АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА

ШАРУН АЛЕСЯ ВІТАЛІЇВНА

УДК 616.31:579.83/.88:546.215

ВПЛИВ АКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ РІЗНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА ПРЕДСТАВНИКІВ МІКРОБІОЦЕНОЗУ

РОТОВОЇ ПОРОЖНИНИ

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений працівник народної освіти України Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Бірюкова Світлана Василівна, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України; професор кафедри клінічної імунології та мікробіології

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України; завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України

Захист відбудеться “ 26 ” травня 2005р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057, Харків, вул. Пушкінська, 14/16

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: Харків, вул. Пушкінська, 14/16

Автореферат розісланий “ 22 ” квітня 2005р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради, к.мед.н., ст.н.с. Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі мікрофлору людини розглядають, як сукупність безлічі мікробіоценозів, що займають екологічні ніші на шкірі і нестерильних слизових оболонках макроорганізму. Життєдіяльність мікроорганізмів, що населяють поверхню і внутрішні органи макроорганізму, регулюється за принципом зворотного зв'язку. Неповноцінне функціонування симбіотичної мікрофлори дестабілізує організм людини. В той же час, дисбаланс у функціонуванні макроорганізму (дістрес, нераціональне харчування, інфекційний процес, неадекватна антибіотікотерапія й ін.) викликає, у свою чергу, зміну складу ендогенного мікробіоценозу. При розвитку дисбіотичних порушень організму, селективну перевагу набувають умовно патогенні мікроби, серед яких виявляються клони з медикаментозною стійкістю і генетичними детермінантами, які обумовлюють вірулентність та патогенність бактерій (Кременчуцький Г.Н. та співавт., 2003; Шендеров Б.А., 1994).

Враховуючи те, що запальні захворювання верхніх дихальних шляхів по своїй поширеності займають перше місце в структурі ЛОР-патології, недивно, що вони є одним із найчастіших показників для призначення антибіотиків і сульфаніламідів (Сухов В.М., 1998). Захворювання верхніх дихальних шляхів складають 31% всіх призначень антибіотиків. Проте, дійсність така, що навіть в країнах із високим рівнем охорони здоров'я, за наявності широкого арсеналу антибіотичних і антисептичних препаратів, кількість гнійних ускладнень неухильно росте. Частота, наприклад, ріногенних очноямкових ускладнень, за даними різних авторів, коливається від 0,5 до 8,4%. За останні роки спостерігається її підвищення, що пояснюється зміною резистентності мікрофлори під впливом антибіотиків, інтенсивним розповсюдженням полірезистентних штамів (Дайняк Л.Б., 1997). Сказане диктує необхідність пошуку нових методів терапії, антисептики й дезинфекції.

У останнє десятиріччя достатньо інтенсивно розвиваються дослідження по розробці й використовуванню лікувально-профілактичних препаратів біологічного походження, створених з представників нормальної й умовно патогенної мікрофлори з вираженими антагоністичними властивостями. У прояві антагоністичних властивостей нормофлори по відношенню до патогенів беруть участь біологічно активні з'єднання, які синтезуються бактеріями: органічні кислоти, коротко ланцюжкові жирні кислоти, мікробний лізоцим (мурамідаза), перекис водню й антибіотико-подібні пептидні субстанції — мікроцини, бактеріоцини, володіючі широким спектром антибактеріальної активності. У ряді фізико-хімічних процесів, утворюються активні форми кисню (АФК): супероксидні радикали (О2), перекис водню (Н2О2), гідроксильні (вільні) радикали (ОН, НО2.), синглетні форми кисню (1О2), іони НО2- (Осипов А.Н. та співавт., 1990). Біологічна дія перекису водню багатоманітна. Бактерицидна активність перекису водню пов'язана також з його високою окислювальною здатністю, а саме з дією токсичних продуктів, що утворюються при перекисном окислюванні ліпідів. Перекисне окислювання впливає на білки рибосом, викликаючи їх руйнування. Перекис водню викликає порушення проникності бактерійних клітин уже в перші хвилини контакту.

Біологічна активність бактерій - продуцентів перекису водню забезпечується за рахунок функціонування ряду ферментів і продуктів біологічно активних метаболітів. Проте, нечисленні дослідження антагоністичних властивостей активних форм кисню, зокрема, біологічного походження, відносно патогенних і умовно патогенних представників мікрофлори людини зумовили мету й задачу нашого дослідження.

Мета дослідження – вивчити вплив активних форм кисню різного походження на представників мікробіоценозу ротової порожнини.

Задачі дослідження:

1. Виділення бактерій – продуцентів перекису водню зі слизової оболонки ротової порожнини, вивчення їх морфологічних, фізіологічних і біохімічних властивостей.

2. Визначення субстратів, при окислюванні яких продукується перекис водню й вивчення їх впливу на антагоністичну активність виділених бактерій.

3. Вивчення антагоністичних властивостей виділених бактерій – продуцентів перекису водню відносно патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, що володіють полірезистентністю до антибіотиків.

4. Вивчення взаємного антагонізму найактивніших штамів виділених бактерій – продуцентів.

5. Вивчення антагоністичного ефекту води і водних антисептичних розчинів, активованих нерівноважною низькотемпературною плазмою.

6. Вивчення сумісного антагонізму бактерій – продуцентів перекису водню й активованих водних розчинів на патогенні й умовно патогенні мікроорганізми.

Об'єкт досліджень – бактерії – продуценти перекису водню, виділені з ротової порожнини людини.

Предмет досліджень – активні форми кисню бактерійного, фізико-хімічного походження та їх антагоністична дія на патогенних і умовно патогенних представників мікробіоценозу.

Методи досліджень – мікробіологічні, біохімічні, фізичні й статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що в ротовій порожнині людини А.viridans є найактивнішими продуцентами перекису водню. Доведено антагоністичну дію перекису водню, продукованого виділеними мікроорганізмами, а також активних форм кисню, що утворюються у водних розчинах, оброблених низькотемпературною плазмою на полірезистентні штами деяких патогенних і умовно патогенних представників мікробіоценозу.

Визначені субстрати окислювання продуцентів перекису водню, до яких відносяться: молочна кислота, -гліцерофосфат, гліцеральдегид, піруват, валін, цистін, пролін. Проведений порівняльний аналіз оксидазних, антагоністичних властивостей, а також субстратів окислювання штамів аерококів, виділених із різних екологічних ніш, що виявив відмінності між різними екогрупами.

З'ясована антиоксидантна роль глутатіону, виступаючого як каталізатор у реакціях, що протікають із поглинанням кисню.

Практична значення одержаних результатів. Одержані результати відкривають перспективу в розробці підходів до корекції порушень у мікробіоценозі ротової порожнини, впливу бактерій – продуцентів перекису водню на біологічні процеси колонізації слизових оболонок, показана перспективність обробки води, водних розчинів у тліючому розряді низькотемпературної плазми з метою надання їм антагоністичної активності відносно ряду патогенних і умовно патогенних бактерій і створення комбінованих препаратів на базі аерококів і активованої води.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно здійснено пошук джерел літератури та їх аналіз. Виділення бактерій – продуцентів перекису водню з ротової порожнини людини, їх мікробіологічна характеристика й ідентифікація виконано автором. Дисертантом особисто вивчено антагоністичні властивості бактерій – продуцентів, активованої води і водних розчинів антисептиків, відносно ряду патогенних і умовно патогенних бактерій, субстрати окислювання виділених бактерій – продуцентів перекису водню, а також вплив субстратів окислювання на антагоністичні властивості виділених штамів.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень оприлюднені в матеріалах Ювілейної підсумкової конференції студентів і молодих учених, Одеса, 2000, на IХ Міжнародній конференції “Нові інформаційні технології в медицині і екології”, Ялта-Гурзуф, 2001, в матеріалах XI Міжнародної конференції “Нові інформаційні технології в медицині”, 2003, на II Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень 2003”, Дніпропетровськ-Запоріжжя, Житомир, в матеріалах V Міжнародної науково-практичної конференції “Пробіотики XXI сторіччя. Біологія. Медицина. Практика”, Тернопіль, 2004, на ХII Міжнародній конференції “Нові інформаційні технології в медицині і екології”, Ялта-Гурзуф, 2004, на VІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта 2004” Дніпропетровськ, 2004, в тезах Х з'їзду Товариства мікробіологів, Одеса, 2004, на Х Конгресі світової федерації Українських лікарських товариств, Чернівці, 2004, в матеріалах ХIV з'їзду гігієністів України, Дніпропетровськ, 2004.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових праць, 6 з яких – у виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 225 сторінках, містить вступ, огляд літератури, розділ „Матеріали й методи досліджень”, 3 розділи власних досліджень. Список використаних джерел літератури (усього 210 найменувань) представлено на 19 сторінках. Робота ілюстрована 55 фотографіями і 62 таблицями, 16 з яких займають повний об'єм сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі викладено суть мети та наукових завдань, які розв’язувались при виконанні дисертаційної роботи, обґрунтовано актуальність теми, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів дисертації. Викладено її обсяг і структуру.

У першому розділі подано огляд літератури, де на основі даних літератури доведено актуальність і перспективу в розробці підходів до корекції порушень у мікробіоценозі ротової порожнини, антагоністичного впливу активних форм кисню мікробного та фізико–хімічного походження відносно ряду патогенних і умовно патогенних бактерій, у тому числі, антибіотикорезистентних мікроорганізмів.

Матеріали й методи дослідження. В результаті бактеріологічного обстеження ротової порожнини 118 практично здорових людей різних вікових категорій було виділено 41 культуру бактерій – продуцентів перекису водню. Виділялися мікроорганізми з продукцією Н2О2 у концентрації не менше 0,0025±0,0008 мг/мл, при вирощуванні на МПБ протягом 16 -18 годин
(370 С) при засіві 1 мл одномільярдної суспензії.

Віднесення виділених мікроорганізмів до A.viridans базувалось на результатах ідентифікації за допомогою АРІ-тесту, та оцінці по додаткових критеріях: зростанні на селективно-індикаторних середовищах, зростанні та біохімічній активності на середовищах із солями селену.

Антагоністичні властивості виділених бактерій – продуцентів перекису водню і активованих низькотемпературною плазмою водних розчинів вивчалися методом відстроченого антагонізму (С.А.Риженко, 2001) із застосуванням у якості тест – культур музейних і клінічних (полірезистентних) штамів патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів.

Дезинтеграція клітин аерококів досягалася обробкою лізоцимом з ЕДТА (1,2 мг/мл і 0,001М відповідно)(С.І.Вальчук, 2004).

Виділення і часткове очищення ферментного комплексу аерококів проводилося за допомогою висолювання сульфатом амонію білків з лізатів клітин, розчиненням осаду в 0,01М фосфатному буфері (рН 7,4) і діалізом розчину через целофанову мембрану проти 0,01М фосфатного буфера (рН 7,4) (Р.Скоупс, 1985). НАД - незалежна лактатдегідрогеназна активність аерококів визначалася згідно з H.W.Doelle (1971). Глутатіонредуктазна активність визначалася методом, описаним Ю.І.Губськім з співавт. (1983). Супероксиддисмутазна активність аерококів визначалася згідно з Е.В .Макаренко (1988).

Молочна кислота визначалася ензиматичним методом (F.Noll, 1974), піровиноградна кислота – ензиматичним і хімічним методами по В.Г.Колб з співавт., 1982, гліоксалаза, як описано E.Racer (1957). Метілгліоксаль визначався ензиматичним методом (В.С.Асантіні, 1969) і хімічним (В.С. Алексєєв, 1978). Малоновий діальдегід визначався за утворенням дієнового кон?югату з тіобарбітуровою кислотою (Е.А.Строєв та співавт., 1986). Білок визначався в реакції скріплення його з фарбником кумасі синім (Сінюхін В.Н. та співавт., 1991).

Поглинання кисню при окисленні субстратів клітинами аерококів і їх ферментними комплексами визначали за допомогою електроду Кларка (K.K.Alexander et al., 1985).

Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень приведені в розділах 3-5. В результаті проведених досліджень зі слизової оболонки ротової порожнини 118 практично здорових людей виділено 41 культуру мікроорганізмів з продукцією Н2О2 в концентрації не менше 0,0025±0,0008 мг/мл при вирощуванні на МПБ протягом 16 -18 годин (370 С) при засіві 1 мл одномільярдної суспензії.

На основі АРІ-тесту і додаткових досліджень (зростання на селективно-індикаторних середовищах, зростання і біохімічна активність на середовищах із солями селену) було виявлено, що всі вивчені культури мікроорганізмів відносяться до A.viridans. Аерококи висівались в кількості 5103±102 кліток на 1 мл у практично здорових осіб різних вікових категорій. Відсоток висіваємості у дітей від 0 до 5 років складав 20%, від 6 – 10 років – 33,3%, у осіб від 20 до 25 років висіваємость складала 40%, а у віковій категорії 30 – 60 років відсоток висіваємості був значно знижений і складав всього 6,6%.

Було встановлено, що штами виділених культур бактерій-продуцентів перекису водню украй бідно або взагалі не ростуть на простих живильних середовищах (МПА і МПБ).

Відмічено, що бактерії-продуценти перекису водню краще всього росли на шоколадному агарі (8109±1109 кл/мл). Інтенсивне зростання зареєстроване на МПА, доповненому 10% капустяним відваром (від 1109±1108 кл/мл до 5109±1108 кл/мл), і на МПА, доповненому 15 % і 20 % кінської сироватки (від 1107±1106 кл/мл до 1108±1107 кл/мл).

У процесі досліджень встановлено, що максимальний рівень продукції перекису водню культурою A.viridans №839 і в казеїновому агарі і в казеїновому бульйоні, як і у випадку з музейним A.viridans №167, спостерігається через 16 – 18 годин інкубації при 370С. Накопичення перекису водню культурами аерококів у казеїновому бульйоні носить двофазний характер (рис.1).

Рис. 1. Динаміка накопичення перекису водню, продукованого А.viridans №839 протягом 72 годин інкубації у казеїновому бульйоні

В результаті проведеного вивчення продукції перекису водню були відібрані 6 штамів найсильніших продуцентів: №№ 6/7, 11/14, 13/16, 170, 774, 839 і як контрольний штам -
А. viridans №167 з музею культур ДДМА.

На етапі виділення продуцентів перекису водню зі слизової оболонки ротової порожнини людини, а також з інших нестерильних порожнин були виділені представники мікрофлори, що надалі використовувалися в роботі, як тест – культури. Після вивчення чутливості до антибактеріальних препаратів з них були відібрані штами мікроорганізмів, що володіли полірезистентністю до антибіотиків.

В результаті вивчення чутливості аерококів до антибіотиків установлено, що всі виділені з ротової порожнини штами продуцентів перекису водню, які є чутливими до гентаміцину, мономіцину, тетрациклінів, офлоксацину, володіють стійкістю до ряду хімічних сполук (амфотерріцин, грамурін, хиноксидін, діоксидін, невіграмон, аскорбінова кислота, борна кислота, дімексид, етоній, бактрін, хлорамін).

В ході вивчення антагоністичних властивостей виділених бактерій – продуцентів перекису водню відносно патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів було з'ясовано, що антагоністичні властивості виділених штамів неоднорідні. Деякі штами аерококів проявляють низьку антагоністичну активність, або взагалі її не проявляють, незважаючи на продукцію перекису водню. Зони затримки зростання тест – мікробів аерококами коливаються від 1±0,2 мм до 22±3,4 мм, а іноді до повного пригнічення. Антагоністичні властивості найактивніших штамів бактерій-продуцентів були вивчені також по відношенню до антибіотикорезистентних штамів мікроорганізмів, виділених з організму людини. При цьому встановлено, що штами № 13/16, №839 не тільки не поступаються в силі антагоністичної дії музейному №167 штаму, але і перевершують його (табл. 1).

Таблиця 1

Антагоністична дія аерококів на полірезистентні мікроорганізми, виділені з організму людини

Штами | Зони пригнічення зростання тест мікроба

S.sapro-phyticus №4 | S.аureus № 9 | S. inter-medius №11 | S.еpider- midis

№7 | Р.aeru-ginosa | К. ozae-nae | E.coli | C.albi-cans

6/7 | 4±0,7 | 6±1,7 | 3±0,7 | 0 | 1±0,2 | 0 | 3±0,8 | 5±1,0

11/14 | 6±1,1 | 8±2,2 | 4±0,5 | 2±0,5 | 6±1,5 | 1±0,2 | 5±1,0 | 13±0,5

13/16 | 22±3,4 до

пов.пригн. | 12±0,5 | 16±2,5 | 9±2,1 | 12±1,5 | 11±1,0 | 12±0,5 | 17±2,6

170 | 9±1,0 | 3±0,5 | 11±1,5 | 4±1,2 | 9±1,0 | 6±0,5 | 10±1,5 | 15±1,7

774 | 12±2,8 | 4±0,3 | 14±0,2 | 4±1,0 | 7±1,0 | 7±0,3 | 13±3,2 | 14±2,0

839 | 18±3,2 | 13±1,5 | 18±1,3 | 10±2,1 | 8±0,7 | 10±0,3 | 13±1,2 | 16±2,1

167 | 12±1,0 | 4±1,1 | 11±0,3 | 4±1,2 | 7±1,0 | 6±0,5 | 12±0,3 | 13±2,0

При порівняльному аналізі антагоністичних властивостей виділених аерококів і пробіотичних препаратів: А-бактерину, біоспорину, біфідумбактерину, біфіколу, колібактерину, лактобактерину, лінексу встановлено, що штами аерококів №13/16 і №839 є сильнішими антагоністами відносно S. intermedius, S. saprophyticus, P. аeruginosa, К. оzaenae, E. coli, С. аlbicans, ніж вивчені пробіотики і поступаються лише біоспорину. Відносно S. aureus і S. epidermidis вивчені штами аерококів №13/16 і №839 поступаються в силі антагоністичної дії всім пробіотикам, що вивчались, за винятком лінексу.

Враховуючи те, що вивчені штами бактерій – антагоністів були виділені нами зі слизової оболонки зіву, була поставлена задача вивчити взаємостосунки аерококів із представниками роду Neisseriа, які є постійними мешканцями слизової оболонки дихальних шляхів людини. Можливість антагоністичної дії аерококів на N.meningitidis представляє великий інтерес, оскільки циркуляцію менінгококів, а значить постійну загрозу спалахів захворювання, підтримує широке розповсюдження так званого “здорового” носійства. Значить, за наявності антагоністичної дії на патогенні менінгококи, можна говорити, в майбутньому, про можливість розробки підходів до корекції складу мікробіоценозу “здорових” носіїв.

Також були проведені дослідження по вивченню антагоністичної дії пробіотичних препаратів на штами менінгококів, виділені від хворих на інфекційний менінгіт і штами, виділені у вогнищах захворюваності по епідпоказниках.

Варто відзначити, що з боку А-бактерина спостерігається виражений антагоністичний ефект, відносно всіх без виключення серогруп менінгококів. Найбільш виражену антагоністичну дію відносно N. meningitidis різних серотипів, у вогнищах захворювань і від хворих, проявив колібактерин. Трохи поступалися йому біфідумбактерин і лактобактерин. Якнайменше активним був біоспорин.

Сила антагоністичної дії А-бактерина на штами, виділені у вогнищах захворюваності майже рівна антагоністичній дії на штами, які виділені від здорових носіїв. Тоді як з боку інших пробіотиків такого стабільного антагоністичного ефекту не спостерігалося. Колібактерин, біфідумбактерин і лактобактерин при яскраво вираженому антагонізмі відносно штамів, виділених у хворих на інфекційний менінгіт і у вогнищах захворюваності, проявляли мінімальний ефект щодо штамів, виділених від здорових носіїв.

В ході експериментів по вивченню взаємного антагонізму найактивніших штамів аерококів установлено: найактивніші штами бактерій – антагоністів, такі як №№13/16, 170, 774, 839, дали зони придушення від 2±0,6 мм і до 13±0,7 мм. Штам А. viridans №13/16 проявив максимальну антагоністичну дію відносно найслабкішого антагоніста А. viridans №6/7, але поступається у розмірі зон затримки зростання відносно А. viridans №6/7 штамам №№ 170, 774, 839, і музейному №167. Разом із тим, трохи перевищує в силі антагонізму відносно А. viridans №11/14, штами №№ 170, 774, 167. Мінімальна антагоністична дія була проявлена відносно найактивніших А. viridans №774 і А. viridans №839.

Результати, одержані при вивченні взаємного антагонізму виділених із ротової порожнини аерококів дали змогу припустити наявність у них антиоксидантних систем. Були вивчені антиоксидантні ферменти лізатів аерококів, глутатіонпероксидаза, супероксиддисмутаза (SOD), накопичення й антиоксидантна дія пірувату, глутатіонтрансфераза.

Раніше було встановлено, що продукція перекису водню аерококами є функцією лактатоксидазної активності. Проте, при зіставленні концентрацій перекису водню, що накопичується в культурах аерококів, із зонами придушення зростання тест – культур аерококами з високою й середньою лактатоксидазною активністю, видно відсутність залежності, хоча рівень визначуваного перекису водню у високо активних штамів декілька вищій, ніж у середньо активних. Виходячи з цього, з метою виявлення продукції супероксиду аерококами в процесі окислювання молочної кислоти, були проведені експерименти з ферментними комплексами аерококів.

Оцінюючи дані, одержані при вивченні антагоністичних властивостей аерококів на щільних селеніто–індикаторних середовищах і, порівнюючи, з раніше приведеними даними по відстроченому антагонізму, можна з упевненістю говорити про зниження антагоністичних властивостей бактерій під дією солей селену відносно всіх без виключення тест – мікроорганізмів. Дані результати, дають право говорити про антиоксидантний ефект Se.

Усі аерококи продукували екзогенний комплекс, що висолюється за допомогою сульфату амонію, має багатокомпонентний склад, що включає глікопротеіди, пептиди, амінокислоти, метилгліоксаль, молочну кислоту і малоновий діальдегід, або інше аналогічне з'єднання, що може давати дієновий кон'югат з тіобарбітуровою кислотою.

У четвертому розділі представлені результати вивчення спектру антагоністичної дії розчинів хімічного перекису водню, води і водних розчинів антисептиків, оброблених контактною нерівноважною низькотемпературною плазмою і проведений порівняльний аналіз ефективності антагоністичної дії бактерій-продуцентів перекису водню, виділених з ротової порожнини людини, води і водних розчинів антисептиків, оброблених нерівноважною низькотемпературною плазмою. Була з'ясована можливість комбінованої антагоністичної дії активованих водних розчинів і бактерій-продуцентів перекису водню.

В ході вивчення антагоністичної активності активованої води з'ясовано: антагоністична дія починає виявлятися при концентрації перекисних сполук 80 мг/л (при обробці води протягом хвилини) з мінімальними зонами придушення S. aureus і S. epidermidis - 9±0,9 мм і 9±0,5 мм.

При підвищенні концентрації перекису водню у воді, відповідно зростає її антагоністична активність, що виражається в збільшенні зон затримки росту тест-культур мікроорганізмів. При концентрації перекису водню 400 мг/л (обробка води протягом 13 хвилин), максимальне значення зони затримки росту дорівнює 23,5±1,9 мм у S. epidermidis.

Для подальших досліджень по вивченню антагоністичних дій на патогенні й умовно патогенні мікроорганізми особливий інтерес представляло вивчення можливості обробки фізіологічного розчину контактною нерівноважною низькотемпературною плазмою з метою отримання антагоністично активного розчину. При обробці фізіологічного розчину контактною нерівноважною низькотемпературною плазмою хлорид натрію, що міститься в розчині, вступає у взаємодію з перекисними з'єднаннями, що створюються унаслідок хімічних реакцій з утворенням NaClO. Гіпохлорит натрію NaClO володіє бактеріостатичними й бактерицидними властивостями.

Результати досліджень показали, що антагоністична активність обробленого фізіологічного розчину виявляється, починаючи з концентрації 20 мг/л і виражається в мінімальній зоні пригнічення росту P. vulgaris, яка дорівнює 7,5±0,5 мм і максимальної 10±1,2 мм у S. epidermidis і 10±1,9 мм у C. albicans. Було показано, що водний розчин синтетичного перекису водню з концентрацією 100 мг/л не проявляє антагоністичної дії, тоді як активований фізіологічний розчин, з аналогічною концентрацією перекису водню, володіє антагоністичною активністю щодо більшості тест-культур. Зони затримки росту мають значення від 8,0±0,8 мм до 10,5±1,5 мм. Виняток становлять лише дві культури, а саме: P. aeruginosa і S. pyogenes.

Аналогічні дослідження були проведені у відношенні розчинів, що містять KJ. Кінцевим антагоністичним продуктом був KJO. Зони затримки зростання тест-культур мікроорганізмів, при застосуванні активованого розчину йодиду калію (0,5 г/л) більше, ніж зони при застосуванні активованої хімічно чистої води, в середньому на 1,8±0,6 мм. Виняток становлять: S. aureus та E. coli - зони без змін, а також P. aeruginosa і P. vulgaris - зони затримки зростання зменшуються на 0,5±0,07 мм.

При сумісній антагоністичній дії активованої води і виділених аерококів можна з упевненістю говорити про зростання антагоністичного ефекту, щодо грамнегативних бактерій:

E. coli і P. aeruginosa, яке виражається не тільки в збільшенні розміру зон інгібіції, але і в загальному зниженні інтенсивності зростання даних тест – мікроорганізмів з придушенням пігментоутворення у P. aeruginosa.

У п'ятому розділі дисертаційної роботи представлені результати вивчення впливу метаболітів на антагоністичні й біохімічні властивості аерококів, досліджень субстратів окислювання бактерій-антагоністів, продуцентів перекису водню, та їх ферментних комплексів. Також вивчена можливість стимуляції їх антагоністичних властивостей при введенні ауксинів в поживні середовища.

В ході досліджень, що проводилися методом вимірювання поглинання кисню електродом Кларка, було вивчено 20 органічних сполук, а саме: незамінні амінокислоти: цистін, пролін, лізин, треонін, валін, аланін, гліцин, органічні кислоти: янтарна, яблучна, лимонна, молочна, винна, щавлева, фумарова, піровиноградна, кето-глутарова, а також: продукт часткового гідролізу білків – пептид глутатіон, фосфоглицерид-гліцерофосфат і тріоза - гліцеральдегід у концентраціях 0,1мг/мл, 1мг/мл, 40мг/мл.

В результаті досліджень з'ясовано, що найбільші показники поглинання кисню ферментними комплексами найбільш антагоністично активних штамів аерококів №839, №13/16 і музейного №167, зареєстровані при введенні наступних субстратів: глутатіону, гліцеральдегіду, Na--глицерофосфату, Na-піровиноградно-кислого, янтарної, молочної кислоти, аланіну (рис. 3). При визначенні перекису водню на індикаторному середовищі виявилося, що тільки молочна, аміно-оцтова кислоти, Na-піровиноградно-кислий, Na -?- гліцерофосфат, гліцеральдегід ініціювали появу кольорової реакції. Посилене поглинання О2 при введенні в систему глутатіону не давало перекису водню, що вимагає подальших досліджень.

Найактивніше поглинання кисню відбувалося при введенні в мікроосередки: глутатіону, гліцеральдегіду, Na-- гліцерофосфату в концентрації 40 мг/мл.

Слід підкреслити, що ферментні комплекси вивчених штамів аерококів, окислюють одні і ті ж метаболіти з різною активністю. Це дає можливість біохімічного розподілу різних груп аерококів. Приклад – максимальні коефіцієнти поглинання кисню при окислюванні гліцеральдегіду ферментними комплексами аерококів №13/16 і №167 на фоні зниженої активності штаму №839 (рис.2),

Метаболіти, вивчені, як субстрати окислювання для ферментних комплексів та цільних мікробних клітин були досліджені в комбінаціях один з одним в різних концентраціях. В результаті з'ясовано, що найбільше поглинання кисню відбувається при введенні в мікроосередок комбінації метаболітів, що складаються з: гліцеральдегіду, Na--гліцерофосфату й комплексу: глутатіону, гліцеральдегіду, Na--гліцерофосфату в концентрації 40 мг/мл. У разі додавання цієї ж комбінації метаболітів у мікроосередки з цільними мікробними клітинами, найактивніше поглинання кисню відбувалося у штамів №№ 6/7, 839, 167.

Наступним етапом досліджень було вивчення впливу комплексу метаболітів, що складається з глутатіону, гліцеральдегіду, Na-- гліцерофосфату і кожного з метаболітів окремо на продукцію перекису водню найактивнішими штамами антагоністів: A.viridans №13/16, A.viridans №839, A.viridans №167 в динаміці. Як контроль – вивчення продукції перекису водню A.viridans №13/16, A.viridans №839, A.viridans №167 при культивуванні на простому МПБ.

Загальним для всіх вивчених штамів виявилась відсутність продукції перекису водню при доповненні МПБ комплексом, що складається з: глутатіону, гліцеральдегіду, Na--глицерофосфату і при доповненні одним лише глутатіоном. Але у присутності гліцеральдегіду і Na--гліцерофосфату продукція перекису водню зареєстрована, що швидше за все, говорить про антиоксидантну роль глутатіону, а високі показники поглинання кисню електродом Кларка при його внесенні в мікроосередки з цільними клітинами аерококів і їх ферментними комплексами – про роль даного метаболіту, як каталізатора протікаючих реакцій.

В ході досліджень по вивченню можливості впливу ауксинів на антагоністичні властивості аерококів одержані наступні результати: субстрати окислювання аерококів, що дають збільшення поглинання кисню, підсилюють продукцію Н2О2 (у 1,5 - 8 разів) і ведуть до зростання антагоністичної активності на 20-60%, а в деяких випадках, до 100% і більш.

Великий інтерес представляло порівняння біологічних властивостей аерококів, виділених із різних локусів організму людини. Штами аерококів, виділених з калу і сечостатевої системи були люб'язно надані О. Нікуліною (ЦБКЛ м. Дніпропетровська).

В результаті проведеного порівняльного аналізу біологічних властивостей штамів, що вивчалися, встановлено, що концентрація перекису водню, продукованого аерококами, виділеними з калу і сечостатевої системи практично не перевищує концентрацію перекису водню, продукованого аерококами, виділеними з ротової порожнини. І в першому і в другому випадку, концентрація складає соті й тисячні частки мг/мл. Антагоністичні властивості штамів, виділених із сечостатевої системи й калу, неоднорідні.

Найактивніша антагоністична дія представлених штамів виявляється щодо грам-позитивних бактерій, менш інтенсивно щодо грамнегативних. Якнайменшій антагоністичній дії піддається - K.pneumoniae. З представлених штамів найактивнішими антагоністами з'явилися А. viridans №567 і А. viridans №577, проявляючи високу антагоністичну дію до тест – культур.

Необхідно відзначити ще одну властивість аерококів, знайдену при вивченні штамів, виділених з ротової порожнини, і що простежується також у випадку із штамами, виділеними з калу і сечостатевої системи. Ця властивість полягає в здатності аерококів не тільки повністю пригнічувати зростання мікроорганізмів, а і знижувати їх інтенсивність росту.

При аналізі результатів вивчення субстратів окислювання для аерококів, виділених із ротової порожнини встановлено, що найбільші показники поглинання кисню електродом Кларка зареєстровані при внесенні в мікроосередки з ферментними комплексами штамів аерококів №839, №13/16 і музейного №167 наступних метаболітів: глутатіону, гліцеральдегіду, Na-б-?ліцерофосфату, Na-піровиноградно-кислого, янтарної кислоти. А найбільші показники поглинання кисню при вивченні ферментних комплексів аерококів, виділених з калу і сечостатевої системи, одержані при внесенні амінокислот: аланіну й проліну в концентраціях 40 мг/мл і 1 мг/мл. При дослідженні ферментних комплексів аерококів, виділених з ротової порожнини, показники поглинання кисню при внесенні аланіну в концентрації 1 мг/мл виявилися значно нижчими, а при внесенні аланіну в концентрації 40 мг/мл і 0,1 мг/мл до штаму №839 – рівні нулю, як і у випадку з ферментним комплексом штаму №13/16 і аланіном у концентрації 0,1 мг/мл. Не зареєстроване поглинання кисню при внесенні проліну до ферментного комплексу штаму №13/16. Дуже незначне поглинання кисню при внесенні до ферментного комплексу штаму №839 проліну в концентрації 0,1 мг/мл, тоді як з ферментними комплексами аерококів, виділених з сечостатевої системи й проліном у концентрації 40 мг/мл і 1 мг/мл реєструються найвищі показники. Небагато нижчі, ніж при внесенні аланіну й проліну - показники при внесенні фумарової, лимонної кислот і гліцину до комплексів аерококів сечостатевої системи. Не відбувається поглинання кисню при внесенні до ферментних комплексів аерококів, виділених із ротової порожнини, фумарової кислоти, а також при внесенні гліцину до одного з найактивніших антагоністів - штаму №13/16. У разі ферментного комплексу штаму №839 і гліцину показники надзвичайно низькі.

Результати вивчення аерококів виділених із сечостатевої системи показали, що при внесенні гліцеральдегіду до суспензії цільних мікробних клітин поглинання кисню електродом Кларка нижчі, ніж при внесенні його до ферментних комплексів цих же штамів.

Подібні результати одержані і при внесенні гліцеральдегіду до аерококів, виділених з ротової порожнини. В той же час, одержані високі показники при додаванні пірувату до цільних мікробних клітин усіх досліджуваних штамів аерококів ротової порожнини. А ось у випадку з аерококами сечостатевої системи (штами №22, №94) і піруватом – поглинання кисню не відбувається. Відносно глутатіону і аерококів сечостатевої системи реєструється зниження поглинання кисню, практично удвічі, тоді як у випадку з глутатіоном і переважної кількості штамів аерококів ротової порожнини поглинання кисню не відбувається зовсім, а у інших штамів активність знизилася в три - чотири рази порівняно з даними по ферментних комплексах. При внесенні гліцерофосфату до цільних мікробних клітин обох груп аерококів, спостерігається схожа картина: показники поглинання кисню електродом Кларка рівні 0.

При вивченні впливу ауксинів на антагоністичні властивості аерококів, виділених із нестерильних порожнин з'ясовано: максимальний антагоністичний вплив на тест – культури, при їх рясному рості в контролях, всі досліджувані штами аерококів проявляють на середовищі, доповненому 15% кінською сироваткою, 1% (40% р-ну) глюкози й комплексом ауксинів, який складається з Na -? - гліцерофосфату і гліцеральдегіду – для аерококів, виділених з ротової порожнини, і аланіну, проліну – для аерококів, виділених з сечостатевої системи. Звертає на себе увагу відсутність пігменту у P. аеrugіnоsа, при культивуванні на середовищах, доповнених вищезгаданими ауксинами. А також цікавий факт наявності не тільки зон повної затримки росту тест – мікробів, виділеними штамами аерококів, але і зон із пониженою інтенсивністю росту.

Нами була вивчена чутливість аерококів різних груп до представників основних груп антибіотиків. До метіциліну - представнику напівсинтетичних пеніцилінів, основна маса аерококів, виділених з сечостатевої системи й калу – помірно – чутливі, як і у випадку з аерококами, виділеними зі слизової оболонки ротової порожнини.

До представника цефалоспоринів – цефазоліну обидві групи аерококів високо чутливі. При вивченні чутливості до представників групи тетрацикліну (хлортетрацикліну і доксіцикліну) виявлено, що аерококи, виділені з сечостатевої системи, проявляють стійкість, в той час, як усі аерококи ротової порожнини - чутливі. В той же час, при вивченні чутливості до левоміцетину, реєструється висока чутливість аерококів сечостатевої системи і повна резистентність групи найактивніших антагоністів, виділених із ротової порожнини людини.

Також практично не зустрічається стійких до гентаміцину (група аміноглікозидів) штамів аерококів з ротової порожнини, і реєструється практично половина резистентних до нього штамів, виділених із піхви й сечі. Відмінності в чутливості до антибіотиків двох досліджуваних груп аерококів зв’язані, швидше за все, з відмінностями у складі мікробних асоціацій і, умов існування в середовищі, із якого вони були виділені. Відносно представника фторхінолонів – офлоксацину й макролідів – еритроміцину, картина схожа.

З результатів встановлено, що A. vіrіdans, виділені з різних екологічних ніш людського організму: одна група - зі слизової оболонки ротової порожнини, інша - зі слизової оболонки піхви, сечі й калу, при загальних морфологічних, культуральних і біохімічних характеристиках, володіють рядом відмінностей. Відмінності в оксидазній і антагоністичній активності, визначені в раніше проведених дослідженнях, загальні для обох груп аерококів і не залежать від локусу виділення. Відмінності в субстратах окислювання, в їх концентраціях, а також у відношенні до антибактеріальних препаратів знаходяться в прямій залежності від локусу виділення мікроорганізмів. Крім цього, були виявлені індивідуальні відмінності в здатності до окислювання різних метаболітів з відмінними концентраціями усередині груп аерококів, мешканців однієї еконіши організму людини. Слід підкреслити: не дивлячись на те, що всі досліджувані штами аерококів виділені з нестерильних порожнин людського організму, різні ділянки слизових оболонок мають свої особливості, обумовлені фізіологічними функціями, особливостями у складі секрету (високий рівень глікогену, обумовлений впливом естрогену в піхві; наявність ферментів і велика кількість поживних речовин в ротовій порожнині; реакції обміну холестерину і жовчних кислот, синтез вітамінів, біологічно активних речовин в шлунково-кишковому тракті), різниця в рівні рН середовища (різко кисла в піхві, лужна в ротовій порожнині і кишечнику), антимікробними чинниками (бактерицидні речовини слини - лізоцим, інгібін, фагоцитарна активність лейкоцитів), розбіжність у складі мікробних асоціацій. Виказані припущення потребують подальшого ретельного вивчення, як і питання про те, чи є ці відмінності проявами фенотипу або ж вони генетично детерміновані.

У розділі обговорення результатів досліджень в стислій формі приведені результати проведених експериментів, результати реалізації поставлених задач і мети дисертаційної роботи.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі на підставі експериментальних досліджень і теоретичного аналізу наведено нове розв'язання наукових питань, пов'язаних з обґрунтуванням підходів до розробки методів корекції порушень в мікро біоценозі ротової порожнини, завдяки можливості антагоністичного впливу бактерій – продуцентів перекису водню на патогенних і умовно патогенних представників мікросвіту, колонізуючих слизові оболонки нестерильних порожнин організму людини, а також питань перспективності обробки води, водних розчинів в тліючому розряді з метою надання їм антагоністичної активності для ряду патогенних і умовно патогенних бактерій, створення комбінованих препаратів на базі аерококів і активованої води.

2. Встановлено, що зі слизової оболонки ротової порожнини людини виділяються мікроорганізми A. viridans, які є найактивнішими продуцентами перекису водню, продукуючи його в концентрації 0,00250,0008 – 0,01050,002 мг/мл при інкубації протягом 12-24 годин та початковому засіві 1 млрд. кл/мл у МПБ, доповненого 10% капустяним відваром.

3. Доведено антагоністичну дію перекису водню, продукованого виділеними мікроорганізмами, а також активних форм кисню (АФК), що утворюються у водних розчинах, оброблених низькотемпературною плазмою на полірезистентні штами патогенних і умовно – патогенних представників мікробіоценозу (S. pyogenes, S.аureus, S.еpidermidis, S.saprophyticus, S. intermedius, Р.aeruginosa, К. ozaenae, E.coli, C.albicans).

4. Визначені субстрати окислювання аерококів, що дають збільшення поглинання кисню, до яких відносяться: молочна кислота, -гліцерофосфат, гліцеральдегид, піруват, валін, цистін, пролін, підсилюючі продукцію Н2О2 (у 1,5-8 разів) і ведучі до зростання антагоністичної активності (на 20-60%, а в деяких випадках, до 100% і більш).

5. Встановлено, що глутатіон, підвищуючи поглинання О2 на 35-38 %, знижує продукцію Н2О2 до нуля і, відповідно, антагоністичний ефект практично всіх аерококів відносно патогенних і умовно патогенних культур мікроорганізмів, що, мабуть, пов'язане з його антиоксидантною роллю й наявністю у аерококів глутатіон-пероксидази.

6. Виявлені індивідуальні відмінності в здатності до окислювання різних метаболітів з відмінними концентраціями усередині груп аерококів, мешканців одної еконіши організму людини (максимальні коефіцієнти поглинання кисню при окислюванні гліцеральдегіду ферментними комплексами аерококів №13/16 і №167 на фоні зниженої активності штаму №839; активне окислювання -кето-глутарової кислоти ферментними комплексами аерококів №167 і №839, при повній відсутності активності штаму №13/16).

7. Проведений порівняльний аналіз оксидазних і антагоністичних властивостей, а також вивчення спектру субстратів окислювання штамами аерококів, виділених з різних екологічних ніш, виявили достовірні відмінності між штамами аерококів з екогрупп порожнини рота, моче-полових шляхів і вмісту кишечнику, які полягають в істотних відмінностях в активності окислювання субстратів (молочна кислота, -гліцерофосфат, гліцеральдегід, піруват для штамів ротової порожнини і валін, цистін, пролін для штамів моче-полової системи і вмісту кишечнику), а також антибіотикорезистентності (стійкість штамів ротової порожнини до левоміцетинів, резистентність штамів моче-полової системи і вмісту кишечнику до тетрацикліну і представника аміноглікозідів - гентаміцину).

8. Доведена перспективність обробки води, водних розчинів в тліючому розряді з метою надання їм антагоністичної активності відносно патогенних і умовно патогенних бактерій і створення комбінованих препаратів на базі аерококів і активованої води.

9. При вивченні сумісного антагонізму аерококів – продуцентів перекису водню і активованих водних розчинів установлено, що сильні продуценти Н2О2 менш антагоністично активні у відношенні один до одного, ніж у відношенні до слабких продуцентів і менш чутливі до дії активованих водних розчинів, що пов'язане з їх, антиоксидантними системами.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Риженко С.А., Вальчук С.І., Шарун О.В. Дослідження лікувальної дії Aerococcus viridans на моделі стафілококової інфекції // Медичні перспективи. - 2003. - Т.VIII, № 1.-С.34-36 (Шарун