НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

СТЕПАНЮК АНДРІЙ РУСЛАНОВИЧ

УДК 577.352:616-006.6

МЕХАНІЗМИ, ЩО ВИЗНАЧАЮТЬ КІНЕТИКУ СПАДУ ГАЛЬМІВНИХ СИНАПТИЧНИХ СТРУМІВ В КУЛЬТУРІ НЕЙРОНІВ ГІПОКАМПУ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Веселовський Миколай Сергійович,

зав. відділом нейрональних мереж Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

доктор фізико-математичних наук

Тесленко Віктор Іванович,

Інститут теоретичної фізики ім.. М.М.Боголюбова НАН України, відділ квантової теорії молекул та кристалів, провідний науковий співробітник.

Провідна установа: кафедра біофізики Київського Національного університету імені Тараса Шевченка.

Захист дисертації відбудеться “ 11 квітня 2006 року о “ 14 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “ 10 березня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. ГАМК-ергічні інтернейрони, головні елементи, що забезпечують швидке гальмування, регулюють ефективність передачі сигналів (Bernard et al., 2000b; Cossart et al., 2001a), рівень і синхронність збудження нейронної мережі (Semyanov et al., 2004), приймають участь у регулюванні сну, пам'яті, кодуванні сенсорних образів (Chan and Yeh, 2003; Cobb et al., 1995; Rossі and Hamann, 1998), впливають на пластичні зміни синаптичних зв'язків, що залежать від активності (Garaschuk et al., 1998). Однак, у той час як механізми, що регулюють ефективність і кінетичні властивості глутаматергічної передачі, добре вивчені, у випадку ГАМК-ергічного гальмування багато принципових питань вимагають подальшого прояснення.

Відомі дві форми гальмування : тонічне та фазне. Фазне гальмування розвивається у відповідь на поодинокий потенціал дії в пресинаптичному нейроні в характерному часовому інтервалі 20-200 мсек. Ця форма гальмування надзвичайно важлива для кодування, що спираєтся на розташуванні сигналів у часі, наприклад синхронізації активності нейронної мережі гіппокампа (Cobb et al., 1995;Cragg and Rіce, 2004). Показано, наприклад, що частота синхронних гаммаосциляцій значною мірою визначається кінетикою гальмівної передачі (Traub et al., 2004). Тому механізми, що регулюють цю кінетику, надзвичайно важливі.

Друга, тонічна форма гальмування, розвивається в часових діапазонах від хвилин до годин і мало залежить від рівня активності інтернейронів (Hamann et al., 2002; Nusser and Mody, 2002; Overstreet and Westbrook, 2001; Stell and Mody, 2002). Гальмівні процеси, що регулюють рівень активності нейронної мережі в масштабі часу від сотень мілісекунд до декількох секунд, характерному для багатьох важливих фізіологічних процесів у ЦНС, не були відомі. Нещодавно описано різновид повільних гальмових струмів, що розвивається в ГАМК-ергічних нейронах у відповідь на серії потенціалів дії (Belan et al., 2001; Jensen et al., 2000a; Jensen et al., 2000b; Kіrіschuk and Grantyn, 2003; Lu and Trussell, 2000). Приймаючи до уваги, що ця форма гальмування (1) у кілька разів більш значима, ніж фазне гальмування (Belan et al., 2001), (2) може викликатися високочастотними групами з 3-10 потенціалів дії, що розповсюджені іn vіvo у ГАМК-ергічних нейронах (Ben-Arі et al., 1989a) , (3) як було нещодавно виявлено, її експресія залежить від типу інтернейрона і стадії розвитку нейронної мережі (Belan et al., 2001; Jensen et al., 2000a; Sіpіla et al., 2004), було б украй важливо краще зрозуміти механізми, що лежать в основі цієї форми гальмування і її фізіологічне значення.

Мета дослідження. Мета даної роботи полягала в виявленні біофізичних процессів, що визначають кінетику спаду гальмівних постсинаптичних струмів, що викликаються поодинокими потенціалами дії та короткими серіями потенціалів дії у пресинаптичному нейроні

Завдання дослідження.

1) Довести, що кінетики спаду мГПСС та поодиноких викликаних в тих же синапсах ГПСС відрізняються статистично достовірно.

2) Дослідити можливість використовувати метод оцінки частоти виділення квантів медіатора і середньої амплітуди квантів синаптичного струму за аналізом моментів розподілу флуктуацій синаптичного струму у випадку ГАМКергічних синапсів культури нейронів гіпокампу.

3) Дослідити можливість використовувати маргінальний розподіл флуктуацій синаптичного струму для оцінки частоти виділення квантів медіатора і середньої амплітуди квантів струму.

4) За допомогою аналізу флуктуацій струму оцінити вплив асинхронного виділення квантів медіатора на кінетичні властивості поодиноких ГПСС.

5) За допомогою аналізу флуктуацій синаптичних струмів оцінити частоту асинхронних квантів на спаді довготривалих ГПСС, викликаних серією потенціалів дії, оцінити можливі зміни розподілу їхніх амплітуд і кінетик і, таким чином, перевірити припущення, що асинхронне виділення медіатора є єдиним механізмом, що забезпечує збільшення ефективності гальмування в довготривалих ГПСС, викликаних серією потенціалів дії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано збільшення ефективності гальмівної синаптичної передачі при стимуляції серією потенціалів дії в культурі нейронів гіппокампу. В умовах культури виявлена розбіжність кінетик спаду вГПСС і мГПСС. Вперше показано, що асинхронним виділенням медіатора неможливо пояснити уповільнення спаду поодиноких ГПСС і що в довготривалих ГПСС варто припускати істотну зміну форми розподілу амплітуд та/чи кинетик асинхронних ГПСС.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають теоретичну цінність, роблять внесок у розвиток уявлень про закономірності, що лежать в основі процесів збудження і гальмування в центральній нервовій системі. Отримані результати можуть бути використані при подальшому вивченні механізмів, що регулюють ефективність і кінетику як гальмівної, так і збуджуючої синаптичної передачі, поліпшують розуміння можливих компенсаторних і паталогічних змін при різних патологічних процесах.

Особистий внесок здобувача.

Здобувачем виконані майже всі електрофізіологічні експерименти та обробка їх результатів. Частину використаних електрофізіологічних даних було отримано Чвановим М. і Марковою О. Здобувач брав активну участь в обговоренні результатів дослідів і формулюванні висновків. Ведення культури нейронів гіппокампа здійснювалося співробітниками Інституту Фізіології ім. О.О.Богомольця Півневою Т., Лушниковою І., Цугоркою Т., Дребот Ю., Марковою О.

При обробці результатів експериментів використовувалося програмне забезпечення, створене Бойчуком Я

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на літній школі "Фармакологія синаптичної передачі в нервовій системі ", Київ 2002, а також на конференціях Socіety of Neuroscіence, Сан-Дієго 2001, Орландо 2002, Сан-Дієго 2004.

Публікації. Результати роботи приведені в трьох наукових статтях і тезах конференцій Socіety for Neuroscіence 2001, 2002, 2004.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел з 171 найменувань. Робота викладена на 118 сторінках та містить 30 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Культура клітин. Гіппокамп новонароджених щурів було ферментативно діссоційовано з використанням пронази E у концентрації 0.05% (Melnіck et al., 1999). Суспензія клітин з початковою щільністю 3-5 x 105 клітин на см2 було нанесено на скекльця для культивування, лолередньо покриті ламініном і полі-L-орнітином. Культуральне середовище складалося з MEM (mіnіmal essentіal medіum), 0.6 % глюкози, 1 мМ аміду альфа-аміноглутарової кислоти, 26 мМ NaHCO3, 10 мкг/моль інсуліну і 10%-ої сироватки коня. Усі культури використовувалося для експериментів після 14 днів інкубування (14-19 днів у більшості експериментів).

Електрофізіологічні реєстрації. Нейрони, що зростають у культурі, спостерігалися в 40X об'єктив інвертованого мікроскопа (Axіovert, Zeіss, Німеччина). Струми від одного чи двох нейронів досліджувалося методом “петч-клемп” у конфігурації “цілої клітини” за допомогою підсилювачів EPC-7 (HEKA, Німеччина) і RK-400 (BіoLogіc, Франція). В експериментах з двома клітинами пресинаптичні нейрони, що підтримувалися при потенціалі на мембрані -60 мВ, стимулювалися з частотою 0.1-0.2 Гц 1-10 сходинками напруги тривалістю 1мс і амплітудою +50 мВ. У частині експериментів пресинаптичні нейрони стимулювалися позаклітинно, мікроелектродом, що був розташований біля соми пресинаптичного нейрона, з використанням ізолюючого стимулятора (ІSO-Flex, A.M.P.І., Ізраїль). Стимулюючий електрод був заповнений позаклітинним розчином без блокаторів глутаматних іонотропніх рецепторів і глюкози. Імпульси напруги тривалістю 0.5-1 мс з амплітудами, необхідними для виникнення потенціалу дії в пресинаптичних нейронах (звичайно 20-40 мВ), прикладалися з частотою 0.1-0.2 Гц. Постсинаптичні нейрони підтримувалися при потенціалі на мембрані -60 мВ чи -0 мВ. Мікроелектроди при заповненні внутрішньоклітинним розчином мали опір 3-5 МОм.

Внутрішньоклітинний розчин містив (у мМ): Cs gluconate 100, CsCl 30, MgCl2 4, Na2ATP 4, EGTA 10, HEPES 10; pH 7.3-7.4, осмотичний тиск 270-280 мОсм. У частині експериментів для поліпшення фіксації потенціалу у внутрішньоклітинний розчин додавався блокатор натрієвих каналів QX-314. Позаклітинний розчин містив (у мМ): NaCl 140, KCl 4, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, глюкоза 10, DL-AP5 0.05, CNQX 0.01; pH 7.3-7.4, осмотичний тиск 290-300 мOсм. Для цієї пари внутрішньо/позаклітинних розчинів потенціал реверсії струмів ГАМКа каналів був біля -30мВ. Мініатюрні гальмівні постсинаптичні струми реєструвалися в присутності 1 мкМ тетродотоксину (TTX).

Блокатори глутаматних рецепторів були придбані у Tocrіs, Великобританія; TTX і QX 314 - у Alamone Lab, Ізраїль; всі інші хімічні речовини були придбані у Sіgma, Німеччина. Всі експерименти проводилися при кімнатній температурі (20-250 C).

Опір доступу 7-20 МОм компенсувався на 50-70 %. Некомпенсований опір доступу у всіх представлених експериментах (звичайно 5-7 МОм) був завжди меншим 10 МОм. На додаток до апаратної компенсації опору доступу обчислювальна процедура, що призводить до практично повної компенсації цього опору, була застосована до більшості реєстрацій синаптичних струмів. Якщо знехтувати проблемами просторової фіксації потенціалу, для досить повільних синаптических струмів з потенціалом реверсії при опорі доступу електрода , і потенціалі, підтримуваному на мембрані , струм , що протікає через вимірювальний електрод буде зв'язаний зі струмом , обмірюваним в експерименті співвідношенням : . Опір доступу оцінювався або за допомогою схеми компенсації опору доступу підсилювача, або як відношення амплітуди ємнісних струмів, що викликалися у постсинаптичній клітині перед реєстрацією синаптичних струмів сходинкою потенціалу 1мВ, до висоти цієї сходинки потенціалу.

Залежність струму від напруги вимірювалася для кожного постсинаптичного нейрону. При реєстрації струмів використовувався фільтр низьких частот із граничною частотою 3 кГц. Реєстровані струми оцифровувалися з частотою 10 чи 20 кГц.

Щоб порівняти кінетики спаду, набори викликаних і мініатюрних ГПСС були нормовані до одиничноі амлітуди і набори площ під отриманими кривими порівнювалися за допомогою непарного t-тесту.

Аналіз флуктуацій синаптичного струму методом моментів. Щоб оцінити можливі значення частоти виділення квантів медіатору і середньої амплітуди квантів струму в ході фази спаду викликаних ГПСС, ми застосували метод, нещодавно запропонований (Sakaba et al., 2002) для дослідження синаптичної передачі в Calyx of Held. Ми розробили модифікацію цього методу, що може використовуватися для досліджень синаптичної передачі в ГАМК-ергічних гіпокампальних синапсах. Основне доповнення до попереднього методу, це можливість оцінювати частоти виділення квантів медіатору, що швидко змінюються.

Коротко, метод полягає у оцінці частоти виділення квантів медіатору та середнього розміру квантових струмів шляхом аналізу кумулянтів розподілу флуктуацій реєстрацій синаптичних струмів. Завдяки тому, що викликаний струм складається з набору одноквантових подій, вони, разом з ГАМКа каналами й шумом устаткування, повинні вносити вклад у шум струму. Можна показати, що за умови, коли інші джерела шуму усунуті (наприклад, належною фільтрацією) кумулянти (коефіцієнти розкладання в ряд Маклорена логарифма від перетворення Фур'є функції щільності імовірності, як то середнє, дисперсія, і т.п.) шумового сигналу, що генерується потоком випадково виникаючих квантів струму, пропорційні частоті квантових подій і інтегралу від n-го ступеня середнього квантового струму за часом. Відповідно до узагальненої теореми Кембела:

(2.1)

Де це -ий кумулянт розподілу імовірностей фільтрованого синаптичного струму, а -середнє від -ого ступеня фільтрованого квантового струму.

Після усереднення по вікну тривалістю маємо:

(2.2)

(2.3)

Отже, якщо квант струму має постійну кінетику і квазістаціонарний розподіл амплітуд:

(2.4)

(2.5)

де - фільтрований квантовий струм нормований до одиничної амплітуди, - перетворення Фур'є, - середнє від -ого ступеня амплітуди кванта струму.

Далі ми скористаємося припущенням, зробленим в роботі (Neher et al., 2001), що співвідношення:

(2.6)

де , , і - значення математичного очікування для відповідних ступенів розподілу амплітуд квантових струмів, повинне зберігатися в процесі розвитку синаптичного струму. Тоді:

(2.7)

(2.8)

У випадку, коли і квазістаціонарне, обчислення спрощуються і призводять до співвідношень, наведенних у роботі (Sakaba et al., 2002) :

(2.9)

де , - дисперсія і нахил розподілу значень струму на його фільтрованих реєстраціях;,- позначають інтеграли від 2-ого і 3-ого ступенів нормалізованих, фільтрованих середніх квантових струмів.

Було показано (Sakaba et al., 2002), що точність цієї оцінки дисперсії зворотньо пропорційна квадратному кореню з числа незалежних квантових струмів, що можуть бути отримані в плині інтервалу спостереження. Щоб збільшити точність експериментів, ми повторювали даний протокол реєстрації струмів 40-100 разів і усереднювали дисперсію струмів у даному вікні по всіх реєстраціях.

Фільтрація низьких частот здійснювалася з метою усунути низькочастотні артефакти і нестаціонарності в струмах. Останнє також дозволяло зменшити інтервал вибірки. Фільтрація була виконана шляхом диференціювання, як описано раніше (Stepanyuk et al., 2004), підпрограмою, вбудованою в програму AnDatRa (створену Я. Бойчуком).

Щоб зменшити вплив шуму іонних каналів і високочастотних шумів процесу реєстрації, виконувалася фільтрація високих частот. Для цієї мети використовувалося усереднення в рухливому вікні тривалістю 0.8 - 2.0 мсек.

Метод оцінки властивостей квантів синаптичного струму за маргінальним розподілом флуктуацій синаптичного струму (ММР). Метод аналізу моментів флуктуацій синаптичних струмів (ММ), що описаний вище, має цілий ряд недоліків. При деяких морфологиях синаптичного з’єднання ММ може практично повністю не детектувати істотні (більш ніж в 2 рази) зміни в середніх амплітудах квантових струмів, пов'язані з їхньою взаємодією на дендритах.

Тому нами був разроблений новий статистичний метод аналізу синаптичних струмів за його повним розподілом (метод маргінального розподілу (ММР)) (Білан та ін. 2004) .

Цей метод заснований на тім, що процес спонтанного виділення медіатора можна дуже точно охарактеризувати всього декількома параметрами (7 у нашій моделі). Форма квантових струмів добре апроксимується сумою 2-3-х експоненційних функцій а розподіл їхніх амплітуд - сумішшю трьох гауссовських розподілів. Розподіл шуму також залежить від частоти виділення квантів. Далі по цьому наборі параметрів можна оцінити імовірність зареєструвати аналізований струм (особливо легко це зробити, якщо знехтувати корелляциями в ньому). Набори параметрів, для яких ця ймовірність істотно відрізняється від нуля, звичайно лежать у дуже вузькому діапазоні (крім часу спаду кванта струму). У результаті виявилося можливим оцінити частоту виділення квантів медіатора й амплітуду квантів струму й трохи менш точно - форму розподілу їхніх амплітуд (остання оцінка ґрунтується на припущенні, що час наростания кванта струму суттєво менше характерного часу використовуваної нами процедури фільтрації високих частот, що справедливо для мГПСС).

Оцінка ймовірності зареєструвати аналізований струм ґрунтувалася на чисельному оцінюванні маргінального розподілу шуму (ММР, метод маргінального розподілу), тобто розподілу ймовірності зареєструвати набір значень струму , у зневазі всіма кореляціями між значеннями струму в різні моменти часу, тобто в припущенні про незалежність (яка досягається наприклад для великих інтервалів між моментами реєстрацій струму). Використовуваний нами варіант цього методу є узагальненням ММ запропонованого в роботі Sakaba і разом з тим байесовским методом для великих інтервалів.

Перший етап методу МР аналогічний першому етапу ММ, тобто здійснюється фільтрація вихідних реєстрацій синаптичних струмів. Як фільтр ми використали згладжування реєстрацій шляхом усереднення в певнім вікні й наступне дифферинціювання. Оскільки це перетворення лінійно, отримані вибірки також можна вважати породженими процесом дробового шуму (але з іншим набором параметрів).

Далі, нехай - вибірка значень струму, отримана із дробового шуму, із щільністю ймовірності для окремих елементів вибірки , де - набір параметрів дробового шуму. Якщо зневажити тимчасовими кореляціями між окремими елементами вибірки, щільність імовірності всієї вибірки (маргінальний розподіл) буде :

(2.10)

де це число елементів вибірки в i-ом бине гістограми дробового шуму.

Пошук найкращого набору параметрів , що описують можна проводити наприклад методом Максимальної Правдоподібності, що полягає в пошуку набору параметрів при якому щільність імовірності максимальна. Більше доречно, однак одержати вибірку з яким небудь із різновидів методу Монте-Карло (ми використали “slice sampling”).

оцінювалася чисельно з аналітичного вираження для характеристичної функції дробового шуму (Rice 1944):

(2.11) ,

де це модель розподілу амлитуд квантових струмів, що апроксимує амплітудний розподіл спонтанних струмів зареєстрованих на хвості довготривалих ГПСС при , -частота виділення квантів медіатора, , -форма квантового струму, де ; ; , -вікно фільтрації. Ми брали .

Ми провели серію обчислювальних експериментів для оцінки ефективності методу МР і порівняння його із ММ, які підтвердили більш високу ефективність і надійність нового методу. Метод МР дозволяє оцінити середньої амплітуди та частоти виділення квантів струму за умов зміни форми розподілу амплітуд квантових струмів внаслідок їх взаємодії, що дає змогу визначити, як змінювався середній заряд, що переносится квантом струму. Ці оцінки будуть сприяти виявленню механізмів взаємодії квантових струмів.

Результати цих очислювальних експериментів наведені в розділі 3.5 дисертації.

Деконволюція. Якщо прийняти припущення про лінійне підсумовування квантів струму в ході викликаного ГПСС і незалежності розміру і форми квантів струму від часу їхнього виникнення, частота квантових подій може бути визначена шляхом деконволюції (Sakaba and Neher, 2001). Відповідно до цього методу середній викликаний ГПСС, <I(t)>, - є згорткою середнього квантового ГПСС, <E(t)>, і частоти квантових подій . Тобто ,

(2.10)

Таким чином, частота квантових подій може бути визначена з вищенаведеної рівності. Деконволюція була виконана в цифровій формі в програмі Andatra, як зворотнє перетворення Фур'є від відношення перетворень Фур'є <I(t)> та <E(t)>.

Моделювання. Моделювання викликаного ГПСС методом Монте-Карло на основі оцінок частоти квантових подій, отриманих із деконволюції, проводилися, щоб візуально оцінити флуктуації струму в ході спаду модельованого викликаного ГПСС, а також перевірити точність оцінки частоти квантових подій, отриманої з аналізу шумів. При моделюванні, проведеному в програмі Andatra, викликані струми створювалися як сума мініатюрних ГПСС відповідно до заданої функції частоти квантових подій, як це було описано раніше (Stepanyuk et al., 2004). Процес вивільнення медіатора вважався квазістаціонарним і Пуассонівским. Ці припущення здаються прийнятними, тому що досліджувані моносинаптичні з'єднання мали 10-40 незалежних зон виділення медіатора (неопубліковані дані нашої лабораторії), середня кількість готових до вивільнення везикул в одній зоні була приблизно 10 (Kіrіschuk and Grantyn, 2000), модельована частота квантових подій була в діапазоні 0.05-2 мс-1 і крок за часом, використаний для моделювання був 0.05-0.1 мс. Таким чином, ймовірність для даної везикули виділити медіатор була <<1 що має на увазі процес Пуассона.

Програма NEURON (Hіnes and Carnevale, 2001) використовувалася, щоб оцінити, чи могли помилки фіксації потенціалу і постсинаптична взаємодія одноквантових струмів вплинути на характер спаду викликаного ГПСС. Параметри моделі синаптичного з'єднання були наступні:

1. Морфологічні параметри: сома - циліндр з діаметром 15мкм і довжиною 15 мкм; дендрит - усічений конус з початковим діаметром 3 мкм, діаметром наприкінці 0.5 мкм і довжиною 250 мкм.

2. Пасивні кабельні параметри дендрита: питомий опір цитозоля, Ri=200см; провідність мембрани, Gm=0.0001С/см2, питома ємність мембрани С=1мкФ/см2 .

3. ГАМК-ергічний струм у кожному синапсі моделювалася як сума двох експоненційних функцій, і мав час зростания =0.3мсек, спад =20мсек; максимальну провідність, gmax =1200пС; потенціал реверсії, E = -35мВ.

4. Потенціал соми фіксувався на -65мВ.

Моделювання проводилося для різних опорів доступу і різних розташувань синапсів на дендриті. Опір доступу брався в діапазоні 0.1-18.0 МОм. Розглядалися два різних розподіли 25 ГАМК-ергичних синапсів на мембрані модельованого нейрона. Перше (соматична локалізація): усі 25 синапсів розташовані на сегменті соми; друге (дендритна локалізація): 5 синапсів знаходяться на соматичній мембрані і 20 синапсів рівномірно розподілені по всій довжині дендрита.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Властивості викликаних і мініатюрних ГПСС у культурі нейронів гіпокампа. У наведеній роботі досліджувався розвиток у часі викликаного ГПСС (вГПСС) і мініатюрного ГПСС (мГПСС) у культурі нейронів гіпокампа з використанням прямої стимуляції поодиноких пресинаптичних клітин. На мал. 1 наведені середні вГПСС і мГПСС, зареєстровані від одного постсинаптичного нейрона. У даному експерименті пресинаптичний нейрон фіксувався в конфігурації "ціла клітина", стимули прикладалися, а постсинаптичні струми реєструвалися як це було описано в Методах. мГПСС були зареєстровані в тім же постсинаптичнім нейроні після реєстрації достатньої кількості викликаних ГПСС шляхом заміни позаклітинного розчину на розчин, що містить TTX (1мкМ).

Викликані гальмівні постсинаптичні струми при потенціалі -60 мВ мали наступні характеристики : синаптична затримка 3.6 - 2.2 мс (полічена для 11 пар), час зростання переднього фронту від 10 до 90% амплітуди 3.4 -0.7 мс (n=14), час спаду (що оцінювалися як площа під кривою нормованого до одиниці середнього вГПСС із його двоекспоненційної апроксимації) коливався в межах від 20 до 100 мсек (n=26), амплітуди коливалися від 20пА до одиниць нА. Ці струми мали лінійну вольтамперну характеристику в діапазоні від -70 до +30 мВ і цілком зникали з додаванням бікукулліну (10 мкМ).

Ці дані свідчать, що гальмівні відповіді, що реєструвалися, не містять струми, опосередковані ГАМКв і ГАМКс рецепторами, а пов'язані з активацією ГАМКа рецепторів. У більшості реєстрацій викликаних і спонтанних струмів не спостерігалося неспецифічного зменшення амплітуди постсинаптических відповідей (т.зв. "run-down") протягом принаймні перших 15 хвилин.

З мал. 1 видно, що спад середнього нормалізованого вГПСС був повільнішим, ніж у середнього нормалізованого мГПСС (p <0.001, непарний t-тест). Часи спаду оцінювалися як площі під нормалізованими до одиниці струмами або (у випадку мГПСС) їхніми апроксимаціями сумами трьох експонент і відрізнялися статистично вірогідно (p<0.001, непарний t-тест) приблизно в два рази. У 8 з 25 проаналізованих нами синаптичних парах спостерігалися істотно більш повільні (>20%), ніж у мГПСС кінетики спаду вГПСС. Зворотня ситуація не спостерігалася в жодній клітині. Слід також зазначити консервативність властивостей мГПСС у культурі нейронів гіпокампу. Так, кінетики спаду середніх мГПСС для різних клітин коливалися у вузькому діапазоні від 20 до 30 мсек, а амплітуди від 15 до 30пА.

Мал. 1. Cередній (n=115) мініатюрний спонтанний ГПСС (1 мкМ TTX) і середній (n=43) викликаний ГПСС отримані від одного постсинаптичного нейрона. Також представлена апроксимація мГПСС двома експонентами, що використовувався при деконволюції.

Розподіли амплітуд мають характерну форму з довгим хвостом і коефіцієнтом варіації близько 0.4 - 0.5. Більш того, середні мГПСС добре збігалися за формою з середніми спонтаними ГПСС, зареєстрованими в хвостах поодиноких вГПСС (n=1) і довготривалих ГПСС (n=7) у тих самих нейронах, форми розподілів їхніх амплітуд також, як правило, були подібними. Передбачається, що синхронні й асинхронні ГПСС на хвостах синхронних (де їхня частота значно вища базового рівня) виникають у тих самих синапсах (Lu and Trussell, 2000). Також, слід зазначити факт відсутності достовірної кореляції амплітуди і часу спаду мГПСС у декількох проаналізованих клітинах зі значною різницею кінетик спаду мініатюрних і синхронних струмів. Таким чином розглянутий феномен навряд чи можна пояснити просто більшою часткою участі синапсів з повільним спадом мГПСС у викликаному ГПСС у порівнянні з спонтанною активністю.

Крім того, в деяких постсинаптичних нейронах вГПСС реєструвалися після часткового блокування ГАМКа рецепторів специфічними конкурентними антогоністами бікукулліном і габазином. У цих експериментах не спостерігалося статистично достовірної кореляції амплітуди і кінетики вГПСС. Це може свідчити про задовільну просторову фіксацію потенціалу в цих клітинах.

Описане нами уповільнення гальмування при спільній активації групи синапсів у порівнянні з одним синапсом, представляє цікаве явище, що свідчить про те, що в ході викликаної потенціалом дії синаптичної відповіді могло мати місце асинхронне вивільнення медіатора та/чи нелінійна взаємодія квантів струму. Цей феномен може бути важливим як для ГАМК-ергічної синаптичної передачі, так і для функціонування нейронних систем у цілому, тому що більше половини заряду, переміщеного до соми клітини може бути обумовлено саме цим механізмом.

Характеристика ГПСС, викликаних серією потенціалів дії в культурі нейронів гіпокампу. Довготривалі (викликані тетанічною стимуляцією) і поодинокі викликані гальмівні постсинаптичні струми (дГПСС і вГПСС) у ГАМК-ергічних синапсах культури нейронів гіпокампу були зареєстровані з використанням прямої стимуляції окремих пресинаптичних клітин. На малюнках 3 і 4 представлені два приклади середнього довготривалого й поодинокого викликаних ГПСС. У цих експериментах пресинаптичний нейрон фіксувався у конфігурації "ціла клітина" чи стимулювався позаклітинно (мал. 2) і постсинаптичні струми реєструвалися, як описано в Методах. Розподіл амплітуд, зареєстрованих у тому ж постсинаптичному нейроні мГПСС, використовувався як розподіл амплітуд квантових струмів у ході довготривалого ГПСС для наступної деконволюції і аналізу шуму. На мал. 4 показано, що спад середнього довготривалого ГПСС був істотно повільнішим, ніж спад середнього поодинокого ГПСС (p <0.001, непарний t-тест). Такі драматичні розбіжності спостерігалися в більшості проаналізованих реєстрацій довготривалих ГПСС (n=22) у широкому діапазоні частоти потенціалів дії в серії (від 20 до 100Гц). При частоті стимуляції близько 50Гц, у ході зміни кількості стимулів у серії, час спаду довготривалого ГПСС спочатку зростає, а потім досягає насичення. Для повного розвитку ефекту звичайно досить 10-40 послідовних потенціалів дії. У певній групі реєстрацій час спаду на початку серії залежить практично лінійно від номера потенціалу дії (n=15).

В іншій групі клітин час спаду струму у відповідь на перші кілька потенціалів дії (<5) стає істотно повільнішим, ніж на декілька наступних (n=7). Також істотно нелінійно залежить від частоти потенціалів дії в серії час спаду довгтривалого ГПСС. При частоті стимуляції меншій 10 Гц розглянутий ефект, як правило, відсутній. Зміна ефективності гальмування в серії ГПСС залежить від ймовірності вивільнення медіатора в синапсах у відповідь на потенціал дії, що свідчить про участь медіатора, що вивільняється синхронно у формуванні спаду дГПСС.

При зміні концентрації Ca2+ у зовнішньому розчині з 2 до 0.5 мМ кінетика спаду дГПСС прискорюється, й у деяких випадках, практично збігається з кінетикою спаду вГПСС. У той же час, при зменшенні дГПСС приблизно до такого ж рівня шляхом блокування ГАМКа рецепторів бікукулліном, кінетика спаду дГПСС не змінюється, що свідчить про адекватну просторову фіксацію потенціалу в даних постсинаптичних нейронах.

Описане нами драматичне збільшення ефективності гальмування у відповідь на серію потенціалів дії, у порівнянні з відповідями на поодинокий потенціал дії в культурі нейронів гіпокампу, є цікавим явищем, яке свідчить, що після тетанічного збудження синаптичного з'єднання між гальмівними пресинаптичними і постсинаптичними нейронами могло мати місце асинхронне вивільнення нейромедіатора із синаптичних везикул та/чи нелінійна взаємодія квантів струму. Це явище може бути важливим і для ГАМК-ергічної синаптичноі передачі, і для функціонування гіпокампу в цілому, тому що заряд, переміщений до соми нейрона за один потенціал дії може драматично збільшитися при зростанні частоти потенціалів дії в пресинаптичній терміналі. У конкретному прикладі, показаному на мал. 2, заряд, перенесений через мембрану в розрахунку на один потенціал дії, збільшився майже в 4 рази при зростанні частоти від 0.3 до 60 Гц (мал.2).

Перевірка припущення про те, що асинхронне вивільнення медіатора є основною причиною посилення гальмування у випадку поодиноких викликаних ГПСС. У 7 з 24 (позаклітинна пресинаптична стимуляція) і 3 з 9 (подвійна реєстрація) досліджених нейронах ми спостерігали значні розбіжності в кінетиці спаду між викликаним і мініатюрним ГПСС (p <0.05).

Спочатку ми припустили, що асинхронне вивільнення квантів медіатора могло бути причиною уповільнення спаду струму, як це показано для деяких збуджуючих синапсів у гіпокампі. Для попередньої оцінки передбачуваної частоти вивільнення нейромедіатора ми використовували деконволюцію середнього мГПСС із середнього вГПСС. Як показують ці оцінки частоти вивільнення медіатору, істотне асинхроне вивільнення медіатора (25-100% від синхронного) могло б пояснити повільну кінетику спаду вГПСС.

Ця оцінка частоти квантових подій ґрунтується на припущеннях про однаковість амплітуд квантових струмів впродовж спаду вГПСС і амплітуд мГПСС, а також про лінійну сумацію квантів струму. Перше навряд чи має місце, тому що в досліджуваних нейронах спостерігалася висока ймовірність вивільнення медіатора у відповідь на потенціал дії і висока внутришньосинаптична однорідність амплітуд квантів(рукопис у процесі підготовки), що має на увазі насичення та/чи десенситізацію постсинаптичних рецепторів наприкінці синхронної фази вивільнення нейромедіатора. Таким чином, амплітуди квантових струмів могли зменшуватися протягом спаду вГПСС і, отже, наш результат напевно недооцінює реальну частоту квантових подій.

Однак, навіть за такої недооцінки, щоб пояснювати повільну кінетику спаду вГПСС, швидкість виділення медіатора протягом перших 100мсек після закінчення синхронної фази повинна бути на рівні 0.1-0.4 мсек-1. Впродовж цього часу повинні бути вивільнені кілька десятків везикул. Якщо так, то шум повинен включати компонент, пов'язаний зі стохастичністю процесу виділення медіатора.

Щоб наочно представити можливий рівень шуму, пов'язаний з квантовою природою вивільнення синаптичних везикул, ми виконували моделювання викликаного ГПСС методом Монте-Карло на основі оцінки частоти виділення медіатора, отриманої з деконволюції і мГПСС в якості квантового струму. Мал.3 представляє приклад поодиноких експериментального і модельованого вГПСС. Середні струми збігаються добре, тоді як поодинокі змодельовані струми виглядають істотно більш шумними, ніж експериментальні реєстрації. Ця різниця в характері шумів струмів вказує на те, що наше початкове припущення, що тривалий спад ГПСС був обумовлений виключно асинхронним виділенням медіатора, не є правильним.

Одним з найвірогідніших пояснень може стати те, що амплітуди квантів струму могли зменшуватися, внаслідок насичення і/чи десенситизації постсинаптичних ГАМКа рецепторів. Припустимо, що причиної розбіжністі в оцінках частоти квантових подій, отриманих із дисперсії і за деконволюцією, була зміна середньої амплітуди квантів струму у фазі спаду викликаних відповідей. Тобто, ми припускаємо, що шум вГПСС протягом спаду викликається квантовими струмами, що мають подібну форму, але менші за амплітудою. Тоді, у випадку квазістаціонарності відповідно до 2.9-2.10 :

;

де і , - нова оцінка частоти квантових подій і її оцінки з аналізу шуму при незмінному і деконволюції, і - нова середня амплітуда квантового струму і середня амплітуда мГПСС. Інші позначення аналогічні позначенням у рівняннях 2.1-2.9.

Отже:

Оскільки і у всіх проаналізованих клітинах з великою різницею кінетик спаду вГПСС і мГПСС істотно відрізнялися (мал. 4),

оцінена в такий спосіб частота квантових подій в 10 разів перевищувала величину, оцінену із деконволюції (1-4 мсек-1), тоді як середня амплітуда квантового струму була приблизно в 10 разів меншою від амплітуди мГПСС. Обидві оцінки знаходяться поза діапазоном, що показаний для центральних синапсів (Kіrіschuk and Grantyn, 2000). Більш того, як доводить подальший аналіз, може в основному відповідати шуму, що виникає в результаті відкривання-закривання ГАМКа каналів, що б значно збільшило розбіжність оцінок середньої амплітуди квантів (більш ніж у 5 разів для даних на мал. 4). Для цього аналізу дисперсія шуму каналів оцінювалася в припущенні, що процес відкривання/закривання каналів для відносно великих струмів (сотні пА) можна вважати майже пуассонівським, тоді процес фільтрованого для аналізу шуму вГПСС буде дробовим шумом і у відповідності до 2.9 :

де -середній ГПСС, - результат дії процедури фільтрації вГПСС, що застосовувалася для аналізу шуму, на функцію Хевісайда ( тобто сходинку одиничної амплітуди), -струм через поодинокий ГАМКа канал. Відповідно до результатів досліджень струмів поодиноких ГАМКа каналів і шумів макроскопічних ГАМКа струмів основний стан ГАМКа каналу, що приймає участь у синаптичних струмах має провідність 28 пС (Kaіla, 1994). Крім того, можна оцінити методом "peak-scaled noіse analysіs" (Sіlver et al., 1996), що в нашому випадку при аналізі вГПСС давало в середньому оцінку 316 пС (n=15) . Таким чином, ми зробили висновок, що повільний спад вГПСС важко цілком пояснити асинхронним виділенням синаптичних везикул, що супроводжується зменшенням амплітуд квантових струмів.

Перевірка припущення про асинхронне вивільнення медіатора як основну причину посилення гальмування у випадку довготривалих ГПСС. Значне збільшення ефективності синаптичної передачі під дією високочастотної стимуляції спостерігалося як у глутаматергічних, так і в ГАМК-ергічних синаптичних з'єднаннях (Lu and Trussell, 2000;Sakaba et al., 2002;Sakaba and Neher, 2001) і пояснювалося як правило драматичним посиленням асинхронного вивільнення нейромедиатора (Lu and Trussell, 2000). Результати наших експериментів також свідчать про участь квантів медіатора, що виділяються асинхронно, у формуванні довготривалих ГПСС.

По перше, важко уявити собі дійсний механізм, що міг би уповільнювати спад квантів синаптичного струму в десятки разів (до 50). По друге, у більшості реєстрацій спостерігалося значне збільшення частоти спонтанних ГПСС (у порівнянні з базовим рівнем) на хвості довготривалих ГПСС. Крім того, як правило, спостерігалося збільшення рівня шуму на спаді довготривалих струмів у порівнянні з поодинокими струмами. Далі, в ході деяких реєстрацій дГПСС проводилося зменшення ймовірності вивільнення квантів медіатора шляхом зменшення позаклітинної концентрації Ca2+ з 2мМ

Мал. 5. Приклад залежності від часу відношення середньої амплітуди квантів струму, що формують дГПСС, отриманої методом МШ до середньої амплітуди асінхронних ГПСС узятих на хвості даних дГПСС. Можна відзначити збіг оцінок середніх амплітуд квантів з точністю до статистичних похибок методу оцінювання.

до 0.5мМ, що призводило до прискорення кінетики спаду струму аж до її збігу з кінетикою поодинкого вГПСС, тоді як блокування дГПСС до того ж рівня бікукулліном чи габазином практично не змінювало їхню форму. Однак, на деяких реєстраціях при істотному уповільненні спаду струму зміна рівня шуму була невеликою. Тому ми вирішили перевірити, чи могли кванти медіатора, що виділяються асинхронно та викликають квантові струми, подібні до мГПСС чи асинхронних ГПСС на хвостах довготривалих ГПСС, призводити до рівнів шумів, що спостерігаються на спаді дГПСС. Для цього ми скористалися методом МШ, запропонованим у роботі Sakaba et al., 2002. Було проаналізовано 8 нейронів, у яких реєструвалися дГПСС (стимуляція з частотою 50-60 Гц, 15-20 стимулів) з повільною кінетикою спаду. В результаті аналізу ми одержали оцінки частоти квантових подій і середніх амплітуд квантів струму на спаді дГПСС із кроком за часом 50мсек. У кількох клітинах (n=5) амплітуда квантів струму, оцінена із шуму, збігалася з точністю 20-35% з амплітудою мГПСС (n=5)

Мал. 6. Приклад розбіжних оцінок частоти квантових подій, формуючих дГПСС, отриманих методом МШ і із деконволюції з урахуванням оцінки амплітуди квантів струму із аналізу флуктуацій дГПСС. Той же набір дГПСС що і для мал.5.

і асинхронних ГПСС із хвостів довготривалих ГПСС (n=4) (мал.28), в інших клітинах (n=2) вона була спочатку приблизно в 1.3-2.5 рази меншою але поступово ставала статистично подібною (мал.5), у 1-ої клітині вона виявилася в середньому приблизно в 1.2-1.5 рази більшою на значному відрізку часу (близько 1сек) Оцінки частоти квантових подій коливалися на максимумі струму від 0.25 до 1мсек-1 c похибкою 20-40%. Константа її часу спаду (час спаду в раз) була в більшості клітин у діапазоні 200-300 мсек ( приклад на мал. 6).

Далі ми знову оцінили частоту квантових подій, скориставшись методом деконволюції з урахуванням отриманих з аналізу флуктуацій струмів оцінок середньої амплітуди квантів струму, вважаючи процес виділення квантів медіатора квазістаціонарним. У 7-ми проаналізованих клітинах оцінка частоти квантових подій виявилася в 2-4 рази нижчою відповідної оцінки із деконволюції на значному інтервалі часу (500-800 мсек) (мал. 6), для 1-єї клітини обидві оцінки збігалися в межах похибки при відмінності оцінки амплітуди квантів струму від середньої амплітуди асинхронного ГПСС у 2 рази.

Таким чином, можна зробити висновок, що на початку спаду дГПСС (перші 500-1000 мсек після закінчення стимуляції) амплітуда квантів струму зменшувалася (можливо в 2-4 рази) у порівнянні з такою наприкінці струму, але ці зміни не детектувалися методом МШ внаслідок значної зміни форми розподілу амплітуд квантів струму, і/чи відбувалося істотне уповільнення спаду квантів струму. Обидва припущення не сумісні з припущенням, про те що асинхронне вивільнення квантів медіатора є єдиним