ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

ПОДОБА Юрій Васильович

УДК 57.086.83:633.16:573.6

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ОЦІНКИ АСОЦІАТИВНИХ

ВІДНОСИН БАКТЕРІЙ ENTEROBACTER AEROGENES 30Ф

З РІЗНИМИ СОРТАМИ ЯЧМЕНЮ

03.00.20. – біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії біотехнології рослин Інституту агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук, м. Київ

Науковий керівник: кандидат біологічних наук

Петюх Григорій Павлович,

Інститут агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук, завідувач лабораторією біотехнології рослин

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук

Малиновська Ірина Михайлівна,

Інститут землеробства Української академії аграрних наук, головний науковий співробітник лабораторії ґрунтової мікробіології

кандидат біологічних наук

Рудас Володимир Андрійович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії Національної академії наук України, старший науковий співробітник відділу генетичної інженерії

Провідна установа: Вінницький державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, м. Вінниця

Захист відбудеться 4 липня 2005 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології та біотехнології УААН.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН за адресою: м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий “ 03 ” червня 2005р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Л.І. Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ячмінь є однією з провідних зернофуражних культур в світі. В Україні за посівними площами ячмінь займає друге місце серед зернових культур.

В умовах сучасного розвитку одним із шляхів підвищення продуктивності ярого ячменю є селекція сортів з високою здатністю до утворення асоціацій з рістстимулюючими азотфіксуючими бактеріями. Але висока здатність до асоціативної взаємодії з бактеріями виявлена не у всіх сортів, оскільки їх селекція проводилась на високих агрофонах і без урахування здатності сорту забезпечувати інтенсивний розвиток азотфіксуючих мікроорганізмів в кореневій зоні. Основні проблеми селекції ячменю на підвищення рівня біологічної фіксації азоту обумовлені труднощами з визначенням і оцінкою активності функціонування рослинно-бактеріальних асоціацій. Класичні методи таких оцінок потребують багато часу на проведення польових випробувань, а необхідність достатньо великої кількості посівного матеріалу робить неможливим і оцінку гібридів. Недоліками альтернативних методів оцінки рослинно-бактеріальних взаємодій шляхом вивчення рослинних метаболітів (Наумов Г.Ф., Щепкина Т.В., 1992, Кравченко Л.В. та ін., 2002) є те, що вони не враховують весь комплекс речовин, що впливають на розвиток бактерій і утворення рослинно-бактеріальних асоціацій. Проте розвиток ризосферних асоціативних мікроорганізмів залежить не тільки від наявності окремих специфічних виділень рослинних клітин, а й від сумарної дії комплексу метаболітів, бо невідомо яка саме речовина лімітує розвиток бактерій.

В зв’язку з цим особливу актуальність набуває розроблення нових підходів в оцінці рослинного вихідного матеріалу для селекції з використанням методів біотехнології. Культура тканин in vitro розкриває нові шляхи одержання інформації про особливості взаємодії рослин і бактерій. Тому дослідження в напрямку пошуку і вдосконалення біотехнологічних прийомів визначення рівня асоціативних відносин азотфіксуючих бактерій і культурних рослин є основою для розроблення ефективних методів оцінки вихідного матеріалу для практичної селекції сільськогосподарських культур на підвищення рівня ризосферної азотфіксації, тобто збільшення частки біологічного азоту в живленні рослин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно науково-технічної програми Інституту агроекології та біотехнології УААН “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем” (номер державної реєстрації 0101U003296).

Мета й завдання досліджень. Мета роботи – розробити біотехнологічний підхід для оцінки ефективності функціонування асоціативних рослинно-бактеріальних систем. Досягнення мети вимагає вирішення наступних завдань:

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт досліджень – процес взаємодії рослин і мікроорганізмів в умовах культивування in vitro та in vivo.

Предмет досліджень – стимулююча дія клітинних виділень калюсних тканин різних сортів ячменю на ріст культури бактерій E. aerogenes 30Ф.

Методи досліджень: –

польовий метод – гібридизація, аналіз структури урожаю – вивчення особливостей формування рослинно-бактеріальних асоціацій;–

лабораторний метод – культура тканин in vitro, хроматографія, світлова мікроскопія – отримання калюсних ліній ячменю, визначення активності азотфіксації в ризосфері різних сортів, аналіз дії екзометаболітів ячменю на розвиток бактерій;–

статистичний метод – математичний аналіз – встановлення достовірності результатів і функціональних залежностей між різними факторами і процесами.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлений зв’язок швидкості росту і накопичення клітин азотфіксуючих бактерій E. aerogenes 30Ф під дією екзометаболітів калюсних тканин ячменю в культурі in vitro з результатами польових досліджень. Запропоновано біотехнологічний підхід для оцінки ефективності функціонування азотфіксуючих фітобактеріальних систем. Вперше показана дія екзометаболітів калюсних тканин ячменю Харківський 74, Одеський 131, Одеський 100, Донецький 14 на розвиток діазотрофних бактерій E. aerogenes 30Ф. Встановлено, що кількість бактеріальних клітин на поживному середовищі Мурашіге і Скуга з метаболітами калюсних ліній із незрілих зародків різних сортів ячменю залежить від генотипу рослин, з яких виділені експланти.

Практичне значення одержаних результатів. В процесі досліджень оптимізовані умови одержання калюсних ліній довготривалого культивування з незрілих зародків ярого ячменю на середовищі Мурашіге і Скуга. Підібрано склад поживного середовища Мурашіге і Скуга без мінерального азоту для сумісного культивування калюсних ліній ячменю і бактерій E. aerogenes 30Ф.

Розроблено методичні рекомендації для визначення стимуляції розмноження азотфіксуючих бактерій E. аerogenes 30Ф (біопрепарат ризоентерин для підвищення продуктивності ячменю) кореневими виділеннями рослин ячменю. Методику розглянуто і затверджено Вченою радою Інституту агроекології та біотехнології УААН (протокол №10 від 24 грудня 2004 р.).

Наведені в дисертації теоретичні та практичні результати науково-дослідної роботи з отримання та культивування калюсних культур ячменю включені до курсу лекцій та практичних занять з біотехнології кафедрою генетики, селекції та насінництва для студентів V курсу агрономічного факультету Харківського національного аграрного університету ім. В.В. Докучаєва (довідка про впровадження від 20.10.2004р.). Результати роботи використовуються в науково-дослідній роботі відділу селекції, генетики і біотехнології ячменю Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр’єва УААН (довідка про впровадження від 03.11.2004р.).

Особистий внесок здобувача. Автор брав безпосередню участь у проведенні експериментів і досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі літературних матеріалів, у теоретичному обґрунтуванні одержаної наукової інформації, в розробці наукових положень та висновків, в підготовці методичних рекомендацій. У проведенні досліджень та їх узагальненні частка автора складає 80%.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи було представлено на міжнародній науково-практичній конференції “Адаптивное растениеводство: проблемы и решения” (м. Мінськ, 2004); на міжнародній науковій конференції „Використання генетичних і біотехнологічних методів у селекції і первинному насінництві с.-г. культур” (м. Умань, 2004), на Х з’їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, 2004); на IX конференції “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів” (м. Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях, методичні рекомендації і 5 тезових повідомлень.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступної частини, семи розділів, шість з яких є експериментальною частиною роботи, висновків, рекомендацій для впровадження, списку використаних 293 літературних джерел, 94 з яких іноземною мовою, і додатків. Робота викладена на 132 сторінках комп’ютерного набору, містить 22 таблиці і 23 рисунки.

Подяки. Висловлюю щиру подяку академіку УААН, д.б.н. проф. В.П. Патиці, д.с.-г.н. О.В. Шерстобоєвій, к.б.н. Білинській О.В., колективу кафедри генетики, селекції та насінництва Харківського національного аграрного університету ім. В.В. Докучаєва за допомогу у проведенні наукових досліджень за темою дисертації.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі висвітлено використання методів культури тканин в генетико-селекційній роботі з ячменем, народногосподарське значення і біологічні особливості ячменю і діазотрофних бактерій. Виявлено головні труднощі при оцінці асоціативної здатності рослин і мікроорганізмів у рослинництві та в селекції сільськогосподарських культур на підвищення біологічної азотфіксації. Приведено аналіз результатів досліджень вітчизняних і зарубіжних учених щодо екологічних, біотехнологічних і генетичних особливостей взаємодії рослин і бактерій та методів оцінки здатності до утворення рослинно-бактеріальних асоціацій.

Але аналіз літератури показав, що недостатньо висвітлена така характеристика взаємодії, як ріст і розвиток бактеріальних культур під впливом рослинних екзометаболітів. Увагу акцентують переважно на визначенні дії культуральних фільтратів мікроорганізмів на рослини і калюсні тканини. Ми поставили за мету дослідити вплив екзометаболітів калюсних культур ячменю на швидкість розмноження і біомасу азотфіксуючих бактерій і зв’язок стимуляції розвитку бактерій екзометаболітами різних сортів ячменю з азотфіксуючою активністю асоціації в польових умовах.

Матеріали й методи досліджень. В результаті попереднього скринінгу (Проскурнін М.В., Подоба Л.В., 2000) колекції 90 сортів різного еколого-географічного походження і 26 мутантних ліній ярого ячменю були відібрані сорти, контрастні за рівнем азотфіксації при інокуляції ризоентерином. Сорти вітчизняної селекції: Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Донецький 14. Сорти закордонної селекції: Lina (Швеція), Geran (Чехія), Albert (Чехія), Piramid (Франція) і мутантна лінія Еректоїд 2-21. Рослинний матеріал ячменю одержаний з кафедри генетики, селекції та насінництва Харківського національного аграрного університету ім. В.В. Докучаєва.

Культура бактерій Enterobacter aerogenes 30Ф (Берестецкий О.А., Ермолина А.В., Патыка В.Ф., 1987) одержана з лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Індукція калюсоутворення. Введення сортів ярого ячменю в культуру проводилось на поживному середовищі Мурашіге і Скуга (Murashige T., Skoog F., 1962), модифікованому для індукції калюсоутворення – MСі (табл.1) з використанням модифікованої методики (Белінська О.В., 1997). Для дев’яти сортозразків ячменю в 2002-2004рр. було висаджено 1187 незрілих зародків, які виділені з колосків 381 рослини.

Отримання калюсних ліній. В процесі субкультивування калюсних тканин (на протязі 5-7 пасажів в залежності від генотипу) на поживному середовищі MС9 (див. табл. 1) було отримано 311 клітинних ліній. Із них відібрано 49 клітинних ліній сортів Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Донецький 14, Geran, Lina і Еректоїд 2-21.

Таблиця 1

Склад поживних середовищ для культивування рослинних і бактеріальних клітин, мг/л*

Ком-по-

ненти | Хімічна формула

речовини | МСі (індукція) | МСр (пасуван-ня) | МС9 | МС9-N/2 | МС9-NH4NO3 | МС9-NN | МС9-NN+KCL

МАКРО-ЕЛЕМЕНТИ | KCl | - | - | - | - | - | - | 1392

NH4NO3 | 1650 | 1650 | 1650 | 825 | - | - | -

KNO3 | 1900 | 1900 | 1900 | 950 | 1900 | - | -

CaCl2 x 6H2O | 656 | 656 | 656 | 656 | 656 | 656 | 656

MgSO4 x 7H2O | 370 | 370 | 370 | 370 | 370 | 370 | 370

KH2PO4 | 170 | 170 | 170 | 170 | 170 | 170 | 170

МІКРО-

ЕЛЕМЕНТИ | MnSO4 x 5H2O | 241 | 241 | 241 | 241 | 241 | 241 | 241

H3BO4 | 62 | 62 | 62 | 62 | 62 | 62 | 62

ZnSO4 x 7H2O | 86 | 86 | 86 | 86 | 86 | 86 | 86

KJ | 8,4 | 8,4 | 8,4 | 8,4 | 8,4 | 8,4 | 8,4

Na2MoO4 x 2H2O | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5

CoCl2 x 6H2O | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25

CuSO4 x 5H2O | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25

FeSO4 x 7H2O | 278 | 278 | 278 | 278 | 278 | 278 | 278

Na2ЕДТА x 2H2O | 373 | 373 | 373 | 373 | 373 | 373 | 373

ВІТА-

МІНИ | Тіамін HCl | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1

Піридоксин HCl | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5

Нікотинова к-та | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5

АК | Гліцин | - | - | - | - | - | - | -

Лактальбумін | 100 | - | - | - | - | - | -

РЕГУ-ЛЯТОРИ РОСТУ | 2,4-Д | 2-12 | 1-5 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3

НОК | - | 1-2 | - | - | - | -

Кінетин | - | 0,01-0,5 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3

Сахароза | 30000 | 30000 | 30000 | 30000 | 30000 | 30000 | 30000

Агар-агар** | 7000 | 7000 | 7000 | 7000 | 7000 | 7000 | 7000

Примітка: * – склад мінеральних елементів за прописом Murashige T., Skoog F. (1962)

** – агар-агар у рідких поживних середовищах не використовувався

Отримання культури бактерій для інокуляції. Бактерії культивували 24 години на середовищі МC9-N/2 з 5 г/л сахарози на шейкері (120 об/хв) при температурі 24?С, відмивали стерильною водою і ресуспендували в об’ємі стерильної води до отримання суспензії щільністю 109 кл/мл.

Вплив азоту на розмноження бактерій. Вивчали на поживних середовищах MC9, МС9-N/2, МС9-NH4NO3, МС9-NN, МС9-NN +KCL (див. табл. 1). Контроль – середовище МС9. В результаті експериментів вибрали як оптимальне для росту бактерій середовище МС9-N/2.

Отримання рідких поживних середовищ із екзометаболітами калюсних тканин ячменю. 1г калюсної тканини культивували у склянках на поживному середовищі МС9 (див. табл. 1) на шейкері (50-60об/хв) без освітлення при 24?С. Для отримання розчину екзометаболітів культуральне середовище фільтрували через мікропористі капронові мембранні фільтри з розміром пор 0,20мкм.

Стерилізацію зернівок проводили згідно методики (Дунаева С.Е. и др., 1990) 50%-ною сірчаною кислотою (2 години), 70%-ним етиловим спиртом (2 хв.) і водним розчином (1:3) комерційного препарату “Білизна” (діюча речовина гіпохлорит натрію) – 20 хв. з триразовим відмивання у воді.

Пророщування зернівок і отримання екзометаболітів проростків проводили згідно методики (Наумов Г.Ф., Насонова Л.Ф., 1982) і рекомендацій (Козаков Є.О., 2000).

Дію екзометаболітів калюсних тканин і проростків ячменю на ріст культури бактерій E. aerogenes 30Ф визначали культивуванням бактеріальних клітин на рідких середовищах, що містили клітинні виділення. Питому швидкість росту бактеріальних культур розраховували за 10 годин культивування в інтервалі 10-20 годин після початку культивування згідно методики (Варфоломеев С.М., Гуревич К.Г., 1999). Концентрацію бактерій визначали через 48 годин культивування (в дослідженнях з екзометаболітами проростків – через 72 годин).

Концентрацію бактерій підраховували під мікроскопом у камері Горяєва за методичними вказівками Sigma (1991). Ріст бактеріальної культури було проаналізовано в 5-6 кратному повторенні на середовищах з екзометаболітами калюсних ліній семи сортів ячменю, визначення проводилось в 3-разовому повторенні для кожного сорту.

Нітрогеназну активність в кореневій зоні рослин визначали методом ацетиленредукції за R. Hardy (1968).

Математична обробка результатів. Планування експерименту і статистична обробка результатів проводилась за методикою Б.А. Доспєхова (1968) з використанням авторських програм для Microsoft Excel і Statistica 6.0.

Особливості отримання калюсних ліній ячменю. Необхідною умовою ефективного застосування тканинних культур ячменю в селекційному процесі для оцінки особливостей взаємодії рослин з бактеріями є створення технології одержання клітинних ліній ячменю в культурі in vitro. Важливе значення при отриманні калюсних ліній має стадія розвитку незрілих зародків. Незрілі зародки зі щитком повинні бути прозорими або напівпрозорими, розміром 0,8-1,1мм. Рівень частоти індукції калюсогенезу для досліджених сортів ячменю варіював від 27,1% у сорту Albert до 73,0% у сорту Одеський 100 (табл. 2).

Максимальну кількість калюсних ліній отримано для сортів Одеський 100 і Донецький 14 (див. табл. 2).

Таблиця 2

Отримання клітинних ліній різних сортів ячменю

на середовищі Мурашіге і Скуга

Ячмінь |

Висаджено незрілих зародків, од. | Кількість первинних калюсних утворень | Кількість клітинних ліній

од. | %* | од. | %*

Albert | 96 | 26 | 27,1 ± 4,53 | - | -

Piramid | 43 | 28 | 65,1 ± 7,34 | - | -

Донецький 14 | 101 | 49 | 48,5 ± 4,97 | 45 | 44,6 ± 4,89

Geran | 88 | 34 | 38,6 ± 5,19 | 25 | 28,4 ± 4,17

Lina | 115 | 38 | 33,0 ± 4,38 | 25 | 21,7 ± 3,84

Еректоїд 2-21 | 93 | 37 | 39,8 ± 5,07 | 31 | 33,3 ± 4,88

Харківський74 | 94 | 36 | 38,3 ± 5,01 | 27 | 28,7 ± 4,65

Одеський 100 | 137 | 100 | 73,0 ± 3,75 | 74 | 54,0 ± 4,21

Одеський 131 | 101 | 57 | 56,4 ± 4,93 | 27 | 26,7 ± 4,40

Примітка. Визначається як відношення кількості новоутворень до початкової кількості експлантів (при р=0,05)

При отриманні калюсних культур з метою тривалого культивування найбільші труднощі виникають у перших 3-х пасажах, коли відбуваються гормональні зміни при дедиференціації тканин і утворенні калюсів. При цьому масово спостерігаються такі явища, як проростання незрілих зародків на поживному середовищі та утворення коренів на калюсній тканині. Проростання незрілих зародків спостерігається вже на другу добу після їх посадки на поживне середовище. Процент проростання в культурі незрілих зародків ярого ячменю на 7-ий день після введення в культуру у генотипів сортів Одеський 100, Еректоїд 2-21, Geran був найнижчий – 22-25% від загальної кількості експлантів. У решти сортів цей показник був вищим і утримувався на рівні 31-43% (табл. 3).

Коренеутворення на калюсних тканинах спостерігається на перших 3-х пасажах і може бути пов’язане з дією ауксинів після культивування на середовищі для індукції калюсогенезу (Кацы Е.И., 1997). Сорти Одеський 131 і Albert мали відносно високий показник ризогенезу – 42% і 54%. Коренеутворення в культурі незрілих зародків ячменю Донецький 14 і Одеський 100 складало відповідно 2% і 4% ( див. табл. 3).

Існує негативна кореляція (r=-0,56 при р=0,05) між коренеутворенням у калюсних тканин і кількістю отриманих калюсних ліній. Високий процент коренеутворення при культивуванні калюсу свідчить про неоптимальну концентрацію ауксинів для конкретного генотипу. Поживне середовище МСі з 2мг/л 2,4-Д для індукції калюсогенезу є оптимальним при отриманні калюсних ліній сортів Донецький 14, Харківський 74, Одеський 100, Lina, Geran, мутантної лінії 2-21 і неоптимальне для сортів Одеський 131, Piramid, Albert.

Таблиця 3

Інтенсивність процесів проростання незрілих зародків (НЗ) та морфогенезу в культурі in vitro для різних сортів ярого ячменю

Ячмінь | Висаджено НЗ, од. | НЗ з пророст-ками, од. | Відсоток про-ростання НЗ, %* | Калюси з корене-утворен-ням, од. | Ризогенез в культурі НЗ, %*

Донецький 14 | 101 | 43 | 43 ± 3,9 | 2 | 2 ± 0,2

Харківський 74 | 94 | 38 | 40 ± 2,0 | 29 | 31± 2,7

Одеський 100 | 137 | 30 | 22 ± 1,5 | 5 | 4 ± 0,51

Одеський 131 | 101 | 42 | 42 ± 3,9 | 42 | 42 ± 3,9

Geran | 88 | 22 | 25 ± 2,2 | 13 | 15 ± 1,8

Lina | 115 | 36 | 31 ± 1,6 | 25 | 22 ± 1,7

Еректоїд 2-21 | 93 | 22 | 24 ± 1,8 | 19 | 20 ± 1,4

Albert | 96 | 40 | 42 ± 2,0 | 52 | 54 ± 5,1

Piramid | 43 | 17 | 40 ± 3,1 | 12 | 28 ± 1,8

Примітка. Визначається як відношення кількості новоутворень до початкової кількості експлантів (при р=0,05)

Вплив екзометаболітів калюсних ліній ячменю на ріст E. aerogenes 30Ф.

У дослідженнях впливу різних форм і концентрацій мінерального азоту в поживному середовищі Мурашіге і Скуга на ріст культури бактерій найбільш інтенсивний ріст бактеріальної культури спостерігався на середовищі без нітрату амонію (рис. 1). Встановлено, що ріст діазотрофу E. aerogenes 30Ф з питомою швидкістю росту, більшою за 0,08±0,0037 годин-1, неможливий без наявності зв’язаних форм азоту в поживному середовищі Мурашіге і Скуга.

Нами визначена інтенсивність росту бактеріальної культури з екзометаболітами ячменю Харківський 74 на середовищах МС9, МС9-N/2, МС9-NH4NO3, МС9-NN, МС9-NN+KCL. Аналіз експериментальних та літературних даних показав, що інтенсивний розвиток бактерій на середовищах МС9 і МС9-N/2 стимулюється амінокислотами, які виділяють калюсні тканини в процесі живлення амонійними сполуками. Для варіантів середовищ МС9-NN і МС9-NN+KCL слабий розвиток бактерій пояснюється відсутністю азоту. Але у випадку з середовищем МС9-NH4NO3, де присутній нітрат калію у достатньо великій кількості, факт пригнічення життєдіяльності бактерій E. aerogenes 30Ф можна пояснити лише тим, що калюсні тканини при живленні азотом у складі нітратних сполук синтезують і виділяють токсичні для бактерій речовини, які пригнічують їх розвиток на поживному середовищі МС9-NH4NO3.

Рис. 1. Інтенсивність росту бактеріальної культури на середовищах після культивування калюсу ячменю сорту Харківський 74

Для подальших досліджень необхідно було вивчити особливості метаболітичного впливу різної маси калюсних культур і тривалості культивування на азотфіксуючі бактерії E. aerogenes 30Ф. Вплив маси калюсної тканини окремих клітинних ліній ячменю Одеський 100 і тривалості культивування калюсних ліній однакової ваги визначали на поживному середовищі МС9 (табл. 4).

Аналіз даних табл. 5 показує, що із збільшенням тривалості культивування калюсних культур ячменю Одеський 100 від 3 до 20 днів зростає і швидкість росту культури азотфіксуючих бактерій E. aerogenes 30Ф на середовищі з метаболітами цих клітинних ліній. Найбільший приріст росту бактеріальних клітин під дією метаболітів калюсних ліній спостерігалася після перших 3-ох днів культивування калюсу ячменю (див. табл. 4).

Таблиця 4

Вплив екзометаболітів ячменю Одеський 100 на ріст E. aerogenes 30Ф при різній тривалості культивування клітинних ліній

Варіант | Тривалість культивування клітинних ліній, днів | Концентрація бактерій через 48 годин культивування, млн кл/мл*

Контроль МС9 | - | 22,1±3,01

t1 | 3 | 97,5±5,38

t2 | 7 | 109,1±4,92

t3 | 16 | 122,7±3,53

t4 | 20 | 127,2±7,12

Примітка. Визначено при р=0,05

Для визначення впливу метаболітів калюсних культур різної біомаси на бактеріальну культуру використали калюсні лінії ячменю Одеський 100. Результати аналізів свідчать, що із зростанням маси калюсних тканин відповідно підвищується швидкість росту бактеріальної культури E. aerogenes 30Ф під впливом екзометаболітів калюсів ячменю (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив екзометаболітів ячменю Одеський 100 на швидкість росту культури бактерій E. aerogenes 30Ф при різній масі калюсних ліній

Варіант | Маса калюсу, г | Концентрація бактерій через 48 годин культивування, млн кл/мл*

Контроль МС9 | - | 22,1±3,01

m1 | 1 | 91,1±2,57

m2 | 2 | 109,8±5,03

m3 | 3 | 126,7±4,76

m4 | 4 | 133,4±6,12

Примітка. Визначено при р=0,05

Визначали особливості росту бактеріальної культури E. аerogenes 30Ф дія клітинних екзометаболітів калюсних культур різних сортів ячменю на ріст культури бактерій E. аerogenes 30Ф (табл. 6). Оцінку інтенсивності росту бактеріальних клітин характеризували концентрацією і питомою швидкістю росту, яка визначається як відношення різниці натуральних логарифмів початкової і кінцевої кількості клітин до тривалості культивування.

Таблиця 6

Вплив екзометаболітів калюсних ліній різних сортів ячменю на швидкість росту бактеріальної культури E. aerogenes 30Ф

Варіант | Питома швидкість розмноження бактерій µ, годин-1 | Концентрація бактерій через 48 годин культивування, млн кл/мл*

Контроль МС9 | 0,159 | 22,1±3,01

Харківський 74 | 0,430 | 141,3±5,51

Еректоїд 2-21 | 0,272 | 39,0±1,62

Geran | 0,322 | 74,8±0,66

Одеський 100 | 0,355 | 97,2±2,15

Одеський 131 | 0,347 | 94,7±4,95

Lina | 0,227 | 51,1±3,2

Донецький 14 | 0,239 | 33,2±0,5

Примітка. Визначено при р=0,05

Для поживних середовищ з екзометаболітами калюсних ліній показник питомої швидкості росту культури бактеріальних клітин знаходився в межах 0,24 годин-1 для сорту Донецький 14, до 0,43 годин-1 – для сорту Харківський 74, що перевищує показники контрольного середовища МС9 відповідно у 1,5 та 2,7 рази.

Таким чином, в результаті вивчення росту бактеріальних клітин E. aerogenes 30Ф під дією метаболітів калюсу виявлено залежність стимулювання росту бактеріальної культури на поживних середовищах Мурашіге і Скуга після калюсної культури ячменю від сорту ячменю.

Визначення здатності рослин ячменю до утворення асоціацій з E. aerogenes 30Ф в польових дослідженнях. Однією з характеристик здатності рослин до утворення ефективних асоціацій з азотфіксуючими бактеріями є рівень асоціативної азотфіксації. Високим рівнем асоціативної азотфіксації в ризосфері рослин відрізняються сорти ячменю: Одеський 100, Харківський 74 і мутантна лінія Еректоїд 2-21. Сорти Geran, Albert і Одеський 131 можна віднести до сортів з середнім рівнем асоціативної здатності (табл. 7).

За здатністю до інокуляції сортів ячменю E. aerogenes 30Ф, яка входить до складу ризоентерину можна розділити на 2 групи:

1) Сорти з високою здатністю до утворення асоціацій з діазотрофами – Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Geran, Albert, Lina, Piramid.

2) Сорти з низькою здатністю до утворення асоціацій з діазотрофними бактеріями – Донецький 14 і мутантна лінія Еректоїд 2-21.

Таблиця 7

Розподіл сортів ячменю за рівнем асоціативної азотфіксації (РАА)

Сорт | РАА без оброблення біопрепаратом, мкгN2 х (рослина х година)-1* | РАА при обробці ризоентерином, мкгN2 х (рослина х година)-1* | Здатність сортів до утворення асоціацій з E. aerogenes 30Ф

Харківський 74 | 0,806±0,042 | 0,902±0,058 | висока

Одеський 100 | 0,423±0,034 | 0,647±0,032 | висока

Еректоїд 2-21 | 0,37±0,074 | 0,329±0,089 | низька

Geran | 0,168±0,027 | 0,25±0,035 | висока

Albert | 0,157±0,046 | 0,25±0,051 | висока

Одеський 131 | 0,140±0,052 | 0,237±0,046 | висока

Piramid | 0,060±0,029 | 0,094±0,031 | висока

Донецький 14 | 0,058±0,013 | 0,043±0,010 | низька

Lina | 0,054±0,021 | 0,090±0,023 | висока

Примітка. Визначено при р=0,05

Аналіз структури урожаю показав позитивний вплив обробки біопрепаратом ризоентерин на основні елементи продуктивності досліджених сортів. За таким показником, як маса зерна з рослини, найбільш чутливими до обробки ризоентерином виявилися сорти Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Albert, Lina. Меншою чутливістю відрізняються сорти ячменю Донецький 14, Geran, Piramid, мутантна лінія Еректоїд 2-21.

Вплив екзометаболітів проростків ячменю різних сортів на швидкість розмноження E. aerogenes 30Ф. Для виявлення характеру впливу проростків ячменю на розвиток діазотрофних бактерій E. aerogenes 30Ф нами проведені дослідження по співкультивуванню бактеріальної культури з ексудатами проростків ячменю. Виявлена значна залежність інтенсивності росту бактеріальної культури під дією екзометаболітів проростків від вихідного сорту ячменю (табл. 8).

Таблиця 8

Вплив екзометаболітів проростків ячменю на ріст E. aerogenes 30Ф

Варіант | Питома швидкість розмноження бактерій µ, годин-1 | Концентрація бактерій через 72 години культивування, млн кл/мл*

Харківський 74 | 0,20 | 39,2±2,12

Одеський 100 | 0,18 | 35,7±1,12

Geran | 0,17 | 33,4±1,62

Albert | 0,17 | 32,6±2,51

Еректоїд 2-21 | 0,16 | 31,1±0,66

Одеський 131 | 0,10 | 19,9±3,80

Lina | 0,10 | 20,1±4,35

Донецький 14 | 0,09 | 16,2±1,60

Примітка. Визначено при р=0,05

Таким чином, доведено стимулюючий вплив кореневих ексудатів проростків ячменю на ріст бактерій E. aerogenes 30Ф. Для різних сортів кількість бактерій, що утворилися за 72 години під дією екзометаболітів проростків ячменю, варіює в межах від 16,2 млн кл/мл для сорту Донецький 14 до 39,2 млн кл/мл для сорту Харківський 74.

Аналіз результатів досліджень. При співставленні результатів досліджень (рис. 2), проведених на різних рівнях організації клітин, тобто рослина у ґрунті (див. табл. 7) – проросток (див. табл. 8) – калюсна тканина (див. табл. 6), і з використанням різних методів вивчення рослинно-бактеріальної системи, ми можемо зробити висновок про зв’язок здатності до утворення асоціативних взаємовідношень і стимуляцією розвитку діазотрофів рослинними метаболітами. Математичний аналіз показав, що окремі значення лежать в межах 5%-ної похибки, тобто можна вважати залежність лінійною з вірогідністю до 95%.

Рис. 2. Кореляція активності азотфіксації в ризосфері рослин різних сортів ячменю, бактерізованих ризоентерином та питомою швидкістю росту E. aerogenes 30Ф на субстратах з екзометаболітами ячменю

Примітка. - рівень асоціативної азотфіксації при обробленні ризоентерином, мкгN2 х (рослина х година)-1; - питома швидкість росту E. aerogenes 30Ф під дією екзометаболітів калюсу, година-1; - питома швидкість росту E. aerogenes 30Ф під дією ексудатів проростків, година-1.

Проведений кореляційний аналіз результатів досліджень визначення рівня азотфіксації за класичними методами з результатами визначення асоціативної здатності в культурі in vitro показав, що має місце висока кореляція азотфіксуючої активності ризосфери ячменю з концентрацією діазотрофних бактерій на субстратах з екзометаболітами калюсних ліній та ексудатами проростків сортів ячменю Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Донецький 14, Geran, Lina і мутантної лінії Еректоїд 2-21. Статистична обробка отриманих даних показала, що коефіцієнт кореляції між активністю азотфіксації і концентрацією бактеріальної культури під впливом ексудатів проростків (r=0,86) вищий, ніж під впливом екзометаболітів калюсних ліній (r=0,82). Нами запропонована методика визначення стимуляції росту азотфіксуючих бактерій кореневими виділеннями ячменю шляхом визначення концентрації та питомої швидкості росту бактеріальної культури E. aerogenes 30Ф під дією ексудатів проростків ячменю.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення науково-практичного завдання, що виявляється в оцінці особливостей взаємодії мікроорганізмів і рослин, зокрема ризосферних азотфіксуючих бактерій E. aerogenes 30Ф і ячменю сортів Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Донецький 14, Albert, Geran, Piramid, Lina і мутантної лінії Еректоїд 2-21.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ДЛЯ ВПРОВАДЖЕННЯ

1)

2)

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЯ

Подоба Ю.В. Біотехнологічні аспекти оцінки асоціативних відносин бактерій Enterobacter aerogenes 30Ф з різними сортами ячменю. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20. – біотехнологія. Інститут агроекології та біотехнології УААН, Київ, 2005.

Дисертаційну роботу присвячено дослідженню проблем рослинно-бактеріальної взаємодії на прикладі 9-ти сортів ячменю і ризосферних азотфіксуючих бактерій E. aerogenes 30Ф, зокрема пошуку експериментальних шляхів оцінки ефективності функціонування асоціативних рослинно-бактеріальних систем методами біотехнології в культурі in vitro. Проведено оптимізацію умов отримання калюсних ліній в культурі незрілих зародків ярого ячменю. Встановлено високу позитивну кореляцію між азотфіксацією ризосфери рослин ярого ячменю та швидкістю розмноження діазотрофних бактерій під дією екзометаболітів калюсних ліній (r=0,82; p=0,05) ячменю. Розроблено методику визначення стимуляції росту культури азотфіксуючих бактерій ексудатами проростків ячменю.

Ключові слова: Hordeum vulgare L., калюсна культура, екзометаболіти, азот, діазотрофні мікроорганізми, Enterobacter aerogenes 30Ф, азотфіксація, ексудати.

АННОТАЦИЯ

Подоба Ю.В. Биотехнологические аспекты оценки ассоциативных отношений бактерий Enterobacter aerogenes 30Ф с разными сортами ячменя. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20. – биотехнология. Институт агроэкологии и биотехнологии УААН, Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена исследованию проблем растительно-бактериального взаимодействия на примере 9-ти сортов ярового ячменя и ризосферных азотфиксирующих бактерий E. aerogenes 30Ф, в частности поиску экспериментальных методов оценки эффективности функционирования растительно-бактериальных систем методами биотехнологии в культуре in vitro. Оптимизированы условия получения каллусных линий в культуре незрелых зародышей ярового ячменя на модифицированной питательной среде Мурашиге и Скуга. Для повышения эффективности получения неморфогенного каллуса необходимо уменьшить концентрацию ауксина 2,4-Д для индукции каллусогенеза до 2 мг/л, а в следующих пассажах повышать концентрацию до 3 мг/л.

Изучено влияние некоторых минеральных компонентов питательной среды Мурашиге и Скуга, концентраций и форм минерального азота на рост каллусных линий ячменя и бактериальной культуры диазотрофа E. aerogenes 30Ф. Показано, что азот