ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ І БІОТЕХНОЛОГІЇ
УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК
Симочко Людмила Юріївна
УДК 574.26.+631.472.74:633.11
БІОЦЕНОТИЧНА ДІЯЛЬНІСТЬ ДОМІНУЮЧИХ БАКТЕРІЙ
РИЗОСФЕРИ ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ
03.00.16 – екологія
AВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИІВ – 2005
Дисертацією є рукопис
Дисертаційна робота виконана в лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук
Науковий керівник – доктор біологічних наук,
професор, академік УААН
Патика Володимир Пилипович
Інститут агроекології та біотехнології УААН
директор інституту
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Головко Ераст Анатолійович
Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України
завідувач відділу алелопатії
доктор біологічних наук
Коць Сергій Ярославович
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України
завідувач відділу симбіотичної азотфіксації
Провідна установа – Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, м. Київ
Захист відбудеться 24.05.2005 року о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 в Інституті агроекології та біотехнології УААН за адресою: вул. Метрологічна, 12, м. Київ, 03143.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН за адресою вул. Метрологічна, 12, м. Київ, 03143.
Автореферат розісланий 22.04.2005 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради Л.І. Моклячук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Мікробний ценоз ґрунту володіє високою чутливістю та значним видовим різноманіттям. Від діяльності ґрунтових мікроорганізмів залежить родючість ґрунтів, урожайність та якість сільськогосподарської продукції, стан навколишнього середовища. Мікробоценоз вважають чітким індикатором стану екосистеми. В умовах підвищеного забруднення, внаслідок використання різних агротехнологій змінюється комплекс мікробіологічних показників, відбуваються якісні та кількісні зміни у функціонуванні мікробного угруповання ґрунту, які не завжди є позитивними.
Ризосфера будь-якої сільськогосподарської культури характеризується специфічним мікробним ценозом, домінуючі види якого беруть участь як у процесах ґрунтоутворення, так і безпосередньо впливають на агрофітоценоз. Важливим завданням сьогодення є вивчення направленості антропогенного впливу на стійкість, інтегрованість та функціонування мікробного ценозу ризосфери озимої пшениці, оскільки остання є однією з стратегічних культур в Україні.
Відомо, що мікробно-рослинні взаємодії не завжди зводяться до трофічних функцій. У багатьох випадках їх обумовлюють метаболічні зв’язки через фізіологічно активні речовини, що продукуються мікроорганізмами і впливають на ріст рослин. Метаболіти домінуючих бактерій ризосфери суттєво впливають на ріст та розвиток озимої пшениці. Виникає необхідність встановити, як змінюється діяльність домінуючих бактерій ризосфери озимої пшениці при застосуванні різних агрозаходів.
???????? ????????? ?????? ????????????? ???????? ?? біоценотичну діяльність ????????? ?????????? ?????? ????????? ??? ??????ки ???????? ????? ????????????? ???????????? ????????? ????????, удосконалення систем землеробства ? ??????? ????????????? ??????????.
Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах НТП Інституту агроекології та біотехнології УААН „Теоретично обґрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологобезпечного використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращення якості умов життя людини” (№ державної реєстрації 0101U003298).
Мета і завдання досліджень. Метою роботи було виявити зміни у функціонуванні мікробного ценозу ґрунту ризосфери озимої пшениці при антропогенному навантаженні, встановити вплив метаболітів домінуючих бактерій на агрофітоценоз озимої пшениці.
Для досягнення поставленої мети виконували наступні завдання:
ь визначити чисельність основних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів, розрахувати коефіцієнти кореляцій між ними, побудувати кореляційні матриці та встановити направленість мікробіологічних процесів у ґрунті при вирощуванні озимої пшениці;
ь дослідити загальну біологічну активність ґрунту за інтенсивністю виділення вуглекислого газу, нітрогеназною, целюлозолітичною активностями та фітотоксичністю ґрунту в умовах антропогенного навантаження;
ь виділити домінуючі бактерії з ризосфери озимої пшениці та вивчити їх культурально-морфологічні, фізіолого-біохімічні властивості;
ь визначити вплив продуктів метаболізму домінуючих бактерій ризосфери на ріст та розвиток озимої пшениці;
ь провести ідентифікацію найбільш активних ізолятів, що стимулюють ріст озимої пшениці.
Об‘єкт дослідження. Біоценотична діяльність ризосферних бактерій озимої пшениці при застосуванні різних агротехнологій.
Предмет дослідження. Мікробний ценоз, як складова ґрунтово-біотичного комплексу агроекосистеми озимої пшениці.
Методи досліджень. Польові досліди – відбір зразків ґрунту у різні фази розвитку озимої пшениці; лабораторні дослідження – визначення чисельності мікроорганізмів різних еколого-трофічних груп ризосфери озимої пшениці при застосуванні різних варіантів удобрення ґрунту, виділення домінуючих бактерій, вивчення їх культуральних, морфологічних властивостей з використанням світлової мікроскопії, фізіолого-біохімічних властивостей та вмісту G+C% в молекулі ДНК, дослідження впливу метаболітів ризосферних бактерій-домінантів на ріст та розвиток озимої пшениці; статистичні – визначення найменшої істотної різниці (НІР0,5) та коефіцієнтів кореляції між чисельністю основних еколого-трофічних груп мікроорганізмів ризосфери озимої пшениці.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне дослідження екології мікробного ценозу ґрунту в чорноземі стаціонарного досліду Миронівського Інституту пшениці ім. В.М. Ремесла УААН.
Показано, як змінюється стійкість, інтегрованість мікробного угруповання ризосфери озимої пшениці та направленість мікробіологічних процесів при використанні різних агрозаходів.
Вперше виділено домінуючі бактерії ризосфери озимої пшениці основних еколого-трофічних груп у динаміці протягом всього онтогенезу озимої пшениці. Досліджено вплив продуктів метаболізму домінуючих бактерій ризосфери на ріст та розвиток озимої пшениці.
Вперше встановлено відсоткове співвідношення серед домінантів різних еколого-трофічних груп бактерій ризосфери озимої пшениці фітотоксичних ізолятів та продуцентів ріст-стимулюючих речовин залежно від фази розвитку культури, форм і доз добрив.
Визначено найбільш активні бактерії-стимулятори росту та розвитку озимої пшениці, вивчено їх культурально-морфологічні, фізіолого-біохімічні ознаки та вміст G+C% в ДНК.
Науково-практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані представляють собою наукову основу, яка дозволить встановити направленість антропогенного впливу на ґрунти, теоретично обґрунтувати і, в майбутньому, розробити практичні заходи щодо екологобезпечного використання природно-ресурсного потенціалу агроекосистем. Показана доцільність використання органічних та органо-мінеральних добрив у сівозміні при вирощуванні озимої пшениці на чорноземі. Вивчено стимулюючий ефект домінуючих бактерій ризосфери, виділено 5 найбільш активних штамів, які, в подальшому, можна використати для підвищення врожайності озимої пшениці.
Особистий внесок здобувача. Автор брала безпосередню участь у проведенні польових досліджень, виконанні лабораторних робіт і статистичній обробці результатів, підборі та обробці літературних матеріалів, у теоретичному обґрунтуванні та аналізі одержаної наукової інформації, в розробці наукових положень та висновків. У проведенні досліджень та їх узагальненні частка автора складає 80%.
Апробація роботи. Результати досліджень доповідались на Всеукраїнській науково-практичні конференції молодих вчених і спеціалістів із проблем виробництва зерна в Україні (5–6 березня 2002 р., м. Дніпропетровськ); Міжнародній науковій конференції “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми”, присвяченій 40-річчю пам‘яті академіка М.В. Рево (15–16 квітня 2002 р., м. Чернігів); Міжнародній науковій конференції “Сталий розвиток агроекосистем” (17–20 вересня 2002 р., м. Вінниця); Всеукраїнській конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (28–30 жовтня 2002 р., м. Київ).
Публікації результатів досліджень. За результатами досліджень опубліковано 6 наукових праць, з них 3 у фахових виданнях.
Структура та об‘єм роботи. Загальний обсяг дисертаційної роботи складає 201 сторінку машинописного тексту, включає 37 рисунків та 76 таблиць. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів експериментальної частини, висновків, пропозицій виробництву, переліку посилань та додатків. Перелік літературних джерел складається з 176 найменувань, в тому числі 51 іноземного.
Подяки. Висловлюю щиру подяку науковому керівнику академіку УААН, д.б.н, проф. В.П. Патиці, д.с.-г.н. О.В. Шерстобоєвій та колективу лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології УААН; завідувачу відділу сортової агротехніки В.І. Русанову та співробітникам Миронівського Інституту пшениці ім. В.М. Ремесла УААН, завідувачу Закарпатського територіального відділу карантину рослин УААН к.б.н. А.М. Садляк; к.с.-г.н. О.С. Дем‘янюк, к.б.н. В.О. Чумаку, к.б.н. Ф.Ф. Куртякуза допомогу у проведенні наукових досліджень за темою дисертації.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
На підставі узагальнених даних джерел літератури описано ґрунт, як складову біогеоценозу. Висвітлено екологічну характеристику мікробного ценозу ґрунту, зокрема його просторову, таксономічну та функціональну структури. Проаналізовано літературні дані стосовно вивчення взаємовідносин мікроорганізмів з рослинами. Наведені відомості про вплив антропогенного навантаження на ґрунтову мікрофлору.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлений у дисертаційній роботі експериментальний матеріал є результатом досліджень, виконаних у лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології УААН протягом 2001–2004 років.
Матеріалом досліджень слугували зразки ґрунту стаціонарного досліду Миронівського інституту пшениці ім. В.М. Ремесла УААН.
ґрунт – повнопрофільний чорнозем глибокий, малогумусний, слабовилугований, середньосуглинкового гранулометричного складу.
Гумусовий ґрунт 38–42 см, карбонати містяться на глибині 45–65 см, рівень залягання ґрунтових вод 5,5–6,0 м від поверхні ґрунту. Вміст в орному шарі гумусу 4,18 % (фон), рухомого фосфору (за Труогом) 12,8–18,9 мг, обмінного калію (за Масловою) – 9,5–12,7 мг/100г ґрунту, рН сольове – 5,2–6,5; гідролітична кислотність – 1,7–2,2 мг.екв на 100 г ґрунту; ступінь насиченості основами – 81–92,6 %.
Погодні умови за роки досліджень в цілому протягом вегетації озимої пшениці були дуже вологими і теплими. середньорічна температура повітря становила 8,5?С, а середня сума опадів 604 мм. Агротехнічні умови вирощування озимої пшениці в досліді типові виробничим умовам зони. Сорт пшениці Миронівська 61.
Система обробітку ґрунту, догляд – загальноприйняті для зони правобережного Лісостепу України.
Розміщення ділянок систематичне–послідовне. посівна площа ділянок у десятипільній сівозміні (горох > озима пшениця > цукровий буряк > кукурудза > горох > озима пшениця > цукровий буряк > озима пшениця > озима пшениця) – 89 м2, облікова – 50 м2. Повторність триразова.
Культура беззмінного посіву – пшениця озима Миронівська 61. Площа ділянок: посівна – 149,25 м2, облікова – 100,19 м2. Розміщення варіантів у досліді систематичне–послідовне. Повторність триразова.
З мінеральних добрив використовували: аміачну селітру, суперфосфат простий, калій хлористий; з органічних – гній напівперепрілий.
Схема досліду:
І-й стаціонар – з 1929 року сівозміна (попередник горох)
1. Контроль (без добрив)
2. Гній 30т/га
3. Гній 30т/га+ N60 P60 K60
4. N60 P60 K60
5. N120 P120 K120 | ІІ-й стаціонар – з 1929 року монокультура озимої пшениці
6. Контроль (без добрив)
7. Гній 30т/га
8. Гній 60т/га
9. N60 P60 K60
10. N120 P120 K120
Зразки ризосферного ґрунту відбирали кілька разів за сезон у основні фази розвитку озимої пшениці, а саме – кущіння, трубкування, цвітіння, молочно-воскова стиглість. Мікробіологічні аналізи з визначення чисельності основних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів проводились за загальноприйнятими методиками (Звягінцев, 1991; Селібер, 1962). Направленість мікробіологічних процесів у ґрунті характеризували за допомогою коефіцієнтів мінералізації-іммобілізації, оліготрофності та педотрофності.
Токсичність ґрунту відібраних зразків визначали за методикою О. Берестецького (1971) та А. Гродзинського (1965), а біологічну активність ґрунту – за методом В. Штатнова (1952). Целюлозолітичну активність ґрунту визначали за модифікованим методом Крістенсена (1983). Дослідження нітрогеназної активності ґрунту проводили, використовуючи ацетиленовий метод Харді в модифікації М. Умарова (1986). Визначення домінуючих бактерій, їх морфологічних, культуральних, фізіолого-біохімічних властивостей проводили за стандартними методиками (Герхардт, 1983; Заварзін, 1974; Ковач, 1956; Селібер, 1962; Теппер, 1987). Визначення вмісту G+C% в молекулі ДНК бактерій проводили, використовуючи метод теплової денатурації (Блохіна та ін., 1976; Леванова, 1979). Стимулюючу та рістінгібуючу дію метаболітів мікроорганізмів на рослини вивчали в лабораторних умовах (Красильніков, 1958; Родзинський та ін., 1990).
Статистичну обробку отриманих результатів проводили за доспєховим (1985) та з використанням комп‘ютерної програми “Statistica” для статистичного аналізу даних Windows Statistica 2000 (фірма-випускник StatSoft Inc. USA).
ЕКОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА МІКРОБНОГО ЦЕНОЗУ ҐРУНТУ
ДОСЛІДЖУВАНОЇ АГРОЕКОСИСТЕМИ
Чисельність основних еколого-трофічних груп мікроорганізмів у ризосфері при застосуванні різних агротехнічних заходів. Мікробіологічні дослідження чисельності основних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів показали, що протягом всього періоду онтогенезу озимої пшениці відбувається перебудова мікробного ценозу ґрунту, яка залежить не тільки від природних умов, а й від агрозаходів, що використовуються. Так, ризосферний грунт у фазу кущіння характеризувався інтенсивним розвитком зимогенної мікробіоти, зокрема: амоніфікаторів, целюлозоруйнівних мікроорганізмів, розвитком асоціативних азотфіксаторів та мінімальним вмістом представників мікрофлори розсіювання і мікроміцетів, порівняно з тим ґрунтом, який був відібраний у інші фази розвитку озимої пшениці та після збирання врожаю.
Використання органічної та органо-мінеральної систем удобрення призводило до значних змін у співвідношенні основних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів, порівняно з неудобреними ділянками. Саме на цих варіантах удобрення при культивуванні озимої пшениці в сівозміні у фазу кущіння спостерігалась мінімальна чисельність мікроміцетів, спороутворювальних бактерій, оліготрофів.
Дослідження ризосферного ґрунту у фазу молочно-воскової стиглості показали, що співвідношення різних еколого-трофічних груп мікроорганізмів та їх чисельність значно змінилися порівняно з мікробним ценозом ризосфери озимої пшениці на початку її онтогенезу. Чисельність амоніфікаторів зменшилась в 3–5 разів залежно від варіантів удобрення. Більш ніж удвічі зменшилась чисельність бактерій, здатних асимілювати мінеральний азот. Слід відмітити значне пригнічення розвитку азотфіксувальної мікрофлори, зокрема Azotobacter. Внесення подвійної дози мінеральних добрив призвело до зменшення чисельності Azotobacter у 6 разів.
Найбільша кількість оліготрофних мікроорганізмів спостерігалась в фазу молочно-воскової стиглості у варіантах із подвійним внесенням мінеральних добрив як у сівозміні, так і в монокультурі. Процес розкладання гумусових сполук ґрунту активізувався на ділянках, де беззмінно культивувалась озима пшениця і вносились мінеральні добрива у подвійних дозах комплексу NPK, про що свідчить збільшення чисельності педотрофів, порівняно з контролем та іншими варіантами удобрення.
Використання помірних доз мінеральних добрив не викликало суттєвих змін у функціонуванні мікробного ценозу ризосфери озимої пшениці. Але, порівняно з тими ділянками, де добрива взагалі не вносилися, умови для розвитку мікробоценозу були кращими, що віддзеркалилось на його структурі та певному співвідношенні різних еколого-трофічних груп мікроорганізмів. Застосування мінеральних добрив комплексу NPK у подвійних дозах викликало негативні зміни як у функціональній характеристиці мікробного ценозу ґрунту, так і його таксономічній структурі. Значно збільшилась кількість спороутворювальних бактерій, мікроміцетів, оліготрофів, педотрофів. Більш виразно цей негативний вплив проявлявся при беззмінному вирощуванні озимої пшениці. Культивування озимої пшениці в сівозміні покращувало екологічний стан мікробного ценозу ризосфери та сприяло зменшенню прояву негативного впливу подвійних доз мінеральних добрив комплексу NPK.
Для оцінки стійкості мікробного угруповання в ризосфері озимої пшениці при беззмінному вирощуванні та в сівозміні, на основі даних про динаміку розвитку мікроорганізмів у досліджуваному ґрунті, проводили встановлення кореляційних зв‘язків. Якщо окремо розглянути дві агроекосистеми вирощування озимої пшениці з точки зору аналізу їх кореляційних плеяд залежно від варіанту удобрення, то простежується чітка закономірність, що вирощування озимої пшениці у сівозміні з використанням органічних і комплексу органо-мінеральних добрив сприяє активізації стійкості та інтегрованості мікробного угруповання ризосфери озимої пшениці (рис. 1).
Беззмінне вирощування озимої пшениці значно поступається вирощуванню в сівозміні за показниками, поданими на рисунку 2.
Навіть внесення органічних добрив у дозі 30 т/га не призводило до збільшення кількості кореляційних зв‘язків і, відповідно, не покращувало інтегрованість мікробного угруповання порівняно із будь-яким варіантом сівозміни, окрім внесення N120P120K120.
Із наведених даних випливає, що застосування такого агрозаходу як сівозміна з використанням органічних та органо-мінеральних добрив збільшує стійкість та інтегрованість мікробних угруповань ризосфери озимої пшениці з міцною структурою трофічних зв‘язків.
А | Б | В
Примітка:
А –ґрунт без добрив; Б – гній 30 т/га;
В – гній 30 т/га + N60P60K60;
Г – N60P60K60; Д – N120P120K120
1 – амоніфікатори;
2– бактерії, що використовують мінер. азот;
3– оліготрофи; 4 – педотрофи;
5 – спороутворювальні бактерії;
6 – актиноміцети; 7 – олігонітрофіли;
8 – азотфіксувальні бактерії;
9 – мікроміцети; 10 – Azotobacter
Г | Д
Рис. 1. Кореляційні плеяди зв‘язків мікроорганізмів різних еколого-трофічних груп у ризосфері озимої пшениці, вирощуваної у сівозміні
А | Б | В
Примітка:
А – ґрунт без добрив; Б – гній 30 т/га
В – гній 60 т/га;
Г – N60P60K60; Д – N120P120K120
1 – амоніфікатори; 2– бактерії, що використовують мінер. азот;
3– оліготрофи; 4 – педотрофи;
5 – спороутворювальні бактерії;
6 – актиноміцети; 7 – олігонітрофіли;
8 – азотфіксувальні бактерії;
9 – мікроміцети; 10 – Azotobacter
Г | Д
Рис. 2. Кореляційні плеяди зв‘язків мікроорганізмів різних еколого-трофічних груп у ризосфері озимої пшениці, вирощуваної у монокультурі
Екологічні показники спрямованості мікробіологічних процесів у ґрунті. Результати наших досліджень показали, що екологічні показники спрямованості мікробіологічних процесів у ризосфері озимої пшениці змінюються протягом онтогенезу та залежать від агротехнічних умов вирощування – доз, форм і видів добрив. Найнижчий показник напруженості мінералізаційних процесів протягом онтогенезу озимої пшениці спостерігався у фазу кущіння. Особливо виразно це проявлялось у сівозміні при застосуванні комплексу органо-мінеральних добрив – гній 30т/га+N60P60K60, де Км-і в середньому складав 1,09. Внесення мінеральних добрив, особливо подвійних доз, призводило до значного збільшення напруженості мінералізаційних процесів, порівняно з вищеописаними варіантами удобрення. У даних варіантах показник мінералізації-іммобілізації був удвічі вищим.
Якщо окремо порівняти блок сівозміни і монокультури, то простежується підвищення коефіцієнту мінералізації-іммобілізації у останньому. Найбільш диферентними фазами розвитку озимої пшениці за коефіцієнтом оліготрофності були фази кущіння та молочно-воскової стиглості. Так, при культивуванні озимої пшениці у сівозміні з використанням органічних (гній 30 т/га) та органо-мінеральних добрив (гній 30т/га+N60P60K60) оліготрофність ґрунту була найнижчою і становила, в середньому, 0,90. найнижчий коефіцієнт оліготрофності при беззмінному вирощуванні озимої пшениці в чорноземі спостерігався при внесенні органічних добрив (гній 30 т/га; 60 т/га) – 1,23, хоча цей показник вищий, ніж у сівозміні.
У фазу молочно-воскової стиглості коефіцієнт оліготрофності значно зріс. Максимального значення Коліг (5,22) набував при культивуванні озимої пшениці в монокультурі з використанням подвійних доз мінеральних добрив (N120P120K120) та варіанті без удобрення. Така ж закономірність спостерігається для коефіцієнта педотрофності.
Найнижче значення Кпед , який складав у середньому 0,96, було відмічено на початку онтогенезу озимої пшениці, культивованої у сівозміні з використанням органічних та органо-мінеральних добрив.
Використання помірних доз мінеральних добрив – N60P60K60 як у сівозміні, так і в монокультурі дещо знижувало значення Кпед, порівняно з контрольним варіантом (без добрив). Натомість подвійні дози мінеральних добрив призводили до підвищення значення коефіцієнта педотрофності, в середньому, на 30%. Фаза молочно-воскової стиглості характеризувалась високим Кпед, який майже в 2,5 раза перевищував значення у фазі кущіння. При чому, ця різниця спостерігалась у всіх варіантах удобрення та на контролі.
БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ ТА БІОГЕННІСТЬ ПЕДОСФЕРИ ПРИ
АНТРОПОГЕННОМУ НАВАНТАЖЕННІ
Інтенсивність виділення вуглекислоти та целюлозолітична активність ґрунту. Інтенсивність виділення вуглекислоти є дуже важливим показником, який визначає загальну біологічну активність ґрунту. Найвищий рівень біологічної активності спостерігався навесні у фазу кущіння, що обумовлено інтенсифікацією усіх мікробіологічних процесів у ґрунті (рис. 3). У сівозміні показник біологічної активності в ризосфері варіював від 49,5 до 71,4 мг СО2/кг ґрунту за добу, а у варіантах монокультури від 39,9 до 59,1 мг СО2/кг ґрунту за добу. Надалі рівень біологічної активності ґрунту поступово знижувався і з усіх чотирьох досліджуваних фаз розвитку озимої пшениці був найнижчим у фазу молочно-воскової стиглості. Мінімальна інтенсивність виділення вуглекислого газу спостерігалась у варіантах з подвійним внесенням мінеральних добрив і дорівнювала у сівозміні – 26,8 мг СО2/кг ґрунту за добу, а при беззмінному вирощуванні озимої пшениці – 18,9 мг СО2/кг ґрунту за добу.
Примітка: І фаза – кущіння – HIP0,5=1,7; ІІ фаза – молочно-воскова стиглість – HIP0,5=1,2
Варіанти удобрення: сівозміна 1 – Контроль (без добрив); 2 – Гній 30т/га; 3 – Гній 30т/га+N60P60K60; 4 – N60P60K60; 5 – N120P120K120, монокультура 6 – Контроль (без добрив); 7 – Гній 30т/га; 8 – Гній 60т/га; 9 – N60P60K60;
10 – N120P120K120;
Рис. 3. Інтенсивність виділення вуглекислого газу при вирощуванні озимої пшениці
на чорноземі
У ґрунті міжрядь інтенсивність виділення вуглекислого газу була меншою порівняно з ризосферним ґрунтом у середньому на 20%. Другим важливим показником, який характеризує біологічну активність ґрунту, є його целюлозолітична активність (рис.4).
Дослідження показали, що в ризосферному ґрунті чисельність целюлозоруйнівних мікроорганізмів у фазу кущіння в середньому на 20–30% більша ніж у фазу молочно-воскової стиглості в усіх варіантах досліду.
Активніше розклад целюлози проходив у ризосферному ґрунті сівозміни у фазу кущіння, де целюлозолітична активність на контролі становила 52%, що на 20% вище порівняно з монокультурою.
Примітка: фаза – кущіння – HIP0,5=1,27; ІІ фаза – молочно-воскова стиглість – HIP0,5=1,54
Варіанти удобрення: сівозміна 1 – Контроль (без добрив); 2 – Гній 30т/га; 3 – Гній 30т/га+N60P60K60; 4 – N60P60K60; 5 – N120P120K120, монокультура 6 – Контроль (без добрив); 7 – Гній 30т/га; 8 – Гній 60т/га;
9 – N60P60K60; 10 – N120P120K120
Рис. 4. Целюлозолітична активність ґрунту при вирощуванні озимої пшениці на чорноземі
При внесенні помірних доз мінеральних добрив відбувалось підвищення чисельності целюлозоруйнівних мікроорганізмів у середньому на 14% порівняно з контролем як у сівозміні, так і у монокультурі.
Найвищий рівень целюлозолітичної активності у сівозміні був на варіанті з гноєм і складав 72,4%. У монокультурі найвища активність розкладу клітковини спостерігалась також при внесенні органічних добрив і становила – 61,1%. Чисельність целюлозоруйнівних мікроорганізмів була на 16% вищою за контроль. Застосування високих доз мінеральних добрив дещо пригнічувало функціонування целюлозоруйнівних мікроорганізмів, їх чисельність зменшилась на 7%, а активність процесу розкладу клітковини – на 10%. При беззмінному вирощуванні озимої пшениці цей негативний вплив був ще більш виразним, чисельність целюлозоруйнівних мікроорганізмів зменшувалась вдвічі, ніж у сівозміні, а целюлозолітична активність – на 20%. Целюлозолітична активність ґрунту у фазу молочно-воскової стиглості зменшилась в середньому на 25%, а чисельність целюлозоруйнівних мікроорганізмів на 30% на всіх варіантах удобрення порівняно з фазою кущіння. Загальна тенденція змін залежно від варіанту удобрення була така ж, як і на початку вегетації.
Нітрогеназна активність ґрунту. Потенційна азотфіксуюча активність змінювалась в залежності від виду та дози внесених добрив. Найбільш сприятливі умови для діяльності азотфіксувальної мікробіоти створювались у сівозміні при внесенні органічних та органо-мінеральних добрив, про що свідчить найвищий рівень азотфіксації (35,2–36,0 мкг N2/мл середовища/добу). Внесення помірних доз мінеральних добрив N60P60K60 призводило до зменшення інтенсивності фіксації молекулярного азоту порівняно з органічними добривами. Але порівняно з контролем азотфіксація проходила активніше в середньому на 10% у сівозміні.
При беззмінному вирощуванні озимої пшениці внесення такої ж дози мінеральних добрив призводило до більш значного інгібування процесу азотфіксації порівняно з контролем. Цей показник був майже вдвічі меншим у монокультурі порівняно із сівозміною. Застосування подвійних доз мінеральних добрив значно пригнічувало функціонування азотфіксувальних мікроорганізмів. Рівень нітрогеназної активності зменшився у сівозміні на 20% порівняно з контролем, а в монокультурі – на 40%.
Отже, було встановлено значний інгібуючий вплив мінерального азоту на активність нітрогенази. Беззмінне вирощування озимої пшениці на чорноземі глибокому викликало негативні зміни в угрупованні азотфіксувальних мікроорганізмів, рівень фіксації молекулярного азоту атмосфери зменшився в 2, а в деяких варіантах удобрення – 3 рази у порівнянні з відповідними варіантами сівозміни.
токсичність ґрунту. Важливим показником екологічного стану ґрунту є його токсичність. Отримані результати свідчать про те, що токсичність ґрунту як у сівозміні, так і в монокультурі залежить від виду та дози внесених добрив і змінюється протягом усього вегетаційного періоду озимої пшениці (рис. 5). Так, показник токсичності (% інгібування схожості насіння) був найнижчим у фазу кущіння при внесенні органічних добрив (гній 30 т/га) і складав, відповідно, в ризосферному ґрунті сівозміни 5%, що в 4 рази менше ніж у контрольному варіанті. у монокультурі токсичність ґрунту була мінімальною при внесенні гною (60 т/га) і складала 26%, що в середньому в 1,7 раза менше порівняно з контролем. У ґрунті міжрядь токсичність на цих варіантах була вищою на 45% порівняно з ризосферним ґрунтом.
Застосування подвійної дози мінеральних добрив призводило до зростання рівня токсичності в 1,3 раза порівняно з контролем як у ризосферному ґрунті, так і в ґрунті міжрядь при беззмінному вирощуванні озимої пшениці і в сівозміні. У період дозрівання озимої пшениці токсичність ґрунту зросла в середньому на 45% на всіх варіантах удобрення. Максимальний рівень токсичності спостерігався після збору врожаю, що, на нашу думку, пов’язано зі збільшенням кількості мікроміцетів та спороутворювальних бактерій, зокрема фітотоксичних видів. Найвищим рівнем токсичності характеризувався ґрунт, де вносились подвійні дози мінеральних добрив. у монокультурі цей показник складав 85 %.
Примітка: І фаза – кущіння – HIP0,5=2,13; ІІ фаза – молочно-воскова стиглість – HIP0,5=1,87
Варіанти удобрення: сівозміна 1 – Контроль (без добрив); 2 – Гній 30т/га; 3 – Гній 30т/га+N60P60K60; 4 – N60P60K60; 5 – N120P120K120,
монокультура 6 – Контроль (без добрив); 7 – Гній 30т/га; 8 – Гній 60т/га; 9 – N60P60K60; 10 – N120P120K120;
Рис. 5. токсичність ґрунту при вирощуванні озимої пшениці на чорноземі
Мінімальний рівень токсичності був на варіантах з органічним добривом, в середньому на 15-20% менше за контроль, як при беззмінному вирощуванні озимої пшениці, так і в сівозміні.
ХАРАКТЕРИСТИКА ДОМІНУЮЧИХ БАКТЕРІЙ РИЗОСФЕРИ
ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ
Морфологічно-культуральні ознаки домінуючих бактерій. За період 2002–2003 рр. при вирощуванні озимої пшениці у сівозміні з ризосфери було виділено 257 домінантів, а при беззмінному культивуванні – майже на 30% менше, а саме 191 ізолят. У сівозміні найбільшу кількість домінантів становили амоніфікатори (98 ізолятів), а в монокультурі – спороутворювальні бактерії (67 ізолятів).
Культивовані на м‘ясопептонному агарі (МПА) бактерії-домінанти – амоніфікатори, що були ізольовані з ризосферного ґрунту, утворювали помітні неозброєним оком колонії за формою двох типів: округлі та сочевичкоподібні. Забарвлення колоній – прозоре, прозоре з білими краями, молочно-біле, кремове. Розмір колоній виділених домінантів в усіх фазах розвитку озимої пшениці – варіабельний, але найбільш розповсюдженими були колонії середнього розміру, величина яких варіювала від 1 до 10 мм. За консистенцією колонії поділялись на щільні, ті, що розмащуються по поверхні та водянисті. Поверхня колоній, здебільшого, була гладенькою, блискучою, але зустрічалися зморшкуваті, нерівні блискучі, гладенькі матові колонії. Профіль – випуклий, напіввипуклий та плаский. При фарбуванні за Грамом домінанти, культивовані на МПА, представляли одну групу – грамнегативні палички різної конфігурації, які в мазках мали рожеве забарвлення, розміщувались попарно, ланцюжками та, зрідка, поодиноко.
Домінуючі бактерії, культивовані на крохмаль-аміачному агарі (КАА), в усі фази розвитку озимої пшениці незалежно від варіанту удобрення мали округлу форму. Колір колоній був різноманітним – білий напівпрозорий, білий, молочно-білий, жовтий, рожево-оранжевий, кремовий. За розміром, колонії поділялися на точкові (менше 1 мм) та середні, розміром від 1 мм до 10 мм. Поверхня у всіх виділених домінантів була або гладенькою блискучою, або матовою. Профіль – плаский або випуклий, край рівний (в більшості варіантів), нерівний та хвилеподібний. Консистенція – водяниста, щільна, в‘язка у поодиноких випадках або розмащувалась по поверхні. При фарбуванні за Грамом всі бактерії – грамнегативні дрібні палички (в більшості мазків) та палички середнього розміру.
Більшість колоній спороутворювальних бактерій мали біле забарвлення. Поодиноко зустрічались колонії кремового кольору, білі з напівпрозорим краєм та жовті. На початку онтогенезу озимої пшениці у ризосфері спостерігались спороутворювальні домінанти точкового або середнього розміру. Крупні за розміром колонії були виявлені у фазу молочно-воскової стиглості як у сівозміні, так і в монокультурі, а також у фазу цвітіння. Форма – округла, сочевичкоподібна, іноді грибоподібна. У початковій фазі розвитку домінанти мали гладеньку блискучу поверхню колоній, випуклий профіль та хвилеподібний край колоній. Наприкінці розвитку озимої пшениці переважали бактерії, колонії яких мали суху, зморшкувату поверхню, плаский профіль та нерівний край колоній. Консистенція – щільна (в більшості) або розмащувалась по поверхні. При фарбуванні за Грамом всі досліджувані ізоляти бактерій відносилися до грампозитивних, в основному, короткі товсті палички або палички середнього розміру з чітким контуром. Розміщення, здебільшого, поодиноке, зрідка парами або короткими ланцюжками.
Фізіолого-біохімічна характеристика домінуючих бактерій. Бактерії–амоніфікатори є аеробними мікроорганізмами, оксидазо- та каталазопозитивними, переважна більшість ізолятів здатна утворювати флюоресцируючий пігмент та розріджувати желатину; ізоляти, яким не притаманна наявність флюоресцируючого пігменту, найчастіше спостерігались у ризосфері озимої пшениці, що вирощувалась у сівозміні. Порівняльний аналіз тест властивостей, які спостерігались у досліджуваних ізолятів, із даними визначника Берджі дав змогу віднести даних домінантів до роду Pseudomonas.
Ізоляти виділених домінантів із ризосфери озимої пшениці, що використовують мінеральний азот, каталазо- та оксидазопозитивні, не утворюють спори. Досить суттєво спостерігається варіабельність ізолятів за наявністю чи відсутністю флюоресцируючого пігменту. Серед 148 ізолятів не проявляли флюоресценцію 35 ізолятів, здебільшого у ранні фази розвитку озимої пшениці, а саме кущіння та трубкування. На ці фази припадало близько 3/4 всіх проаналізованих бактерій-домінантів. Властивості виділених ізолятів дали змогу віднести даних домінантів до роду Pseudomonas.
Серед спороутворювальних домінантів ризосфери озимої пшениці 2/3 всіх ізолятів є аеробними мікроорганізмами, 1/3 – факультативними анаеробами. Хоча всі ізоляти виявились каталазопозитивними, значна варіабельність спостерігалася при проведенні тесту на оксидазу. Кожен ізолят здатен утворювати спори. Порівняльні дані про фізіолого-біохімічні властивості спороутворювальних бактерій дали змогу віднести їх до роду Bacillus.
ЕКОЛОГІЧНА РОЛЬ ДОМІНУЮЧИХ БАКТЕРІЙ В БІОЦЕНОЗІ
Фітотоксичні бактерії у ризосфері озимої пшениці. Загалом з 152 ізолятів домінантів-амоніфікаторів 37 виявились фітотоксичними
Найбільш фітотоксичні ізоляти були виділені у фази цвітіння та молочно-воскової стиглості при беззмінному вирощуванні озимої пшениці у варіантах із подвійним внесенням мінеральних добрив(N120P120K120). Всього на цих варіантах було виділено 5 ізолятів, які інгібували ріст та розвиток рослин на 50-75%. Кількість фітотоксичних ізолятів амоніфікаторів, виділених з ризосфери озимої пшениці, вирощуваної в монокультурі, у фази цвітіння та молочно-воскової стиглості (14 ізолятів) була у двічі більшою порівняно з кількістю фітотоксичних домінантів у сівозміні (7 ізолятів).
токсичний вплив метаболітів ізолятів бактерій, які здатні використовувати мінеральний азот, на ріст та розвиток рослин збільшувався від початкових стадій розвитку озимої пшениці до кінцевих. Фактично, спостерігається та ж сама закономірність, що й для амоніфікаторів. Ймовірно, що на кінцевих фазах розвитку рослин в ризосфері створюються більш сприятливі умови для життєдіяльності фітотоксичних форм мікроорганізмів. Особливо це чітко простежується у варіантах беззмінного вирощування озимої пшениці з внесенням подвійних доз мінеральних добрив та у контролі. внесення комплексу органічних та органо-мінеральних добрив призводило до зниження кількості фітотоксичних бактерій–домінантів, здатних асимілювати мінеральний азот. Цей факт також підтверджувався низьким рівнем токсичності ґрунту у даних варіантах удобрення. Загалом, із 148 досліджуваних ізолятів бактерій, що асимілюють мінеральний азот, 60 в тій чи іншій мірі інгібували проростання насіння озимої пшениці. Ця кількість ізолятів складає близько 41% від загальної чисельності домінантів, що виділені з ризосфери озимої пшениці протягом 2002–2003 років.
Екологія спороутворювальних бактерій-домінантів відрізнялась від попередніх еколого-трофічних груп ґрунтових бактерій тим, що серед них виявлено найбільшу кількість фітотоксичних ізолятів, які в деяких варіантах повністю затримували ріст тестових рослин. Найбільш сприятливі умови для розвитку фітотоксичних спороутворювальних бактерій створювались в ризосфері озимої пшениці на пізніх етапах її розвитку, особливо це чітко проявлялось при беззмінному її культивуванні. Загалом, із 138 ізолятів спороутворювальних бактерій-домінантів фітотоксичність проявили 103, що складає близько 75%.
Ризосферні бактерії – стимулятори росту озимої пшениці. Дослідження стимулюючої дії на ріст озимої пшениці з боку домінуючих бактерій-амоніфікаторів показали, що останні є досить ефективними стимуляторами, оскільки з усіх досліджуваних ізолятів амоніфікаторів майже третина позитивно впливала на проростання тест-об‘єктів (37 ізолятів у сівозміні, 11 – у монокультурі). Кількість бактерій-стимуляторів серед домінантів, здатних використовувати мінеральний азот, порівняно з амоніфікаторами була меншою. Загалом, у сівозміні культуральні рідини 28 ізолятів бактерій, здатних асимілювати мінеральний азот мали ріст-стимулюючу дію на рослини, а в монокультурі – 11 ізолятів. Найбільшу кількість мікроорганізмів, які стимулювали ріст рослин, було виділено на початкових фазах розвитку озимої пшениці, у варіантах, сівозміни, де застосовувались органічні (гній 30 т/га) та органо-мінеральні добрива (гній 30 т/га + N60P60K60).
При дослідженні спороутворювальних бактерій встановлено значну кількість ізолятів, які не впливали на рослини, тобто були нейтральними. Натомість жоден ізолят не проявив стимулюючого ефекту
серед різних еколого-трофічних груп ризосферних бактерій озимої пшениці найбільш високий стимулюючий ефект мали бактерії-амоніфікатори. Серед них 5 ізолятів (304, 310, 3303, 802, 6806) мали найвищий показник стимулюючої дії на рослини при концентрації культуральної рідини 1:50. було проведено дослідження оптимальної концентрації культуральної рідини цих ізолятів, яка б забезпечувала максимальний стимулюючий ефект на розвиток озимої пшениці. Стимулююча активність ізолятів 304, 310, 3303, 802, 6806 при досліджуваних концентраціях культуральної рідини коливалась в межах 77,4–98,8% (табл. 1). Максимальний стимулюючий ефект на ріст озимої пшениці з боку ізолятів 304, 310, 3303, які виділені з ризосфери озимої пшениці у фазу кущіння в сівозміні, спостерігався при концентрації культуральної рідини 1:100.
Ізолят 310 при цій концентрації показав найбільший стимулюючий ефект серед всіх досліджуваних штамів. Ізоляти 802, 6806, що виділені з ризосфери озимої пшениці у фазу трубкування при концентраціях 1:50 та 1:100, поступалися стимулюючим ефектом трьом попереднім ізолятам.
Таблиця 1
Стимулюючий ефект амоніфікаторів-домінантів при різних концентраціях культуральної рідини
Номер ізоляту | Стимулюючий ефект різних розведень культуральної рідини ізолятів, %:
1:50 | 1:100 | 1:200
304 | 93,3 | 98,5 | 90,2
310 | 96,7 | 98,8 | 91,4
3303 | 91,4 | 96,9 | 89,3
802 | 81,7 | 83,4 | 96,8
6806 | 77,4 | 81,5 | 95,5
Однак, при концентрації 1:200, в якій ізоляти 304, 310 та 3303 проявляли меншу стимулюючу дію на рослини, ізоляти 802 та 6806 активізували свій вплив до 96,8 і 95,5% відповідно.
Таксономічна належність штамів домінуючих бактерій ризосфери – активаторів росту озимої пшениці. Ми проводили ідентифікацію найбільш активних бактерій, що стимулюють ріст та розвиток озимої пшениці. Такими штамами виявились №№ 304, 310, 802, 3303 та 6806, які за морфо-культуральним та фізіолого-біохімічними властивостями відносяться до роду Pseudomonas. Результати досліджень наведені у таблиці 2.
Таблиця 2
Ідентифікація домінуючих ризосферних бактерій-стимуляторів росту озимої пшениці
№ шта-му | Тпл*
ДНК,
0С | Вміст G+C,% | Забар-влення за Грамом | Ріст при
t-420С | Відно-шення до кисню | Наявність | Флюорес-цируючий пігмент | Розрід-ження желатини
каталази | оксидази
304 | 93,8 | 59,75–– | аероб | + | + | +–
310 | 94,2 | 60,73–– | аероб | + | + | +–
3303 | 94,0 | 60,24–– | аероб | + | + | +–
802 | 96,5 | 66,34–– | аероб | + | + | + | +
6806 | 96,2 | 65,60–– | аероб | + | + | + | +
Типовий# Pseudomоnas putida | 59,4–62,5–– | аероб | + | + | +–
Типовий# Pseudomоnas putida | 62,3– 66,4–– | аероб | + | + | + | +
Примітка: Тпл* – температура плавлення ДНК.
# – згідно Мандель, Блохіної та Леванової, визначника Берджі.
Температура плавлення досліджуваних штамів варіювала в межах 93,80С –96,50С. Найвищу температуру плавлення мали штами 802, 6806, які виділені з ризосфери озимої пшениці у фазу трубкування на варіантах з органічною та органо-мінеральною системами удобрення. За морфо-культуральними ознаками – це були грамнегативні палички середнього розміру, які утворювали білі напівпрозорі округлі колонії. Відповідно вміст G+C% у штама 802 складав 66,34%, а у 6806 – 65,60%. Слід відмітити, що ці штами утворювали флюоресцируючий пігмент на середовищі Кінга В, мали позитивні тести на оксидазу та каталазу, а також не росли на середовищі при 420С. Розрідження желатини здійснювали досить інтенсивно. Вже на другу-третю добу було відмічено розрідження майже 1/3 від всієї кількості желатини. Наведені штами відносяться до Pseudomonas fluorescens.
Досліджувані штами 304, 310 та 3303. які були виділені з ризосфери озимої пшениці, культивованої у сівозміні на варіантах удобрення –– гній 30 т/га (штами 304, 3303) та гній 30 т/га+N60P60K60 (шт. 310) у фазу кущіння, мали наступні межі температури плавлення: 93,8–94,20С. Відповідно до цих температур вміст G+C% в молекулі ДНК даних штамів складав: штам 304 –59,75%; штам 310 – 60,73%; штам 3303 – 60,24%. Окрім цього домінанти-стимулятори утворювали молочно-білі колонії, округлої форми з випуклим профілем. Морфологія клітин – дрібні палички, грамнегативні, оксидазо- та каталазопозитивні. Враховуючи вміст G+C% в молекулі ДНК, культурально-морфологічні та біохімічні властивості, штами 304, 310 та 3303 відносяться до Pseudomonas putida.
ВИСНОВКИ
1. Оптимальні умови для функціонування ризосферної мікробіоти створюються при культивуванні озимої пшениці у сівозміні з використанням органічних та органо-мінеральних систем удобрення, про що свідчить утворення стійкого та інтегрованого мікробоценозу з найбільшою кількістю міцних трофічних зв‘язків серед різних функціональних груп мікроорганізмів.
2. Беззмінне вирощування озимої пшениці з використанням мінеральних добрив N120P120K120, викликає негативні зміни у мікробному угрупованні ризосфери. Збільшується оліготрофність ґрунту, зростає напруженість мінералізаційних процесів та ступінь розкладання органічної речовини ґрунту. Порушується стійкість та інтегрованість мікробного ценозу.
3. Інтегральний показник біологічної активності ґрунту змінюється в залежності від фази розвитку озимої пшениці та використання агротехнічних заходів. Целюлозолітична активність, інтенсивність виділення вуглекислого газу, нітрогеназна активність зменшуються при беззмінному культивуванні озимої пшениці з внесенням подвійних доз мінеральних добрив. Значно підвищується рівень токсичності ґрунту, що свідчить про негативні наслідки антропогенного
