НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Сілонова Наталія Борисівна

УДК 577.121:636.92

Метаболічні процеси в організмі кролів за умов створення стану штучного вуглекислотного гіпобіозу

03.00.04. – біохімія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, доцент

Мельничук Сергій Дмитрович,

Національний аграрний університет,

директор Української лабораторії

якості та безпеки продукції АПК,

проректор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович, Львівська

національна академія ветеринарної медицини

ім.С.З. Гжицького, професор кафедри органічної

і неорганічної хімії, директор НДІ біотехно-

логічних основ підвищення продуктивності тварин

кандидат біологічних наук,

провідний науковий співробітник,

Михайловський Володимир Олегович,

в.о. зав. відділом регуляції обміну речовин

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

Національної академії наук України

Провідна установа – Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “16” червня 2005 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, Київ – 41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. № 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, Київ – 41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, к. 41

Автореферат розісланий “12 травня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Калінін І.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Формування гіпобіотичного стану є пристосовною ознакою, властивою рослинам і тваринам, обумовленою наявністю у живому організмі спеціалізованих систем, здатних забезпечувати виживання організму, що потрапив в екстремальні умови, існування в яких може привести до його загибелі.

Найвагоміші досягнення у вивченні цієї проблеми пов’язані з дослідженнями П. Бахметьева (1900), О.В.Палладіна (1943), П.В. Шмідта (1948), H.T. Meryman (1966), А.М. Голдовського (1977), H. Swan (1981), М.І. Калабухова (1985), Р.С. Ушатинської (1990), P.W. Hochachka (1996), R.G. Boutilier (1997), K.B. Storey (1997), Д.О. Мельничука (2000). Стан зниженої життєдіяльності формується як складний комплекс морфо-фізіологічних перебудов на рівні організму, тканини й клітини за впливу різких змін температури, зневоднення, дефіциту корму і проявляється у зниженні інтенсивності загального метаболізму. Він закріплений генетично, як норма реакції, і формується на постійних видоспецифічних стадіях та етапах індивідуального розвитку організму. На основі цих досліджень виникли такі розділи науки як кріобіологія та кріомедицина.

Хоча було відомо давно, що перехід організму в стан гіпобіозу зумовлюється змінами вмісту СО2 та О2, а поєднання холоду і гіперкапнії значно посилює цей ефект (В.Е. Маршак 1969), однак результатам досліджень вуглекислотного гіпобіозу протягом тривалого часу не приділялося достатньої уваги. Лише після того як були з‘ясовані механізми карбоксилювання та декарбоксилювання у тканинах тварин, досліджено роль вуглекислоти в регуляції метаболізму в організмі та значення згаданих реакцій у процесах біосинтезу та біоенергетики, багато дослідників почали вивчати роль та механізми впливу вуглекислоти на процеси обміну речовин у стані гіпобіозу (H.G. Wood, C.Н. Werkman (1969), М.Ф.Гулий (1978), Д.О. Мельничук (1989), A. Malan (1989), В.О. Михайловський (2000), С.П. Роговський (1995), С. Д. Мельничук (1995).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася у проблемній науково-дослідній лабораторії біохімії гіпобіозу тварин (зав. лабораторії д.б.н. Мельничук С.Д.), що функціонує на базі кафедри біохімії тварин, якості та безпеки сільськогосподарської продукції Національного аграрного університету, згідно плану науково-дослідних робіт № 110/98-пр “Вивчення впливу різних форм вуглекислоти на розвиток стану штучного гіпобіозу та розробка технологій переведення організму тварин, тканин та клітин в стан штучного гіпобіозу”( № державної реєстрації 01034U005378 ).

Мета роботи та завдання. Основною метою даної роботи було дослідити механізми дії вуглекислоти на основні ланки метаболічних процесів у динаміці формування й виходу із штучного гіпобіозу кролів з використанням розробленої нами біомоделі.

Для досягнення поставленої мети необхідно було виконати наступні завдання:

- розробити нову біомодель та встановити оптимальні умови щодо створення стану штучного гіпобіозу для кролів, тобто для зовсім нового біологічного об`єкту;

- вивчити фізіолого-біохімічний стан організму, зміни вмісту газів та рівня рН, а також – інтермедіатів гліколізу і циклу трикарбонових кислот у кролів за умов динаміки їх входження у стан штучного гіпобіозу;

- з`ясувати особливості окисних процесів, вуглеводного й азотового метаболізму у компартментах клітин печінки у стані штучного вуглекислотного гіпобіозу кролів;

- дати порівняльну характеристику активності ферментів та окисно-відновного стану гепатоцитів кролів за умов штучного гіпобіозу.

Об’єкти досліджень: інтермедіати, ензими, компартменти гепатоцитів, кров, кролі.

Предмет досліджень: стан зниженої життєдіяльності, метаболічні процеси за даних умов, ферментативні реакції, окисно-відновний стан.

Методи досліджень: спектрофотометричні, хроматографічні, ензиматичні, потенціометричні, фізико-хімічні, ультрацентрифугування та ін.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено нову біомодель та встановлено оптимальні умови щодо створення стану штучного гіпобіозу для кролів, тобто для зовсім нового біологічного об`єкту, якому цей стан не є властивим. На основі вивчення змін фізіолого-біохімічних показників, концентрації метаболітів гліколізу та циклу трикарбонових кислот, величини рН та вмісту газів у крові з`ясовано динаміку входження тварин у стан штучного гіпобіозу. Показано, що змодельований стан характеризується розвитком компенсованого респіраторного ацидозу.

Встановлено, що на початкових етапах формування гіпобіотичного стану, внаслідок зниженого забезпечення тканин киснем, активуються гліколітичні процеси. Власне гіпобіоз характеризується зростанням активності глюконеогенезу, що регулюється і контролюється рівнем рН та вмістом метаболітів проміжного обміну.

За результатами визначення вмісту малату, оксалоацетату й ?-кетоглутарату, активності ізоцитратдегідрогенази і малатдегідрогенази встановлено підвищення інтенсивності карбоксилювання ?-кетоглутарату та пірувату відповідно та зниження декарбоксилювання ізоцитрату. Зміщення рівноваги між процесами карбоксилювання та декарбоксилювання при моделюванні штучного гіпобіозу викликає гальмування інтенсивності функціонування ЦТК.

Вивчено закономірності змін співвідношення NАD+ / NАDН та NАDР+ / NАDРН у цитозолі та NАD+ / NАDН у мітохондріях гепатоцитів за умов штучного гіпобіозу у кролів. Встановлено важливу роль змін співвідношення СО2 / НСО3- та концентрації NН3+ у регуляції окисно-відновного стану мітохондрій. Це має також важливе значення в регуляції інтенсивності процесів анаболізму-катаболізму та теплопродукції в організмі. Визначено вміст піридиннуклеотидних коферментів в гепатоцитах. Значне зниження вмісту NАD+ та NАDН при незмінному їх співвідношенні свідчить про зниження інтенсивності обмінних процесів за умов формування стану штучного гіпобіозу.

На основі аналізу результатів досліджень вмісту вільних амінокислот, аміаку, сечовини та креатиніну у крові в умовах штучного гіпобіозу встановлено зниження інтенсивності процесів дезамінування, та порушення адаптивних механізмів, що забезпечують стабільність амінокислотного фонду.

Переважна більшість метаболічних змін, які притаманні стану штучного гіпобіозу, до певної міри властива його природному аналогу і свідчить про існування у них подібних основних механізмів формування гіпобіозу ( Голдовський А.М. 1986, Ушатинська Р.С. 1990, Мельничук С.Д. 1995, Storey K.B. 1997 ).

Практичне значення одержаних результатів. Моделювання гіпобіозу у кролів за участю вуглекислоти є новим і перспективним напрямком у біології. Воно пов’язане з проблемою пристосування організмів до умов існування шляхом формуванням у них адаптивних метаболічних механізмів з допомогою впливу вуглекислоти, яка є важливим чинником цих перебудов у процесі еволюції. Використання в нашій роботі для моделювання гіпобіозу природних чинників, які відіграли вирішальну роль у формуванні і вдосконаленні в біологічних системах гомеостатичних механізмів для збереження їх внутрішньої стабільності всупереч зовнішнім змінам є виправданим, актуальним і перспективним. Вивчення фізіолого-біохімічних особливостей цього явища, пошук спільних механізмів формування природного та штучного гіпобіозу створює нові можливості для моделювання гіпобіозу у вищих тварин та людини, відкриває нові перспективи для подальшого його впровадження в хірургічну практику як альтернативу загального знеболення. Використання здатності до підвищення опірності й інших властивостей організму за гіпобіозу може застосовуватися і в імунології, онкології, геронтології та інших галузях медицини.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження є самостійною роботою автора, проаналізовано літературу згідно теми дослідження, проведено експерименти, статистичну обробку одержаних результатів, оформлено дисертаційну роботу. Аналіз одержаних результатів, формулювання основних положень та висновків дисертаційного дослідження обговорювалися спільно із науковим керівником.

Апробація дисертації. Результати досліджень, які увійшли в дисертаційну роботу, доповідалися на: міжнародній науково-практичній конференції // Ветеринарна медицина – 2004: сучасні аспекти розробки маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів (24-31 травня 2004 року, АР Крим, м. Феодосія), науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України (6 липня 2004 року м. Київ), ІХ міжнародній науково-практичній конференції “Проблема ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” 27-30 жовтня 2004 року, ІІ, ІІІ та IV конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК.

Публікації. Результати дисертаційної роботи відображені у 7 статтях, опублікованих у фахових наукових виданнях, а також у 2 матеріалах наукових конференцій.

Структура та об`єм дисертації. Дисертація складається із вступу; огляду літератури; обґрунтування моделі досліджень; методів досліджень; результатів досліджень; аналізу та узагальнення результатів досліджень; висновків; списку використаних джерел. Робота викладена на 126 сторінках основного тексту, містить 7 таблиць та 21 рисунок. Список використаних джерел включає 231 найменування, у тому числі 127 зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. У досліді використовували кролів – самців масою 2.5-3 кг. Тварин утримували у віварії Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК на стандартному раціоні. Для введення тварин у стан штучного гіпобіозу їх вміщували у холодильну камеру, подаючи через наркозну маску газову суміш, яку моделювали за допомогою змішувача газів 122СГ-01.

Експериментальну частину роботи було поділено на такі основні етапи:

1. Розробка моделі штучного гіпобіозу у кролів. Підбір оптимальних співвідношень гіпобіотичних чинників та визначення тривалості їх дії за фізіологічними параметрами: вимірюванням температури тіла, визначенням кількості дихальних рухів та серцевих скорочень.

Дослідження фізіологічних параметрів. Температуру тіла дослідних тварин вимірювали у прямій кишці електронним термометром. Кількість серцевих скорочень визначали за даними електрокардіограми на електрокардіографі ЭК1К-01, частоту дихальних рухів за коливаннями черевної стінки.

2. Дослідження впливу газової суміші (СО2 та О2) при моделюванні вуглекислотного гіпобіозу у кролів. Крім комплексного впливу трьох гіпобіотичних чинників, окремо досліджували і вплив лише холодового фактора.

3. Визначення вмісту інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот в крові у динаміці формування у кролів стану штучного гіпобіозу.

Вміст досліджуваних метаболітів визначали спектрофотометрично за змінами поглинання NAD+ та NADH при 340 нм. Кров у дослідних тварин відбирали з вени вуха через 1.5 годин після початку досліду (початок входженя тварин у стан штучного гіпобіозу), через 3 години (коли тварини перебували у гіпобіозі), та через 1 годину після припинення дії чинників гіпобіозу.

4. Дослідження основних показників кислотно-лужної рівноваги у кролів при моделюванні стану штучного гіпобіозу, яке проводили на аналізаторі газів крові типу ОР-215 “Radelkis” (Угорщина).

5. Визначення показників азотового обміну в крові за стану штучного гіпобіозу. Визначали вміст аміаку за Силаковою (1969), кількість сечовини в сироватці та креатиніну в плазмі крові - на аналізаторі Microlab – 200 (Нідерланди); фонд вільних амінокислот методом рідинної іонообмінної хроматографії на амінокислотному аналізаторі ААА Т 339М виробництва фірми MICROTECHNA-PRAHA (Чехія ).

6. Дослідження інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот в гепатоцитах у стані штучного гіпобіозу. Досліджувані показники визначали методами ферментативного аналізу (В.С. Асатиани 1969).

7. Визначення активності ферментів за створення стану штучного гіпобіозу у кролів. Активність досліджуваних ферментів в цитозольній фракції печінки визначали спектрофотометрично за змінами інтенсивності поглинання NАD+ та NАDН при 340 нм (J. Bergmeyer 1983, B. Kitto 1969).

8. Визначення вмісту нікотинамідних коферментів за умов моделювання гіпобіозу. Вміст нікотинамідних коферментів визначали ферментативними методами за участю відповідних дегідрогеназ: АДГ, ЛДГ, ІДГ, ГДГ (H.A. Krebs 1970).

Отримані результати були опрацьовані методами варіаційної статистики та за допомогою комп`ютерної програми Microsoft Exel.

Обгрунтування моделі для досліджень. Для досягнення мети і вирішення поставлених завдань спочатку необхідно було змоделювати стан штучного гіпобіозу у кролів, потім дослідити комплексний вплив трьох чинників: гіпотермії, гіпоксії та гіперкапнії на розвиток та підтримання їх гіпобіотичного стану, а далі з’ясувати у них перебіг основних метаболічних процесів за умов даного явища.

Підбирали оптимальне співвідношення газів СО2 та О2 у межах 0 – 30% та 60 –5 % відповідно. Критерієм оцінки ефективності впливу гіпобіотичних чинників слугували такі фізіологічні показники як температура тіла, кількість дихальних рухів та серцевих скорочень за хвилину. Встановлено, що при повільному підвищенні концентрації СО2 від 5 % до 20 % та зниженні кисню від 52 % до 6 % протягом 3 годин спостерігається зниження температури тіла, значно сповільнюється дихання та знижується кількість серцевих скорочень.

При моделюванні стану штучного гіпобіозу необхідно було визначити оптимальні параметри й інших гіпобіотичних чинників, одним з яких була температура холодильної камери, яку змінювали у межах від 6 до –40С, спостерігаючи за змінами фізіологічних показників. Було з’ясовано, що максимальне зниження температури тіла тварин спостерігалося при –40С. За коливань температури від 4 до –10С зміни мають менш виражений характер. При –40С спостерігалося раптове зниження температури тіла дослідних тварин до 22-240С, що мало летальні наслідки.

На наступному етапі був підбір тривалості дії чинників гіпобіозу, який здійснювали за часом перебування тварин у досліді від 2 до 6 год. За одержаними даними найсуттєвіше зниження температури тіла дослідних тварин до 26 0С спостерігалося після 6 годинної дії на них чинників гіпобіозу, після 3 та 4 годиннного впливу температура тіла кролів знижувалася до 290С - 28оС і відмічалося сповільнення частоти серцевих скорочень, яке суттєво не залежало від тривалості їх дії.

Отже, в результаті проведених досліджень було підібрано оптимальні співвідношення таких гіпобіотичних чинників: концентрацію газової суміші: (підвищення концентрації СО2 до 20 % та зниження О2 до 6 % на протязі

3 год), температуру холодильної камери (20С) для моделювання стану гіпобіозу на новому біологічному об`єкті (кролях), критерієм оцінки якого були фізіологічні показники (табл. 1), зовнішні ознаки, зміни рН та газів крові.

Дослідження фізіологічних показників у динаміці формування гіпобіозу. При моделюванні стану штучного гіпобіозу у кролів температура тіла починає знижуватися через 1,5 години на 1,90С, на третю годину знижується до 28,70С і різниця становить 9,20С. Таблиця 1

Фізіологічні показники при моделюванні стану штучного гіпобіозу та дії холодового чинника у кролів (М±m, n=10 )

Показ

ники | Стан тварин | інтактнігіпобіоз | після виходу із гіпобіозу | холодовий чинник | після дії

холоду | 1,5 год. | 3год. | 1 год | 1,5 год. | 3год. | 1 год | Температура тіла ( 0С ) | 37, 9± 0,26 | 36,0±0,19* | 28,7 ± 0,95* | 35,8±0,27* | 37,2±0,19 | 37,1±0,25 | 37,4±0,21 | Частота cерцевих скорочень/ хв. | 210±27 | 132±24* | 145 ± 19* | 201±18 | 167±29 | 224±31 | 188±27 | Частота дихаль-

них рухів / хв. | 162±16 | 71±22* | 57 ± 6* | 69±31* | 131±22 | 156±19 | 200±28 | * - Р 0.05 у порівнянні з контролем

Через годину після виходу тварин із стану штучного гіпобіозу температура тіла підвищується, залишаючись на 2,1 0С нижчою у порівнянні з контрольною групою. За дії холодового чинника протягом усього досліду температура тіла тварин не змінюється. За умов штучного гіпобіозу через 1.5 години частота пульсу у тварин знижується на 78, за впливу холодового чинника на 43 скорочення за хвилину. Через 3 год. у групи тварин в стані штучного гіпобіозу кількість серцевих скорочень знижується на 65, за дії холодового чинника дещо зростає. Через годину після виходу з гіпобіозу частота серцевих скорочень у тварин в обох дослідних групах наближається до контролю. Через 1.5 години перебування у досліді кількість дихальних рухів зменшується за умов гіпобіозу на 91, а при впливі холодового чинника на 31. Через 3 год. кількість дихальних рухів у кролів за гіпобіозу продовжує знижуватися до 105, в той час як за дії холодового чинника майже сягає контрольних значень, при виході тварин зі стану штучного гіпобіозу спостерігається незначне підвищення інтенсивності дихання. Зниження фізіологічних показників, яке ми спостерігаємо, за даними літератури властиве як природному гіпобіозу, так і штучно створеному (Мельничук С.Д., Роговський С.П. 1995, Михайловський В.О. 2000).

Дослідження вмісту інтермедіатів циклу трикарбонових кислот та гліколізу в динаміці формуванні штучного вуглекислотного гіпобіозу. У цій серії досліджень показано, що при моделюванні у кролів гіпобіозу вміст глюкози через 1,5 год, на початку входження тварин у стан штучного гіпобіозу, зростає на 40 %, через 3 годин спостерігається подальше її зростання на 75 % порівняно з контролем.

Таблиця 2

Вміст інтермедіатів циклу трикарбонових кислот й гліколізу у крові кролів при моделюванні стану штучного гіпобіозу та за дії холодового чинника (М±m, n=5, мкмоль/мл крові )

Показ

ники

Стан тварин | інтактні |

гіпобіоз | після виходу з гіпобіозу | холодовий чинник | після дії холоду | 1.5 год. | 3 год | 1 год. | 1.5 год | 3 год | 1 год | Лактат | 2,77±

0,15 | 3,57±

0,20* | 4,84±

0,11* | 5,80±

0,11* | 2,75±

0,18 | 3,15±

0,26 | 2,68±

0,26 | Піруват | 0,08±

0,01 | 0,10±

0,01* | 0,09±

0,01 | 0,07±

0,01 | 0,07±

0,01 | 0,06±

0,01 | 0,07±

0,01 | Малат | 0,15±

0,02 | 0,13±

0,01 | 0,15±

0,02 | 0,16±

0,02 | 0,18±

0,01 | 0,17±

0,02 | 0,18±

0,01 | Оксало-ацетат | 0,06±

0,01 | 0,07±

0,01 | 0,07±

0,01 | 0,06±

0,01 | 0,05±

0,01 | 0,05±

0,01 | 0,05±

0,01 | б-?ето-глутарат | 0,11±

0,01 | 0,10±

0,01 | 0,10±

0,01 | 0,10±

0,01 | 0,12±

0,01 | 0,11±

0,01 | 0,12±

0,0110 | Глюкоза (ммоль/л) | 5,12±

0,32 | 7,19±

0,46* | 8,97±

0,57* | 6,33±

0,24 | 5,98±

0,29 | 6,82±

0,31 | 6,54±

0,27 | *- Р<0.05 відносно контролю

Через годину після припинення дії чинників гіпобіозу її вміст помітно знижується. При дії холодового чинника має місце схожа динаміка, але зміни менш виражені. Рівень пірувату і лактату у крові тварин на початку входження їх у стан штучного гіпобіозу підвищувався на 25 % та 29 % відповідно (табл. 2), кількість малату, оксалоацетату і ?-кетоглутарату вірогідно не змінювалася. Через 3 години, коли кролі знаходилися у стані штучного гіпобіозу, рівень пірувату знижувався, порівняно з попереднім показником, але залишався дещо вищим за контроль. Вміст лактату зростав на 75 % щодо контролю. Через годину після припинення впливу чинників гіпобіозу високим залишався лише рівень лактату, інші досліджувані показники знаходилися у межах контролю. При вивченні впливу температурного чинника вірогідних змін вмісту всіх досліджуваних показників не спостерігалося.

Зниження температури тіла кролів за гіпобіозу, зменшення кількості дихальних рухів і серцевих скорочень в наших дослідах узгоджуються з даними літератури і свідчать про зниження інтенсивності метаболічних процесів і енерговитрат в організмі Зростання на початку формування гіпобіотичного стану у тварин рівня глюкози, можливо, пов’язане і з посиленим розщеплення глікогену. В одержаних результатах увагу привертає постійне збільшення вмісту лактату, яке продовжується після припинення дії чинників гіпобіозу, та підвищення вмісту пірувату на початку формування гіпобіотичного стану з подальшим його зниженням. Такі зміни можуть відбуватися при активації гліколізу, коли надлишок пірувату (+25%), що утворився в результаті розщеплення глюкози, відновлюється в лактат (+29%) за участі лактатдегідрогенази. Зниження рівня пірувату та оксалоацетату при подальшому зростанні глюкози та лактату за умов входження тварин у стан штучного гіпобіозу, яке відбувається після 3–х годинної дії гіпобіотичних чинників, може викликатися активацією глюконеогенезу, що є одним з механізмів зв’язування надлишку лактату.

Показники кислотно-лужної рівноваги у стані штучного гіпобіозу та при дії холодового чинника. Відомо, що цілісний організм і кожна його клітина потребують чітко визначеного функціонування кислотно-лужної рівноваги. В процесі еволюції в організмі розвивалися та закріплювалися потужні механізми компенсації порушень його нормального стану, як на рівні окремих органів, так і на молекулярному.

Таблиця 3

Основні показники кислотно-лужної рівноваги у крові кролів

(М±m, n=5)

Показники | Контроль | Гіпобіоз | Холодовий чинник | рН | 7,21±0,02 | 7,12±0,05 | 7,23±0,03 | рО2мм.рт.ст. | 47,7±6,01 | 24,8±0,57* | 37,7±7,79 | рСО2 мм.рт.ст. | 46,4±3,54 | 69,1±4,02* | 38,6±6,52 | СО2заг. ммоль/л | 19,6±2,35 | 24,7±0,88* | 17,1±3,21 | НСО-3ммоль/л | 17,7±1,86 | 22,5±0,93* | 12,9±4,00 | ВЕ ммоль/л | -10,3±1,68 | -7,3±1,73 | -12,5±3,31 | ЕВЕ ммоль/л | -9,7±1,82 | -6,6±1,83 | -12,4±3,47 | * - Р<0.05 відносно контролю

Одним з найважливіших чинників, що визначають ці зміни в обміні речовин при порушенні рівноваги є рН біологічних рідин організму і концентрація СО2 в них. Тому важливо було дослідити кислотно- лужний стан за моделювання гіпобіозу у кролів.

За умов штучного гіпобіозу спостерігається зниження рН крові, у той час як при дії зниженої температури відмічається незначне підвищення. За умов моделювання штучного гіпобіозу у крові кролів знижується рівень рО2 на 48 % та спостерігається зростання рСО2 на 49 %, загального СО2 на 26 % та НСО3 на 27 % проти контролю, відмічається також незначне зниження рівня ВЕ та ЕВЕ. За впливу зниженої температури вміст вміст всіх досліджуваних показників вірогідно не змінюється.

Зниження рівня кисню в крові кролів в стані гіпобіозу на 48 % змушує організм компенсувати його нестачу шляхом підвищення інтенсивності анаеробного метаболізму. Не у всіх організмів і не у всіх тканин одного організму залежність від кисню виявлена однаковою мірою. У хребетних його рівень регулюється інтенсивністю кровотоку, який за гіпобіозу знижується. Відомо, що скелетні м’язи в короткі періоди інтенсивної діяльності можуть працювати головним чином за рахунок гліколізу. Клітини коркової речовини нирок також можуть значною мірою використовувати анаеробний обмін. Інші тканини, за виключенням серцевого м’яза та центральної нервової системи, які повністю залежать від дихання, займають проміжне положення, можуть певний час бути в анаеробіозі і містять ізоферменти гліколітичних ферментів (піруваткінази, фосфофруктокінази, фосфогліцераткінази ).

Одержані дані підтверджують попередні наші результати. Зниження забезпечення киснем тканин активує в них процеси гліколізу. Легкий ацидоз в умовах гіпобіозу, знижуючи інтенсивність гліколізу, активує глюконеогенез. Лактат і піруват з інших тканин, де за недостатнього надходження кисню активуються процеси гліколізу, течією крові переносяться до печінки для регенерації пірувату в лактат, а останнього – в глюкозу. Інтенсивність гліколізу і глюконеогенезу при цьому регулюється і координується системою кислотно-лужного гомеостазу (Мельничук Д.О. 1989).

З отриманих даних видно, що при моделюванні стану штучного гіпобіозу у кролів розвивається респіраторний субкомпенсований ацидоз, для якого характерним є зростання рівня рСО2, загального СО2, бікарбонатів та зниження концентрації рО2. Зміни кислотно-лужної рівноваги, що спостерігалися у кролів при моделюванні штучного гіпобіозу, певною мірою спостерігаються у і інших видів тварин, яким притаманний цей стан (Мельничук С.Д. 2001, Михайловський В.О. 2000).

Дослідження показників азотового обміну за стану штучного гіпобіозу. Відомо, що значення амінокислот визначається їх унікальною роллю в побудові та синтезі основних структурних компонентів клітини таких як білки, нуклеїнові кислоти, низькомолекулярні азот- та сірковмісні сполуки та в реалізації через ці компоненти більшості функцій, що забезпечують взаємозв’язок біологічних систем з оточуючим середовищем. Тому важливо було з`ясувати вплив гіпобіотичних чинників на вміст індивідуальних амінокислот в тканинах кролів. При дослідженні пулу вільних амінокислот сироватки крові за умов штучного гіпобіозу відмічалось зростання кількості лейцину та фенілаланіну у 2 рази, лізину в 1,8 раза, рівень глутаміну (69%), аланіну (65%), валіну (63%), метіоніну (51%), ізолейцину (59%), гістидину (54%), відносно контролю. За дії температурного чинника відмічається зниження вмісту цистину у 2,1 раза;

Таблиця 4

Вміст вільних амінокислот у сироватці крові кролів за умов гіпобіозу та при дії холодового чинника (мг/100мл), (Мм, n=5) |

Амінокислота | Контроль | Гіпобіоз | Холодовий чинник

1. | Аспарагін | 0,950,093 | 1,030,04 | 0,990,18

2. | Треонін | 5,810,25 | 7,151,70 | 5,650,72

3. | Серин | 37,853,94 | 52,742,47* | 36,976,37

4. | Глутамін | 5,050,65 | 8,520,80* | 7,401,63

5. | Пролін | 45,347,11 | 41,588,45 | 42,245,26

6. | Гліцин | 26,712,66 | 23,101,03 | 24,143,59

7. | Аланін | 16,440,81 | 27,132,15* | 23,215,20*

8. | Цистин | 3,090,52 | 3,970,55 | 1,470,23*

9. | Валін | 8,360,56 | 13,592,62* | 11,001,56

10. | Метіонін | 2,150,17 | 3,260,60* | 2,660,25

11. | Ізолейцин | 4,590,38 | 7,281,00* | 6,280,74*

12. | Лейцин | 5,560,61 | 10,351,66* | 8,541,14*

13. | Тирозин | 6,590,15 | 7,081,19 | 7,620,94

14. | Фенілаланін | 4,010,33 | 8,570,88* | 5,070,53*

15. | Гістидин | 7,570,13 | 11,700,46* | 8,740,85

16. | Лізин | 8,640,33 | 15,233,56* | 10,541,14

17. | Триптофан | 14,191,16 | 16,591,10 | 15,131,61

18. | Аргінін | 12,44+1,19 | 13,102,49 | 13,632,44

У | Сума амінокислот | 215,33 | 271, 62 | 231,26

* - Р<0.05 відносно контролю

зростання глутаміну, аланіну, валіну та ізолейцину у межах від 50 до 30 % до контролю (табл. 4). Сумарна кількість вільних амінокислот у тварин в стані штучного гіпобіозу підвищується на 26% проти контролю, температурний чинник не впливає на їх сумарний вміст.

Обмін аланіну пов’язаний з перетворенням вуглеводів. Він є основним посередником між печінкою і іншими тканинами в реакціях глюкогенезу, зокрема в транспорті пірувату, який утворюється при дезамінуванні аланіну і саме через піруват відбувається включення в цикл трикарбонових кислот тривуглецевих амінокислот: аланіну серину та цистеїну. В наших дослідженнях за умов гіпобіозу спостерігається зростання рівня аланіну на 65%, що може пояснюватися порушенням його дезамінування.

Катаболізм амінокислот пов’язаний з використанням їх вуглецевих скелетів для пластичних та енергетичних цілей, вивільненням аміаку і утворенням з нього сечовини. За гіпобіозу на 47 % знижується кількість аміаку та сечовини на 40%, вміст креатиніну вірогідно не змінюється. В другій дослідній групі за впливу холодового чинника вірогідних змін вмісту аміаку, сечовини та креатиніну не спостерігалося(табл. 5)..

Таблиця 5

Показники азотового обміну за умов гіпобіозу та при дії холодового чинника (Мм, n=5)

Показники | Контроль | Гіпобіоз | Холодовий чинник | Аміак (мкмоль/л) | 20,540,4410,781,29*18,30,83*Сечовина (ммоль/л) | 16,91,36 | 10,21,53* | 17,91,95 | Креатинін(мкмоль/л) | 116,53,4 | 100,810,7 | 131,614,5 | * - Р<0.05 відносно контролю

Так як в попередніх роботах встановлено, що підвищення концентрації вуглекислоти і інтенсивності її фіксації в тканинах кролів та великої рогатої худоби значною мірою стимулює утилізацію амонійного азоту в організмі, то зниження рівня аміаку, сечовини та креатиніну за умов гіпобіозу може бути пов’язане з підвищеною утилізацією аміаку та порушенням окисного дезамінування.

Дослідження інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот у печінці кролів у стані штучного гіпобіозу. В результаті проведених досліджень встановлено, що у кролів у стані гіпобіозу рівень більшості досліджуваних метаболітів відрізняється від контрольного. При дії на тварин лише холодового чинника ці зміни менш виражені. В печінці

Таблиця 6

Вміст метаболітів гліколізу та трикарбонового циклу в печінці кролів у стані штучного гіпобіозу (Мм, n=5, мкмоль/г)

Показник | Контроль | Гіпобіоз | Холодовий чинник | Лактат | 1,690,16 | 2,320,12* | 1,570,16 | Піруват | 0,080,01 | 0,100,01* | 0,090,01 | Малат | 0,400,03 | 0,740,02* | 0,490,02 | Оксалоацетат | 0,250,02 | 0,300,02 | 0,250,02 | Глутамат | 0,820,03 | 1,470,05* | 1,150,07* | б –?етоглутарат | 0,200,01 | 0,190,01 | 0,280,02* | Ізоцитрат | 0,700,01 | 0,700,02 | 0,700,02 | * - Р<0.05 відносно контролю

кролів за гіпобіозу зростає рівень малату (на 85 %), глутамату (на 79 %), лактату (на 37 %), пірувату (на 25 %), оксалоацетату (на 20%), кількість а-кетоглутарату та ізоцитрату не змінюється. Одержані дані підтверджують попередні результати і свідчать про активацію глюконеогенезу, зниження інтенсивності дезамінування та порушення інтенсивності ЦТК в печінці за гіпобіозу.

Дослідження активності ферментів цитозольної фракції печінки. При дослідженні впливу гіпобіозу на активність ферментів виявилося, що в цитозолі печінки щурів змінюється активність ізоцитратдегідрогенази, внаслідок чого окисне декарбоксилювання ізоцитрату зменшується на 45 %, прискорюється карбоксилювання ?-кетоглутарату на 73 %. За участю малатдегідрогенази на 38 % прискорюється карбоксилювання пірувату, не змінюється інтенсивність декарбоксилювання малату. Відзначається зростання активності лактатдегідрогенази на 27 % і зниження активності альдегіддегідрогенази на 58 %, а піруваткарбоксилази на 30 % відносно контролю. Температурний чинник не спричинює істотних змін активності досліджуваних ферментів.

Таблиця 7

Активність ферментів цитозольної фракції печінки кролів за умов штучного гіпобіозу (Мм, n =5, нмоль/ мг білка/ хв.)

Показник | Контроль | Гіпобіоз | Холодовий чинник | Лактатдегідрогеназа | 61230 | 77666* | 59647 | Малатдегідрогеназа

(карбоксилювання пірувату) | 41223 | 56841* | 48741 | Малатдегідрогеназа

(декарбоксилювання малату) | 362 | 335 | 365 | Ізоцитратдегідрогеназа (декарбоксилювання ізоцитрату) | 984 | 542* | 896 | Ізоцитратдегідрогеназа(карбокси-лювання ?-кетоглутарату) | 267 | 451* | 251 | Піруваткарбоксилаза | 62044 | 43627* | 61656 | Альдегіддегідрогеназа | 741 | 311* | 1084 | Алкогольдегідрогеназа | 1328 | 14412 | 12011 | *- Р 0,05 відносно контролю

Так як вуглекислота є один з чинників гіпобіотичного стану і різні її метаболічні форми є регуляторними факторами, що можуть впливати на інтенсивність і спрямованість обмінних процесів, підвищення інтенсивності реакцій карбоксилювання за участі ізоцитратдегідрогенази та малатдегідрогенази за гіпобіозу напевне пов’язане із зростанням її рівня у тканинах. Порушення рівноваги між процесами карбоксилювання та декарбоксилювання є одним з чинників зниження інтенсивності функціонування трикарбонового циклу при моделюванні гіпобіозу.

В наших дослідженнях активність алкогольдегідрогенази за гіпобіозу не змінюється, але відбувається значне зниження альдегіддегідрогенази, яке повинне супроводжуватися підвищенням рівня ацетальдегіду, а отже підвищенням співвідношення ацетальдегід/етанол, зростання якого характеризує глибину гіпобіозу у насінні. Одержані дані дають можливість вважати, що досліджуваний нами стан гіпобіозу досить глибокий і припустити наявність спільних ланок у механізмах формування природного і штучного гіпобіозів у рослиному та тваринному світі.

Вміст та співвідношення нікотинамідних коферментів у печінці кролів. Нікотинамідні коферменти мають важливе значення для визначення змін в клітинному метаболізмі за різних фізіологічних умов. Вони забезпечують взаємозв’язок між окремими шляхами обміну, через зміну окисно-відновного стану НАД-пар можна впливати на його напрям. Вивчення біосинтезу нікотинамідних коферментів необхідне для з’ясування функцій НАД та НАДФН, оскільки їх стаціонарний вміст зумовлює інтенсивність процесів розпаду та синтезу в організмі.

При дослідженні впливу чинників гіпобіозу на рівень нікотинамідних коферментів у печінці кролів встановлено, що вміст НАД+ та НАДН за

Таблиця 8

Вміст нікотинамідних коферментів у печінці кролів (Mm, n=5), (мкмоль/г)

Показники | Контроль | Гіпобіоз | Холодовий чинник | [НАД+] | 0,39±0,02 | 0,11±0,01* | 0,45±0,03 | [НАДН] | 0,17±0,01 | 0,06±0,01* | 0,14±0,02 | [НАДФ+] | 0,085±0,008 | 0,106±0,008 | 0,078±0,012 | [НАДФН] | 0,079±0,05 | 0,067±0,01* | 0,058±0,02 | *- Р 0,05 відносно контролю

гіпобіозу знижений у порівнянні з нормою на 72% та на 63% відповідно. За дії температурного чинника спостерігається підвищення НАД+ на 16% та зниження НАДН та 20% щодо контролю. Вміст НАДФ+ за гіпобіозу зростає на 25%, а НАДФН, як за гіпобіозу, так і при дії температурного чинника знижується (табл. 8). З наведених результатів видно, що при експериментальному визначенні з усіх досліджуваних нікотинамідних коферментів за гіпобіозу найсуттєвіше змінюється вміст НАД+ та НАДН, що

при незмінному їх співвідношенні відносно контролю напевне, може свідчити про зниження інтенсивності метаболічних процесів у організмі дослідних тварин за цього стану. Дія температурного чинника не викликає вірогідних змін у рівні піридиннуклеотидів.

Відомо, що пряме визначення вмісту піридиннуклеотидів в тканинах не дає можливості диференціювати вільні і зв`язані форми кофакторів, що визначають швидкість біохімічних реакцій та свідчать про інтенсивність метаболізму і дозволяє лише приблизно оцінити стан в НАД-пар окремих компартментах. Тому співвідношення [НАД+] / [НАДН] в цитозолі та мітохондріях та [НАДФ+] / [НАДФН] в цитозолі розраховувалися за вмістом метаболітів ЛДГ-МДГ та ГДГ систем за номограмами.

Виявилося що за гіпобіозу та при дії холодового чинника співвідношення [НАД+] / [НАДН] у цитозолі не зазнає вірогідних змін. В мітохондріях за гіпобіозу воно знижується на 67% проти контролю, за дії холодового фактору - на 23%. У величині співвідношення НАДФ/НАДФН в цитозолі вірогідних змін як за гіпобіозу, так і при дії холодового чинника не спостерігалося. Було встановлено, що при моделюванні стану гіпобіозу важливе значення має величина співвідношення рСО2 та НСО3,- яка корелює з співвідношенням [НАД+] / [НАДН] в мітохондріях і спостерігається у ховрахів під час сплячки.

Рис.1. Співвідношення [НАД+] / [НАДН] в мітохондріях гепатоцитів та

рСО2/НСО3-у крові при моделюванні гіпобіозу

.Відомо, що при зміні метаболічного стану організму суттєвим регуляторним чинником вуглеводного обміну вцілому і, зокрема, глюконеогенезу в печінці є зміни окиснювально-відновного стану вільних нікотинамідних коферментів, посилення глюконеогенезу призводить до зниження співвідношення вільних нікотинамідних коферментів, і цитоплазма та мітохондрії набувають більш виражених відновних властивостей, отже зниження співвідношення НАД+/НАДН у мітохондріях гепатоцитів кролів за гіпобіозу активує інтенсивність глюконеогенезу.

За умов гіпобіозу різні метаболічні форми вуглекислоти є регуляторними факторами метаболічної адаптації, що можуть безпосередньо впливати на біоенергетичні, біосинтетичні та транспортні процеси у тканинах тварин. Механізмами її регуляторного впливу є участь у реакціях карбоксилювання та декарбоксилювання, а також пряма взаємодія СО2 з аміногрупами ферментів, регуляторних, транспортних білків і пептидів та інших біологічно активних сполук. За одержаними нами даними при формуванні штучного гіпобіозу у кролів порушується кислотно-лужна рівновага, що супроводжується розвитком компенсованого респіраторного ацидозу, який на початкових етапах формування гіпобіотичного стану на тлі зниженого забезпечення тканин киснем викликає активацію гліколізу та зростання активності глюконеогенезу в період гіпобіозу. Інтенсивність гліколізу і глюконеогенезу регулюється і контролюється метаболічною системою кислотно-лужного гомеостазу (значенням рН та вмістом метаболітів проміжного обміну). У стані штучного гіпобіозу спостерігаються порушення процесів карбоксилювання – декарбоксилювання та гальмування інтенсивності функціонування ЦТК і процесів окисного дезамінування. Зростання фонду вільних амінокислот за цих умов виникає внаслідок порушення адаптивних механізмів, що забезпечують їх стабільність та регуляцію обмінних і транспортних функцій клітинних мембран. Зниження активності АДГ призводить до зростання рівня ацетальдегіду в тканинах та підвищення співвідношення ацетальдегід/етанол, яке відображає підвищення рівня анаеробних процесів і характеризує глибину гіпобіотичного стану, що є спільним для природного і штучного гіпобіозу у рослин і тварин.

Вуглекислота, що є одним з чинників гіпобіотичного стану, через модифікацію структури певних білків і зміни їх фізико-хімічних та каталітичних властивостей може обумовлювати відмінності у інтенсивності гліколізу, глюконеогенезу, обміну амінокислот та ЦТК у групі тварин, на яких діяв лише температурний чинник.

ВИСНОВКИ

У дисертації, відповідно до поставленої мети і завдань досліджень, встановлено, що підвищення рівня вуглекислоти є важливим фактором для формування у кролів стану штучного гіпобіозу.

Розроблено оптимальні умови для моделювання у кролів стану штучного гіпобіозу на основі вивчення змін фізіолого-біохімічних показників у динаміці його формування, а також метаболічних особливостей даного явища у крові та гепатоцитах.

1. Досліджено фізіологічні показники, що характеризують перебування тварин у стані гіпобіозу: зниження температури тіла на 24%, частоти серцевих скорочень на 31% та кількість дихальних рухів на 65% порівняно з контролем. За дії холодового чинника температура тіла тварин, частота пульсу та дихання не зазнають вірогідних змін.

2. Формування у кролів стану штучного гіпобіозу характеризується зростанням рівня лактату через 1,5 год на 29%, через 3 год на 75%, через 1 год після виходу з гіпобіозу в 2,1 рази; пірувату - на 25% через 1,5 год; глюкози - на 40%, 75% та 24%. Вміст малату, оксалоацетату та ?-кетоглутарату не зазнає вірогідних змін у всіх досліджуваних часових проміжках.

3. Стан штучного гіпобіозу характеризується розвитком компенсованого респіраторного ацидозу, про що свідчать зниження рН на 0,13, рО2 на 48%, підвищення рСО2 на 49%, НСО3- на 27% та загального СО2 на 26%.

4. За гіпобіозу спостерігається підвищення сумарного вмісту амінокислот на 26%, зниження рівня аміаку та сечовини в крові на 48 та 40% відповідно.

5. В печінці кролів, які перебувають у стані гіпобіозу, зростає рівень малату (на 85%), глутамату