КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

РАДИШ ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 618.396:612.112.94+576.8.097.3:615.373.3

Функціональний стан лімфоцитів жінок

із звичним невиношуванням вагітності

за умов імунізації алогенними лейкоцитами

03.00.09 – імунологія

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005 р.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Чернишов Віктор Павлович

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України

завідуючий лабораторії імунології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Гавриленко Тетяна Іллівна

Інститут кардіології ім. акад. М.Д.Стражеска АМН України

завідуюча лабораторії імунології

доктор біологічних наук

Алексєєва Ірина Миколаївна

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

завідуюча відділом імунології та цитотоксичних сироваток

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Захист дисертації відбудеться “ 24 ” січня 2006 року о 1400 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, просп. Академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 22 ” грудня 2005 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В.Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі розвитку імунології репродукції дослідження в галузі імунобіології та імунопатології вагітності набувають все більшого значення, що обумовлено їх теоретичним та практичним значенням. Відомо, що у модуляції імунної відповіді матері на плід як на локальному, так і на системному рівні, задіяні практично всі існуючі імунні механізми (Hill J.A., Choi B.C., 2000; Raghupathy R., 2001; Croy B.A. et al., 2002; Mincheva-Nilsson L., 2003). Водночас питання про нейро-імуно-ендокринну регуляцію взаємовідносин матері та плоду, роль імунної системи матері в розпізнаванні вагітності та механізми, які опосередковують імунну толерантність до плоду, досі не отримали одностайних відповідей.

Практична значущість вивчення механізмів, які лежать в основі імунного врегулювання взаємовідносин матері і плоду, визначається тим, що значна частина звичного невиношування вагітності виникає через імунологічні чинники (Coulam C.B., 1992; Lopez B.H.H. et al., 1995; Billington W.D., 1999). Вивчення патогенезу та розробка нових методів діагностики та лікування невиношування є приоритетними питаннями сучасного акушерства (Венцківський Б.Н., Венцківська І.Б., 1997; Коханевич Є.Г. та ін., 2001), оскільки невиношування – найпоширеніша патологія вагітності (Кулаков В.И., Сидельникова В.М. 1996; Сидельникова В.М., 1999). Проте серед дослідників немає одностайності у поглядах на роль імунних факторів у патогенезі звичного невиношування, а особливості активаційного стану та супресорної функції лімфоцитів під час фізіологічної і патологічної вагітності вивчені недостатньо.

Підтвердження участі імунної системи у розвитку невиношування порушує питання про застосування імунотерапевтичних заходів, спрямованих на збереження вагітності. Імунізація алогенними лейкоцитами була одним з перших методів імунотерапії, запропонованих для лікування невиношування вагітності (Mowbray J.F. et al., 1985). Результатами досліджень підтверджено високу клінічну ефективність такого лікування (Clark D.A. et al., 2001; Malinowski A., 2001; Adachi H. et al., 2003; Clark D.A., 2004). Проте механізми дії алоімунізації досі залишаються нез’ясованими, що вважають за підставу для обмеження застосування такої імунотерапії (Ober C. et al., 1999; Chaouat G., 2003). Ефективність алоімунізації для збереження вагітності у жінок із звичним невиношуванням за відсутності чітких уявлень про її вплив на материнську імунну відповідь на плід засвідчує актуальність вивчення механізмів дії та оцінки патогенетичності алоімунізації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами темами. Робота виконана в рамках науково-дослідних робіт Інституту педіатрії, акушерства і гінекології АМН України “Патогенез та терапія передчасного переривання вагітності при пізньому гестозі” (№ державної реєстрації 01.99.U 000310) та “Вдосконалити та розробити діагностику та ефективні технології лікування герпесвірусних інфекцій у вагітних” (№ державної реєстрації 01.02.U 001069).

Мета дослідження. Розкриття механізмів імунотерапевтичної дії імунізації алогенними лейкоцитами на підґрунті характеристики її впливу на функціональний стан лімфоцитів жінок із звичним невиношуванням вагітності нез’ясованої етіології (ЗНВ).

Завдання дослідження.

Дослідити стан лімфоцитарних субпопуляцій, експресію маркерів активації лімфоцитами та ConA-індуковану супресорну активність лімфоцитів у жінок із ЗНВ в ранні терміни вагітності (4-7 тижнів) для визначення імунопатогенетичних ознак зазначеної патології.

Вивчити вплив алоімунізації на стан лімфоцитарних субпопуляцій, експресію маркерів активації лімфоцитами, ConA-індуковану супресорну активність лімфоцитів та продукцію плацентарних протеїнів у вагітних із ЗНВ для розкриття механізмів дії алоімунізації і оцінки її патогенетичності.

Проаналізувати результати застосування імунізації алогенними лейкоцитами жінок із ЗНВ залежно від наслідків вагітності та визначити інформативність імунологічних показників для доклінічної оцінки ефективності зазначеної імунотерапії.

Об’єкт дослідження – імунопатогенез звичного невиношування вагітності нез’ясованої етіології та імунотерапевтична дія імунізації алогенними лейкоцитами.

Предмет дослідження – лімфоцитарні субпопуляції, експресія маркерів активації лімфоцитами, ConA-індукована супресорна активність, секреція плацентарних протеїнів у жінок із ЗНВ в ранні терміни вагітності до та після застосування алоімунізації і умовного плацебо.

Методи дослідження: імунологічні, культуральні, імунохімічні, загальноклінічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі отримано новітні дані про підвищення експресії HLA-DR на CD3+ і CD8+ клітинах та зниження експресії CD25 на CD3+, CD4+, CD8+ і CD16/56+ лімфоцитах в 4-7 тиж. вагітності у жінок із ЗНВ порівняно із здоровими вагітними жінками. Продемонстровано зв’язок низької експресії CD25 з низькою експресією CD8 на природних кілерах (ПК), високою експресією CD45RA на CD4+ клітинах і високою експресією HLA-DR на CD8+ лімфоцитах. Підтверджено підвищення вмісту CD16/56+ клітин і CD4+/CD8+ співвідношення та частоти виявлення ефекту ConA-індукованої стимуляції, зниження ConA-індукованої супресорної активності у жінок із ЗНВ порівняно із здоровими вагітними жінками. Отримані результати дозволили визначити імунопатологічні ознаки ЗНВ в ранні терміни вагітності: недостатність генерації T-регуляторних (TR) лімфоцитів (CD4+25+) та лімітування активованих Т-цитотоксичних клітин (CD8+DR+), затримка диференціації наївних хелперів (CD4+45RA+) у клітини пам’яті, дефект супресорної функції лімфоцитів (ConA-індукованої супресорної активності) та активації природних кілерів (CD16/56+25+, CD3–8+). Таким чином, вперше на підставі аналізу фенотипових особливостей і супресорної функції лімфоцитів підтверджено недостатність системного плодо-материнського імунного розпізнавання і формування неадекватної імунної відповіді на плід в ранні терміни вагітності за звичного невиношування нез’ясованої етіології.

Результатами роботи продемонстровано, що імунізація алогенними лейкоцитами жінок із ЗНВ в 5-7 тиж. вагітності спричиняла повну нормалізацію експресії маркерів ранньої (CD25) та пізньої (HLA-DR) активації на Т-лімфоцитах, CD4+ і CD8+ клітинах, фізіологічне відновлення стану активації ПК (експресії CD25 і CD8 на них), сприяла нормалізації субпопуляційного складу (вмісту В-лімфоцитів та ПК) і посиленню супресорної функції лімфоцитів. Отримані дані дали підстави підсумувати, що механізми імунотерапевтичної дії алоімунізації реалізуються за рахунок індукції генерації TR клітин, відновлення супресорної функції лімфоцитів, елімінації активованих Т-цитотоксичних лімфоцитів, регуляції активації ПК.

Новітніми є отримані в роботі результати про нормалізацію секреторної функції плаценти внаслідок алоімунізації, що свідчить про формування фізіологічних механізмів запобігання розвитку материнських ефекторних реакцій, які уражують плодо-материнську інтерфазу. Аналіз динаміки змін стану активації лімфоцитів після алоімунізації встановив значне підвищення експресії CD25 на Т-лімфоцитах і ПК через 1 тиждень після лікування з подальшою її нормалізацією через 2 тижні, що дозволило обґрунтувати новий погляд на імунізацію алогенними лейкоцитами як засіб додаткового антигенного стимулювання, який посилює процеси плодо-материнського імунного розпізнавання та сприяє розвитку фізіологічної висоти материнської імунної відповіді на плід. Нормалізуючий вплив алоімунізації на плодо-материнські імунні взаємовідносини підтверджений клінічними результатами застосування зазначеної імунотерапії – 90 % збережених вагітностей у жінок із ЗНВ.

Практичне значення одержаних результатів. Результатами роботи підтверджено ефективність імунізації алогенними лейкоцитами як методу імунотерапії ЗНВ. Визначено умови проведення імунізації алогенними лейкоцитами, за яких можливо досягти її високої (90 %) клінічної ефективності: застосування алоімунізації у жінок із ЗНВ, що не мають антифосфоліпідних антитіл; використання для імунізації свіжовиділених клітин без їхнього зберігання; проведення алоімунізації в ранні терміни вагітності – 5-7 тиж.; використання донорських клітин для імунізації в разі збігу партнерів за антигенами гістосумісності І класу.

Вперше показано, що ефективність алоімунізації значною мірою визначається глибиною імунних порушень у жінок із ЗНВ. За умов формування в 4-7 тиж. вагітності компенсаторних імунних змін, а саме зниження експресії CD25 на ПК і підвищення експресії CD45RA на CD4+ лімфоцитах порівняно з фізіологічним перебігом вагітності, алоімунізація є ефективною. В разі відсутності зазначених компенсаторних змін та наявності підвищення експресії HLA-DR на СD4+ лімфоцитах, нестачі ТR клітин не тільки в 5-7, але й в 4-6 тиж. вагітності, виявлення ConA-індукованими лімфоцитами ефекту стимуляції, алоімунізація виявляється неефективною.

В роботі опрацьовано нові підходи до доклінічної оцінки ефективності імунізації алогенними лейкоцитами у жінок із ЗНВ залежно від результатів імунологічного обстеження, що є підґрунтям для розробки нових методів імунологічного моніторингу в практичному акушерстві. На підставі отриманих результатів, запропоновано визначення експресії HLA-DR на CD3+ лімфоцитах, клітинного співвідношення CD4+/CD8+, вмісту CD3–8+ клітин, ConA-індукованої активності лімфоцитів та концентрації глікоделіну до та після проведення алоімунізації для прогнозування наслідків вагітності після зазначеної імунотерапії.

Результати роботи впроваджено у науково-дослідну роботу та клінічну практику відділень наукових проблем невиношування вагітності, патології вагітності і пологів, планування сім’ї Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України та навчальний процес кафедри мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено опрацювання літератури, визначена мета та основні задачі дослідження, здійснено лабораторне імунологічне дослідження 286 зразків крові, одержаних від 100 вагітних жінок і 42 донорів лейкоцитів для імунізації. Клінічна характеристика обстежених жінок та оцінка клінічної ефективності застосування алоімунізації проведені спільно із співробітниками відділення наукових проблем невиношування вагітності Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України (зав. – д.мед.н., проф. Писарєва С.П.). Особисто автором виконана статистична обробка та проведено узагальнення одержаних в роботі результатів, за результатами роботи підготовлені друковані праці, зроблено наукові доповіді.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації апробовані на Міжнародних форумах з репродуктивної імунології (Магдебург, Німеччина, 1993, 1996 рр.), Міжнародних симпозіумах з імунології репродукції (Київ, Україна, 1993, 1996 рр.), Міжнародному симпозіумі з репродуктивної імунології (Казимерж-Дольний-на-Віслі, Польща, 1995 р.), Міжнародному конгресі з імунології репродукції (Вашингтон, США, 1995 р.), Міжнародному конгресі з імунології (Монреаль, Канада, 2004 р.).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 15 наукових праць: 6 статей, 4 з яких – у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК, та 9 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 151 сторінці комп’ютерного друку, проілюстрована 19 таблицями та 16 рисунками (3 з яких розташовані на окремих сторінках), містить 1 додаток (займає 6 сторінок). Дисертація побудована за загальноприйнятим планом і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу та методів дослідження, трьох розділів власних результатів досліджень, аналізу і узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаної літератури, що містить 316 джерел (займає 25 сторінок).

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Для досягнення мети та розв’язання завдань, поставлених в роботі, проведено імунологічне дослідження 199 зразків крові від 58 вагітних жінок, які за клінічними та анамнестичними критеріями відповідали акушерському анамнезу звичне невиношування нез’ясованої етіології і діагнозу загроза переривання вагітності, та 45 зразків крові від 42 соматично здорових вагітних жінок з необтяженим акушерсько-гінекологічним анамнезом і фізіологічним перебігом вагітності (контроль).

58-ми жінкам із ЗНВ проведене імунологічне обстеження в 4-6 та 5-7 тиж. вагітності. 45 жінок, що були серонегативними за антифосфоліпідними антитілами, були відібрані для проведення лікування алоімунізацією. 31 жінка отримала алоімунізацію в 5-7 тиж. вагітності, з них 3 – імунізацію клітинами донора (через збіг за антигенами гістосумісності з чоловіком) та 28 – лейкоцитами чоловіка. Зазначену імунотерапію проводили в день приготування лейкоцитів для імунізації без їхнього зберігання, клітини у кількості (10020) млн. вводили внутрішньошкірно. 14-ти жінкам через неможливість отримати достатню кількість клітин для імунізації в 5-7 тиж. вагітності проведено умовне плацебо (розчин глюкози), 13 з них у 8-10 тиж. отримали алоімунізацію. Обидва типи лікування проводили на фоні базисної терапії. Для оцінки впливу алоімунізації і умовного плацебо жінки обстежувалися двічі після лікування – через 1 та 2 тижні. Досліджені показники вагітних жінок із ЗНВ порівнювали з такими в контрольних групах з урахуванням термінів вагітності, в яких проводилося обстеження (контроль 1 – 4-7 тиж., контроль 2 – 7-10 тиж.).

У зразках цільної крові визначали вміст лімфоцитів різних субпопуляцій (CD3+ Т-ліфоцити, CD19+ В-лімфоцити, CD16/56+ природні кілери (ПК), CD3+4+ Т-хелпери, CD3+8+ Т-цитотоксичні клітини) та експресію маркерів CD45RA і HLA-DR на лімфоцитах методом двоколірної проточної цитометрії з використанням моноклональних антитіл та цитометру FAСScan (Becton Dickinson, США). Визначення експресії CD25 на лімфоцитах здійснювали аналогічним методом на виділених мононуклеарних клітинах після їхньої інкубації з субоптимальними дозами фітогемаглютинину впродовж ночі. Для дослідження супресорної функції лімфоцити преінкубували протягом 48 год. з високими дозами конканаваліну А (СonA, кінцева концентрація 60 мкг/мл), після чого їх обробляли мітоміцином С і досліджували їхній ефект на проліферацію донорських лімфоцитів в присутності фітогемаглютинину. Плацентарні протеїни хоріонічний гонадотропін (ХГ) і глікоделін, а також антифосфоліпідні IgG антитіла визначали імуноферментним методом в сироватках крові. Типування лімфоцитів за антигенами гістосумісності І клісу жінок із ЗНВ та чоловіків (донорів) здійснювали в комплемент-залежному цитотоксичному тесті.

Для статистичної обробки отриманих даних використовували: в разі нормального (гаусового) розподілу даних вибірки – критерій Student td; в разі розподілу, відмінного від нормального, – критерій Mann-Whitney U (для оцінки різниці між різними групами), критерій Wilcoxon Т (для оцінки різниці в межах однієї групи в динаміці до або після лікування), метод множинних порівнянь Frideman (для оцінки різниці в динаміці протягом всього обстеження). Зв’язки між показниками оцінювали за коефіцієнтом кореляції Spirman rs (для оцінки зв’язку між кількісними показниками) або точковим бісекторіальним коефіцієнтом кореляції rpb (для оцінки зв’язку між кількісним і якісним показниками). Результати представляли у вигляді середніх значень та стандартної похибки (Mm). Всі обчислені критерії вважали за статистично вірогідні, коли рівень значущості Р був менший за 0,05.

Результати досліджень, їх аналіз і узагальнення. У крові жінок із ЗНВ в 4-6 та 5-7 тиж. вагітності спостерігалося зниження вмісту В-лімфоцитів і клітин з фенотипом CD3–8+, які відображають експресію CD8 на ПК, та підвищення вмісту ПК, співвідношення CD4+/CD8+ і кількості наївних клітин-хелперів (СD4+45RA+) (табл. 1) за збереження нормальної кількості Т-лімфоцитів, Т-хелперів, ЦТЛ та співвідношення СD3+4+/CD3+8+ порівняно із здоровими вагітними жінками. Експресія HLA-DR була значно підвищеною на CD3+ та CD8+ лімфоцитах, але незмінною на CD4+ клітинах у жінок із ЗНВ в 4-6 та 5-7 тиж. порівняно з показниками контролю. Водночас вміст CD3+25+, CD8+25+ та СD16/56+25+ виявився значно зниженим в 4-6 та 5-7 тиж., так само як і вміст СD4+25+ в 5-7 тиж., у жінок із ЗНВ порівняно із здоровими вагітними жінками (табл. 2).

Таблиця 1

Вміст CD19+, CD16/56+, CD3–8+ лімфоцитів (%), клітинне співвідношення CD4+/CD8+ і експресія CD45RA на CD4+ клітинах у крові вагітних жінок

із звичним невиношуванням (Mm)

Групи обстежених | n | CD19+ | CD16/56+ | CD4+/CD8+ | CD3–8+ | % CD45RA

на CD4+

Вагітні із ЗНВ

(4-6 тиж.) | 58 | 10,40,4* | 16,70,7* | 1,440,04* | 4,30,3* | 37,11,7*

Вагітні із ЗНВ

(5-7 тиж.) | 54 | 9,90,3* | 17,10,7* | 1,480,05* | 3,90,3* | 35,01,9*

Контроль 1

(4-7 тиж.) | 22 | 12,30,6 | 11,30,6 | 1,300,08 | 8,00,6 | 29,02,0

Примітка. * – p<0,05 порівняно з показником в групі Контроль 1.

Таблиця 2

Експресія маркерів активації HLA-DR i CD25 на субпопуляціях лімфоцитів у крові вагітних жінок із звичним невиношуванням (Mm)

Групи обстежених | %HLA-DR

на CD3+ | %HLA-DR

на CD8+ | CD3+25+ | CD4+25+ | CD8+25+ | CD16/56+25+

Вагітні із ЗНВ

(4-6 тиж.) | 16,40,8* | 23,02,8* | 19,30,8* | 12,80,6 | 5,30,3* | 0,80,1*

Вагітні із ЗНВ

(5-7 тиж.) | 18,81,0* | 24,00,9* | 16,80,6* | 10,90,4* | 4,40,3* | 0,80,1*

Контроль 1

(4-7 тиж.) | 10,30,8 | 16,91,0 | 22,30,9 | 14,10,8 | 8,40,7 | 1,40,2

Примітка. * – p<0,05 порівняно з показником в групі Контроль 1.

У половини обстежених вагітних із ЗНВ (50 % в 4-6 тиж. та 53 % в 5-7 тиж.) ConA-індуковані лімфоцити виявляли анормальний стимуляторний ефект. До того в обидва досліджені терміни вагітності ConA-індукована стимуляторна активність у жінок із ЗНВ була значно вищою, ніж в контролі, а супресорна – значно нижчою (рис. 1).

Рис. 2. Супресорна активність ConA-індукованих лімфоцитів у крові вагітних жінок із звичним невиношуванням (Mm).

+1 І, +1 П – 6-8 тиж. вагітності, через 1 тиждень після імунізації або плацебо; +2 І, +2 П – 7-9 тиж. вагітності, через 2 тижні після імунізації або плацебо; * - p<0,05 порівняно з показником в групі Контроль 2; # - p<0,05 порівняно з показником до лікування.

Зниження кількості В-лімфоцитів, підвищення вмісту ПК, накопичення в циркуляції лімфоцитів в пізній стадії активації (HLA-DR позитивних) свідчать, що в ранні терміни вагітності (4-7 тиж.) у жінок із ЗНВ материнська імунна відповідь на плід формується по типу хронічного запалення, що є небезпечним для розвитку вагітності (Hill J.A., Choi B.C., 2000; Буткова О.І., 2004). Нестача експресії CD25 і CD8 на CD16/56+ клітинах у жінок із ЗНВ є ознакою зниження рівню активації ПК, що має відбуватися під час вагітності як компенсаторна у відповідь на розвиток системної імуносупресії (Meeusen E.N. et al., 2001). Зниження експресії CD25 на лімфоцитах та підвищення кількості некомітованих хелперів (CD4+45RA+), є свідченням недостатньої антигенної стимуляції лімфоцитів у жінок із ЗНВ, тобто нестачі плодо-материнського імунного розпізнавання, що розцінюється як один з чинників переривання вагітності (Jiang S.P., Vacchio M.S., 1998; Barnea E.R. et al., 2000). Недостатня експресія CD25 за підвищеної експресії HLA-DR на CD8+ клітинах в разі ЗНВ вказує на відсутність ефективного системного і локального контролю (Lenardo M. et al., 1999; Guller S., LaChapelle L., 1999) за активованими Т-цитотоксичними лімфоцитами. Знижена кількість CD4+25+ Т-регуляторних клітин з вираженими супресорними властивостями (Bluestone J.A., Abbas A.K., 2003), висока частота виявлення ConA-індукованого ефекту стимуляції та зниження супресорної ативності ConA-індукованих лімфоцитів засвідчують наявність у жінок із ЗНВ порушень у формуванні супресорної домінанти, необхідної для забезпечення фізіологічного перебігу вагітності (Wegmann T.G. et al., 1993; Chaouat G., Menu E., 1997). Знайдені порушення активаційного стану лімфоцитів у вагітних жінок із ЗНВ, з урахуванням сучасних уявлень про розвиток імунної відповіді (Griffith T.S. et al., 1995; Johannisson A., Festin R., 1995; Buckner J.H., Ziegler S.F., 2004), дають підстави підсумувати, що в разі означеної патології формуються дефекти в контролі за динамікою, розповсюдженням, тривалістю та висотою імунної відповіді матері на плід.

За таких умов постає питання про необхідність додаткового алоантигенного стимулювання жінок із ЗНВ для підсилення плодо-материнського імунного розпізнавання, досягнення фізіологічної висоти імунної відповіді на антигени плоду і формування толерантності до них. Це питання може бути розв’язане за рахунок проведення імунізації алогенними лейкоцитами.

Дослідження лімфоцитарних субпопуляцій у жінок із ЗНВ після застосування алоімунізації (АІ) показало, що через 2 тижні після лікування спостерігалася тенденція до нормалізації вмісту ПК (зниження порівняно із станом до лікування), повна нормалізація (відсутність змін порівняно з контролем) вмісту В-лімфоцитів, клітинного співвідношення CD4+/CD8+ та кількості CD3–8+ клітин. Після умовного плацебо (УП) аналогічні зміни були відсутні – означені показники мали такі самі зміни порівняно з контролем, що і до лікування. Зміни експресії CD45RA на CD4+ лімфоцитах виявилися схожими після обох видів лікування, однак зниження цього показника порівняно із станом до лікування за умов алоімунізації відмічалася через 2, а умовного плацебо – через 1 тиждень після лікування (табл. 3).

Проведення алоімунізації спричиняло зниження і нормалізацію експресії HLA-DR на CD3+ та CD8+ лімфоцитах, водночас умовне плацебо супроводжувалося підвищенням цих показників (табл. 4). Після алоімунізації спостерігалося підвищення вмісту CD25 позитивних лімфоцитів, до того, через 1 тиждень відбувався зріст кількості CD3+25+ і CD16/56+25+ клітин порівняно з контрольними показниками, а через 2 тижні – повна нормалізація вмісту цих клітин. Водночас нормалізація CD4+25+ і CD8+25+ лімфоцитів відбувалася вже через 1 тиждень після алоімунізації і зберігалася через 2 тижні. Після умовного плацебо експресія CD25+ на CD3+, CD4+, CD8+ та CD16/56+ лімфоцитах залишалася нижчою, ніж в контролі, і знижувалася порівняно із станом до лікування (табл. 4).

Таблиця 3

Вміст CD19+, CD16/56+, CD3–8+ лімфоцитів (%), клітинне співвідношення CD4+/CD8+ і експресія CD45RA на CD4+ клітинах у крові вагітних жінок із звичним невиношуванням після лікування (Mm)

Групи обстежених | n | CD19+ | CD16/56+ | CD4+/CD8+ | CD3–8+ | CD45RA

на CD4+

Вагітні із ЗНВ

(1 тиж. після АІ) | 31 | 9,70,3* | 16,40,9* | 1,320,03*# | 6,60,5*# | 31,31,9

Вагітні із ЗНВ

(2 тиж. після АІ) | 28 | 9,90,4 | 14,80,7*# | 1,220,05# | 8,30,5#@ | 28,31,7#

Вагітні із ЗНВ

(1 тиж. після УП) | 14 | 9,70,4* | 16,10,8* | 1,470,07* | 3,30,5* | 27,41,9#

Вагітні із ЗНВ

(2 тиж. після УП) | 13 | 9,70,8* | 16,91,3* | 1,500,09* | 3,20,4* | 31,52,0

Контроль 2

7-10 тиж. | 23 | 11,80,9 | 11,10,6 | 1,160,05 | 8,40,6 | 27,71,7

Примітка. * - p<0,05 у порівнянні з показником в групі Контроль 2; # - p<0,05 порівняно з показником до лікування; @ - p<0,05 порівняно з показником через 1 тиж. після лікування.

Таблиця 4

Експресія маркерів активації HLA-DR i CD25 на субпопуляціях лімфоцитів

у крові вагітних жінок із звичним невиношуванням після лікування (Mm)

Групи обстежених | % HLA-DR

на CD3+ | % HLA-DR

на CD8+ | CD3+25+ | CD4+25+ | CD8+25+ | CD16/56+

25+

Вагітні із ЗНВ

(1 тиж. після АІ) | 13,81,1* | 19,01,3# | 18,91,0* | 12,50,8 | 7,50,5# | 1,70,3*#

Вагітні із ЗНВ

(2 тиж. після АІ) | 13,20,9# | 19,71,4# | 16,90,9 | 10,30,6#@ | 7,30,6# | 0,91,2@

Вагітні із ЗНВ

(1 тиж. після УП) | 22,41,8*# | 26,61,5*# | 13,91,2# | 8,10,8*# | 4,00,4* | 0,50,1*#

Вагітні із ЗНВ

(2 тиж. після УП) | 23,41,5*# | 31,92,0*# | 12,91,3*# | 6,70,7*# | 3,40,3*# | 0,40,1*#

Контроль 2

7-10 тиж. | 11,21,1 | 17,41,2 | 15,31,2 | 11,30,8 | 6,80,5 | 1,00,2

Примітка. * - p<0,05 порівняно з показником в групі Контроль 2; # - p<0,05 порівняно з показником до лікування; @ - p<0,05 порівняно з показником через 1 тиж. після лікування.

Після проведення алоімунізації частота виявлення стимуляторного ефекту ConA-індукованих лімфоцитів значно знижувалася порівняно із станом до лікування: через 1 тиждень у 42 % жінок, а через 2 тижні – ще у 15 % жінок ефект з анормального стимуляторного змінювався на нормальний супресорний. Тобто, частота виявлення ефекту ConA-індукованої супресії зростала після алоімунізації порівняно із станом до лікування і через 2 тижні була такою, що не відрізнялася від контрольного показника. Після умовного плацебо будь-які зміни у виявленні ConA-індукованими лімфоцитами жінок із ЗНВ ефекту стимуляції або супресії не відзначалися.

Помітна динаміка у ConA-індукованій стимуляції як після проведення алоімунізації, так і умовного плацебо, була відсутня. Водночас у ConA-індукованій супресорній активності відзначалися динамічні зміни: через 1 тиждень після алоімунізації, так само як і після умовного плацебо, цей показник був значно знижений у жінок із ЗНВ порівняно з контролем; через 2 тижні після алоімунізації відбувалося значне підвищення супресорної активності ConA-індукованих лімфоцитів порівняно із станом до лікування, однак без її повної нормалізації. Через 2 тижні після умовного плацебо спостерігалися протилежні зміни – ConA-індукована супресорна активність знижувалася порівняно із станом до лікування, залишаючись зниженою щодо контролю (рис. 2).

Рис. 2. Супресорна активність ConA-індукованих лімфоцитів у крові вагітних жінок із звичним невиношуванням за умов алоімунізації та умовного плацебо (Mm).

+1 І, +1 П – 6-8 тиж. вагітності, через 1 тиждень після імунізації або плацебо; +2 І, +2 П – 7-9 тиж. вагітності, через 2 тижні після імунізації або плацебо; * - p<0,05 порівняно з показником в групі Контроль 2; # - p<0,05 порівняно з показником до лікування.

Визначення концентрації плацентарних протеїнів продемонструвало, що через тиждень після алоімунізації у жінок із ЗНВ відбувалася нормалізація продукції глікоделіну та ХГ з подальшим її динамічним зростанням. Водночас після умовного плацебо позитивна динаміка зростання концентрацій обох протеїнів була відсутня, до того, зберігалася недостатність продукції глікоделіну (рис. 3).

Рис. 3. Концентрації глікоделіну (нг/л) і хоріонічного гонадотропіну (мМO/л) у крові вагітних жінок із звичним невиношуванням за умов алоімунізації та умовного плацебо (Mm).

-1 І/П – 4-6 тиж. вагітності, за 1 тиждень до імунізації або плацебо; 0 І/П – 5-7 тиж. вагітності, в день імунізації плацебо; +1 І/П – 6-8 тиж. вагітності, через 1 тиждень після імунізації або плацебо; +2 І/П – 7-9 тиж. вагітності, через 2 тижні після імунізації або плацебо; Контроль ––– , АІ – – – , УП - - - -; * - p<0,05 порівняно з показником в контрольних групах; # - p<0,05 порівняно з показником до лікування; @ - p<0,05 порівняно з показником через 1 тиж. після лікування.

Отримані результати засвідчують, що імунізація алогенними лейкоцитами жінок із ЗНВ у 5-7 тиж. вагітності спричиняла відновлення фізіологічного рівня експресії маркерів активації лімфоцитами, викликала тенденцію до нормалізації кількості ПК та супресорної функції лімфоцитів, мала наслідком динамічне зростання продукції плацентарних протеїнів.

Раніше було продемонстровано, що алоімунізація нормалізує кількість і функціональну активність ПК (Higuchi K. et al., 1995; Kwak J.Y. et al., 1998), стимулює продукцію блокуючих антитіл (Adachi H. et al., 2003; Pandey M.K. et al., 2003), врегульовує Th1/Th2 цитокіновий баланс (Hayakawa S. et al., 2000; Szpakowski A. Et al., 2000), сприяє нормалізації співвідношення CD4+/CD8+ (Zhao A.M. et al., 1994) та кількості CD3+DR+ клітин (Wilczynski J. et al., 1997). Водночас вплив алоімунізації на стан активації і супресорну функцію лімфоцитів та секреторну функцію плаценти в нашій роботі досліджено вперше. Отримані нами результати дають підстави підсумувати, що механізми імунотерапевтичної дії алоімунізації реалізуються за рахунок нормалізації генерації TR клітин, відновлення супресорної функції лімфоцитів, стимулювання елімінації активованих ЦТЛ, регуляції фізіологічної активації ПК. Внаслідок алоімунізації відбувається встановлення фізіологічних механізмів запобігання розвитку реакцій, які уражують плодо-материнську інтерфазу, що доводить відновлення фізіологічного рівня продукції плацентарних протеїнів. Нормалізація активаційного стану лімфоцитів внаслідок алоімунізації може розцінюватися як ознака підсилення плодо-материнського імунного розпізнавання та нормалізації висоти і фазовості материнської імунної відповіді на плід. Це свідчить про патогенетичність обраної імунотерапії для лікування жінок із ЗНВ, що підтверджується іншими дослідженями (Gafter U. et al., 1997; Ito K. et al., 1999; Чернишов В.П. та ін., 2001), а також клінічними результатами застосування алоімунізації, отриманими в нашій роботі.

Проведення імунізації алогенними лейкоцитами в 5-7 тижнів вагітності показало, що жінки добре переносили таку імунотерапію. Шкірна реакція на введення алогенних лейкоцитів проявлялася як типова реакція гіперчутливості уповільненого типу. Бічних ефектів в жодному випадку відмічено не було.

Ефективність застосування імунізації алогенними лейкоцитами оцінювали за наслідками вагітності (за позитивні наслідки приймали збереження вагітності, її пролонгацію щонайменше до 28 тижнів і народження живої дитини). Після проведення імунізації в 5-7 тиж. передчасна втрата вагітності відбулася у 3-х жінок, у 28-ми з 31-ї жінки (90 %) вагітність була пролонгована і закінчилася народженням живої дитини. У 3-х з 13-ти жінок, яким алоімунізацію провели в 8-10 тиж. після умовного плацебо, сталася передчасна втрата вагітності, у 10-ти (77 %) вагітність мала позитивні наслідки. Аналіз результатів застосування алоімунізації в різні терміни вагітності показав, що ефективність зазначеної імунотерапії була значно вищою в разі, коли вона проводилася в 5-7 тиж., ніж в 8-10 тиж. вагітності (рис. 4).

P<0,05

Імунізація алогенними Умовне плацебо (5-7 тиж.)

лейкоцитами (5-7 тиж.) + алоімунізація (8-10 тиж.)

Рис 4. Ефективність лікування імунізацією алогенними лейкоцитами в разі її проведення в 5-7 та 8-10 тижнів вагітності.

Враховуючи дані про низьку результативність алоімнузації у жінок з наявністю автоантитіл (Malinowski A. et al., 1998), втрату толерогенності клітинами, що зберігаються (Clark D.A., 2004), роль збігу партнерів за антигенами гістосумісності у невиношуванні вагітності (Beer A.E. et al., 1985; Creus M. еt al., 1998), необхідність якомога раннього плодо-материнського імунного розпізнавання (Barnea E.R. et al., 2000), високої ефективності імунізації алогенними лейкоцитами в нашій роботі вдалося досягти за низки умов: 1) ретельного відбору пацієнтів для проведення алоімунізації (виключення АФА серопозитивних жінок); 2) використання для імунізації свіжовиділених клітин без їхнього зберігання; 3) використання донорських лейкоцитів в разі збігу партнерів за антигенами гістосумісності; 4) проведення алоімунізації в ранні терміни вагітності (5-7 тиж.).

Вихідні (до лікування) показники імунологічного обстеження жінок із ЗНВ було проаналізовано залежно від наслідків вагітності. Результати показали, що характер змін імунологічних показників у жінок з передчасною втратою вагітності (ВВ) порівняно з контролем був дещо іншим, ніж у жінок із збереженою вагітністю (ЗВ). Так, у них не відбувалося підвищення експресії CD45RA на СD4+ лімфоцитах в 4-6 і 5-7 тиж. та зниження кількості CD25 позитивних ПК в 5-7 тиж., спостерігалося підвищення експресії HLA-DR на CD4+ лімфоцитах в 4-6 тиж. вагітності. До того, у всіх жінок із ВВ визначався анормальний стимуляторний ефект ConA-індукованих лімфоцитів (табл. 5).

Таблиця 5

Експресія маркерів активації на лімфоцитах та активність ConA-індукованих лімфоцитів (%) в крові вагітних жінок із звичним невиношуванням

залежно від наслідків вагітності (Mm)

Групи обстежених | n | % CD45RA

на CD4+ | % HLA-DR

на CD4+ | CD4+25+ | CD16/56+

25+ | ConA-індукована

стимуляція | Супресія

Вагітні з ЗВ

(4-6 тиж.) | 38 | 37,52,5* | 10,40,7 | 13,00,7 | 0,80,1* | 60,82,5* | 40,63,2*

Вагітні з ЗВ

(5-7 тиж.) | 38 | 35,22,1* | 10,30,7 | 11,00,6* | 0,60,1* | 55,72,6* | 45,22,0*

Вагітні з ВВ

(4-6 тиж.) | 7 | 30,04,0 | 14,83,3* | 11,61,0* | 0,80,2* | 62,03,9* | Не виявлено

Вагітні з ВВ

(5-7 тиж.) | 7 | 27,93,4& | 10,10,8 | 10,71,1* | 1,10,3& | 58,92,9* | Не виявлено

Контроль 1

(4-7 тиж.) | 22 | 29,02,0 | 8,80,7 | 14,10,8 | 1,40,2 | 8,00 | 57,82,9

Примітка. * - p<0,05 порівняно з показником в групі Контроль 1; & - p<0,05 між групами вагітних із ЗНВ із збереженою та втраченою вагітністю.

Підвищення експресії CD45RA на CD4+ клітинах та зниження вмісту активованих (CD25+) ПК у жінок із ЗВ, на нашу думку, має компенсаторний характер: обмеження диференціації наївних Т-хелперів у Th2 клітини (Hill J.A., Choi B.C., 2000; Van Roon J.A.G. et al., 2003) та зниження активації ПК у відповідь на їхню надлишкову функціональну активність (Emmer P.M. et al., 2000; Morikawa M. At al., 2001) може сприяти збереженню вагітності. З іншого боку, відсутність компенсаторних імунних механізмів та глибокі і тривалі порушення у стані активації T-хелперів і супресорній функції лімфоцитів, які спостерігаються у частини жінок із ЗНВ у 4-7 тиж. вагітності, є однією з можливих причин того, що проведення алоімунізації у таких жінок не мало позитивних результатів.

Враховуючи характер впливу алоімунізації на субпопуляційний склад, стан активації, супресорну функцію лімфоцитів і продукцію плацентарних протеїнів, був проведений кореляційний аналіз між позитивними наслідками вагітності і змінами означених показників з метою визначення їх прогностичної і моніторингової значущості. Найбільш суттєво корелювали з наслідками вагітності зміни, що відбувалися через 2 тиж. після алоімунізації у ConA-індукованій активності лімфоцитів, експресії HLA-DR на CD8+ лімфоцитах, вмісті CD3–8+ лімфоцитів і співвідношенні CD4+/CD8+, концентрації глікоделіну (табл. 6). Отримані результати засвідчують доцільність використання зазначених показників у доклінічній оцінці ефективності алоімунізації жінок із ЗНВ і розширюють можливості імунологічного моніторингу перебігу вагітності.

Таблиця 6

Кореляційні зв’язки у змінах, обумовлених застосуванням імунізації алогенними лейкоцитами, з позитивними наслідками вагітності

Показники | Коефіцієнти кореляції

Зниження % HLA-DR позитивних клітин серед CD3+ лімфоцитів | r=0,53; r=0,53 (P<0,010)

Підвищення вмісту CD3–8+ лімфоцитів | r=0,68; r=0,76 (P<0,010)

Зниження співвідношення CD4+/CD8+ | r=0,53; r=0,62 (P<0,010)

Підвищення супресорної активності ConA-індукованих лімфоцитів

або зміна стимуляторного ефекту на супресорний | r=0,94; r=0,86 (P<0,010)

Підвищення концентрації глікоделіну | r=0,86; r=0,71 (P<0,010)

Примітка: коефіцієнт кореляції обчислювали між позитивними наслідками вагітності та різницею значення відповідного показника () станом через 2 тижні після алоімунізації і станом за тиждень до лікування та в день проведення лікування.

ВИСНОВКИ

У жінок із звичним невиношуванням нез’ясованої етіології в 4-7 тиж. вагітності спостерігається зниження кількості В-лімфоцитів, підвищення вмісту ПК та низька експресія на них маркерів активації CD8 і CD25; зниження кількості CD3+, CD4+ і CD8+ клітин, що експресують CD25; підвищення експресії HLA-DR на CD3+ і CD8+ лімфоцитах та експресії CD45RA на CD4+ клітинах; виявлення ConA-індукованими лімфоцитами анормального стимуляторного ефекту або зниження їхньої супресорної активності порівняно з фізіологічним перебігом вагітності.

Імунопатогенетичними ознаками звичного невиношування нез’ясованої етіології є недостатність генерації T-регуляторних лімфоцитів (CD4+25+) та лімітування активованих Т-цитотоксичних клітин (CD8+DR+), затримка диференціації наївних Т-хелперів (CD4+45RA+) у клітини пам’яті, дефект супресорної функції лімфоцитів (ConA-індукованої супресорної активності) та активації природних кілерів (CD16/56+25+, CD3–8+).

Імунізація алогенними лейкоцитами жінок із звичним невиношуванням нез’ясованої етіології в 5-7 тиж. вагітності спричиняє повну нормалізацію експресії маркерів активації CD25 і HLA-DR на CD3+, CD4+ і CD8+ клітинах та CD25 і CD8 на ПК, тенденцію до нормалізації супресорної активності ConA-індукованих лімфоцитів та кількості ПК, відновлення фізіологічного рівня продукції плацентарних протеїнів хоріонічного гонадотропіну та глікоделіну через 2 тижні після лікування.

Механізми імунотерапевтичної дії алоімунізації полягають в алоантигенному стимулюванні Т-лімфоцитів та ПК (значний зріст вмісту CD3+25+ і CD16/56+25+ з подальшою його ормалізацією), індукції генерації T-регуляторних клітин (нормалізація кількості CD4+25+ лімфоцитів), відновленні супресорної функції лімфоцитів (підвищення ConA-індукованої супресорної активності або зміна стимуляторного ефекту ConA-індукованих лімфоцитів на супресорний), регуляції активації ПК (нормалізація вмісту CD3–8+ і CD16/56+25+ клітин) та підвищенні ефективності гомеостатичного контролю за Т-цитотоксичними лімфоцитами (нормалізація експресії HLA-DR на CD8+ клітинах і вмісту СD8+25+ лімфоцитів).

Імунізація алогенними лейкоцитами є високоефективним методом імунотерапії звичного невиношування нез’ясованої етіології, який сприяє збереженню вагітності у 90 % жінок. Ефективність та патогенетичність зазначеної імунотерапії засвідчує відсутність фізіологічного відновлення кількості ПК, В-лімфоцитів, CD3+25+, CD4+25+, CD8+25+, CD16/56+25+, CD3–8+ клітин, експресії HLA-DR на CD3+ і CD8+ лімфоцитах, продукції плацентарних протеїнів та супресорної функції лімфоцитів після застосування умовного плацебо в 5-7 тиж. вагітності.

Зниження експресії HLA-DR на CD3+ лімфоцитах і клітинного співвідношення CD4+/CD8+, підвищення вмісту CD3–8+ клітин, підсилення ConA-індукованої супресорної активності або зміна стимуляторного ефекту ConA-індукованих лімфоцитів на супресорний, динамічне зростання концентрації глікоделіну через 2 тижні після імунізації алогенними лейкоцитами порівняно із станом до лікування свідчать про ефективність проведеної імунотерапії і дозволяють очікувати позитивних наслідків вагітності.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Застосування імунізації алогенними лейкоцитами з метою збереження вагітності найбільш доцільно у АФА серонегативних жінок із звичним невиношуванням нез’ясованої етіології, у яких до лікування (в 4-6 та 5-7 тиж.) спостерігається компенсаторне підвищення експресії CD45RA на CD4+ лімфоцитах та зниження кількості ПК, що експресують CD25.

Досягнути високої клінічної ефективності алоімунізації можливо за рахунок проведення лікування в ранні терміни вагітності (5-7 тиж.), використання свіжовиділених клітин для імунізації, застосування донорських лейкоцитів в разі збігу жінки з чоловіком за антигенами гістосумісності.

Для доклінічної оцінки ефективності імунізації алогенними лейкоцитами у вагітних жінок із звичним невиношуванням нез’ясованої етіології є інформативним аналіз змін в експресії HLA-DR на CD3+ лімфоцитах, клітинному співвідношенні CD4+/CD8+, кількості CD3–8+ клітин, ConA-індукованій супресорній активності лімфоцитів та концентрації глікоделіну через 2 тижні після зазначеної імунотерапії порівняно із станом до лікування.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Radysh T.V., Chernyshov V.P. Cell immunotherapy