МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

РУСАНОВА СВІТЛАНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 542.91:547.89:547.587.51:547.415.3

СИНТЕЗ ТА ВИВЧЕННЯ ШЛЯХІВ ПЕРЕТВОРЕННЯ

2-ІМІНОКУМАРИН-3-КАРБОКСАМІДІВ З МЕТОЮ

ПОШУКУ НОВИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ

РЕЧОВИН

15.00.02 - фармацевтична хімія і фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі органічної хімії

Національного фармацевтичного університету

Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

КОВАЛЕНКО Сергій Миколайович

Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри управління якістю

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

БОЛОТОВ Валерій Васильович

Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри аналітичної хімії

доктор фармацевтичних наук, професор

ДЕМЧЕНКО Анатолій Михайлович

Чернігівський педагогічний університет,

професор кафедри хімії

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться “25” лютого 2005 року о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “24” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

професор МАЛОШТАН Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. 2-Імінокумарини (2Н-хромен-2-іміни, 2Н-[1]-бензопіран-2-іміни, 2_кумариніміни) є топологічними та ізо--електронними аналогами ві-до-мо-го і важливого в практичному відношенні класу гетероциклічних сполук – кумаринів (2Н-[1]-бензопіран-2-онів). Серед похідних кумарину знайдено сполуки різноманіт-ної фармакологічної дії, деякі з них мають застосування у сучасній медичній прак-тиці. Крім того, сполуки цього класу широко використовуються як люмінесцент-ні барвники для штучних волокон, флуоресцентні рН-індикатори, оптичні відбілюва-чі, біологічні маркери, ак-тивні середовища для лазерів та колектори сонячної енер-гії. На відміну від кумаринів, їх 2-іміноаналоги досить довго залишались поза увагою дослідників, і тільки останнім часом на них звернули увагу, як на сполуки з широ-кими синтетичними та біологічними можливостями.

В цьому відношенні вельми актуальними є дослідження хімічної поведінки 2_імінокумарин-3-карбоксамідів у реакціях з нуклеофільними та електрофільними ре-агентами, розробка методів синтезу комбінаторних бібліотек зазначеного класу спо-лук, здійснення оцінки їх біологічного потенціалу та проведення фармакологічно-го скринінгу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію ви-ко--нано згідно плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного уніве-рситету з проблеми МОЗ України “ Хімічний синтез та аналіз нових фармакологіч-но активних речовин, встановлення зв’язку “структура – дія”, створення нових лікарських препаратів” (номер державної реєстрації 0198 U 007011).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення взаємодії 2_імі-но-ку-ма-рин-3-карбоксамідів з N-нуклеофільними реагентами та дослідження реакції ацилювання 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів, доведення хімічної будови синтезова-них сполук; проектування та синтез комбінаторних бібліотек на основі 2_імі-но-ку-ма-рин-3-карбоксамідів та 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів; проведення ком-п’ю-терного прогнозування фармакологічної активності зазначеного класу спо-лук та здійснення біологічного скринінгу на протизапальну, гепатотропну, протипухлин-ну, анальгетичну та протиалергічну активності з метою від-бо-ру найбільш перспективної речовини для подальшого вивчення.

Для досягнення зазначеної мети було поставлено ряд задач:

1. здійснити синтез систематичного ряду 2-імінокумарин-3-карбоксамідів;

2. вивчити взаємодію 2-імінокумарин-3-карбоксамідів з арил- та бензиламінами, з амінами Гевальда, з арилгідразинами та гідроксиламіном;

3. дослідити рециклізаційні перетворення 2-імінокумарин-3-карбоксамідів під дією 2-амінобензофенонів та здійснити синтез 3_арилхіназолін-2_іл)-ку-ма-ри-нів;

4. дослідити взаємодію 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів з оцтовим ан-гід--ридом;

5. провести проектування та здійснити синтез комбінаторної бібліотеки 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів та N3-ацетил-2-(N-арил)імі-но-ку-ма-рин-3-карбоксамідів;

6. за допомогою інструментальних методів (ІЧ-, УФ/Вид-, ПМР-спектроскопії, хромато-мас-спектрометрії, рентгеноструктурного аналізу) довести хімічну будову синтезованих сполук;

7. здійснити комп’ютерне прогнозування фармакологічної дії синтезованих сполук за допомогою програмного пакету PASS;

8. провести фармакологічні дослідження одержаних сполук та QSAR-аналіз результатів скринінгу, визначити перспективну сполуку для подальшого дослідження.

Об’єкт дослідження – синтетичні похідні 2-імінокумарин-3_карбоксамідів.

Предмет досліджень – методи синтезу, фізико-хімічні властивості, реакційна здатність 2-імінокумарин-3-карбоксамідів та продуктів їх перетворень; метод комбіна-торного синтезу 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів та N3-ацетил-2N_арил)-імінокумарин-3-карбоксамідів; прогнозування біологічної дії; біологічна активність синтезованих сполук.

Методи досліджень – синтез N-заміщених 2-імінокумарин-3_карбоксамідів, аци--льні похідні 2-імінокумарин-3_карбоксамідів; синтез 3-(4-арилхіназолін-2_іл)-ку-ма--ринів; синтез комбінаторних бібліотек 2-(N_арил)імінокумарин-3_карбоксамідів та N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів; аналіз хімічної будови одержаних речовин за допомогою фізико-хімічних методів дослідження: УФ/Вид-, ІЧ-спек-т-рофотометрії, спектроскопії ПМР, хромато-мас-спектрометрії, рент-ге-но-с-т-рук-тур-но-го аналізу та ВЕРХ; віртуальний скри-ні-нг досліджуваного класу сполук з використанням комп’ютерної програми PASS; тестування біологічної активності синтезованих сполук за стандартними методиками та проведення QSAR-аналізу даних фар-ма--ко-ло-гічного скринінгу.

Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено нові властивості та по-гли-блено відомості про реакційну здатність 2-імінокумарин-3-карбоксамідів, що сут-тєво збагачує уявлення про хімічну поведінку даного класу сполук. Встановлено, що 2_імінокумарин-3-карбоксаміди взаємодіють не тільки з арил- та бензиламінами, а й з амінами Гевальда, гідроксиламіном та арилгідразинами, утворючи продукти за-мі-щення по іміногрупі. Доведено, що реакція 2-імінокумарин-3-карбоксамідів з 2_амі-нобензофенонами перебігає за рециклізаційним механізмом, а продукти реакції є новими гетероциклічними ансамблями циклів і мають будову 3-(4-арил-хі-на-зо-лін-2_іл)кумаринів.

Вперше одержано N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксаміди аци-лю-ван----ням 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів оцтовим ангідридом. На прикладі N3-аце-тил-2-[N_(2-фторфеніл)]імінокумарин-3-карбоксаміду вивчено структуру про---ду-ктів зазначеної реакції методом рентгеноструктурного аналізу.

В результаті проведених досліджень синтезовано 431 спо-луку, що не описана в літературі, а їх будову підтверджено даними елементного аналізу, УФ/Вид-, ІЧ_, ПМР-спек-тро-с-копії, рентгеноструктурного аналізу та хромато-мас-спек-т-ро-ме-т-рії.

За допомогою комп’ютерних програм ChemoSoft, PASS і QSAR-аналізу проведе-но віртуальний скринінг комбінаторних бі-бліотек 2N_арил)імінокумарин-3-кар-бок-самідів і N3-ацетил-2-(N-арил)-іміно-ку-ма-рин-3-карбоксамідів та встановлено деякі закономірності зв’язку “будова – біологічна дія” для систематичних рядів дослід-жу-ваних сполук, що дозволило спланувати та провести біологічний скринінг.

Вперше одержано дані про гостру токсичність, гепатотропну, протипухлинну, ан--тиексудативну, анальгетичну та протиалергічну активності синтезованих сполук.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено та удосконалено си-нтетичні методи одержання 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів, 3-(4-арил-хі-на-золін-2_іл)кумаринів, N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбокс-амідів, що доз-во-ляє суттєво розширити можливості цілеспрямованого пошуку БАР серед зазначе-них класів сполук.

Здійснено проектування комбінаторних бібліотек 2N_арил)імінокумарин-3-ка-р---бо-к-самідів і N3-ацетил-2-(N-арил)-іміно-ку-ма-рин-3-карбоксамідів та методом пара-лельного рідиннофазного синтезу одержано 252 та 136 сполук, відпо--відно.

За результатами фармакологічного скринінгу синтезованих сполук знайдено най-більш перспек-тивну біологічно активну речовину – 2_амі-но-кар-бо-ніл-фе-ніл)-імі-но-5,6_бе-н--зо--ку-ма-рин__ка-р-бок-са-мід та для неї розроблено АНД.

Результати, що отримано при виконанні дисертаційної роботи, впроваджено до нав-ча-льного процесу хіміко-біологічного факультету Чернігівського педагогічного уні-верситету імені Т.Г.Шевченка і кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків ІПКСФ Національного фармацевтичного університету, а також – до наукових досліджень відділу гетероциклічних сполук ІСМА НТК “Інститут монокристалів” НАН України.

Особистий внесок здобувача. В наукових працях, опублікованих із співавторами Чернихом В.П., Коваленком С.М., Журавель І.О., Баумером В.М., Яковлєвою Л.В., Шаповал О.М., Івановим В.В., Карасьовим О.О., Ситніком К.М., Порохняком А.О., Нікітченком В.М., Михайловим В.С. особисто автором виконані:

– аналіз літературних джерел з синтезу та біологічної дії похідних 2_імі-но-ку-ма-ри-нів;

– планування синтетичної частини роботи;

– розробка методик синтезу та одержання похідних 2-імінокумарин-3-кар-бо-к-са-мі-дів, N-заміщених 2-імінокумарин-3-карбоксамідів, 3_арилхіназолін-2-іл)-ку-маринів та N3_ацетіл-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів;

– синтез комбінаторних бібліотек 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів та N3-аце-тил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів;

– обробка, інтерпретація результатів синтетичних, фізико-хімічних, біологічних до-сліджень та комп’ютерних розрахунків; систематизація, аналіз даних і офор--млення результатів.

Апробація результатів дисертації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено на українській конференції “Хімія азотвмісних гетероциклів” (Харків, 1997); на V Національному з’їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (Харків, 1999); на конференції молодих вчених Харківського державного медичного уні-верситету “Медицина третього тисячоліття” (Харків, 2001); на XIX Українській конференції з органічної хімії (Львів, 2001); на всеукраїнській науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002); на всеукраїнській науково-практичній конференції “Сучасні технології органічного синтезу та медичної хімії” (Харків, 2003); на міжнародній конференції “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки та освіти” (Запоріжжя, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 статей у фахових виданнях та 7 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, чотирьох розділів, висновків, списку літературних джерел та додатків. Загальний об’єм дисертації складає 157 сторінок. Робота ілюстрована 14 схемами, 25 рисунками і 52 таблицями. Перелік використаних літературних джерел містить 229 найменування.

Перший розділ містить огляд літературних джерел щодо синтезу та біологічної ак-тивності 2-імінокумаринів та продуктів їх перетворень. Другий розділ присвячено ви-вченню взаємодії 2-імінокумарин-3-карбоксамідів з N-нуклеофільними та електро-фільними реагентами. В третьому розділі описується проектування та синтез комбі-наторних бібліотек 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів та N3-ацетил-2-(N-арил)-імінокумарин-3-карбокс-амідів. Комп’ютерне прогнозування та вивчення бі-о-ло-гі-ч-ної активності синтезованих сполук наведено у розділі 4.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Синтез та реакційна здатність 2-імінокумарин-3-карбоксамідів

Як вихідні сполуки для здійснення хімічних перетворень обрано 2-імі-но-ку-марин-3-карбоксаміди (1), що одержували взаємодією саліцилових альдегідів з амідом ціанооцтової кислоти за Кньовенагелем.

Наявність у структурі 2-імінокумарин-3-карбоксамідів (1) імінолактонного цик-лу, котрий можна розглядати як циклічний іміноефір, надає цим сполукам високої реакційної здатності в реакціях з ну-к-ле-о-фі--льними реагентами різної електронної природи. Крім того, наявність у положенні 3 сполук (1) карбоксамідної групи створює сприятливі можливості для перебігу рециклізаційних перетво-рень, що суттєво збагачує їх хімічний потенціал і в синтетичному відношенні ви-гідно відрізняє від кумаринів.

1.1. Реакції 2-імінокумарин-3-карбоксамідів з N-нуклеофільними

реагентами

В реакціях 2-імінокумаринів з N-нуклеофільними реагентами, в залежності від умов проведення реакції, природи нуклеофільного реагенту та характеру замісника в положенні 3, можуть утворюватись різні кінцеві продукти.

При взаємодії 2-імінокумарин-3-карбоксамідів (1) з арил- та бензиламінами, амі--нами Гевальда, гідроксиламіном, арилгідразинами при нагріванні в льодяній оцто--вій кислоті утворюються відповідні 2-N-заміщені 2-імінокумарин-3-карбоксаміди (2):

Особливої уваги заслуговує реакція 2-імінокумарин-3_карбоксамідів (1) з амі-на-ми Гевальда. Незважаючи на низьку нуклеофільність аміногрупи в молекулі 2_амі-но-тіофенів, при проведенні реакції в присутності каталітичної кількості сульфатної кислоти були одержані кінцеві продукти (2) з високими виходами.

Синтез диядерних гетероциклічних структур, що містять 2-імінокумариновий та тетрагідробензо[b]тіофеновий фрагменти на сьогодні – один із напрямків пошуку по-тенційних інгібіторів тирозинової кінази.

При проведенні реакції 2-імінокумарин-3_карбоксамідів (1) з заміщеними 2_амі-но-бензофенонами (3) передбачалося, що взаємодія відбуватиметься за ста-н-дартною схе-мою з отриманням відповідних 2-N-заміщених 2-імі-но-ку-ма-рин-3-кар-бо-к-са-мі-дів (2). Однак, аналіз спектрів 1Н ЯМР зразків продуктів реа-к--ції показав, що в ході взає-мо-дії зникають сигнали протонів іміногрупи (12 – 13 м.д.) і протонів амідної гру-пи (9.0 – 9.2, 7.7 – 7.9 м.д.), які є характерними для 2N_арил)-імі-но-ку-ма-рин-3-кар-бо-к-са-мі-дів (2).

Ймовірно, зазначена реакція відбувається за рециклізаційним механізмом, що вклю-чає стадію утворення проміжних 2-(N-2-бензоїларил)імінокумарин-3_кар-бо-к-са-мі-дів (A), виділити котрі за даних умов не вдалося. Нестабільність цих структур, на наш погляд, пов’язана з активізацією карбонільної групи бензофенонового фрагмента під дією іону амонію, що елімінується на першій стадії, і утворенням нових інтер-ме-діатів – аміноспиртів (B). Далі внаслідок атаки аміногрупи на атом Карбону зв’я-з-ку С=N імінокумарину 2-імінолактоний цикл розмикається, відбувається цис-транс-ізомерізація інтермедіата (C) на (D) та його циклізація з утворенням R1-3-[6-R2-4-(R3-феніл)хіназолін-2-іл)кумаринів (4).

В спектрах 1Н ЯМР сполук (4) спостерігаються сигнали ароматичних протонів в регіоні 6.54 – 8.70 м.д. та синглетний сигнал протону Н-4 кумаринового циклу (8.65 – 9.49 м.д.).

В ІЧ-спектрах одержаних речовин (4) відсутні смуги валентних коливань ?N–H іміду та N–H амідного фрагмента (3400 – 3300 см-1), що є характерними для вихідних 2-іміно-R1-кумарин-3-карбоксамідів (1), відсутня смуга коливань ?С=О кетону (1670 – 1690 см-1) та з’являється сильна смуга валентних коливань ?С=О лактону (1713 – 1763 см-1) і слабка смуга коливань зв’язку ?С=N (1632 – 1694 см-1).

Наявність інтенсивного піка молеклярного іона (m/z: 414, 100%) і характер-них для кумаринових систем осколочних іонів (m/z: 415 [M]+, 379 [M-Cl]+, 190, 177 [M-C14H8ClN2]+, 127) на прикладі молекули 3-(4-феніл-6_хло-р-хі-на-зо-лін-2-іл)-8-ме-то-к-си-ку-марину (4; R1=8-ОСН3, R2=Cl, R3=H) також підтверджують достовірність запропо-но-ваної структури.

При проведенні даної реакції в льодяній оцтовій кислоті кінцеві продукти зазначених процесів рециклізації та гетероциклізації (A?B?C?D) – R1-3-[6-R2-4-(R3-фенілхиназолін-2_іл)]кумарини (4) утворюються вже на холоду:

Факт перебігу даної реакції за рециклізаційним механізмом остаточно доведено рентгеноструктурним аналізом. Рентгеноструктурні дослідження на прикладі 3_фе-ніл-6-хлорхіназолін-2-іл)-7_гідроксикумарину (4; R1 = 7_ОН, R2 = Cl, R3 = H) підтвердили, що кінцеві продукти мають запропоновану структуру 3_арилхиназолін-2_іл)кумаринів (4). Виявлено, що структура цієї сполуки по-бу-до-ва-на з триад молекул, які утворюються за рахунок вод-не-вих зв’язків О–Н…О. Уточнення струк-тури проведено повноматричним МНК з ви-ко-ристанням комплексу програм SHELX-97.

1.2. Реакції ацілювання 2N-арил)імінокумарин-3_карбоксамідів

При вивченні реакційної здатності 2-N-R-заміщених 2-імі-но-ку-марин-3_кар--бо-ксамідів (2) було встановлено, що ацилювання карбамідної групи проходить при кип’ятінні в оцтовому ангідриді за 20 – 80 хв., що значно швидше у порівнянні з кумарин-3-карбоксамідами (10 – 12 год.).

Підвищена нуклеофільність амідної групи, що полегшує перебіг цієї реакції, мо-жно пояснити впливом внутрішньомолекулярного водневого зв’язку в вихідних 2N-арил)імінокумарин-3_карбоксамі-дах (2). При переході до сполук з більш електро-нодонорними замісниками R2 міцність водневого зв’язку зростає, підвищується еле--к-тронна густина на атомі Нітрогену аміногрупи і зростає швидкість реакції аци-лю--вання.

При проведенні реакції 2-N-(2-фторфеніл)імінокумарин-3-карбоксаміду (2; R1=Н, R2=2-F) з оцтовим ангідридом на стадії очищення кінцевого продукту перекристалізацією із ДМФА було виділено два типи кристалів: тонкі пластинчасті голки (І) та приблизно ізомерні призми (ІІ). Рентгеноструктурним аналізом цих речовин доведено, що вони утворені молекулами однакового складу, що мають різну просторову будову і тип упакування в кристалах.

2. Проектування та синтез комбінаторних бібліотек

2.1. Побудова віртуальних бібліотек та аналіз характеристик сполук

Для проведення коректного біологічного тестування синтетичних сполук з метою пошуку речовини, перспективної для подальшої розробки в якості можливої лікарської субстанції, необхідно мати достатній набір сполук схожої структури, що різняться природою та положенням замісників, так звану комбінаторну бібліотеку сполук. Першим етапом проектування таких бібліотек є побудова віртуальної бібліотеки та віртуальний аналіз характеристик структур.

Для побудови віртуальних бібліотек 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів і N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів використовували віртуальний ма-сив із 56 саліцилових альдегідів та 210 ароматичних амінів, які є комерційно доступними. За допомогою комп’ютерної програми Project Library було згенеровано віртуальну бібліотеку 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів (11760 речовин) та бібліотеку їх ацильних похідних (11760 речовин).

Далі для кожної сполуки одержаних бібліотек з використанням комп’ютерної програми ChemoSoft (Chemical Divesity Labs, Inc., США) було розраховано ряд дескрипторів: молекулярна маса (MW); коефіцієнт розподілу у системі 1-октанол/вода (logP); логарифм розчинності у воді (г/мл) при рН=7,4 (logSw); кількість нетермінальних зв'язків (RotB), що обертаються; кількість донорів водневого зв'язку (Hd); кількість акцепторів водневого зв'язку (Ha); частка речовини, що проникає з шлунково-кишкового тракту в кровотік за допомогою пасивної дифузії і без урахування метаболитической деградації (FA). Відповідність сполуки – потенційного лікарського засобу цим дескрипторам свідчить про можливість сполуки проникати до клітини та взаємодіяти з ферментами і іншими біологічними об’єктами.

З метою виключення небажаних структур була проведена процедура ADMET –фільтрування (ADMET – absorption, distribution, metabolism, exretion, toxicity), внаслідок чого було сформовано віртуальну бібліотеку 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів (2705 структур), та віртуальну бібліотеку N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів (764 структур). Ці бібліотеки далі при дослідженні біологічної дії можуть бути використані для проектування мішень-спе-ци-фіч-них фокусованих бібліотек, для проведення QSAR (КССС) – моделювання, для оцінки “drug - likeness” – подібності до лікарської речовини, для проведення молекуляр-но-го докінгу тощо.

Порівняння розрахованих величин з необхідними значеннями дескрипторів, свід--чить про те, що більшість сполук, досліджених у даній роботі, за су-купністю сво--їх фізико-хімічних властивостей відповідає сучасним вимогам до хімічних сполук, придатних для первинного тестування біологічної активності. Вони можуть бу-ти рекомендовані для випробувань на біологічну активність, як речовини, що мають сприятливі фармакокінетичні характеристики.

При плануванні синтезу зазначених комбінаторних бібліотек всі сполуки, що пройшли первинний відбір, були відсортовані за принципом репрезентативності структурного різноманіття та виходячи з вимог до технологічності процесу. Таким чином, було сплановано комбінаторну бібліотеку з 300 2N_арил)-імі-но-ку-марин-3-карбоксамідів (3) та 144 N3-ацетил-2-(N_арил)імінокумарин-3-кар-бо-к-са-мі-дів.

2.2. Синтез комбінаторних бібліотек

Відповідно до проекту було проведено синтетичні роботи методом рідиннофазного паралельного синтезу з використанням лабораторного синтезатора CombiSyn-012-3000 та одержано бібліотеки, які містять 252 2N_арил)-імі-но-ку-ма-рин-3-кар-бок-са-мідів (3) (ефективність методики скла-дає 84%) та 136 N3-ацетил-(N-арил)-імі-но-ку-ма-рин-3-карбоксамідів (5) (ефективність методики складає 94%), що ціл-ком задовільно для методик комбінаторного синтезу. Структуру та чистоту всіх син-тезованих сполук контролювали за допомогою ПМР-спектроскопії.

3. Комп’ютерне прогнозування та дослідження біологічної дії синтезованих сполук

Для прогнозу спектру біологічної активності по структурній формулі хімічної сполуки була використана комп’ютерна програму PASS (Prediction of Activity Specfor Substances), яка дає можливість оцінювати фармакологічні ефекти, механізми дії та специфічну токсичність сполуки та забезпечує прогнозування всього спектру ак-тивності сполуки, включаючи як основну дію, так і можливі побічні ефекти.

Для проведення PASS-прогнозу нами обрано 2-(N-арил)імінокумарин-3_кар-бо-к-са-міди та N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксаміди. Віртуальні бібліотеки з 11760 сполук, відповідно, були обчислені за допомогою програми PASS для визначення напрямку подальших біологічних досліджень. Аналіз отриманого PASS-па--кету ймовірної біологічної дії 2N_арил)імінокумарин-3_карбоксамідів та N3-аце-тил-2-(N-арил)імінокумарин-3_кар-боксамідів дозволив спланувати цілеспрямова-ний по-шук серед синтезованих сполук речовин з антиалегічною, протипухлинною, ге-па-то-тропною, протизапальною та анальгетичною дією.

Протиракову дію 82 синтезованих 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів ви-в--чали в Національному інституті раку США (NCI) на клітинних культурах лю-д-сь-ких пух-лин: лейкeмії (6 різновидів), раку легень (9), товстої кишки (7), нирок (8), яєч-ни-ків (6), простати (2), молочної залози (8), пухлин ЦНС (5), меланоми (8). Згідно з ме-то-дикою NCI протираковий ефект оцінювали за цитопатичним впливом тестованої ре-човини на клітинні культури пухлин. За результатами тестів на клітинних культурах злоякісних пухлин людини виявлено, що 6,8-дихлор-24_фтор-фе-ніл)-імі-но-ку-ма-рин-3_кар-боксамід (3; R1=Н, R2=4-F) значною мірою пригнічує розвиток більшості клітинних культур (особливо меланоми та пухлин нирок).

Тестування гепатотропної, анальгетичної, антиексудативної, антигістамінної, протиалергічної активності синтезованих сполук було проведено на базі Центральної науково-дослідної лабораторії НФаУ під керівництвом проф. Л.В.Яковлєвої.

Вивчення гепатотропної дії 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів проводили на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту у мишей. З групи 2-(N-арил)-імі-но-ку-марин-3-карбоксамідів детоксикуючі та гепатопротекторні властивості виявляють ре-човини 2амінокарбоніл)феніл]іміно-5,6-бензокумарин-3-карбоксамід (3; R1 = 5,6-бензо, R2 = 4-СОNH2) та 2амінокарбоніл)феніл]іміно-7-диетиламіно-ку-мА-рин--карбоксамід (3; R1 = 7-N(C2H5)2, R2 = 4-СОNH2). Під впливом сполуки (3; R15,6-бензо, R2 = 4-СОNH2) 100% тварин у групі вижили, знизився показник ВКП, та відновилися до рівня інтактного контролю показники відновленого глютаті-о-ну та малонового діальдегіду у гомогенаті печінки. Речовина (3; R1 = 7-N(C2H5)2, R2 = 4-СОNH2) сприяла підвищенню до 80% рівня тварин, які вижили, зниженню вмі-сту МДА та підвищення вмісту G-SH до рівня таких показників у групі інтактного контролю.

Вивчення анальгетичної активності 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів вив-чали на моделі оцтово-кислих корчів у щурів. Вплив сполук на розвиток ноцицеп-тивної реакції оцінювали за їх здатністю зменшувати кількість корчів у дослідній групі щурів у порівнянні з контрольною. Найбільшу ефективність виявила речовина 2амінокарбоніл)феніл]іміно-5,6_бензокумарин-3-карбоксамід (3; R1 = 5,6-бензо, R2 = 4-СОNH2), її ЕД50 дорівнює 0,58 мг/кг та переважає ЕД50 інших сполук у 1,2 – 4,4 рази, препарат порівняння вольтарен (5 мг/кг) – у 8,6 рази.

Нами проведено QSAR-аналіз результатів тестування на анальгетичну дію. Згідно методології QSAR-аналізу, яка орієнтована на знаходження мінімального набору молекулярно-структурних параметрів (дескрипторів), необхідних для опису заданого виду активності, була проведена подальша статистична обробка дескрипторного набору, сумісно з експериментальними даними про біологічну активність. Це доз-во-лило сформувати необхідну прогностичну функцію:

2 = 0.017, q2 = 0.63,

яка пов'язує з топологічним параметром IC1 та енергією верхньої зайнятий МО, розрахованою у рамках напівемпіричного методу АМ1. Це рівняння може бути ви--користано в цілях попереднього прогнозу анальгетичної активності похідних 2_імі--нокумарин-3_карбоксаміду.

У деяких похідних 2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів також встановлено рі-зна за ступенем вираженості антиексудативна активність. Виражену антиексудати-в-ну дію (на моделі карагенінового набряку стопи у білих щурів) виявила сполука 2(амінокарбоніл)феніл]іміно-5,6-бензокумарин-3_карбоксамід (3; R1=5,6-бензо, R2=4-СОNH2) у дозі 0,58 мг/кг (ЕД50 за анальгетичною активністю) – 45,35%.

З метою скринінгового вивчення антигістамінної дії 2амі-но-кар-бо-ніл)-фе-ніл]-іміно-5,6-бензокумарин-3-карбоксаміду (3; R1 = 5,6-бензо, R2 = 4-СОNH2), було про--ведено тест “офтальмореакція на введення гістаміну”, що дозволило визначити оп--тимальну дозу і обумовило подальше вивчення субстанції в цій дозі.

При експериментальному вивченні протиалергічної активності ступінь тяжкості ана-філактичного шоку у мурчаків визначали за методом Ф.Ф.Лукманова. В результа--ті встановлено, що речовина 2амінокар-боніл)феніл]іміно-5,6-бензокумарин-3-кар--боксамід (3; R1 = 5,6-бензо, R2 = 4-СОNH2) в дозі 1 мг/кг виявляє тенденцію до зни--ження алергічної реакції.

Вивчення гострої токсичності найбільш активних похідних 2N_арил)-імі-но-ку-ма-рин-3_карбоксамідів з використанням двох методів за Т.В.Пастушенко та за В.Б.Прозоровським при одноразовому пероральному введенні мишам дозволило вста-новити, що всі речовини відносяться до групи відносно нешкідливих за класифі-ка-цією К.К.Сидорова (їх ЛД50 складає більше за 15000 мг/кг).

За результатами досліджень найбільш перспективну субстанцію – 2амі-но-кар--боніл)феніл]іміно-5,6-бен-зо-ку-марин-3-кар-боксамід (3; R1 = 5,6-бензо, R2 = 4_СОNH2) запропоновано для поглибленого фармакологічного вивчення. На зазначену субстанцію розроблено проект АНД.

В И С Н О В К И

1. Показано, що 2_імінокумарин-3-карбоксаміди взаємодіють не тільки з арил- та бензиламінами, а й з амінами Гевальда, гідроксиламіном та арилгідразинами з утворенням продуктів заміщення по іміногрупі в положенні 2 кумарину.

2. Вперше встановлено, що реакція 2_імінокумарин-3-карбоксамідів з 2_амі-но-бен-зо-фе-но-нами перебігає за реціклізаційним механізмом. Продуктами реакції є нові 3-(4-феніл-хіназолін-2-іл)кумарини.

3. Показано, що 2_імінокумарин-3-карбоксаміди легко ацілюються оцтовим ангід-ридом з утворенням N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів, та зроб-лено припущення про суттєвий вплив на проходження реакції внутрішньо-молекулярного водневого зв’язку.

4. За даними рентгеноструктурного дослідження N3-ацетил-2-[Nфтор-фе-ніл)]-імінокумарин-3-карбоксаміду встановлено, що для цієї сполуки є характер-ним поліморфизм.

5. Проведено проектування комбінаторних бібліотек 2N_арил)імінокумарин-3_карбокс-амі-дів та N3-ацетил-2-[Nфторфеніл)]імінокумарин-3-кар-бо-к-са-мі-дів та проведено синтез цієї бібліотеки методом рідиннофазного паралельного син-тезу з високою ефективністю.

6. З використанням програми PASS було спрогнозовано вірогідна біологічна дія 2N_арил)імінокумарин-3-карбоксамідів та N3_аце-тил-2-(N-арил)-імі-но-ку-ма-рин-3-карбоксамідів, та виявлено, що для них можлива антиалергенна, про-ти-ві-русна, імуностимулююча, протипухлинна та анальгетична активність.

7. За результатами проведеного фармакологічного скринінгу виявлено, що 2амінокарбоніл)феніл]іміно-5,6-бензокумарин-3-карбоксамід є нетоксичним (“відносно нешкідливим” за класифікацією К.К.Сидорова), та проявляє до-сить високий рівень гепатопротекторної, анальгетичної та антиексудативної дії. Також вказана речовина виявляє тенденцію до зниження алергічної реакції на моделі анафілактичного шоку.

8. 2-[4-(Амінокарбоніл)феніл]іміно-5,6-бензокумарин-3-карбоксамід запропоновано для поглибленого фармакологічного дослідження. На зазначену субстанцію розроблено проект АНД.

Список опублікованих праць за темою дисертації:

1. Рециклизация 2-иминокумаринов под действием нуклеофильных реагентов. 4. Взаимодействие 2-иминокумарин-3-карбоксамидов с 2_амино-бен-зо-фе-но-нами / С.В.Русанова, И.А.Журавель, С.Н.Коваленко, В.П.Черных, В.Н.Бау-мер. // Химия гетероцикл. соед. – 2004. - №10. – С. 1533-1542. (Особистий вне-сок – виконання експерименту, обробка та аналіз експерементальних даних)

2. Вивчення бі-ологічної активності похідних 2-(4-карбомоіл-феніліміно)-2Н-хромен-3-кар-бок-са-мі-дів / С.В. Русанова, Л.В. Яковлєва, О.М. Шаповал, С.М. Коваленко. // Мед. хімія. – 2004. - №1(6). – С. 36-40. (Особистий внесок – планування та здійснення експерименту, аналіз та оформлення результатів синтетичних фізико-хімічних та біологічних досліджень)

3. Русанова С.В., Иванов В.В., Коваленко С.Н. QSAR анализ био-ло-ги-чес-кой активности производных 2-(4'_карбомоил-фенилимино)кумарин-3-кар-бок-са-ми-дов // Запорожский медицинский журнал. – 2004. - № 1(2). - С. 19-22. (Особистий внесок – виконання експерименту, обробка та аналіз даних біологічних доліджень)

4. Використан-ня рециклізаційних перетворень у синтезі 2Н-хромен-2-імінів / І.О. Журавель, С.М. Коваленко, В.П. Черних, С.В Русанова.// Журнал органічної та фармацевтичної хімії. – 2003. - № 1(3-4). - С. 21-25. (Особистий внесок –обробка та аналіз результатів літературного пошуку, експерементальних даних)

5. Взаємодія 2-імінокумаринів з N-нуклеофільними реагентами / С.М. Коваленко, В.П. Черних, О.О. Карасьов, І.О. Журавель, С.В. Русанова // Фізіологічно актив-ні речовини. – 2002. - №1(33). – С. 14-25. (Особистий внесок – аналіз огляда літературних джерел, обробка та аналіз експерементальних даних)

6. Two crystal mofor the product of the acetylation of 2-N-(2-fluorophenyl) iminocoumarin-3-carboxamide / S.N. Kovalenko, V.N. Baumer, S.V. Rusanova, V.P. Chernykh // Zeitschrift fur Kristallographie. – 1999. – Vol. 214. – P. 580-583. (Особистий внесок – здійснення експерименту, обробка та аналіз експериментальних даних)

7. Рециклизация 2-имино-2Н-1-бензопиранов под действием нуклеофильных реагентов. 4. Использование 2-(N_ароилгидразоно)кумарин-3-карбоксамидов для синтеза 3-(1,3,4-оксадиазолил-2)кумаринов / С.Н.Коваленко, К.М.Сытник, В.М.Никитченко, С.В.Русанова, В.П.Черных, А.О.Порохняк // Химия гетероцикл. соед. – 1999. - №2. – С. 190-193. (Особистий внесок – вико-нання експерименту, участь при обробці та аналізі експериментальних даних)

8. Синтез и строение 3-(2,4-дихлорфенил)-6-фторхиназолин-2,4Н, 3Н)-диона / С.В. Русанова, В.С. Михайлов, С.Н. Коваленко, В.П. Черных, В.Н. Баумер // Вісник фармації. – 1999. - №2(20). – С. 14-19. (Особистий внесок – здійснення синтезу об’ектів дослідження, обговорення результатів)

9. Рециклизація 2-(N-ароїлгідразоно)кумарин-3-карбоксамидів у 3-(1,3,4-оксадіазоліл-2)кумарини / С.М. Коваленко, В.М. Нікітченко, К.М. Ситник, С.В. Русанова, О.В. Сілін, В.В. Маслов // Укр. конф. “Хімія азотвмісних гетероциклів” (ХАГ-97). – Харків, 1997. - С. 114.

10. Редькін Р.Г., Русанова С.В., Коваленко С.М. Синтез та реакційна здатність 2-(N-ариліміно)кумаринів // Досягнення сучасної фармації та перспективи розвитку новому тисячолітті: Матеріали V Нац. з’їзду фармац. України. - Харків, 1999. – С. 446-447.

11. Русанова С.В., Коваленко С.С., Черних Ю.В. Синтез та біологічна активність похідних 2-імінокумарин-3-карбоксамідів, що містять п_амінобензамідний залишок // Медицина третього тисячоліття: Зб. тез. конф. мол. вчених Харків. держ. мед. ун-ту. – Ч. I. – Харків, 2001. – С.34.

12. Взаємодія 2-імінокумарин-3-карбоксамідів з 2-амінобензофенонами / С.В. Русанова, С.М. Коваленко, В.П. Черних, С.Д. Боровик // Тез. доп. ХІХ укр. конф. з органічної хімії. – Львів, 2001. – С. 561.

13. Шаповал О.М., Коваленко С.М., Русанова С.В. Результати вивчення гострої токсичності похідних N-арилкумаринкарбоксамідів // Фармація ХХІ століття: Тез. доп. Всеукр. наук.-практ. конф.– Харків, 2002. – С. 204-205.

14. Русанова С.В., Коваленко С.М., Черних В.П. Використання реакцій Кньовенагеля та нуклефільного заміщення для отримання аналогів кумарина // Тез. доп. Всеукр. наук.-практ. конф. – Харків, 2003. – С. 66.

15. Взаємодія 5-гідроксіметил-2-іміно-8-метил-2Н-пірано[2,3-c]піри-дин-3-кар-бокс-аміда і 2-іміно-R-кумарин-3-карбоксамідів з 2-аміно-бензофенонами / П.Є. Шинкаренко, С.В. Русанова, І.О. Журавель, С.М. Коваленко // Тез. доп. XX Укр. конф. з органічної хімії. – Одеса, 2004. – С. 373.

Русанова С.В. “Синтез та вивчення шляхів перетворення 2-імінокумарин-3-карбоксамідів з метою пошуку нових біологічно активних речовин”. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спе-ціальністю 15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фарма-цевтичний університет, Харків, 2005.

Знайдено, що 2_імінокумарин-3-карбоксаміди реагують з арил- та алкіламінами, амі-на-ми Гевальда, гідроксиламіном та арилгідразинами з утворенням відповідних імі-но--похідних. Але з 2_амінобензофенонами 2_імінокумарин-3-карбоксаміди реагують за реціклізаційним механізмом та утворюють 3-(4-арилхіназолін-2-іл)кумарини. По-ка-зано, що внаслідок міцного внутрішньомолекулярного водневого зв’язку 2N_арил)-імінокумарин-3-карбоксаміди легко ацілюються оцтовим ангідридом з утворен--ням N3-ацетил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів. Структуру синтезованих сполук підтверджено даними ІЧ, УФ/Вид, ЯМР-спектроскопії, хромато-мас-спе-к--т-ро-мет-рії та рентгеноструктурним дослідженням. Сплановано комбінаторні бібліоте-ки 2N_арил)імінокумарин-3_карбоксамідів та N3_ацетил-2-(N-арил)іміно-ку-ма-рин-3-кар-боксамідів, розроблено методики їх синтезу та проведено синтез цих біб-ліотек з ви-сокою ефективністю. Вірогідну біологічну активність 2N_арил)-імі-но-ку-ма-рин-3-кар-боксамідів та N3_аце-тил-2-(N-арил)імінокумарин-3-карбоксамідів було спро-гно-зова-но за допомогою розрахункової програми PASS. Ці сполуки можуть проявляти ана-льгетичну, антиалергічну, противірусну, імуностимулюючу та протипухлинну дію. За результатами проведеного фармакологічного скринінгу виявлено, що 2N-4амі--нокарбоніл)феніл]іміно-5,6-бензокумарин-3-карбоксамід є відносно не-ток-сичним, та проявляє високий рівень гепатопротекторної, анальгетичної та анти-ек-судативної дії. Цю речовину запропоновано для поглибленого фармакологічного до-слідження. На вказану субстанцію розроблено проект АНД.

Ключові слова: синтез, кумарини, хіназоліни, рециклізація, комбінаторна бібліотека, прогнозування, біологічна активність, гепатопротектор, анальгетик, антиексудант.

Русанова С.В. “Синтез и изучение путей превращения 2-иминокумарин-3-карбоксамидов с целью поиска новых биологически активных веществ”. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2005.

Диссертация посвящена поиску новых биологически активных соединений среди производных 2_иминокумарин-3-карбоксамида.

Исходные 2_иминокумарин-3-карбоксамиды были получены при конденсации са-лициловых альдегидов с цианацетамидом в условиях реакции Кневенагеля.

Исследование взаимодействия 2_иминокумарин-3-карбоксамидов с N-нук-ле-о-фи-лами показало, что 2_иминокумарин-3-карбоксамиды в реакции с арил- и алкилами-нами, аминами Гевальда, гидроксиламином и арилгидразинами в уксусной кислоте образуют продукты замещения по иминогруппе в положении 2 кумарина. В этих же условиях реакция 2_иминокумарин-3-карбоксамидов с 2-аминобензофенонами про-текает по рециклизационному механизму и приводит к 3-(4-арилхиназолин-2-ил)кумаринам.

Установлено, что 2-(N-арил)иминокумарин-3-карбоксамиды легко ацилируются ук-сусным ангидридом с образованием N3-ацетил-2-(N-арил)иминокумарин-3-кар-бо-к-самидов. Легкость протекания реакции и относительно высокая стабильность N3-аце-тил-2-(N-арил)иминокумарин-3-карбоксамидов объясняется наличием сильной вну-тримолекулярной водородной связи между амидным протоном и атомом азота ими-ногруппы.

Строение синтезированных веществ подтверждено данными элементного анали-за, ИК, УФ/Вид, ЯМР-спектроскопии и хромато-масс-спектрометрии. Структура 3-(4-фе-нилхиназолин-2-ил)кумаринов и N3-ацетил-2-(N-арил)иминокумарин-3-кар-бо-к-са-ми-дов была дополнительно подтверждена данными рентгеноструктурного анализа кристаллов 3-(4-фенил-6-хлорхиназолин-2-ил)-7-гидроксикумарина и N3-ацетил-2-(N-2-фтор-фенил)иминокумарин-3-карбоксамида соответственно.

С учетом дескрипторного анализа с помощью компьютерной программы “Chemo-soft” были спланированы комбинаторные библиотеки 2-(N-арил)-ими-но-ку-ма-рин-3-карбоксамидов и N3-ацетил-2-(N-арил)иминокумарин-3-карбоксамидов, разра-ботаны методики их синтеза и проведен синтез этих библиотек с высокой эффе-к-тивностью. Использование расчетной программы PASS позволило спрогнозировать био-логическую активность 2-(N-арил)иминокумарин-3-карбоксамидов и N3-ацетил-2-(N-арил)иминокумарин-3-карбоксамидов как возможных антиаллергенов, противо-вирусных, иммуностимулирующих, и противоопухолевых лекарственных средств. С помощью метода прогнозирования QSAR уточнена вероятность проявления аналь-гетической активности в ряду 2-(N-арил)иминокумарин-3-карбоксамидов.

По результатам проведенного фармакологического скрининга установлено, что 2-[N-4-(аминокарбонил)фенил]имино-5,6-бензокумарин-3-карбоксамид относительно безвреден и проявляет достаточно высокий уровень гепатопротекторного, анальге-тического и антиэкссудативного действия. Это соединение также проявляет тенде-н-цию к снижению аллергической реакции по модели анафилактического шока. Поэтому 2-[N-4-(аминокарбонил)фенил]имино-3-карбоксамид был предложен для углу-бленного фармакологического исследования. На указанное вещество разработан про-ект аналитической и нормативной документации.

Ключевые слова: синтез, кумарины, хиназолины, рециклизация, комбинаторная библиотека, прогнозирование, биологическая активность, гепатопротектор, ана-ль-гетик, антиэксудант.

Rusanova S.V. “Synthesis and study of transformation ways of 2-iminocoumarin-3-carboxamides for searching new biologically active substances”. – Manuscript.

Thesis for the Ph.D. in Pharmacy in Specialty 15.00.02 – Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy. – National University of Pharmacy, Kharkiv, 2004.

It has been found that reactions of 2-iminocoumarin-3-carboxamides with aryl- or alkyl-amines, Gewald amines, hydroxylamine and arylhydrazines lead to corresponding imino-derivative. But 2-iminocoumarin-3-carboxamides react with 2-amino-benzophenones by recyclization mechanism and gave corresponding 3-(4-arylquinazolin-2-yl)coumarines. It has been shown that due to strong intramolecular hydrogen bond 2-(N-aryl)-imino-cou-ma-rin-3-carboxamides easily acetylated by acetic anhydride produce stable N3-acetyl-2-(N-aryl)-iminocoumarin-3-carboxamides. The structure of compounds obtained has been confir-med by data of IR-, UV/Vis-, NMR-, chromato-mass-spectra characteristics and X-ray analysis. The combinatorial libraries of 2-(N-aryl)iminocoumarin-3-carboxamides and N3-acetyl-2-(N-aryl)-iminocoumarin-3-carboxamides have been planned, procedures of synthesis of these libraries have been developed and synthesis has been carried out with good effectivity.

Possible biological activity of 2-(N-aryl)iminocoumarin-3-carboxamides has been pre-dicted by PASS software. These compounds may possess analgesic, antiallergic, antiviral, immunostimulating and antitumor activity. The pharmacological screening of synthesi-zed compounds showed that 2-[N-(4-aminocarbonylphenyl)]iminocoumarin-3-car-bo-xamide is relatively non-toxic and possess high level of hepatoprotector, analgesic and an-tiexudative action. This substance has been recommended for the further pharmacological studying and project of analytical and technical documentation for this substance has been developed.

Key words: synthesis, coumarines, quinazolines, recyclization, combinatorial library, PASS prediction, biological activity, hepatoprotector, analgesic, antiexudative.