Національна академія наук україни

інститут проблем кріобіології і кріомедицини

Родіонова Валерія Львівна

УДК 615.361.013.11.014.413

ФЕРМЕНТАТИВНА АКТИВНІСТЬ І МОРФОКІНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ СПЕРМІЇВ ЛЮДИНИ ДО І ПІСЛЯ НИЗЬКОТЕМПЕРАТУРНОГО КОНСЕРВУВАННЯ

14.01.35 - кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук, професор, лауреат Державних премій СРСР та України

Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор ІПКіК НАН України, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріопротекторів, м. Харків

доктор біологічних наук, професор Гладкова Алла Іванівна, Інститут проблем ендокринної патології АМН України, завідувач лабораторією репродуктивної ендокринології, м. Харків

Провідна установа

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра педіатрії, акушерства та гінекології факультету фундаментальної медицини, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “__24__”_____січня____2006 року о__13.30_ годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розіслано “__23_”____грудня____ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чоловіче і жіноче безпліддя - це не тільки надзвичайно важлива медична, але й соціальна проблема. У багатьох країнах світу, у тому числі в Україні, відзначається різке зниження народжуваності [Стешенко В.С., 2003]. Рішення проблеми безплідного шлюбу є важливою складовою національної програми щодо поліпшення демографічної і соціальної ситуації в Україні.

Відомо, що за останні 15-20 років чоловічий фактор в етіології безпліддя підвищився з 17 до 55 % [Joffe V., 1994, Сердюк А.М., 1997].

Для лікування безпліддя розроблені і більш широко застосовуються методи допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), зокрема метод штучної інсемінації спермою чоловіка або донора. Використання у багатьох країнах світу різних технологічних режимів заморожування – відігріву сперміїв, ооцитів і ембріонів розширює можливості ДРТ. Для реалізації раніш розробленого в ІПКіК НАН України методу надшвидкого заморожування сперми людини [Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А., 1998] виготовляються спеціальні алюмінієві контейнери і застосовується складна апаратура, яка забезпечує необхідний режим заморожування. Інші розроблені методи кріоконсервування сперми також реалізуються за допомогою коштовної і складної апаратури. Розробка спрощеної, але не менш ефективної технології кріоконсервування чоловічих гамет, яка не передбачає застосування спеціального устаткування буде сприяти більш широкому використанню методів інсемінації спермою чоловіка або донора в центрах по лікуванню безпліддя.

У вивченні сперми людини досягнуто значних результатів, зокрема у дослідженні гамет та механізмів їхнього ушкодження на різних етапах низькотемпературного консервування (НТК). Однак пошук нових кріозахисних середовищ залишається актуальною проблемою. Зміни значень рН і коливання осмотичного тиску позаклітинних кріозахисних розчинів можуть бути причинами ушкодження клітин на всіх етапах низькотемпературного консервування [Белоус А.М., 1982]. Адекватні кріозахисні середовища і режими заморожування біооб’єктів слід підбирати разом з оптимізацією умов розморожування, необхідних для ефективної репарації нелетальних ушкоджень і капацитації сперміїв, що досягається підбором спеціальних середовищ і умов інкубації у них клітин після відтавання.

Чоловічі статеві клітини - складноорганізована метаболічна “машина”, де ферментативні реакції відіграють важливу роль у реалізації процесу запліднення. За даними літератури, активність акрозину і гіалуронідази в сперміях людини корелює з їх фертильністю [Смаглий Н.Ю., 1988]. Тому оцінка цих ферментів після низькотемпературного консервування є одним з найбільш достовірних прогностичних тестів на функціональну повноцінність деконсервованих сперміїв. Іншим можливим механізмом низькотемпературного ушкодження гамет може бути необоротна денатурація ферментів, які беруть участь у процесі гліколізу та окислювально-відновних реакціях – сукцинатдегідрогенази (СДГ) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ). Існує небагато робіт, де показники активності зазначених ферментів встановлені після заморожування з високими і низькими швидкостями [Goodpasture J.C. et al., 1981, Смаглий Н.Ю., 1988, Дунаєвська А.В, 2001].

Таким чином, активність ферментів у сполученні з морфологічними характеристиками клітин може бути критерієм оцінки морфофункціонального стану статевих клітин до кріоконсервування та ефективності методів низькотемпературного консервування і, зокрема, кріозахисних середовищ, які використовуються при заморожуванні сперми людини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України в рамках теми №2.2.6.96 „Вивчення особливостей дії низьких температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні клітини в залежності від етапу гамето- і ембріогенезу, розробка середовищ збереження, кріоконсервування та репарації нелетальних кріопошкоджень цих біооб’єктів”, № держреєстрації 0100U003480.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - оцінити ступень збереження ферментативної активності та морфокінетичних показників сперми донорів, кріоконсервованої нескладним і ефективним методом, який не потребує спеціального обладнання.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1.Провести порівняльний аналіз впливу різних кріозахисних середовищ на кінетичні параметри, морфологічні характеристики, а також на збереження мембран і конденсацію хроматину в сперміях людини.

2.Визначити вплив складу, рН і осмолярності кріозахисних середовищ на рухливість сперміїв людини.

3.Зробити вимір діелектричної проникності сперми при нормо- та олігозооспермії і еквілібрації з кріозахисним середовищем гліцерин-лактоза-жовток.

4.Розробити доступний, ефективний метод кріоконсервування сперми людини, який не потребує спеціального обладнання.

5.Дослідити морфофункціональні показники сперміїв людини і ферментативну активність в них акрозину, гіалуронідази, сукцинатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази до і після заморожування.

6.Дослідити вплив різних середовищ інкубації сперміїв після розморожування на рухливість чоловічих гамет.

Об’єкт дослідження. Вплив факторів низькотемпературного консервування на морфокінетичні властивості та активність ферментів сперміїв людини.

Предмет дослідження. Спермії і еякулят людини.

Методи дослідження: морфологічні, біохімічні (спектрофотометрія, фотоелектрокалориметрія), біофізичні (рН-метрія, осмометрія, КВЧ-діелектрометрія).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлена активність основних ферментів сперми людини після низькотемпературного консервування під захистом середовища гліцерин-лактоза-жовток з використанням розробленого режиму заморожування. Проведено теоретичне обгрунтування оптимальної швидкості охолодження сперміїв людини на всіх етапах кріоконсервування, яке підтверджено результатами експериментальної роботи. Уперше для підвищення рухливості сперміїв встановлена доцільність додавання адреналіну в середовище їх інкубації до і після розморожування. Уперше визначена діелектрична проникність сперми людини в нормі та при патології сперматогенезу, а також після експозиції з середовищем гліцерин-лактоза-жовток.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено доступний та ефективний метод низькотемпературного консервування сперми людини, який не потребує застосування спеціального обладнання. Створено банк кріоконсервованих доз донорської сперми людини. Деконсервована сперма успішно використується для лікування чоловічого безпліддя на базі деяких клінік ДРТ України.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно отримано експериментальні дані, підготовлено аналітичний огляд літератури за тематикою дисертації. Разом з науковим керівником дисертантом було здійснене обговорення і узагальнення результатів дослідження та сформульовані остаточні висновки. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1,5] у визначенні активності основних ферментів у кріоконсервованих по розробленому методу сперміях людини;

- у роботах [2,7] у вивченні змін концентрації, рухливості, життєздатності, морфологічної цілісності сперміїв людини після заморожування по розробленому методу;

- у роботі [3] у вивченні впливу шкідливих факторів зовнішнього середовища на морфофункціональні властивості сперміїв людини, зокрема у визначенні їх фізико-хімічних властивостей та стану хроматину;

- у роботі [4] у вимірі діелектричної проникності сперміїв людини при патології сперматогенезу та додаванні кріопротектора;

- у роботі [7] в участі у теоретичній та практичній розробці методу кріоконсервування сперми донорів.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень доповідалися на щорічній конференції молодих вчених "Холод в біології і медицині " ІПКіК НАН України разом з міжнародною кафедрою кріобіології під егідою ЮНЕСКО (Харків, 2002 - 2004); на щорічній конференції "Збереження генетичних ресурсів" (Пущіно, 2002); на конференції “Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології” (Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 6 наукових праць, у тому числі 4 статті у спеціалізованих фахових виданнях та 1 патент на винахід.

Структура дисертації. Дисертацію викладено на 129 сторінках друкованого тексту, з яких 111 сторінок основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаної літератури (в кількості 189 джерел на 18 сторінках). Робота ілюстрована 19 рисунками та 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Для виконання роботи було використано 273 зразків еякулятів і спермоплазми 187 чоловіків-донорів і претендентів у донори віком від 20 до 40 років після 3-4 днів статевої абстиненції. Кріоконсервування зразків сперми проводили під захистом середовища гліцерин-лактоза-жовток (ГЛЖ) у полімерних трубочках довжиною 70–80 мм, з зовнішнім діаметром 3,8 мм та товщиною стінок 120 мкм [Осташко Ф.И., 1990], які поміщали в ультратермостат, що потім переносили в холодильник, і на першому етапі охолоджували зі швидкістю1-2°С/мин до температури 8±2°С. Далі зразки переносили до металевого контейнера, який встановлювали на поверхні рідкого азоту і охолоджували зі швидкістю 80°С/мин до температури –70-75°С на протязі 1 хвилини, після чого трубочки занурювали у рідкий азот. Також кріоконсервування проводили з використанням програмного заморожувача УОП2 СКТБ ІПКіК НАНУ за аналогічною програмою.

Кріоконсервовані зразки сперми відігрівали на водяній бані при температурі 37°С протягом 10 секунд.

Дослідження еякулятів проводили відповідно до рекомендацій ВООЗ (2001) за загальноприйнятою методикою. Концентрацію і рухливість сперміїв визначали за допомогою лічильної камери Makler (Ізраїль) і методом комп'ютерного аналізу (CASA). Життєздатність сперміїв визначали за методом суправітального фарбування еозин-нігрозином. Функціональну цілісність цитоплазматичної мембрани визначали за тестом гіпоосмотичного набрякання (HOS-тест), що дозволяє визначити толерантність мембран спермїів до гіпоосмотичного стресу (Jeyendran, 1984). Для морфологічного дослідження сперміїв використовували модифіковану нами методику фарбування мазків, при якій не виникає стиснення клітин [Рубенков А.А., 1959]. Середню кількість дефектів на один спермій з морфологічними порушеннями визначали за допомогою індексу тератозооспермії, що дорівнює відношенню суми кількості всіх дефектів, визначених у 200 сперміях, до відсотка атипічних форм. Стан хроматину сперміїв оцінювали за методом Tejada (1984), тобто коли використовуються метахроматичні властивості акридину оранжевого.

Активність акрозину досліджували за методикою, що грунтується на визначенні кількості казеїна, який нерозщеплений ферментом. Визначення активності гіалуронідази зумовлено здатністю ферменту каталізувати процес гідролітичного розщеплення субстрату до утворення гіалуронової кислоти (ГК). Сукцинатдегідрогеназну активність у сперміях людини досліджували за модифікованою нами методикою, яка базується на вимірі падіння оптичної щільності 2,6–діхлорфеноліндофенола, що відновлюється при окислюванні сукцинату. Визначення глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності проводили за методом [Baquer N.Z., 1967], тобто на реакції відновлення никотинамідаденіндинуклеотидфосфату (НАДФ) у присутності глюкозо-6-фосфата.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Вплив різних факторів зовнішнього середовища на сперматогенез при підборі донорів сперми. Відомо, що початковий стан біооб’єкта значно впливає на результат його кріоконсервування. Різні фізико-хімічні впливи на організм людини зумовлюють збільшення патологічних форм сперміїв, які не елімінуються в процесі сперматогенезу. У зв'язку з цим, було проведено обстеження чоловіків з метою підбору донорів сперми для її використання в репродуктивних технологіях і, зокрема, для кріоконсервування. Були досліджені еякуляти 90 чоловіків, праця яких пов'язана зі шкідливими умовами: 1 - праця зі надвисокочастотним (НВЧ) обладнанням; 2 - робота з комп'ютером більш 6-7 годин на добу; 3 – хімічне виробництво; 4 – мали тривале переохолодження; 5 – зварники; 6 – вантажники; 7 – водії; 8 – спортсмени-борці; у групу 9 (контроль) входили 94 кандидата у донори і донорів сперми, праця яких не була безпосередньо пов'язана зі шкідливими умовами (рис.1). В усіх групах вік чоловіків складав від 20 до 42 років. При оцінці якості еякуляту ми враховували об’єм еякуляту, а також значення рН, час розрідження, концентрацію, рухливість, життєздатність, морфологічні характеристики сперміїв, деконденсацію хроматина в гаметах.

Рис.1. Вплив шкідливих професійних факторів на концентрацію сперміїв, кількість лейкоцитів (а), рухливість, морфологічні характеристики, конденсацію хроматину (б) в сперміях людини.

Встановлено, що рН еякулятів у контролі, а також у групах 2,3,6 7 і 8 коливався лише в невеликих межах і складав 7-7,3. Зниження рН до кислої сторони (6,8) відзначали в пацієнтів груп 1,4,5. В'язкість еякулятів і час їхнього розрідження позитивно корелюють з ростом кількості лейкоцитів у групах 1,3,4,5,6 (рис.1). Виявлено достовірне зменшення концентрації сперміїв у всіх досліджуваних групах стосовно контролю (Р<0,05).

Слід зазначити, що у чоловіків, які працюють із НВЧ обладнанням та комп'ютером (рис.1,а), у залежності від кількості та режиму опромінення знижується утворення повноцінних сперміїв, як і при дії радіаційного низькодозового опромінення [Карпенко Н.А. и др.,2000]. Можливість успішного запліднення у значній мірі корелює з морфологічними характеристиками, концентрацією і рухливістю сперміїв, а саме фракції “а”+“в”. Незважаючи на значні зміни в кінетиці та структурі сперміїв, ми не виявили відхилень у ядерному апараті клітин (рис.1,б), що погодиться з результатами інших дослідників [Tateno H. et al., 1998].

Таким чином, у результаті проведеного дослідження й аналізу даних літератури можна зробити висновок, що чоловіки, які тривалий час працюють з комп’ютером та НВЧ обладнанням, а також професійні водії та спортсмени бойових мистецтв частіше мають порушення сперматогенної функції, що може призвести до безпліддя.

Для оцінки функціонального стану сперміїв був застосований метод коротковисокочастотної діелектрометрії (КВЧ), який інтегрально відображає стан води в біооб’єктах (рис.2).

Рис.2. Показники дійсної ?’ (а) і мнимої ?” (б) частин діелектричної проникності зразків еякулятів людини при нормо- і патоспермії (норм – нормоспермія; астено - астеноспермія; оліго – олігоспермія).

Відомо, що вода відіграє важливу роль на всіх етапах кріоконсервування, особливо в процесі кристалізації клітинної суспензії. Були встановлені розходження діелектричних параметрів (?’ і ?”) у залежності від патології сперматогенезу. Кріозахисне середовище ГЛЖ впливає на стан водного компонента еякуляту, знижуючи кількість вільної води в сперміях, що є позитивним ефектом для кріоконсервування.

Вплив кріозахисних середовищ на кінетичні властивості сперміїв людини. Проведено порівняльне вивчення впливу кріозахисних середовищ (КС) з різними концентраціями кріопротекторів, значенням рН і осмолярності на рухливість сперміїв людини.

Вивчено 7 КС з таким складом:

1)

2)

3)

4)

5)

6)

7)

Загальна концентрація кріопротекторів у багатокомпонентних КС 6 і 7 складала 4,4 М. Вихідна осмолярність досліджуваних КС та концентрація кріопротекторів у суспензії після розведення варіювала в широких межах у залежності від застосованого середовища (табл.1).

Таблиця 1.

Значення рН, осмолярності і кінцевої концентрації кріопротектора в КС

КС | рН КС | Осмолярність КС,

мОсмоль/л | Кінцева концентрація кріопротектора, М

1 | 2 | 3 | 4

1.Безжовткове середовище | 6,2 | 1297 | 0,35

2.Sperm Freeze | 6,8 | - | 0,8

3.ГЛЖ | 6,8 | 1100 | 0,5

Продовження табл. 1

1 | 2 | 3 | 4

4. Glicerol CryoBioSistem | 5,8 | 2567 | 0,65

5.Medi-cult | 6,7 | 3000 | 0,8

6.ЕГ;1,2ПД; ДМФА (глюкоза) | 5,0 | 2920 | 2,2

7.ЕГ;1,2ПД; ДМФА | 5,4 | 3100 | 2,2

Примітки: КС 1-5 - кінцева концентрація гліцерину;

КС 6-7 - кінцева концентрація суміші ЕГ+1,2-ПД+ДМФА.

Експерименти було проведено на 42 еякулятах, отриманих у 34 чоловіків із нормозооспермією. Зразки сперми поділяли на дві частини: першу пробу використовували як контроль, а в другу додавали одне з досліджуваних КС. Після 30 хвилин еквілібрації суспензії клітин із КС найбільша рухливість сперміїв (групи “а”+“в”) спостерігалася в середовищах Sperm Freeze, ГЛЖ і Medi-cult і не відрізнялася від контролю. Контакт же сперміїв із КС 1, 4, призводив до достовірного зменшення рухливості сперміїв у порівнянні з контролем (рис.3).

Рис.3. Вплив КС на рухливість сперміїв людини (n = 42): а – активнорухливі спермії, в - рухливі спермії (1 - безжовткове середовище, 2 - Sperm Freeze, 3 - ГЛЖ, 4 - Glicerol, 5 - Medi-cult, 6,7 - багатокомпонентні середовища).

Під захистом багатокомпонентних КС 6 і 7 спостерігалося достовірне зниження кількості сперміїв групи “а”+“в” (р<0,05) (рис.3). Можливо, що зменшення кількості рухливих сперміїв у цих КС обумовлено низькими значеннями рН середовищ 4, 6 і 7 (рН 5,8, 5,0 і 5,4 відповідно). Слід зазначити, що до складу КС 6 і 7 не включені мембранно-стабілізуючі добавки (жовток або білки), що може впливати на зниження активності сперміїв у відповідних середовищах, і кінцева концентрація цих кріопротекторів в зразках мабуть завелика, що виявляється в їх цитотоксичності. Таким чином, на підставі отриманих результатів для заморожування сперми людини КС 6 і 7 не використовували.

У наступній серії експериментів ми вивчили вплив температури і тривалості експозиції сперміїв у ГЛЖ на концентрацію і рухливість чоловічих гамет при його додаванні до еякуляту. У результаті досліджень встановлено, що після додавання КС до еякуляту при всіх використаних температурах концентрація сперміїв істотно не змінювалась. У той же час вміст активнорухливих і рухливих сперміїв вірогідно підвищувався по мірі зниження температури експозиції сперміїв у КС від 37 до 40С (табл.2).

Таблиця 2.

Вплив температури ГЛЖ на концентрацію і рухливість сперміїв

(M±m) (n=17)

Темпе

ратура

ГЛЖ, ?С | Концентрація сперміїв, млн/мл | Активнорухлива

фракція, % | Рухлива

фракція, %

Час переживаємості, хвилини

15 | 30 | 60 | 15 | 30 | 60 | 15 | 30 | 60

37 | 45±3,2 | 44±3,7 | 43±3,8 | 15±1,2 | 13±1,2 | 10±0,6 | 35±2,7 | 30±2,4 | 20±1,8

22 | 43±3,7 | 42±3,6 | 44±3,7 | 18±1,4 | 17±1,5 | 12±0,8 | 37±3,0 | 30±2,7 | 18±1,5

4 | 47±3,4 | 46±3,2 | 45±3,5 | 26±0,4* | 27±0,5* | 18±1,2** | 52±2,5* | 57±2,7* | 35±1,9**

Примітки: * - розходження достовірні стосовно часу еквілібрації;

** - розходження достовірні стосовно температури еквілібрації

Отримані дані свідчать про те, що кращі показники рухливості зберігалися при тривалості експозиції сперміїв у КС, яка не перевищує 30 хвилин.

Тривалість експозиції клітин з КС може призвести до ушкоджень за рахунок цитотоксичности кріопротектора, але підвищення його внутрішньоклітинної концентрації, у свою чергу, знижує ушкодження шляхами, так званого, ефекту розбавлення та зменшення імовірності кристалоутворення в цитоплазмі через збільшення ії в'язкості.

Розробка методу кріоконсервування сперми донорів. метою наступної серії експериментів була розробка доступного та ефективного методу заморожування сперміїв донорів, який не потребує спеціального обладнання. За основу для розробки спрощеного методу низькотемпературного збереження сперми людини була взята технологія кріоконсервування сперми биків [Осташко Ф.И.,1990]. При розробці режиму заморожування для сперми людини ми враховували експериментальні дані про вплив швидкості охолодження на етапі від початку охолодження до низьких позитивних температур. Швидкість охолодження на цьому етапі була повільною і складала не більш 1-20С/хв. Далі була визначена гранична температура при заданій швидкості, охолодження нижче якої викликало ушкодження сперміїв за рахунок температурного шоку. Пул еякулятів поділяли на 5 зразків і додавали ГЛЖ (1:1). Після охолодження зразків до заданої температури (2, 4, 6, 8, 10, 12°С) та їх еквілібрації при 37°С підраховували рухливу фракцію сперміїв (групи “а”+“в”).

Таблиця 3.

Вплив граничної температури охолодження на рухливість сперміїв

(M±m) (n=27)

Температура охолодження зразків, С | 2 | 4 | 6 | 8 | 10

Рухливість сперміїв групи “а”+“в”, % | 20±2,1* | 22±2,1* | 52±2,7 | 58±5,1 | 56±5,4

Примітка: * - достовірна зміна (р<0,05).

Встановлено, що кількість рухливих клітин була достовірно вища після збереження при температурі 6, 8, 10 С (табл.3). По отриманим даним на першому етапі охолодження і гіпотермічного збереження ми обрали температуру 8±2С, при якій показники збереження рухливої фракції сперміїв були найбільш високими.

Оптимальну швидкість охолодження сперми людини на етапі від початку кристалізації в позаклітинному розчині до його евтектичної області ми оцінили теоретично. Відповідно до двухфакторної теорії кріопошкодження оптимальною вважається швидкість охолодження, при якій переохолодження цитоплазми та імовірність внутрішньоклітинної кристалізації зменшуються практично до нуля і, у той же час, тривалість контакту клітин з висококонцентрованим розчином, що утвориться у результаті виморожування води в клітинній суспензії, є мінімальною. Аналітично цю умову можна представити у вигляді:

Tопт ~ ? T/? ?0 LP000о exp U ?T/ RT0 Т эвт ,

де Tопт - оптимальне значення швидкості охолодження на етапі кристалізації клітинної суспензії, ? T - різниця між температурою початку кристалізації в клітинної суспензії Т0 і евтектичною температурою Тэвт, тобто температурою повного затвердіння зразка, ? – поверхово об’ємне відношення клітини, ?0 - осмотичний тиск фізіологічного розчину, LP000о – коефіцієнт фільтрації клітинної мембрани при температурі Т0, R - універсальна газова константа, U - енергія активації процесу переносу молекул води через клітинну мембрану.

З урахуванням того, що одним з основних компонентів КС є ГЛ, при оцінці значення оптимальної швидкості охолодження на етапі кристалізації вважаємо Т0 ?-5 ?С, Тэвт = - 45 ?С, Т=40 ?С. Коефіцієнт фільтрації мембрани сперміїв людини при температурі 20?С складає ?1,3·10-13 м3/Нс, а поверхово об'ємне відношення спермія людини ? 0,33·106 м-1. Враховуючи, що ?0~105 Н/м2, R=8,31 Дж/моль·К і U?20кДж/моль, одержуємо Tоп ? 80 ?С/хв.

На підставі проведеної теоретичної оцінки охолодження сперми в області температур від 8-90С до –700С ми здійснювали зі швидкістю 800С/ хв, а потім занурювали зразки безпосередньо в рідкий азот. Експериментальна перевірка підтвердила теоретичний прогноз.

Морфофункціональні властивості кріоконсервованих сперміїв людини. Для оцінки кріоконсервованих по розробленому нами методу сперміїв донорів була розширена методика контролю якості. Показано, що до і після заморожування сперміїв людини в присутності середовищ ГЛЖ і Medi-cult не виявлено дійсних порушень тесту на життєздатність і гіпоосмотичного набрякання та конденсації хроматину. Але кількість морфологічно непошкоджених клітин достовірно зменшилась (табл.4).

Таблиця 4.

Морфофункціональні показники кріоконсервованої сперми людини (M ± m)

Характеристики

сперміїв | n | Зразки

після эквілібрації | після заморожування

с ГЛЖ | с Medi-cult | с ГЛЖ | с Medi-cult

Концентрація сперміїв,

х 106 /мл | 14 | 39,6±2,41 | 38,4±2,61 | 35,7±2,71 | 34,9±2,61

група “а”+“в”, % |

14 | 68,4±4,0 | 67,5±5,0 | 63,6±3,8 | 61,8±4,0

НОS-тест, % |

14 | 65,5±5,0 | 65,2±6,0 | 61,8±6,0 | 62,5±1,5

Спермії з конденсованим хроматином, % | 28 | 70,5 ± 6,3 | 70,3 ± 6,9 | 69,6 ± 6,3 | 68,5 ±5,8

Кількість морфологічно неушкоджених сперміїв. | 14 | 54,4±5,4 | 53,1±5,3 | 34,5±3,2* | 34,2±3,1*

Примітка: * - достовірна зміна між досліджуваними групами (р<0,05).

При дослідженні ферментативної активності сперміїв людини на етапах НТК було зроблено висновок, що активність акрозину (рис.4,а), одного з основних ферментів у заплідненні, та активність СДГ (рис.4,б) і Г6ФДГ (рис.4,в), які беруть участь у процесах метаболізму, знаходяться на рівні показників у зразках після дії ГЛЖ і кріоконсервування.

Рис. 4. Вплив кріоконсервування на активність акрозину (а), СДГактивність (б) і Г6ФДГ активність(в), вміст ГК (г) в сперміях донорів (1 – нативні спермії; 2 – спермії після експозиції з ГЛЖ; 3 – кріоконсервовані спермії).

При оцінці гіалуронідазної активності було виявлено достовірне зниження кількості ГК після низькотемпературного консервування (рис.4,г). Можливо, це зв'язано з наявністю мікроушкоджень акросомальної мембрани гамет, особливо зовнішньої, на внутрішній стороні якої розташована гіалуронідаза і де, очевидно, найчастіше виникають ушкодження на етапах низькотемпературного консервування. У цьому випадку можуть знижуватися протеолітичні властивості розморожених сперміїв і їхня проникаюча здатність через клітини кумулюса.

Вплив середовищ інкубації на морфокінетичні показники сперміїв. Відомо, що етап відігрівання і створення умов для відновлення після НТК функціональних властивостей біооб’єктів не менш важливий, ніж етап заморожування. У наших подальших експериментах проведено порівняльне вивчення ряду середовищ для підвищення рухливості сперміїв після кріоконсервування по розробленому нами методу (рис.5).

Рис.5.Вплив середовищ відігрівання на рухливість сперміїв людини: а – до кріоконсервування, б – після кріоконсервування.

Після відігрівання до зразків сперми додавали по 5 мл розчину Хенкса (РХ), центрифугували, відбирали супернатант і на осад нашаровували по 0,5-0,7 мл одне з середовищ інкубації:

1)РХ + 2,5 % глюкози;

2)РХ+ 2,4 мкМ цитохрому С;

3)РХ + 3,5 мМ прогестерону;

4)РХ (контроль);

5)РХ+ 15 % сироватки АВ (IV);

6) середовище Menezo B2;

7)РХ + 3,5 мМ пентоксифілину;

8)РХ + 1мМ адреналіну.

Зразки для інкубації поміщали в термостат (37°С) на 40-60 хвилин.

Найбільш високі показники рухливості чоловічих гамет були отримані в середовищах 5, 6, 7 і 8 до- і після заморожування.

При додаванні в зразки адреналіну після НТК рухливість сперміїв групи ”а”+”в” через 15-20 хвилин зростала на 10-15 % стосовно контролю (рис.5,б) у той час, як додавання пентоксифілину збільшувало рухливість через 40-50 хвилин. Цей час необхідно враховувати при підготовці матеріалу до штучної інсемінації.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми, що стосується поліпшення методу кріоконсервування сперми донорів шляхом розробки нескладної та ефективної технології Ії заморожування, яка не потребує спеціального обладнання.

2. Визначення морфокінетичних властивостей та оцінка ферментативної активності сперміїв людини дозволили комплексно оцінити ефективність розробленого методу кріоконсервування чоловічих гамет.

3. Найменшу цитотоксичність стосовно сперміїв людини серед досліджених мають середовища гліцерин-лактоза-жовток і Medi-Cult.

4. Використання середовища гліцерин-лактоза-жовток в нашій модифікації дозволило в 2 рази знизити концентрацію гліцерину в кріоконсерванті і скоротити час еквілібрації з кріозахисним середовищем при кімнатній температурі.

5. Кріоконсервування сперми людини під захистом середовища гліцерин-лактоза-жовток дозволяє зберегти морфофункціональні властивості гамет на рівні зразків, заморожених із фірмовим середовищем Medi-Cult.

6. Активність ферментів акрозину, сукцинатдегідрогенази і глюкоза-6-фосфатдегідрогенази в кріоконсервованій спермі по розробленому нами методу кріоконсервування сперми донора зберігається на рівні активності досліджуваних ферментів у нативних зразках.

7. Використання у складі середовища інкубації 1мМ адреналіну дозволяє підвищити вміст активнорухливої фракції на 15-20 % після кріоконсервування.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Дунаевская А.В., Чуб Н.Н., Крамар М.И., Родионова В.Л. Активность акрозина в криоконсервированных спермиях человека // Пробл. криобиологии. – 2003. - № 1. – С. .

2. Чуб Н.Н., Родионова В.Л., Крамар М.И. Оптимизация этапа отогрева криоконсервированной спермы человека // Актуальные пробл. медицины и биологии. – 2004. - № 1. – С. 89-92.

3. Чуб Н.Н., Крамар М.И., Юрченко Г.Г., Родионова В.Л. Влияние вредных условий производства на сперматогенез // Экология и здоровье человека. – 2004. – Т. 1. – С. 410-412.

4. Родионова В.Л., Чуб Н.Н., Щеголева Т.Ю., Тодоров П. Диэлектрическая проницаемость эякулятов человека при нормо- и патоспермии после взаимодействия с криозащитной средой // Пробл. криобиологии. – 2004. - № 3. – С. 45-47.

5. Родионова В.Л., Никитченко Ю.В., Чуб Н.Н., Черепанов В.В. Сукцинатдегидрогеназная и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная активности спермы человека на этапах низкотемпературного консервирования // Пробл. криобиологии. – 2005. - № . – С. 207-211.

6. Родионова В.Л. Искусственная инсеминация криоконсервированной спермой донора // Матер. наук.-практ. конф. “Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології”: Тези доповідей. - Харків, 2005. – С.173.

7. Пат.№70803А Україна, МПК А01N1/00. Спосіб низькотемпературного консервування сперми донорів / В.І. Грищенко, Н.Н.Чуб, М.І.Крамар, В.Л. Родіонова. (ІПКіК НАН України) №20031212833; Заявлено 29.12.2003; Опубл.15.10.2004, Бюл.№10. – С. 3.15.

АНОТАЦІЇ

Родіонова В.Л. Ферментативна активність і морфокінетичні властивості сперміїв людини до і після низькотемпературного консервування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2005.

Дисертацію присвячено вивченню впливу факторів низькотемпературного консервування на ферментативну активність і морфокінетичні властивості сперміїв людини з розробкою доступного, не потребуючого спеціального обладнання метода кріоконсервування чоловічих гамет. Отримані в роботі результати дозволяють зробити наступний висновок: після кріоконсервування за допомогою нескладної технології активність основних ферментів і морфокінетичні властивості сперміїв людини не знижуються в порівнянні з нативними зразками, що свідчить про ефективність розробленого метода.

Використання у складі середовища інкубації адреналіну у кінцевій концентрації 1мМ дозволяє підвищити вміст активнорухливої фракції на 15- 20 %.

Ключові слова: кріоконсервування, кріозахисне середовище, сперма людини, акрозин, гіалуронідаза, сукцинатдегідрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа.

Родионова В.Л. Ферментативная активность и морфокинетические свойства спермиев человека до и после криоконсервирования. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков 2005.

Диссертация посвящена изучению влияния факторов низкотемпературного консервирования на ферментативную активность и морфокинетические свойства спермиев человека при разработке доступного, не требующего специального оборудования метода криоконсервирования мужских гамет.

Показано, что наименьшей цитотоксичностью по отношению к спермиям человека среди изученных сред обладают среда глицерин-лактоза–желток и коммерческая среда Medi-Cult. Предложенная модификация способа приготовления и добавления среды глицерин-лактоза–желток позволила в 2 раза снизить концентрацию глицерина в образце и сократить время эквилибрации с криозащитной средой при комнатной температуре. Лучшие показатели подвижности сохранялись при продолжительности экспозиции спермиев в криозащитной среде, не более 30 мин.

Определено значение предельной температуры для первого этапа (охлаждение и гипотермическое хранение), охлаждение ниже которой приводит к повреждению спермиев за счет температурного шока. На основе полученных данных, нами выбрана температура 9±1С, при которой показатели сохранности подвижной фракции спермиев были наиболее высокими. Теоретически обоснована и подтверждена экспериментально оптимальная скорость охлаждения спермы человека на втором этапе, от начала кристаллизации во внеклеточном растворе до его эвтектической области. На основании проведенной теоретической оценки охлаждение спермы в области температур от 8-90С до –700С мы осуществляли со скоростью около 800С/ мин, а затем погружали образцы непосредственно в жидкий азот.

В результате сравнительного изучения степени сохранности морфокинетических свойств спермиев, криоконсервированных по разработанному нами методу и с помощью программного замораживателя УОП-2 с аналогичными программами замораживания, достоверных различий обнаружено не было.

С помощью визуального наблюдения и компьютерного анализа установлено достоверное увеличение активно-подвижной фракции через 60 минут после размораживания. Можно предположить, что восстановление подвижности спермиев группы „а” происходит за счет увеличения подвижности спермиев группы „в”. На основании полученных результатов можно рекомендовать для практической репродуктивной медицины использовать криоконсервированную сперму не ранее, чем через 40-60 минут после размораживания.

Криоконсервирование спермы человека по разработанному методу под защитой среды глицерин-лактоза–желток позволяет сохранить морфофункциональные свойства гамет на уровне образцов, замороженных на фирменной криозащитной среде Medi-Cult. Активность ферментов акрозина, сукцинатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в образцах, криоконсервированных по разработанному нами методу криоконсервирования спермы донора, сохраняется на уровне активности исследуемых ферментов в нативных образцах.

Использование в составе среды инкубации адреналина в конечной концентрации 1мМ позволяет повысить содержание активно-подвижной фракции на 15-20 %.

Ключевые слова: криоконсервирование, криозащитная среда, сперма человека, акрозин, гиалуронидаза, сукцинатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Rodionova V.L. Enzymatic activity and morphokinetic properties of human sperm before and after cryopreservation. - Manuscript.

Thesis for obtaining the degree of candidate of medicine sciences on the specialty 14.01.35 – cryomedicine. – Institut for problems of cryobiology and cryomedicine of the National academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2005.

The thesis is devoted to the study of low-temperature preservation influence on enzymatic activity and morphokinetic properties of human sperm when developing a simple method of donor sperm cryopreservation that doesn't demand any special equipment. The obtained results allow us to make the following decision that enzymatic activity and morphokinetic properties of human sperm after cryopreservation with the help of the simple technology remain at the level of native samples.

It suggests the effectiveness of the developed method. Addition to a washing medium of adrenalin in the final concentration 1µM allows to increase the motile fraction by 15-20 %.

Key words: cryopreservation, cryoprotective medium, human sperm, acrosin, gialuronidase, succinatdehydrogenase, glucose-6-phosphatdehydrogenase.

Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук

Підписано до друку 12.12.2005 р. Формат 60х84 1/16

Наклад 100 прим. Умов. друк.арк. 0,9. Друк на ризографі.

ПП Степанов В.В. м. Харків, вул.. Ак. Павлова, 311