ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

ПОСТОЄНКО

Володимир Олексійович

УДК 638.17 : 661.158.001.76

НАУКОВІ ОСНОВИ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ВИКОРИСТАННЯ АПІФІТОПРЕПАРАТІВ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРИЗНАЧЕННЯ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

КИЇВ – 2005

Дисертація є рукописом.

Робота виконана в Інституті бджільництва ім.П.І.Прокоповича Української академії аграрних наук.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН

ПАТИКА Володимир Пилипович, Національний авіаційний університет, професор кафедри біотехнології факультету екологічної безпеки.

Офіційні опоненти:  доктор сільськогосподарських наук, професор

ГЛАЗКО Тетяна Теодорівна, Інститут агроекології та біотехнології УААН, завідувачка відділом молекулярно-генетичних досліджень.

доктор технічних наук, професор, академік УААН

ЄЖОВ Валерій Микитович, Нікітський ботанічний сад УААН – Національний науковий центр, директор.

доктор сільськогосподарських наук

МАЛИНОВСЬКА Ірина Михайлівна, Інститут землеробства УААН, головний науковий співробітник лабораторії ґрунтової мікробіології.

Провідна установа: Вінницький державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, м. Вінниця.

Захист дисертації відбудеться „01листопада 2005 року о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .371.01 в Інституті агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук за адресою: 03143, м. Київ, вулиця Метрологічна 12, Інститут агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН, 03143, м. Київ, вулиця Метрологічна 12.

Автореферат розісланий „___” вересня 2005 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Л.І.Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Конструювання нових натуральних ветеринарних засобів, зокрема з продуктів бджільництва і рослин, є одним із сучасних напрямків вітчизняної сільськогосподарської біотехнології, який знаходиться на початкових стадіях свого розвитку. Формування наукових основ біотехнології апіфітопрепаратів невід’ємно пов`язане з розробкою критеріїв відбору рослин і продуктів бджільництва на підставі вивчення їх хіміко-біологічних характеристик та безпосереднім використанням у виробництві засобів для профілактики і лікування тварин.

В умовах загострення екологічної ситуації особливого значення набувають дослідження біохімічних механізмів адаптації різних біологічних об`єктів до несприятливих факторів існування. Встановлено, що баланс сполук адаптогенної дії під впливом екзогенних чинників в рослинах формується внаслідок функціонування складних механізмів їх біосинтезу, концентрування і акумуляції (Таран Н.Ю., 2001, Ребров В.Г., Громова О.А., 2003). За цих умов діючі речовини рослин являють собою комплекс споріднених сполук-ізомерів. Підсилення їх адаптогенної дії залежить не тільки від збільшення кількості, але і від співвідношення концентрацій між ними. Таким чином, є всі підстави передбачати, що у біотехнології натуральних препаратів перспективним є використання комплексу речовин, а не окремих індивідуальних компонентів. Проте, цей новий біотехнологічний напрямок не розроблений і потребує свого теоретичного й експериментального обгрунтування.

Відомо, що несприятливі екзогенні чинники є причиною виникнення широкого спектру захворювань незаразної етіології. Вони характеризуються інтенсифікацією процесів перекисного окислення ліпідів, зростанням напруження в багаторівневій системі антиоксидантного захисту, порушеннями обмінних процесів у різних органах і системах, генетичними відхиленнями, зниженням імунітету тощо (Барабой В.А., 1991, Бариляк І.Р., 2002, Мельничук Д.О., 2000, Захаренко М.О., 2000, Попова Е.М. і співавт., 1997, Gavant V., 1999, Chen H., Tappel A., 1996 та ін.). Це, зокрема, означає, що будь-які аспекти годівлі, утримання й лікування тварин повинні підлягати екологічній оцінці (Патика В.П. і співавт., 2003, Глазко Т.Т. і співавт., 2005, Засєкін Д.А., 2002, Красочко П.А., 2002 та ін.). В цьому аспекті актуальними є дослідження, спрямовані на теоретичне обгрунтування біотехнологічного напрямку із застосування біологічних об`єктів, які адаптовані до несприятливих біотичних та абіотичних факторів екологічного стресу у технологіях одержання ветеринарних засобів із корегуючими метаболізм властивостями.

До них відносять сполуки антиоксидантної дії з продуктів бджільництва і рослин. Найпоширенішими серед них є біологічно активні фракції каротиноїдів, токоферолів і фенольних сполук. Вони нетоксичні, не забруднюють продукцію тваринництва і довкілля, високоефективні і виявляють комплексну позитивну антиоксидантну, протимікробну, імуномоделюючу, регенераційну, детоксикуючу дію, нормалізують функції органів і систем (Боднарчук Л.І. і співавт., 2002, Тихонов О.І., 2002, Асафова Н.Н. и соавт., 2001, Макарова В.Г. и соавт., 2002, Максютіна Н.П., 2000, Sung-Kee Jo et al., 2004, Sato T., 2000 та ін.).

В зв`язку з цим, теоретичним обґрунтуванням біотехнологічних прийомів у розробці багатокомпонентних апіфітопрепаратів ветеринарного призначення слугували дослідження біохімічної ролі та синергізму дії в процесах адаптації до несприятливих умов існування біологічно активних фракцій антиоксидантів (каротиноїдів, токоферолів та фенольних сполук з апіфітосировини) на різних об`єктах - рослинах (в яких вони синтезуються), тваринах (для яких вони є незамінними факторами годівлі) і моделях in vitro. Розвиток цього напрямку вимагає розробки критеріїв відбору біологічних об`єктів (продуктів бджільництва і рослин), нових технологічних підходів до переробки апіфітосировини, які передбачають зниження вмісту в ній токсичних речовин і елементів, отримання і використання у лікуванні тварин екологічно безпечних засобів з адаптогенними і корегуючими метаболізм властивостями.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною наукових досліджень тем: „Визначити потреби тваринництва України в незамінних факторах годівлі (амінокислотах, вітамінах, макро- і мікроелементах) та вивчити виробничі, технологічні і технічні можливості їх задоволення”, номер державної реєстрації UA 01011045 P (1992 1995роки) та „Розробити та впровадити технологію виробництва масляного екстракту харчового каротину концентрацією 0,02 0,2% з рослинної сировини”, номер державної реєстрації 0194 U 016701 (1994 рік), що виконували співробітники лабораторії кормових та харчових добавок Інституту харчової хімії і технології Держхарчопрому України та НАНУ на замовлення НАНУ та Держхарчопрому України відповідно. Фрагменти роботи були виконані на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка згідно теми „Дослідити закономірності патогенезу фітовірусних інфекцій з метою раціонального використання природних ресурсів”, номер державної реєстрації 0197 U 003157 (1996 2000 роки). Дисертаційна робота також є частиною НДР лабораторії біохімії та технології продуктів бджільництва Інституту бджільництва ім. П.І.Прокоповича УААН за темою „Створити і впровадити в практику апіфітокомпозиції цілеспрямованої дії”, номер державної реєстрації 0101 U 004435 (2000 2005 роки).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - розробка біотехнологічних основ виробництва і використання апіфітопрепаратів ветеринарного призначення шляхом з’ясування біохімічних особливостей їх функціонування при патогенезі клітинних пошкоджень під впливом несприятливих факторів існування.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

· дослідити вміст каротиноїдів і вітаміну Е в рослинах під впливом несприятливих факторів довкілля в умовах польового експерименту;

· визначити зміни в обміні речовин у розвитку захворювань незаразної етіології органів травлення і дихання тварин;

· вивчити синергізм дії каротиноїдів, вітаміну Е з рослин та фенольних сполук з продуктів бджільництва в умовах лабораторного експерименту;

· обґрунтувати шляхи регулювання біотехнологічних властивостей апіфітосировини й отримання з них біологічно активних субстанцій: масляного концентрату каротиноїдів, прополісно - живичної пасти, фітостеринової мазевої основи, настоянок лікарських рослин;

· розробити біотехнологію і впровадити у виробництво ряд високоефективних апіфітопрепаратів ветеринарного призначення у формі мазей та водно-спиртових розчинів;

· визначити шляхи реалізації адаптативного потенціалу тварин в патогенезі захворювань органів травлення і дихання, а також особливості корекції обміну речовин у послідовному ланцюгу: незаразні захворювання (стрес) – ліпіди – перекисне окислення ліпідів – антиоксиданти з апіфітосировини – гомеостаз;

· випробувати апіфітопрепарати у виробничих умовах господарств з різних регіонів України;

· розробити науково – методичні рекомендації щодо оцінки якості і стандартизації апіфітопрепаратів у формі мазей.

Об’єкт дослідження – комплекс адаптаційно - захисних реакцій рослин і тварин під впливом несприятливих факторів довкілля.

Предмет дослідження – біотехнологічні прийоми застосування продуктів бджільництва і рослин, як компонентів для конструювання й використання апіфітопрепаратів ветеринарного призначення.

Методи дослідження: польовий – вивчення впливу агроекологічних умов на біохімічні характеристики каротиновмісної рослинної сировини; лабораторний – визначення кількісних і якісних характеристик об’єкту досліджень фізико-хімічними, зоотехнічними, біотехнологічними, біофармацевтичними, реологічними та іншими методами; виробничі випробування - визначення біологічної ефективності і терапевтичні дії апіфітопрепаратів; статистичний – встановлення вірогідності отриманих результатів, функціональних залежностей між різними чинниками і процесами на основі регресійного та дисперсійного методів аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше обґрунтовано наукові основи біотехнології апіфітопрепаратів ветеринарного призначення. Ця мета досягнута шляхом з’ясування біохімічної ролі та синергізму дії біологічно активних фракцій каротиноїдів, токоферолів й фенольних сполук з апіфітосировини в процесах адаптації різних організмів до несприятливих умов існування. Ці сполуки використано як основні діючі речовини при конструюванні препаратів з адаптогенними і корегуючими метаболізм властивостями для використання у лікуванні захворювань незаразної етіології тварин.

Встановлено, що під впливом хлор-, фосфорорганічних сполук і нітратів та вірусної інфекції в природних умовах збільшується біосинтез каротиноїдів і вітаміну Е в рослинах. Критеріями відбору рослин і продуктів бджільництва для конструювання апіфітопрепаратів запропоновано показники загального вмісту каротиноїдів, токоферолів і фенольних сполук.

Теоретично обґрунтовано біотехнологічний прийом використання антиоксидантних фракцій з рослин і продуктів бджільництва, адаптованих до несприятливих біотичних і абіотичних факторів, у виробництві екологічно безпечних ветеринарних засобів.

Показано, що патогенез захворювань незаразної етіології органів дихання і травлення тварин супроводжується зростанням рівня продуктів перекисного окислення ліпідів, змінами в обміні основних класів органічних сполук і зниженням вмісту в крові вітамінів А, Е і каротиноїдів. Цей факт обумовлює використання антиоксидантів як адаптогенів і коректорів метаболізму у лікуванні тварин.

Вперше доведено синергізм дії каротиноїдів, вітаміну Е й фенольної фракції з апіфітосировини у підсиленні їх антиоксидантної активності. Експериментально доведено роль антиоксидантів у механізмах адаптації різних видів організмів до дії екзогенних чинників. Розроблено біотехнологічний підхід до складання рецептур апіфітопрепаратів із програмованою антиоксидантною активністю по співвідношенню концентрацій між діючими речовинами у їх складі.

Відпрацьовано шляхи регулювання технологічних властивостей апіфітосировини та біотехнологічну схему отримання з неї: масляного концентрату каротиноїдів, прополісно- живичної пасти, фітостеринової мазевої основи, настоянок лікарських рослин.

Вперше теоретично обґрунтовано біотехнологічний напрям виробництва багатокомпонентних апіфітопрепаратів на основі стандартизованих фракцій каротиноїдів, токоферолів і фенольних сполук. Для підсилення терапевтичної дії до них додаються інші компоненти у вигляді продуктів бджільництва і фітоекстрактів.

Вперше розроблено біотехнологічний процес, рецептури чотирьох апіфітопрепаратів ветеринарного призначення у формі мазей і водно-спиртових розчинів. Показано, що комплексність дії розроблених препаратів обумовлена їх здатністю нормалізувати обмін речовин у послідовному ланцюгу: захворювання, яке викликане несприятливими чинниками незаразної етіології – активація перекисного окислення ліпідів – апіфітопрепарати цілеспрямованого призначення – гомеостаз.

Для прогнозування і визначення біологічної ефективності ветеринарних апіфітопрепаратів відібрано методи фізико-хімічного аналізу на моделі in vitro за величиною антиоксидантної активності та біологічний – за показниками вмісту у крові тварин гідроперекисів ліпідів і показників ступеня гемолізу еритроцитів.

Наукова новизна проведених досліджень захищена двома патентами України.

Практичне значення проведених досліджень. Виробництву рекомендовано технології масляного концентрату каротиноїдів з рослинної сировини (ТУУ 18.185-94), прополісно – живичної пасти, фітостеринової мазевої основи й настоянок лікарських рослин, які вигідно відрізняються від існуючих аналогів спрощенням та скороченням технологічного процесу, підвищенням виходу цільового продукту і містять в собі ряд нових технічних рішень.

Виробництву запропоновано нові біотехнології чотирьох апіфітопрепаратів у формі мазей і водно-спиртових розчинів для лікування відповідних хвороб тварин:

· мазь „Антимаст” (ТУУ 46.15.211-97) – лікування різних форм маститів, шкірних захворювань;

· „Афродіта” (ТУУ 46.15.331-98) – комплексний препарат для лікування ендометритів, сальпінгітів, порушень статевих циклів маточного поголів’я;

· ;„Віта” (ТУУ 46.15.330-98) – гострі розлади травлення з ознаками діареї новонароджених;

· „Прана” (ТУУ 46.15.329-98) – респіраторні хвороби молодняка.

Розроблено науково-методичні рекомендації „Методи оцінки якості та стандартизації апіфітопрепаратів у формі мазей”.

Одержаний експериментальний матеріал запропоновано внести до програм підготовки спеціалістів вищих учбових закладів біотехнологічного профілю.

Особистий внесок здобувача. В дисертаційній роботі особисто автором обґрунтовано напрямок досліджень, розроблено робочі програми, підібрано методики досліджень, проведено експерименти, проаналізовано і узагальнено результати, підготовлено до друку матеріали, проведено їх апробацію, сформульовано висновки і пропозиції виробництву. Із спільних з іншими співробітниками експериментальних досліджень і публікацій дисертантом використано, за згодою співавторів, лише власну частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на: 7th Asian Apicultural Association Conference and 10th Beenet Symposium and Technofora (Philippines, Los Banos, 2327 February 2004), 14th International symposium on carotenoids (UK, Edinburgh, 17 – 22 July 2005), XL11 Naukowa Konferencja Pszczelarska, (Poland, Pulawy 8 – 9 marca 2005), International Conference “New technologies of isolation and application of biologically active substances”(Ukraine, Alushta, 2025 May 2002), Международной конференции молодых ученых “От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии” (Россия, Тверь, 28 сентября 2003), III Міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” (м. Київ, 2001), 5-й Международной конференции “Опыт и перспективы развития технологии спектрально-динамического анализа (СДА) в медицине и других отраслях народного хозяйства” (Украина, г. Киев, 2005), Всеукраинской научно-практической конференции “Перспективные направления развития сельскохозяйственной науки и производства в Украине” (г. Симферополь, 2002), II з’їзді апітерапевтів України „Апітерапія: погляд у майбутнє” (м. Харків, 2002), II конференції професорсько-викладацького складу і аспірантів Інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК (м. Київ, 2003), Х з’їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, 2004).

Публікації результатів досліджень. Основні положення і результати досліджень опубліковані у 38 наукових працях, у тому числі - в 21 фаховому виданні, 2-х патентах України, 14 збірниках наукових праць, матеріалах з’їздів, конференцій, 1 науково-методичній рекомендації. За матеріалом дисертації розроблено нормативно-технічну документацію на виробництво і застосування ветеринарних препаратів.

Структура та обсяг дисертаційної роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, основних методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів досліджень, висновків та пропозицій виробництву, списку використаної літератури, додатків. Робота викладена на 338 сторінках друкованого тексту, з них основного тексту – 258, містить 43 таблиці, 35 рисунків, 13 додатків. Список літератури включає 513 найменувань, з них 169 закордонних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Наведено аналіз експериментальних даних і теоретичних розробок вітчизняних і закордонних дослідників щодо фізико-хімічних властивостей та біологічної ролі продуктів бджільництва і рослин, їх застосування в продуктивному тваринництві і ветеринарії і біотехнологічних аспектів переробки апіфітосировини. На основі здійсненого аналізу обґрунтовано актуальність і перспективність проведення досліджень.

Загальна методика і основні методи досліджень

Дослідження за темою дисертаційної роботи проведені протягом 1992 – 2004 років згідно схеми (рис. 1).

Вплив забруднювачів зовнішнього середовища хімічної природи і вірусної інфекції на вміст каротиноїдів, вітаміну Е у рослинах вивчали на наступних об’єктах – моркві посівній (Daucus carota L.) сорту Шантане і кропиві дводомній (Urtica dioica L).

Зразки кропиви дводомної з різним ступенем інфікованості вірусами, встановленим за зовнішніми симптомами (некроз листкової пластинки та хлоротична плямистість) відбирали в агро- і природних біоценозах Київської (Богуславський район)і Житомирської (Попельнянський район) областей. Для досліджень використовували листя згідно існуючим рекомендаціям (Мінарченко В.М., 2002).

Ідентифікацію вірусної інфекції проводили методами імуноферментного аналізу (Гнутова Р.В., 1993).

Зразки моркви сорту Шантане відбирали в трьох регіонах, визначених згідно „Екологічного атласу України” за наступними показниками: ступінь забрудненості; потенціал екологічного ризику, рівень теоретичної багаторічної залишкової кількості пестицидів у ґрунті (Барановський В.А., 2000). Ними були: Чернігівська область,

Козелецький район – найнижчий ступінь антропогенного навантаження; Полтавська область, Пирятинський район – середній ступінь антропогенного навантаження; Херсонська область, Бериславський район – високий ступінь антропогенного навантаження.

Сумарний вміст у коренеплодах моркви дихлодифенілтрихлоретану і його метаболітів (ДДТ), фосфамідів визначали методом тонкошарової хроматографії (Конюхов А.Ф., 1975; Клисенко М.А., 1983), а нітратів – спектрофотометрично (Мусієнко М.М., 2001).

В межах кожного регіону морква вирощена на одному типі ґрунтів, облікові площі і зразки коренеплодів для аналізів відбирали згідно існуючим рекомендаціям (Патика В.П. зі співав., 2005). За контрольні зразки брали чисті коренеплоди, а дослідні – із зазначеними ксенобіотиками.

Причинно-наслідкові зв’язки виникнення й перебігу захворювань органів дихання і травлення вивчали в умовах науково-господарського експерименту на телятах віком 1 60 діб. Діагнози гострих розладів травлення і захворювань дихальної системи визначали на основі клінічних ознак і висновків районних лабораторій ветеринарної медицини. Дослідні (телята, віком 3 – 5 діб, хворі на діарею і віком 45 60 діб, що мали гострі респіраторні розлади) і контрольні (телята з нормальним розвитком, віком 1 60 діб) групи тварин, сформовані за принципом аналогів, перебували в однакових умовах утримання і годівлі.

Кров для досліджень відбирали із яремної вени вранці, до годівлі тварин, із дотриманням правил асептики і антисептики. У крові визначали метаболіти білкового, вуглеводного, ліпідного обмінів, циклу трикарбонових кислот за загально прийнятими методами, у тому числі ізвикористанням біохімічного аналізатору STAT FAX 1904 Plus (Австрія) та хімічних реактивів фірми „Lachema” (Чехія). Рівень перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) у крові тварин оцінювали за первинними продуктами – гідроперекисами ліпідів (ГПЛ) та ступенем гемолізу еритроцитів, а стан неферментативної ланки антиоксидантного захисту (АОЗ) - за вмістом у крові вітамінів Е, А та каротиноїдів (Попова Э.М., 1993; Донченко Г.В., 1969).

В умовах цих дослідів було визначено також біологічну ефективність розроблених нами апіфітопрепаратів: „Віта” (лікування і профілактика захворювань органів травлення) і „Прана” (лікування і профілактика захворювань органів дихання у тварин.

Синергізм дії у прояві антиоксидантної активності (АОА) масляних екстрактів каротиноїдів, вітаміну Е з рослин і водно-спиртової (700) фенольної фракції прополісу вивчали на моделі in vitro по автотермічному окисленню олеїнової кислоти із використанням методів математичного моделювання експериментів, статистики й ЕОМ (Паранич А.В. і співав. 1992; Вуколов Э.А., 2000; Горбань І.І., 2003).

Ефективність розроблених ветеринарних препаратів визначали в умовах науково-господарського експерименту на тваринах у господарствах з 4-х регіонів України.

Для визначення терапевтичного ефекту апіфітопрепарату „Афродіта” (профілактика і лікування ендометритів, сальпінгітів, порушень статевих циклів) на підставі характерних клінічних ознак і ректального дослідження корів були відібрані за принципом аналогів дві групи корів віком 3-8 років. Тварини знаходились в однакових умовах утримання. Контрольна група налічувала 114 голів і отримувала традиційне лікування: тканинні, гормональні, вітамінні препарати, антибіотики тощо. Дослідна група корів складалася з 207 голів і лікувалася препаратом „Афродіта”. Нами розроблено дві схеми застосування препарату „Афродіта”: пероральну та ін’єкційну. При пероральному способі введення 5 мл препарату розводять, ретельно перемішуючи, у 100 мл дистильованої або кип’яченої води і дають тваринам цю кількість за два прийоми на добу на невеликій кількості корму. При внутрішньом’язовому введені одна ін’єкція складалася з 2,5 мл препарату, розведеного в 7,5мл розчину для ін’єкцій, двічі на добу. „Афродіту” вводили тваринам на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й та 13-й день лікування. Ін’єкційна форма введення препарату проявила на 5 - 7% вищий ефект, ніж пероральна.

Для визначення терапевтичного ефекту мазі „Антимаст” за принципом аналогів було сформовано три групи корів віком 3 8 років:

· контрольна тварин лікували за схемою, яку традиційно застосовували у господарствах (антибіотики, мастисан, примочки, мазь цинкова тощо);

· дослідна лікування маззю „Антимаст” маститів, різних за перебігом, патогенетичним комплексом та клінічною картиною;

· дослідна лікування маззю „Антимаст” поранень шкіри, фурункульозів.

Вказані захворювання у корів виявляли на підставі аналізу епізоотичної ситуації й клінічних ознак та стандартними лабораторними дослідженнями (бактеріологічними, цитологічними, діагностика різними індикаторами) (Фисенкова И.В., 1997). Дослідним групам мазь „Антимаст” наносили шляхом втирання у вражену поверхню тіла по 4 – 10г двічі на день з інтервалом у 12 годин. Курс лікування залежно від характеру та ступеня лікування тривав 3 – 10 діб.

Терапевтичний ефект апіфітопрепарату „Віта” у профілактиці і лікуванні гострих розладів травлення з ознаками діареї визначали на новонароджених телятах віком 1 5 діб, підібраних за принципом аналогів. Діагноз захворювання органів травлення ставили на основі характерних клінічних ознак й аналізу епізоотичної ситуації. Телят у контрольних групах лікували за схемами, які традиційно використовували у господарствах. Телятам з дослідних груп застосовували препарат „Віта” за запропонованою нами схемою. Після попереднього розведення препарату 1 : водою дистильованою або кип’яченою його давали новонародженим тваринам разом із

молозивом, обов’язково включаючи перше випоювання, тричі на добу з розрахунку 1,5 – 2 мл на 1 кг маси тіла протягом 2 – 3 діб.

Виробниче випробування препарату „Прана” у лікуванні респіраторних захворювань проводили на телятах віком 45 60 діб, яких за принципом аналогів розподілили на дві групи: контрольну лікували за традиційною схемою і дослідну гострі респіраторні захворювання лікували препаратом „Прана”. Згадані захворювання у тварин виявляли на підставі епізоотичної ситуації, клінічних ознак і лабораторних досліджень (лейкоцитоз, нейтрофілія зі зрушенням нейтрофільного ядра вліво, еозинопемія, збільшення кількості еритроцитів і гемоглобіну) (Смирнов А.Н. и соавт. 1998). Препарат „Прана” вводили дослідній групі тварин за двома схемами. Пероральна – 3 мл препарату розводили до загального об’єму 90 мл водою дистильованою, по 30 мл розчину згодовували з невеликою кількістю корму тричі на добу. Внутрішньом’язова - одна ін’єкція складалася з 1 мл препарату та 3 мл розчинника для ін’єкцій, три ін’єкції на добу. Курс лікування 10 діб. Обидві схеми застосування препарату дали однаковий терапевтичний ефект.

У всіх випадках терапевтичний ефект препаратів дорівнював різниці лікувальних ефектів між дослідною і контрольною групами тварин і визначався у відсотках вилікуваних тварин.

У роботі використано ряд технологічних підходів та методів із підбору температурних режимів обробки, обезвожування сировини, подрібнення, екстракції з використанням органічних розчинників і рослинних олій, дослідження оптимальних умов стабільності в процесі зберігання сировини та препаратів (Тихонов О.І., 2002).

Структурно-механічні властивості мазей та їх основ оцінювали за допомогою ротаційного віскозиметру „Реотест-2” (Німеччина) при температурах 200 С і 340 С (Тенцова А.И., 1980).

Протимікробну активність апіфітопрепаратів вивчали методом дифузії в агар із використанням штамів Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus, Micrococcus roseus, Candida albicans, Escherichia coli - з колекції Інституту агроекології та біотехнології УААН (м. Київ) (Михальський Л.О. і співав., 2002).

Оцінку якості і стандартизацію апіфітопрепаратів проводили згідно розроблених нами науково-методичних рекомендацій „Методи оцінки якості та стандартизації апіфітопрепаратів у формі мазей”, у яких наведено нові та адаптовано існуючі методи: визначення стабільності мазей (кислотне число, кількість відпресованої фази, вміст диєнових кон’югатів і кетодієнів, показники окиснюваності й антиоксидантної активності), показник електропровідності, біофармацевтичні (за динамікою вивільнення діючих речовин), кількісне визначення біологічно активних сполук (за вмістом каротиноїдів, вітамінів Е і С, фенольних сполук) (Постоєнко В.О. і співав., 2004).

Отримані експериментальні дані обробляли статистично (Кокунін В.А., 1978).

Роль біологічно активних сполук антиоксидантної групи у механізмах адаптації і захисту організмів рослин і тварин до дії несприятливих факторів

Фізико-хімічний аналіз продуктів бджільництва і рослин свідчить, що до їх складу входить значна кількість біологічно активних сполук із антиоксидантними властивостями. Найпоширенішими серед них є біологічно активні фракції каротиноїдів, токоферолів і фенольних сполук. Зауважимо, що дані літератури щодо впливу несприятливих факторів зовнішнього середовища на біосинтез і вміст у рослинах каротиноїдів і вітаміну Е суперечливі й фрагментарні (Безсонова В.П. і співав., 2000; Скляревський М.А. і співав., 1978; Соколов С.Я., 2000). Нами в умовах польових досліджень проведено визначення впливу хімічних забруднювачів (ДДТ і його метаболітів, фосфамідів і нітратів) на вміст каротиноїдів і вітаміну Е у коренеплодах моркви сорту Шантане з трьох регіонів України. У кожному регіоні виявлені агроценози, умовно названі №1, які не містили досліджених ксенобіотиків. Коренеплоди моркви з них прийняті за контроль. Агроценози №№ 2, 3, 4 по регіонах забруднені вище максимально допустимого рівня переважно одним видом сполук (табл. 1, 2, 3).

Таблиця 1

Вплив ДДТ, ДДД, ДДЕ на вміст каротиноїдів та вітаміну Е у коренеплодах моркви сорту Шантане, вирощеної в різних кліматичних зонах України

Встановлено, що в різних природних зонах спостерігається тенденція до зростання кількості каротиноїдів і вітаміну Е у контрольних зразках моркви в напрямку з півночі на південь, що свідчить про вплив кліматичних факторів на дані показники (табл. 1.). ДДТ і його метаболіти істотно впливають на біохімічні показники коренеплодів моркви, а саме знижується вміст сухої речовини та зростає біосинтез каротиноїдів на 50-67 %, вітаміну Е – на 38 – 67% (р < 0,05).

При збільшенні вмісту фосфамідів вище за максимально допустимий рівень у коренеплодах моркви також достовірно зростає частка каротиноїдів на 36 – 47 %, вітаміну Е на 40 – 50% (табл. 2), під впливом нітратів на 29 – 37%, вітаміну Е - 34 - 42 % (табл. 3). Встановлена закономірність має нелінійний характер, оскільки під впливом більш високих доз ксенобіотиків вміст антиоксидантів зростає менш інтенсивно.

Таблиця 2

Вплив фосфамідів на вміст каротиноїдів і вітаміну Е у коренеплодах моркви сорту Шантане, вирощеної в різних природних зонах України

Таблиця 3

Вплив нітратів на вміст каротиноїдів і вітаміну Е у коренеплодах моркви сорту Шантане, вирощеної в різних природних зонах України

Нами також обстежені екосистеми з різним рівнем антропогенного навантаження Київської і Житомирської областей. Виявлено вплив інфікованості вірусами на вміст каротиноїдів у кропиві дводомній (табл. 4). Показано, що за цих умов їх вміст зростає на 10 - 20% (р < 0,05).

Таблиця 4

Вплив вірусної інфекції на вміст каротиноїдів у листі кропиви дводомної

Таким чином, під впливом песимальних доз несприятливих екологічних факторів (кліматичних, ксенобіотиків, інфікованості вірусами) пригнічується біосинтез основних класів органічних сполук (по зниженню вмісту сухих речовин ) і проявляються захисні реакції рослин, зокрема, шляхом зростання вмісту антиоксидантів. Разом з тим, нашими експериментальними дослідженнями показано, що антиоксидантна активність фракцій каротиноїдів і вітаміну Е із забруднених хімічними сполуками рослин на 15 – 20% вища порівняно з контролем. З літературних джерел відомо, що паралельно зі зміною вмісту каротиноїдів і вітаміну Е порушується баланс співвідношень між ізомерами всередині цих фракцій у рослинах (Таран Н.Ю., 2001). З огляду на це можна зробити висновок, що досліджувані антиоксидантні фракції є структурно-функціональними одиницями, які протидіють екзогенним стрес-чинникам. Тобто, в умовах трансформованого середовища з рослин можна отримувати біологічно активні фракції антиоксидантів, які найбільш адаптовані до протидії існуючим на даній території стрес – чинникам.

Цей висновок використано нами у формулюванні біотехнологічного напряму з конструювання багатокомпонентних апіфітопрепаратів на основі стандартизованих біологічно активних фракцій з рослин і продуктів бджільництва, а критеріями відбору останніх можуть бути показники загального вмісту каротиноїдів і токоферолів.

При цьому виникає можливість вирішення суміжної проблеми, а саме – знешкодження забруднювачів у рослинній сировині, що використовується для отримання згаданих препаратів.

Захисні функції каротиноїдів і вітаміну Е притаманні клітинам усих видів організмів. Ці антиоксидантні фракції, крім рослин, в яких синтезуються, виконують подібну роль і в клітинах тварин, для яких вони є незамінними факторами годівлі (Косенко М.В. і співавт., 2001). Травна й дихальна системи тварин першими реагують на несприятливі умови існування. Встановлення причинно-наслідкових зв`язків виникнення й перебігу захворювань цих систем під впливом екзогенних чинників, визначення дисбалансу в обміні речовин у їх розвитку, відкриває нові можливості у лікуванні тварин. В умовах науково-господарського експерименту нами показано, що патології органів травлення й дихання тварин викликаються екзогенними чинниками незаразної етіології. В крові тварин зростає (р < 0,05) вміст первинних продуктів ПОЛ – гідроперекисів ліпідів у 3,2 рази при захворюваннях органів травлення та в 3,8 рази при гострих респіраторних захворюваннях у порівнянні з нормою та достовірно зростають показники ступеня гемолізу еритроцитів, що свідчить про інтенсифікацію вільнорадикальних процесів (табл. 5).

На цьому фоні, як видно з таблиці 5, порушується метаболізм білкового, ліпідного, вуглеводневого обмінів, вміст і співвідношення між інтермедіатами циклу трикарбонових кислот (енергетичний обмін). Зростання у крові хворих тварин вмісту ГПЛ та значень ступеня гемолізу еритроцитів дає підстави для використання цих показників у відпрацюванні біологічного методу визначення ефективності апіфітопрепаратів.

У патогенезі досліджуваних захворювань у крові обстежених тварин також знижується вміст вітамінів А, Е, каротиноїдів порівняно з нормою. Показовою характеристикою стану організму є співвідношення вмісту вітаміну Е до загальних ліпідів. Ці значення знаходяться вище за одиницю в нормі і при патологіях, що свідчить про повноцінне надходження антиоксидантів в організм із кормами. Отже, в основі зниження рівня антиоксидантів в організмі тварин при патологіях органів дихання і травлення лежать метаболічні порушення.

Такі зміни в обміні речовин можна розглядати як окремі складові єдиного механізму адаптації організму тварин до дії несприятливих чинників довкілля. Очевидно, що за таких умов їх фармакологічний захист повинен бути пов`язаний зі стабілізацією біологічних антиоксидантних систем, вирівнюванням обмінних реакцій.

Таблиця 5

Біохімічні показники крові телят у нормі та при патології

Отримані дані дозволяють зробити висновок, що в умовах трансформованого середовища у біологічному колообізі спрацьовують певні адаптаційні механізми, властиві живій речовині, одним з інструментів яких є підтримання на відповідному рівні й використання в екстремальних умовах захисних сполук - антиоксидантів. Провідна роль у цьому процесі належить рослинам, які реагують на дію песимальних доз стрес-факторів підвищенням біосинтезу каротиноїдів і токоферолів. Бджоли для виробництва своїх продуктів використовують рослинну сировину, з якої до їх складу переходять антиоксидантні фракції у видозміненому вигляді.

На відміну від рослин, для організму тварин, досліджувані антиоксиданти є незамінними факторами живлення. Тому, при розробці раціонів та виборі лікувальних препаратів необхідно враховувати підвищений рівень перевитрат цих речовин в умовах оксидативного стресу. Це завдання на сьогодні вирішується, в основному, збільшенням в 2-3 рази існуючих добових доз прийому препаратів антиоксидантів. Проведені нами дослідження показали, що зменшення їх вмісту в організмі тварин при патологіях органів травлення і дихання пов’язане з метаболічними порушеннями в організмі. У такому випадку просте збільшення цих факторів не повністю вирішує поставлене завдання. Одним із шляхів запобігання їх дефіциту можуть бути препарати отримані на основі вивчення конкретних механізмів прояву біологічної активності діючих речовин в організмі тварин.

Унікальна особливість функціонування біологічно активних сполук в організмі тварин і людини - це синергізм дії, тобто підсилення біологічного потенціалу одне одним. Але в літературі відомості про синергізм дії фракцій каротиноїдів, вітаміну Е з рослин і фенольних сполук із прополісу відсутні.

Лабораторними дослідженнями на моделі термічного окислення олеїнової кислоти встановлено, що у еквівалентних концентраціях антиоксидантна активність комплексу каротиноїдів, токоферолів і фенольних сполук значно вища, ніж окремих компонентів (рис. 2).

Рис. 2 Порівняльний аналіз АОА препаратів каротиноїдів, вітаміну Е з рослин, фенольних сполук з прополісу та їх комплексу у еквівалентних концентраціях 700 мг %.

Детальне дослідження впливу різних концентрацій та співвідношень між вихідними факторами є актуальним у розробці біотехнології та обґрунтуванні рецептур апіфітопрепаратів із заданими властивостями, зокрема, антиоксидантною активністю. Такі експерименти відносяться до багатофакторних і передбачають використання методів математичного моделювання і статистики.

В умовах багатофакторного експерименту показано, що антиоксидантна активність комплексу каротиноїдів, вітаміну Е з рослин і фенольної фракції прополісу знаходяться у прямій залежності від співвідношення концентрацій між ними (табл. 6). Так, зміни концентрацій, тільки одного з факторів (каротиноїдів з 20мг% до 10 мг%) при порівнянні комплексів № 8 і № 7 значно змінює величину антиоксидантної активності, яка в діапазонах досліджуваних концентрацій коливається в межах 3,17 – 7,57 відносних одиниць (в.о.) та визначена нами як критерій стандартизації засобів, що розробляються.

Комплексний біотехнологічний підхід із використанням біохімічних та математичних методів дозволяє досягти оптимальні співвідношення між антиоксидантами та їх дозами у лікувальних засобах. Наприклад, на рисунку 3 наведено різні варіанти рецептур засобів для досягнення в них антиоксидантної активності 7,57 в.о. Таким чином, виходячи з економічної і терапевтичної доцільності, можна розробляти різні варіанти апіфітопрепаратів із заданою антиоксидантною активністю.

Таблиця 6

Антиоксидантна активність комплексу каротиноїдів, вітаміну Е з рослинної сировини та фенольних сполук з прополісу в умовах багатофакторного експерименту

Фізико-хімічний аналіз показує, що кожен продукт бджільництва ґрунтується на оптимальному співвідношенні компонентів для виконання тієї чи іншої ролі. Так, у складі меду, головні функції якого енергетична й трофічна, переважають фруктоза й глюкоза, у прополісі (захисна функція) - протимікробні й антиоксидантні фенольні сполуки. Обніжжя бджолине і перга, які призначені для вирощування молодих бджіл, є достатнім джерелом протеїнів і ліпідів. Проте, незважаючи на спеціалізацію й переважання певних груп речовин, усим продуктам бджільництва притаманні загальні компоненти. До них відносяться вітаміни, мінеральні солі, ферменти, гормони, ненасичені жирні й органічні кислоти тощо (Асафова Н.Н., 2001).

Багатокомпонентний принцип побудови продуктів бджільництва використано нами у розробці біотехнологічного підходу до обгрунтування рецептур апіфітопрепаратів ветеринарного призначення. Основні діючі речовини в їх складі - стандартизовані біологічно-активні фракції каротиноїдів, вітаміну Е і фенольних сполук в оптимальному співвідношенні між собою. Для забезпечення вираженої терапевтичної дії препаратів у лікуванні того чи іншого захворювання до основних діючих речовин додаються спеціальні компоненти у вигляді продуктів бджільництва або фітоекстрактів.

Рис. 3 Співвідношення між концентраціями (в мг %) каротиноїдів, вітаміну Е з рослин та фенольних сполук з прополісу у складі комплексу з АОА 7,57 при заданих діапазонах концентрацій, де А - вітаміну Е – 15 - 30 мг % та фенольних сполук – 450 - 650 мг %; Б - каротиноїдів – 10 - 20 мг %, фенольних сполук – 450 - 650 мг %; В - каротиноїдів – 10 - 20 мг %, вітаміну Е – 15 - 30 мг %.

Такий комплексний біотехнологічний підхід до побудови апіфітопрепаратів вимагає вирішення ряду технологічних завдань, які націлені на отримання стандартизованих апіфітосубстанцій: масляного концентрату каротиноїдів і вітаміну Е з рослин, прополісно-живичної пасти, фітостеринової мазевої основи, а також настоянок прополісу і лікарських рослин.

Розробка технології масляного концентрату каротиноїдів з рослинної сировини.

Існуючі методи отримання масляного концентрату каротиноїдів (МКК) мають ряд суттєвих недоліків як у технологічному плані, так і в тому, що передбачають використання тільки незабрудненої сировини. Це значно звужує сировинну базу і підвищує собівартість кінцевого продукту. Тому нами розроблений оригінальний метод отримання МКК, який значною мірою усуває вказані вади. Основні етапи цього процесу (підготовки та інспекції сировини, обезвожування, екстракції та відділення кінцевого продукту) суттєво вдосконалені та передбачають отримання екологічно-безпечних масляних препаратів каротиноїдів з незабрудненої і забрудненої сировини.

Встановлено, що попереднє подрібнення моркви до частинок 10 - 12 мм супроводжується зниженням вмісту каротиноїдів, у незабруднених коренеплодах через 2год після подрібнення, а в забруднених хімічними речовинами – через 1год (рис. 4).

Рис 4 Вміст каротиноїдів у подрібненій моркві, яка забруднена різними хімічними сполуками: - екологічно чиста; -з вмістом ДДТ + метаболіти (0,17 мг/кг); - з вмістом фосфамідів (0,36 мг/кг); - з вмістом нітратів (440,63 мг/кг).

Нами після подрібнення введено стадію попередньої обробки сировини гідроксидом натрію або калію у вигляді порошку з наступною дією гострого пару для звільнення сировини від хлор- та фосфорорганічних сполук та руйнування компонентів віріонів. Крім цього, така обробка руйнує протеїно – ліпідний комплекс, підвищує вихід каротиноїдів, скорочує тривалість екстракції і частково обезвожує сировину, за аналогією з отриманням убіхінону з рибних відходів (Донченко, 1988). Оптимальними умовами цієї технологічної стадії є концентрація порошку лугу 2% від маси взятої сировини та інтервал температурної обробки гострим паром 10хв (рис. 5).

Порівнянням різних методів обезвожування (два варіанти отримання коагуляту та висушування) встановлено, що найкращі результати дає метод висушування.

У таблиці 7 надано результати експерименту з оптимізації температури та тривалості сушки, які дозволяють зберігати 100% вміст каротиноїдів для кожного виду сировини. Ці показники складають: для моркви – температура 700С - 750С протягом 2 – 2,5 годин, для кропиви - 600С - 650С, протягом 1,5 – 2 годин.

Рис. 5 Вміст каротиноїдів через 120 хв після подрібнення коренеплодів моркви та листя кропиви під впливом гідроксиду натрію.

Таблиця 7

Вплив температури та тривалості висушування на вміст каротиноїдів в коренеплодах моркви

На наступному етапі досліджень було відпрацьовано режими екстракції рослинної сировини. Встановлено, що тонке подрібнення сухої сировини до частинок розміром 30 – 100мкн та підвищення швидкості руху екстрагенту, які об’єднані в один етап гомогенізації, супроводжується значним прискоренням та спрощенням технологічного циклу.

Таблиця 8

Екстракція каротиноїдів з сухого рослинного порошку оліями (n=9-10)

Застосування в процесі екстракції рослинної олії (табл. 8) дає практично однакові виходи цільового продукту з різних видів сировини (коренеплодів моркви, листя кропиви дводомної, плодів гарбузів), що свідчить про універсальність запропонованої технології по видах сировини.

Також цей технічний принцип виявився придатним при застосуванні