Див. Табл.1). Ці дані дозволяють припустити, що 4-вмісні НХР складають особливий підтип рецептора, що був спостережений майже в половині нейронів, які несуть чи то 3(5)-, чи то 7-вмісні НХР.

На думку Пос та співавторів (Poth et al., 1997) нейрони інтракардіального ганглія щура можуть експресувати підтипи НХР із складною структурою, а комбінації підтипів НХР, що експресуються, можуть варіювати від клітини до клітини. Певну роль відіграють і -субодиниці, які додають фактор гетерогенності.

Ми показали, що кожне антитіло зменшувало амплітуду АХ-потенціалу на 19-26%, відповідно сумарне пригнічення складало близько 93%. Усереднені відносні значення пригнічення амплітуд АХ-потенціалів -специфічними антитілами і похибки середнього представлені на Рис.6. У відповідності з цими результатами, a3-, a4-, a5- та a7-вмісні НХР, загалом, були відповідними майже за 100% амплітуду АХ-потенціалу.

Згідно сучасній класифікації (Lukas R.D., et al., 1999) коли автентичність поєднання субодиниць у НХР не визначена, невідома субодиниця чи група субодиниць НХР позначається знаком *.

Наші дані надають можливість припустити, що нейрони субепікардіального плетива щура можуть експресувати декілька підтипів НХР наступних комбінацій: 35*; 7*; 7(5)* и 4. При цьому окремий нейрон може експресувати більше ніж один підтип рецепторів, а нейрони в межах одного ганглія відрізняються за спектром представлених субодиниць, що можливо відображає їх функціональну гетерогенність (див. огляд Skok V., 2002).

Рис.6. Ступінь пригнічення АХ-потенціалів нейро-нів субепікардіального сплетення у відповідь на прикладання відповідних антитіл.

Було цікаво порів-няти два парасимпатичні ганглія та з’ясувати, чи відрізняється субодинич-

ний склад НХР, що представлені на них. Для цього ми дослідили субодиничний склад нейронів підщелепного ганглія, що іннервують під’язикову слинну залозу. Треба зазначити, що за даними Ліхтман (Lichtman J.W., 1997), отриманими при внутрішньоклітинному відведенні відповідей від нейронів ізольованого ганглія дорослих щурів, близько 75% гангліонарних клітин іннервується поодиноким прегангліонарним волокном. З цим феноменом пов’язана неможливість отримання ЗПСП без гіперполяризації клітини. Сильна гіперполяризація клітин часто призводила до їх загибелі. З цим пов’язана обмежена кількість даних, що отримані в серії експериментів з подразненням прегангіонарного нерва.

Для того, аби порівняти субодиничний склад НХР постсинаптичної мембрани та мембрани соми нейронів підщелепного ганглія щура, ми досліджували дію антитіл проти 3-, 4-, 5- та 7-субодиниць НХР на ЗПСП та АХ-викликані потенціали даних нейронів. Було встановлено, що близько 67% нейронів, що досліджені, показали зниження амплітуди ЗПСП при аплікації на них як антитіл проти 3-, так і проти 5-субодиниць і 87% нейронів – антитіл проти 4-субодиниці. Антитіла проти 3-, 4- та 5-субодиниць виявились однаково ефективними в експериментах по з’ясуванню їх впливу на зміни амплітуди АХ-викликаних потенціалів. На них відреагувало 75% від загальної кількості нейронів, що були досліджені за допомогою кожного антитіла. А на антитіло проти 7-субодиниці НХР прореагувало зниженням амплітуд як ЗПСП, так і АХ-викликаних потенціалів тільки близько 33% нейронів. Таким чином, за нашими даними (Рис.7) немає суттєвої різниці у частоті появи НХР, які мають у своєму складі 3-, 4-, 5- чи 7-субодиниці як на сомі, так і на постсинаптичній мембрані.

Рис. 7 Кількість нейронів, що прореагували на аплікацію відповідного -специфічного антитіла (заштрихована частина стовпчиків) в загальній кількості досліджених нейронів