АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

СКЛЯР НАДІЯ ІВАНІВНА

УДК 579.26:611.018.73+616.32/33-002(043)

Взаємовідносини асоціантів мукозної мікрофлори шлунка та дванадцятипалої кишки

у хворих на запально-виразкову патологію гастродуоденального тракту

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Бабич Євген Михайлович, Інститут мікробіології та імунології
ім. І.І. Мечникова АМН України, завідувач лабораторії специфічної профілактики краплинних інфекцій

Офіційні опоненти:доктор медичних наук, професор Мінухін Валерій Володимирович, Харківський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський державний медичний університет МОЗ України, проректор з наукової та лікувальної роботи, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В. Громашевського АМН України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться “ 27 ” жовтня 2005 року о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м.Харків, вул. Пушкінська, 14/16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м.Харків, вул. Пушкінська, 14/16).

Автореферат розісланий “ 20 ” вересня 2005 року

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01

к.мед.н., с.н.с. С.В. Бруснік

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Необхідність удосконалення медичної допомоги хворим на запально-виразкову патологію (ЗВП) гастродуоденального тракту (ГДТ) належить до однієї з найбільш актуальних проблем сучасної системи охорони здоров’я. Приблизно половина, а в деяких розвинутих країнах навіть більша частина працездатного населення страждає від хронічного гастриту, а виразкова хвороба (ВХ) в епоху урбанізації розвивається в 10-20% дорослого населення, що є фактором ризику виникнення раку шлунка (Пелещук А.П., Передерий В.Г., Свинцицкий А.С., 1995; Комаров Ф.И., 1995; Yoshimura Т. еt al., 2000; Харченко Н.В., 2002; Шептулин А.А., 2003).

У багатьох країнах захворюваність на пептичну виразку (ПВ) та гастродуоденіти (ГД) продовжує невпинно зростати. Тільки в Східній Європі за період з 1990 по 2000 рр. рівень захворюваності на ПВ виріс на 38,4% (Ивашкин В.Т., Рапопорт С.И., 2003). У межах світової спільноти майже 120 мільйонів людей страждає від цієї недуги, а принаймні 6 мільйонів чоловік щорічно поповнюють їх ряди (Parsonnet J., 1998). Незважаючи на уніфікацію схем лікування та застосування протимікробних препаратів широкого спектру дії, гастродуоденальна патологія (ГДП) на сьогодні характеризується схильністю до рецидивів та розвитку небезпечних для життя ускладнень (Яицкий Н.А., Седов В.М., Морозов В.П., 2002).

Зазначена тенденція спостерігається і в Україні: частота гастроентерологічних захворювань за останні 10 років зросла на 53%, кількість хворих на ВХ щорічно збільшується на 50-60 тисяч, а випадків перфоративної виразки та шлунково-кишкових кровотеч – на 17,6% і 39,1% відповідно (Філіппов Ю.О. та співавт., 2001; Березницький Я.С. та співавт., 2004; Щербинина М.Б., 2004).

Узагальнюючи матеріали захворюваності на ЗВП у різних країнах, експерти ВООЗ дійшли висновку, що у XXI столітті поширення патології органів системи травлення посідатиме провідне місце поряд із серцево-судинними недугами (Ивашкин В.Т., 2004).

Зазначений прогноз свідчить, що прийнята як наукове відкриття століття концепція щодо провідної ролі Helicobacter pylori (H.pylori) в розвитку ГДП “немає кислоти та Н.pylori – немає виразки” (D.Gragam, 1989; Циммерман Я.С., Зиннатуллин М.Р., 1997) поки що не підтверджується як єдино правильна теорія етіології та патогенезу ЗВП ГДТ. Практична реалізація розробленої стратегії боротьби із зазначеними захворюваннями шлунково-кишкового тракту (ШКТ) базується на широкому застосуванні антимікробних препаратів, спрямованих на ерадикацію H.pylori (the Maastricht Consensus 1-1997, 2-2000; Бабак О.Я., Фадеєнко Г.Д., 1997). При цьому не береться до уваги наявність мукозної мікрофлори, як бактеріальної так і вірусної природи, що персистує у хворих спільно з H.pylori. Між тим за кількісними та якісними характеристиками вона в більшості випадків може виступати підтримуючим чинником патологічних процесів у шлунку та ДПК (Adamsson I. et al., 1999; Червинец В.М. и соавт., 2001; Бондаренко В.М., Базлов С.Н. и соавт., 2003; Чернявський В.І., Бірюкова С.В. та співавт., 2004).

На сьогодні не визначені шляхи ефективного впливу на мукозну мікрофлору, що заселяє патологічно змінені слизові оболонки (СО) ГДТ і особливо ульцерозну зону. Складається враження, що розширення антибіотикотерапії в цьому напрямку мало перспективне, оскільки запропоновані схеми з метою ерадикації H.pylori вже включають 3-4 препарати широкого спектру дії, які досить часто призводять до важких ускладнень (токсичність, алергічні реакції, дисбіози) у хворих та появи резистентних популяцій мікроорганізмів (Adamsson I. et al., 1999; Березняков И.Г., 2001; Фадєєнко Г.Д., 2002). Правомірно припустити, що розроблені схеми відносно H.pylori можуть ефективно діяти і стосовно мукозної мікрофлори, проте це питання недостатньо вивчене на рівні чутливості монокультур і зовсім не розглядалося з урахуванням їх асоціативних взаємовідносин. Останній аспект може мати важливе значення при визначенні механізмів виживання субпопуляцій H.pylori в асоціаціях з мукозною мікрофлорою в умовах застосування хіміотерапевтичних препаратів широкого спектру дії.

Не вивченим залишається також питання щодо взаємовідносин між резидентними мікроорганізмами СО ГДТ H.pylori та представниками аеробних, анаеробних та факультативно-анаеробних бактерій, а також їх можливої векторної спрямованості у формуванні мікробіоценозів, що, ймовірно, впливає на розвиток ГДП.

Вказане вище вимагає проведення пошуків нових підходів до корекції мікробіоценозів шлунка і дванадцятипалої кишки (ДПК). Насамперед на увагу заслуговують уже відомі при інших захворюваннях способи корекції мікрофлори біологічних ніш організму людини – фаготерапія та застосування відповідних пробіотиків (Волянський Ю.Л., Бабич Є.М. і співавт., 1999; Кременчуцкий Г.Н. и соавт., 2000; Крылов В.Н., 2002).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи ІМІ ім. І.І. Мечникова „Вивчити показники імунологічної реактивності та визначити можливості імунокорекції у хворих на виразкову хворобу шлунку та дванадцятипалої кишки, асоційовану з Helicobacter pylori” АМН України, №держреєстрації 0100U000405. Дисертант є співвиконавцем вказаної наукової роботи.

Мета й завдання дослідження. Мета роботи – на основі вивчення видового складу, біологічних властивостей мукозної мікрофлори шлунка та дванадцятипалої кишки при запально-виразкових процесах, а також особливостей взаємовідносин її з H.pylori розробити наукові підходи до корекції мікробних асоціацій, що персистують у слизових оболонках шлунка та ДПК у хворих на гастродуоденіти та пептичні виразки.

Для досягнення поставленої мети сформульовано такі завдання:

1. Вивчити частоту персистенції H.pylori, видовий та кількісний склад мікробних асоціацій слизових оболонок шлунка і дванадцятипалої кишки при гастродуоденітах.

2. Встановити частоту персистенції Helicobacter pylori, видовий та кількісний склад мікробних асоціацій слизових оболонок шлунка і дванадцятипалої кишки при пептичних виразках.

3. З’ясувати характер взаємовідносин різноманітних представників мікробних асоціацій слизових оболонок шлунка та дванадцятипалої кишки з H.pylori.

4. Дослідити біологічні властивості й чутливість до хіміотерапевтичних засобів представників супутньої мукозної мікрофлори, що найбільш часто вилучаються при гастродуоденальній патології.

5. Визначити чутливість до специфічних бактеріофагів найбільш поширених при гастродуоденальній патології представників мукозної мікрофлори.

6. Провести експериментальні дослідження впливу мікроаерофільних умов культивування на антибіотико- та фагочутливість різних представників мукозної мікрофлори, а також на конкурентні властивості антагоністів H.pylori.

Об’єкт дослідження: хворі на гастродуоденіти та пептичні виразки; біоптати слизових оболонок шлунка та ДПК; представники мікробіоценозів мукозної мікрофлори, виділеної з біоптатів слизових оболонок шлунка та ДПК при запально-виразковій патології, штам Aerococcus viridans №167.

Предмет дослідження: активність тканинної уреази; частота вилучення, концентрація мікроорганізмів у слизових оболонках ГДТ; їх біологічні властивості: ферментативна активність, міжмікробні взаємовідносини в біоценозах, чутливість до антибіотиків і бактеріофагів при мікроаерофільних умовах культивування.

Методи дослідження: мікробіологічні (дослідження біоптатів слизових оболонок шлунка та ДПК на Н.pylori та іншу мукозну мікрофлору, вивчення характеру міжмікробних взаємовідносин в асоціаціях), біохімічні (визначення тканинної уреази біоптатів), математико-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше дана комплексна характеристика мікробних асоціацій слизових оболонок шлунка та ДПК, що включають Н.pylori і мукозну мікрофлору, та показано їх роль в обтяженні перебігу ГДП. Уперше встановлено вплив асоціантів супутньої мікрофлори на підвищення антибіотикорезистентності H.pylori.

У хворих на пептичні виразки ДПК міграція та заселення H.pylori та мукозної мікрофлори з антрального відділу шлунка в бульбарну зону дуоденального тракту відбувається лише в окремих випадках, що вимагає диференційованого підходу стосовно удосконалення етіотропної терапії.

Визначення особливостей міжмікробних взаємовідносин хелікобактерів із сумісно персистуючою з ним мукозною мікрофлорою дозволило виявити антагоністів Н.pylori. Експериментально встановлено ефективність штаму А.viridans №167, що складає основу пробіотика А-бактерину, стосовно хелікобактерів.

Уперше показано вплив мікроаерофільних умов культивування на чутливість асоціантів до протимікробних препаратів та бактеріофагів, а також антагоністичну активність штамів-конкурентів H.pylori.

Практичне значення одержаних результатів. Обґрунтовано доцільність застосування у хворих на пептичні виразки специфічних бактеріофагів стосовно представників мукозної мікрофлори з гіалуронідазною та уреазною активністю.

Відібрано штами супутньої мукозної мікрофлори, які за антагоністичною активністю та біологічними властивостями є перспективними для розробки пробіотичних препаратів.

Показано перспективність розширення арсеналу препаратів у комплексній терапії ЗВП ГДТ внаслідок використання пробіотика А-бактерину, основу якого становить штам А.viridans №167, високоактивний стосовно Н.pylori.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно-інформаційний пошук й аналіз літератури за темою дисертації. Особисто виконано практичну та експериментальну частини роботи: зокрема вивчення активності тканинної уреази біоптатів СО ГДТ; мікробіологічні дослідження видового та кількісного складу біоценозів указаних об’єктів; визначення біологічних властивостей окремих ізолятів; з’ясування характеру взаємовідносин між асоціантами мікробних угрупувань; дослідження впливу мікроаерофільних умов культивування на чутливість мікроорганізмів до протимікробних препаратів; встановлення антагоністичних властивостей аерококів стосовно хелікобактерів; проведення статистичної обробки результатів досліджень та оформлення дисертації. Постановка мети, завдань та обговорення одержаних результатів проводилась спільно з науковим керівником.

Автор висловлює подяку лікарям-гастроентерологам та ендоскопістам Інституту терапії імені Л.Т. Малої АМН України, Дорожньої клінічної лікарні ст. Харків, 13-ї міської клінічної лікарні м. Харкова за допомогу в наданні клінічного матеріалу для досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації доповідались та обговорювались на Міжнародній науковій конференції “Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” (м. Харків, 23-24 жовтня 2003 р.), Міжвузівській конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття” (Харків, 20 січня 2004 р.), X з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 15-17 вересня 2004 р.), ХІV з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів України (Полтава, 2004 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 наукових праць, у тому числі 7 статей у фахових виданнях, визначених ВАК України, із них 3 самостійно.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 186 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел та трьох додатків. Робота ілюстрована 36 таблицями та 12 рисунками, що займають повний обсяг 24 сторінок. Список використаних джерел, який викладено на 27 сторінках, містить 239 посилань, серед яких українською та російською мовами 139 та 100 робіт іноземних авторів. Додатки займають обсяг 3-х сторінок.

Основний зміст дисертації

Огляд літератури включає 3 підрозділи, в яких розглянуто характеристику Н.pylori як чинника ГДП, проаналізовано дані щодо мікробіоценозів шлунка та ДПК при пептичних виразках і гастродуоденітах, матеріали щодо хіміотерапевтичних та біопрепаратів, які застосовуються в терапії хелікобактерасоційованих захворювань.

Матеріали і методи досліджень. Проведено мікробіологічні, біохімічні дослідження біоптатів СО тіла та антрального відділу шлунка, бульбарного відділу ДПК та періульцерозних зон від 109 хворих на ЗВП ГДТ, які знаходились на стаціонарному та амбулаторному лікуванні в Інституті терапії імені Л.Т. Малої АМН України (12 осіб), Дорожній клінічній лікарні ст. Харків (33 особи), 13-й міській клінічній лікарні м. Харкова (64 особи). З них 18 хворим встановлено діагноз “ерозивний гастродуоденіт” (ЕГД); у 32 осіб виявлено атрофічний, гіпертрофічний та ін. види ГД, що були об’єднані в групу “неерозивний гастродуоденіт” (НЕГД); 30 пацієнтів мали “гостру” ПВ шлунка або ДПК; у 29 чоловік загострення ВХ протікало без утворення виразкового дефекту СО.

Дослідження 161 біоптату на уреазну активність проводили за допомогою уреазного тесту для ідентифікації H.pylori URE-HPtest (PLIVA-Lachema a.s. Czech Republic) та середовища Крістенсена з протимікробними речовинами (Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003).

Вилучено 61 штам H.pylori, 398 штамів бактерій, що віднесені до 9 різних таксономічних груп, та 37 штамів дріжджеподібних грибів. Як тест-культури використовувались референс-штами бактерій (Staphylococcus aureus ATCC 25923 (F-49), Escherichia coli ATCC 25922 (F-50), Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 (F-51)), дріжджеподібних грибів роду Candida (C.albicans АТСС 885/653, C.tropicalis ВКПГу 547/у) та штам Aerococcus viridans №167, що становить основу препарату А-бактерину, одержані з Філії Національного музею мікроорганізмів ІМІ ім. І.І. Мечникова. Міжмікробні взаємовідносини H.pylori та супутньої мікрофлори були вивчені в 158 асоціаціях.

Мікробіологічні дослідження проводили згідно з методичними рекомендаціями „Лабораторна діагностика гастритів, виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої кишки, які викликані Helicobacter pylori” (Харків, 1995), „Визначником бактерій Берджі” (1997), „Визначником патогенних і умовно патогенних грибів” (2001) за загальноприйнятими методиками. Кількість бактерій визначали шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць у 1 г біоптату (lg КУО/г).

Мікроаерофільні умови культивування створювали в мікроанаеростатах за допомогою газогенеруючих пакетів Generator GENbox microaer (bioMerieux, Франція) або газової суміші, що була виготовлена в заводських умовах і складалась з 5% О2, 10% СО2 та 85% N2.

Ферментативну активність мікроорганізмів визначали по їх здатності продукувати уреазу, лецитиназу, плазмокоагулазу, гемолізини за стандартними методиками (Герхардт Ф., 1984; Турьянов М.Х., 1995). Гіалуронідазну активність виявляли за схемою McClean у модифікації Миронової Т.К. (1978).

Чутливість мікроорганізмів до протимікробних препаратів вивчали диско-дифузійним методом Bauer-Kirbi із використанням готових комерційних дисків (НИЦФ, Санкт-Петербург, Росія та OXOID Ld, England) та за допомогою послідовних двократних серійних розведень в агарі. При визначенні фагочутливості згідно з „Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями” (Москва, 1984) крапельним методом використовували комерційні рідкі бактеріофаги (“Биомед”, Пермь, Россия): стафілококовий, стрептококовий, синьогнійний, протейний, клебсієльозний, ешерихіозний та секстафаг® піобактеріофаг полівалентний.

Антагоністичні властивості 421 штаму мікроорганізмів, вилучених при гастродуоденальній патології, визначали щодо референс-штамів, 30 штамів H.pylori та 85 штамів супутньої мікрофлори методом відстроченого антагонізму (метод перпендикулярних штрихів) (Егоров Н.С., 1965). Тест-штами вважались нечутливими при зоні затримки росту (0-4) мм, малочутливими – зона (5-10) мм та високочутливими при зоні більшій, ніж 10 мм (Борщ С.К. та співавт., 2004). Антагоністичну активність штаму А. viridans №167 стосовно H.pylori досліджували методом двошарового агару (Ермоленко Е.І. та співавт., 2004), бактерицидну дію визначали методом відбитків (Герхардт Ф., 1984).

Досліди проводили в трьох – чотирьох повторюваннях. Результати аналізували статистично (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Гельман В.Я., 2002) за допомогою комп’ютерних програм Microsoft Excel 2000 та "Biostat-4" (Лапач С.Н. та співавт., 2000).

Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень викладено в третьому – шостому розділах.

Встановлено, що мікрофлора з біоптатів СО шлунка та ДПК вилучалась у всіх пацієнтів, що страждали на загострення запально-виразкових захворювань ГДТ. За частотою вилучення Н.pylori встановлено вірогідну різницю між патологічними станами, що супроводжувались дефектами СО (ерозії, виразка), та процесами, які перебігали без порушення цілостності СО: при „гострій” ПВ та ЕГД хелікобактери ізольовані у 80,0% та 83,3% хворих відповідно, тоді як при хронічній ВХ та НЕГД позитивні знахідки Н.pylori спостерігалися відповідно у 17,2% та 53,1% обстежених осіб (р<0,001 та р=0,01). У монокультурі хелікобактери визначено лише у трьох осіб (один випадок при ЕГД– 5,5% та два – при „гострій” ПВ – 6,7%). У 53,2% осіб мікробні асоціації характеризувалися наявністю як хелікобактерів, так і представників супутньої мукозної мікрофлори, у 44,0% пацієнтів захворювання асоціювались лише з мукозною мікрофлорою.

Оскільки одним з основних факторів патогенності Н.pylori вважається мікробна уреаза, в подальшому вивчали спільний вплив хелікобактерів та супутньої мікрофлори на активність тканинної уреази біоптатів. Доведено, що у хворих на ЕГД та „гостру” ПВ вона реєструвалась у 68,4% досліджених біоптатів, із яких 61,5% біооб’єктів розкладали сечовину впродовж перших трьох годин спостереження. У біоптатах, що відбирались у хворих без дефектів СО, позитивний уреазний тест спостерігався лише в 38,8% випадків (р<0,01). При цьому швидкість розкладу сечовини суттєво уповільнювалась: упродовж однієї-трьох годин субстрат ферментували лише 39,4% біоптатів (р<0,05). Визначено, що зазначені особливості тісно пов’язані з персистенцією у СО Н.pylori. Між позитивним уреазним тестом та вилученням хелікобактерів встановлено сильний ступінь прямої лінійної залежності (коефіцієнт кореляції (r) становив 0,89), а між концентрацією Н.pylori та швидкістю прояву позитивного тесту визначено зворотній лінійний зв’язок (r = – 0,62).

У 19 біоптатах (11,8%) результати уреазного тесту та вилучення Н.pylori не збігалися: у 5 зразках бактеріологічні знахідки не супроводжувались позитивним уреазним тестом, а в 14 – при наявності уреази у СО – штами хелікобактерів не визначались. Обґрунтовано припущення, що на процеси накопичення тканинної уреази впливала супутня умовно-патогенна мікрофлора (УПМФ), яка одночасно вилучалась із досліджених біооб’єктів. У біоптатах, що проявляли негативну реакцію на уреазу, персистенція Н.pylori встановлена тільки з уреазонегативними асоціантами і навпаки при відсутності хелікобактерів накопичення тканинної уреази у 12 із 14 випадків відбувалось на фоні життєдіяльності УПМФ, що мала здатність розкладати сечовину. Припущення про синергічну взаємодію уреазопозитивних бактерій при розкладі сечовини підтвердилось у дослідах in vitro при визначенні гідролізу сечовини складними асоціаціями мікроорганізмів порівняно з монокультурами при однаковій кількості мікробних клітин у суспензіях.

Мікробіоценози СО у всіх хворих на ЗВП ГДТ були згруповані за щільністю заселення, кількістю асоціантів, сумарним потенціалом ферментативної активності (СПФА) представників біоценозу та ензимів (уреаза, лецитиназа, плазмокоагулаза, гіалуронідаза, гемолітична активність), що продукували окремі мікроорганізми, у чотири групи (табл.1). Під терміном СПФА зазначали показник добутку кількості асоціантів у мікробіоценозі та ферментів, що продукували окремі штами в рамках досліджуваних ензимів. Перша група мікробного заселення відповідала асоціаціям, які, за даними літературних джерел, визначаються в здорових осіб. Четверта група включала найбільш ферментативно активні бактерії, що персистували в багатокомпонентних мікробіоценозах зі щільністю заселення СО > lg 4,0 КУО/г біоптату.

Таблиця 1

Показники, що характеризують групи мікробного заселення мукозною умовно-патогенною мікрофлорою гастродуоденальної зони хворих на гастродуоденіти та пептичну виразку

Показники | Групи заселення УПМФ слизових оболонок шлунка та ДПК | І | ІІ | ІІІ | ІV | Кількість асоціантів у мікробіоценозах | 1-3 | 1-3 | 4-8 | 4-8 | Концентрація мікроорганізмів (lg КУО/г біоптату) | < 4,0 | < 4,0 | > 4,0 | > 4,0 | Кількість ферментів, що продукували окремі представники мікробіоценозів | 1-2 | 3-5 | 1-2 | 3-5 | Показник сумарного потенціалу фермента-тивної активності (СПФА) в мікробіоценозах | 1-3 | 4-6 | 4-6 | >6 |

Встановлено, що у 89,6% хворих на ЗВП ГДТ вивчені асоціації за зазначеними критеріями відносились до другої-четвертої групи мікробіоценозів, які у 76,4% випадків складались з 4-8 асоціантів, що заселяли СО в концентрації > lg 4,0 КУО/г біоптату, а в 42,4% включали представників мукозної мікрофлори, що характеризувались здатністю продукувати 3-5 досліджених ензимів (рис.1, А).

Результати досліджень мукозної мікрофлори в пацієнтів з різними діагнозами свідчать, що найбільш часто мікробіоценози ІІІ-ІV груп виявлялись у хворих на “гостру” ПВ як асоційовану з Н.pylori, так і без наявності мікроаерофілів (відповідно у 81,9% та 100% обстежених), а також у пацієнтів із хронічною ВХ (у 100% та 87,5%). І-ІІ група мікробного заселення переважала (64,3%) тільки у хворих на хелікобактерасоційований ЕГД.

Вилучення Н.pylori залежало від відділу ГДТ, із якого відбирались біоптати. Найчастіше позитивні знахідки Н.pylori були в антральному відділі та тілі шлунка (при загостренні процесів із дефектами СО – від 70,0% до 83,3% біопроб; при інших патологічних станах – від 17,2% до 60,5%), у СО ДПК хелікобактер вилучено лише при наявності „гострої” ПВ у 21,4% хворих.

А

Б

Рис. 1. Характеристика мікробіоценозів УПМФ слизових оболонок при запально-виразковій патології залежно від діагнозу (А) та місця відбору біоптатів (Б):

ряд 1 – І група мікробного заселення СО; ряд 2 – ІІ група мікробного заселення СО; ряд 3 – ІІІ група мікробного заселення СО; ряд 4 – ІV група мікробного заселення СО.

Причетність супутньої мікрофлори до формування та перебігу ГДП також підтверджується характеристикою мікробіоценозів, які було вилучено в різних відділах ГДТ та періульцерозній зоні. Визначено, що ІІІ- ІV групи мікробного заселення СО з однаковою частотою вилучались як із біоптатів антрального відділу та тіла шлунка, так і з бульбарного відділу ДПК (64,0% та 68,0% відповідно). Проте СО шлунка майже в 2 рази частіше заселяли мікробні асоціації з високим СПФА (визначено 7 та більше ензимів). Найвищі показники мікробної колонізації як за концентрацією, так і за видовою щільністю спостерігались при дослідженні матеріалу з періульцерозних зон. Тільки у двох із дев'ятнадцяти випадків (10,5%) щільність заселення СО в зоні виразки УПМФ була низькою, в половині досліджених біоптатів визначено ІV групу мікробного заселення (рис.1, Б).

До основних положень концепції „без кислоти та Н.pylori немає виразки” відноситься ствердження, що розвитку ПВ ДПК сприяє міграція хелікобактера з антрального відділу шлунка в бульбарну зону дуоденального тракту та заселення ним ектопованого шлункового епітелію. Виходячи з наведеного положення, вважали за доцільне визначити частоту збігу персистенції в різних відділах ГДТ Н.pylori та мукозної мікрофлори. Дослідження показали, що у хворих на „гостру” ПВ ДПК частота одночасного знаходження Н.pylori в антральному відділі шлунка та в бульбарній зоні ДПК складала 21,4% випадків, а супутньої мікрофлори – 38,8%. Інша тенденція відзначена при порівнянні подібності мукозної мікрофлори в сусідніх відділах шлунка. Вилучення Н.pylori одночасно в антральному відділі та в тілі шлунка визначено у 64,7%, а супутньої мікрофлори – у 37,8% випадків.

Концентрація Н.pylori статистично не відрізнялась за всіма видами ГДП і становила (5,71±1,46) lg КУО/г біоптату. Середня щільність заселення СО іншою УПМФ визначена в межах (4,05±0,77) lg КУО/г біоптату, вірогідну різницю за вказаними показниками встановлено у хворих на ЕГД (3,66±0,62) та в пацієнтів із „гострою” ПВ (4,46±0,91) порівняно з іншими видами ГДП (р<0,01).

Усього при ГДП ідентифіковано представників 31 роду мікроорганізмів, концентрація яких була в межах від 2,0 до 7,64 lg КУО/г біоптату. Найбільш різноманітний мікробний пейзаж визначено у хворих на „гостру” ПВ (27 родів мікроорганізмів), в пацієнтів з ЕГД до складу асоціацій входили представники лише 20 родів.

За частотою вилучення у хворих на ЗВП ГДТ вони розташувались таким чином: стафілококи (найчастіше S.epidermidis) – (від 51,7% до 81,3% обстежених); стрептококи (найчастіше S.mitis, S.salivarius, S.sanguis) – (27,8% – 56,3%); анаеробні неспороутворюючі бактерії (переважали представники родів Bacteroides та Peptostreptococcus) – (22,2% – 50%); неферментуючі грамнегативні бактерії (НФГНБ) (найчастіше Pseudomonas spp та Acinetobacter spp) – (22,2% – 48,3%); ентеробактерії (найчастіше E.coli та Klebsiella spp) – (11,1% – 43,3%); грампозитивні бактерії (Вacillus spp, Corynebacterium spp, Micrococcus spр, Enterococcus spp) – (10,3% – 44,4%); дріжджеподібні гриби роду Candida (переважали C.albicans) – (12,5% – 41,4%). Представників Lactobacillus spp найчастіше вилучено у хворих НЕГД (18,8%) та у хворих ВХ без дефекту СО (27,6%). Слід відмітити, що в зазначеної групи пацієнтів у поодиноких випадках ізолювались штами біфідобактерій, аерококів, стоматококів, актиноміцетів.

Порівняльне вивчення ферментативної активності супутньої мікрофлори показало, що при ерозивно-виразкових процесах у ГДТ найбільш часто виділялись бактерії-продуценти гіалуронідази. Так, при ЕГД питома вага таких штамів становила 35,4% на відміну від 19,5% штамів, що ізольовані при НЕГД (р=0,03). У пацієнтів із „гострою” ПВ половина досліджених популяцій (53,2%) мала вказаний фермент проти 24,3% штамів, вилучених у хворих на ВХ без дефектів СО (р=0,001). Продукція інших ензимів була притаманна мікроорганізмам, вилученим від пацієнтів з різними діагнозами, майже з однаковою частотою: гемолітична активність реєструвалась у межах від 40,3% до 47,8%; уреазна – від 30,6% до 34,4%; лецитиназна – від 5,6% до 8,1%, здатність коагулювати плазму мали від 3,7% до 6,5% ізолятів.

Стафілококи та НФГНБ у 31,9% та 18,0% випадків відповідно продукували від трьох до п’яти досліджених ферментів, в т.ч. уреазну активність виявляли 14,0% та 56,8% культур, гіалуронідазну – 9,1% та 20,0%, поєднання вказаних ензимів визначене у 30,7% та 16,0% штамів. Ентеробактерії та коринебактерії у 33,3% та 27,3% випадків відповідно ферментували сечовину, а 15,4% та 27,3% штамів мали поєднану уреазну та гіалуронідазну активність. Здатність ферментувати гіалуронову кислоту мали 74,1% штамів ентерококів, 50,0% бацил, 41,9% мікрококів, 39,7% стрептококів та 30,6% культур анаеробних бактерій.

Відсутність ферментативної активності в межах дослідження або продукція лише одного ензиму встановлена серед представників родів Candida, Aerococcus, Actinomyces, Bifidobacterium, Lactobacillus, Stomatococcus.

Усі вилучені штами Н.pylori характеризувались типовими морфологічними, культуральними та біохімічними властивостями. У 28 (45,9%) популяцій визначено гемолітичні властивості. За вказаною ознакою бактерії, що ізольовані від хворих на ЕГД та „гостру” ПВ, достовірно відрізнялись від інших штамів – у першому випадку наявність гемолізинів визначена у 58,9%, тоді як у хворих без дефектів СО – у 22,7% обстежених осіб (р<0,01).

Невдачі ерадикації Н.pylori хіміотерапевтичними препаратами відносяться до однієї з найбільш складних проблем. Як показали результати досліджень, причинами цього є не тільки процеси формування популяцій з резистентними властивостями, але й, можливо, вплив асоціативних взаємовідносин у мікробних асоціаціях. Показано, що 39 досліджених штамів Н.pylori (63,9%) виявились чутливими до всіх препаратів, що застосовуються з метою ерадикації, 22 культури (36,1%) проявляли стійкість до 1-3 антибактеріальних засобів. Поєднана резистентність хелікобактерів найчастіше була виявлена до амоксициліну та метронідазолу, а також до метронідазолу та кларитроміцину. Стійкі до протимікробних препаратів популяції Н.pylori персистували в складі асоціацій супутньої мікрофлори з щільністю (4,4±1,5) представників різних видів бактерій та дріжджеподібних грибів, тимчасом як чутливі або помірно чутливі штами хелікобактерів визначались у монокультурах або в малокомпонентних мікробіоценозах із (2,6±0,9) асоціантів (р<0,01). Можливо, на чутливість хелікобактерів до антибіотиків також впливала і концентрація супутніх мікроорганізмів. Так, резистентні субпопуляції Н. pylori в 95,5% випадків виділялись з біоптатів, у яких щільність мікробних клітин супутньої мікрофлори перевищувала 4,0 lg КУО/г.

Правомірність припущення впливу міжмікробних взаємовідносин на антибіотикочутливість асоціантів доведено експериментально. Так, встановлено зниження чутливості мікроорганізмів при перебуванні їх в асоціаціях до деяких протимікробних препаратів. Достовірна різниця чутливості (р<0,01) між монокультурами та їх асоціаціями за величинами діаметрів зон затримки росту встановлена у відношенні амоксициліну, кларитроміцину та тетрацикліну. Крім того, (82,3±6,9) % досліджених асоціацій набували резистентності до кларитроміцину та тетрацикліну. Важливо відзначити, що окремі складові мікробних угрупувань у монокультурах виявляли чутливість до вказаних препаратів.

Вивчення активності препаратів, що застосовуються з метою ерадикації (амоксицилін, кларитроміцин, тетрациклін, фуразолідон), стосовно іншої мукозної мікрофлори показало їх низьку ефективність відносно представників груп мікроорганізмів, що найчастіше ізолювались при ГДП та характеризувались уреазною та гіалуронідазною активністю – стафілококів, стрептококів, ентеробактерій, НФГНБ і, особливо, ентерококів (рис.2).

1 – ентерококи; 2 – ентеробактерії; 3 – стафілококи; 4 – стрептококи; 5 – НФГНБ

Рис. 2. Чутливість мукозної мікрофлори шлунка та ДПК до препаратів, що застосовуються з метою ерадикації H.pylori

Серед представників інших груп хіміотерапевтичних засобів ефективними виявились, в основному, лише антибіотики широкого спектру дії або резервного застосування (цефалоспорини ІІІ-ІV покоління, іміпінем, ванкоміцин).

Визначена висока резистентність популяцій мукозної мікрофлори спонукала експериментально встановити вплив атмосфери зниженого до 5% парціального тиску кисню та підвищеного до 10% вмісту вуглекислого газу (необхідні умови персистенції Н.pylori) на антибіотикочутливість бактерій. Встановлено, що у вказаних умовах тест-штами стафілококів та кишкової палички підвищували стійкість до левоміцетину, тетрацикліну, ципрофлоксацину та офлоксацину (р<0,01 між дослідними та контрольними тест-об’єктами згідно з даними зменшення діаметрів зон затримки росту). Крім того, грампозитивні коки виявили меншу чутливість до амоксициліну, бензилпеніциліну та фуразолідону, а грамнегативні палички – додатково до норфлоксацину. У цих же умовах встановлено підвищення резистентності до протимікотичних препаратів дріжджеподібних грибів. Тест-культури змінювали вихідну чутливість на помірну до тріазолів (ітраконазол, флюконазол) та кетоконазолу в усіх дослідах, а у (30,0±10,0) % ставали стійкими до амфотерицину на відміну від контролю.

Одним із шляхів можливої заміни або доповнення антибіотикотерапії є включення в лікувальні схеми специфічних бактеріофагів. Застосування цих препаратів in vitro виявилось високоефективним відносно антибіотикополірезистентних та уреазо-, гіалуронідазоактивних популяцій супутньої мікрофлори – стафілококів, стрептококів, псевдомонад, ентеробактерій, ентерококів (табл. 2). З 184 досліджених культур 164 (89,1%) штамів повністю лізувались полівалентним препаратом – секстафаг® піобактеріофагом. Привертає увагу 100% чутливість штамів S.aureus та P.aeruginosa, які продукували 4-5 досліджених ензимів.

Таблиця 2

Чутливість супутньої УПМФ, виділеної з біоптатів слизових оболонок шлунка та ДПК хворих на запально-виразкову патологію ГДТ, до специфічних бактеріофагів

Мікроорганізми | Кількість штамів | з них чутливі до специфічних бактеріофагів

абс. число | %

E.coli | 16 | 13 | 81,3

Enterococcus spр | 27 | 24 | 88,9

Klebsiella spр | 8 | 8 | 100,0

P.aeruginosa | 8 | 8 | 100,0

Proteus spр | 3 | 3 | 100,0

S.aureus | 12 | 12 | 100,0

Staphylococcus spр | 62 | 53 | 85,5

Streptococcus spр | 48 | 43 | 89,6

184 | 164 | 89,1

На відміну від антибіотикочутливості, мікроаеро- та капнофільні умови навпаки сприяли підвищенню фаголізабельного ефекту (рис. 3). Так, показано, що активність специфічних бактеріофагів при низьких концентраціях кисню відносно референтних та циркулюючих штамів S.aureus, S.epidermidis та E.coli виявлялась у титрах, що перевищували в 4-32 рази титри зливного лізису, що спостерігались в аеробних умовах.

стафілококи

кишкові палички

х – аеробні умови культивування; ^ – мікроаеро- та капнофільні умови культивування

Рис. 3. Лізуюча активність специфічних бактеріофагів залежно від умов культивування тест-культур бактерій

Визначення кореляційних зв’язків між показниками частоти вилучення та концентрації Н.рylori та супутньої УПМФ показало, що хелікобактери можуть співіснувати у біоценозах ГДТ із значною групою мікроорганізмів: аеробними бацилами, дріжджеподібними грибами, ентеробактеріями, ентерококами, коринебактеріями, мікрококами, стафілококами (коефіцієнт кореляції визначено в межах (–0,23) – (0,31)). Сприятливі умови персистенції Н.рylori відзначено в асоціаціях з анаеробними неспороутворюючими бактеріями, НФГНБ та стрептококами (прямий кореляційний зв’язок із коефіцієнтом у межах 0,41-0,54). Інгібуючий вплив на хелікобактери опосередковано визначено у представників біфідо- та лактобактерій (r = – 0,61 та r = – 0,59 відповідно). Останні також мали конкурентні властивості в мікробіоценозах з НФГНБ (r = –0,63).

Між представниками інших видів мікроорганізмів виявлено взаємний стимулюючий ефект при одночасній персистенції між анаеробними неспороутворюючими бактеріями та дріжджеподібними грибами, стрептококами (r = 0,42-0,43). Кандиди також сприяли розмноженню ентерококів (r = 0,45), а останні добре співіснували зі стрептококами (r = 0,49). Ентеробактерії мали такі ж взаємовідносини з НФГНБ, а останні зі стрептококами та коринебактеріями (r = 0,42-0,44). Взаємовигідні відносини визначені між стафілококами та мікрококами (r = 0,41).

Вивчення конкурентних властивостей супутньої УПМФ щодо Н.pylori методом відстроченого антагонізму показало, що із 421 штаму 85 культур (20,2%) різною мірою виявились антагоністами хелікобактерів. До найбільш активних конкурентів віднесено аерококи й аеробні спороутворюючі палички, відносно яких виявились чутливими (93,3±7,1)% та (64,5±11,3) % тест-культур Н.pylori відповідно. Меншою мірою антагоністичні властивості виявляли морганели та представники псевдомонад (відповідно (27,5±13,9) % та (22,1±10,5) % штамів хелікобактерів виявляли чутливість). Серед антагоністів із помірною активністю провідне місце належить Bifidobacterium sрp, Corynebacterium sрp, Lactobacillus sрp (зони затримки росту від 58,6% до 71,7% тест-культур хелікобактерів були в межах від 5 до 10 мм). Проміжну конкурентну здатність у цій групі мали інші представники ентеробактерій (цитробактери, ентеробактер, кишкові палички, клебсієли), стрептококи та стафілококи (від 10,0% до 28,3% помірно чутливих штамів хелікобактерів).

Серед виявлених конкурентів Н.pylori інертними у ферментативному відношенні (не продукували ензимів в межах проведеного дослідження, або мали тільки гемолітичну активність) виявились 32 штами супутньої мікрофлори: серед малоактивних антагоністів Н.pylori 12 штамів (E.coli, E.faecalis, S.mitis, S.salivarius), 15 штамів із середніми властивостями (Bifidobacterium sрp, С.xerosis, Lactobacillus spp) та 5 культур з високим антагоністичним потенціалом стосовно Н.pylori (A.viridans, B.subtilis, Pseudomonas spp) (табл. 3).

Встановлено конкурентні властивості вказаної групи бактерій стосовно високоактивних у ферментативному відношенні антагоністів та симбіонтів Н.pylori. До найбільш активних віднесено штами A.viridans та B.subtilis (подавляли життєдіяльність від 67% до 92,1% тест-культур, середні зони затримки росту реєструвались у межах від 12,5 до 16,3 мм). Із числа антагоністів, що мали помірні конкурентні властивості відносно хелікобактерів, згаданими вище ознаками частіше характеризувались лактобактерії та псевдомонади (майже половина штамів пригнічувала тест-культури в середніх межах від 7,8 до 10,4 мм). Заслуговують на окрему увагу конкуренти відносно найбільш поширених серед мукозної мікрофлори при ГДП стафілококів та стрептококів. Інгібіторами Staphylococcus sрр, крім високоактивних антагоністів із низькою ферментативною активністю, були визначені також представники біфідобактерій – зони затримки росту (12,4±3,3) мм, кишкові палички – (15,6±3,9) мм, лактобактерії – (13,4±3,5) мм та псевдомонади – (15,4±4,2 ) мм. Тест-об’єкти Streptococcus sрр проявляли високу чутливість до штамів A.viridans, B.subtilis (середні зони інгібіції від 12,4 до 22,3 мм) та середню до представників Bifidobacterium sрp, Lactobacillus spp, С.xerosis та S.salivarius (від 5,2 до 7,2 мм).

Визначення векторної спрямованості взаємодії між антагоністами Н.pylori з низьким набором продукуємих ензимів до відповідних конкурентів, що характеризувались високою ферментативною активністю, показало, що до штамів A.viridans, B.subtilis, Bifidobacterium sрp, Lactobacillus spp, С.xerosis та меншою мірою E.coli активних конкурентів виявлено не було.

Вивчення впливу мікроаерофільних умов культивування на антагоністичні властивості виявлених конкурентів Н.pylori показало, що аеробні (B.subtilis, Pseudomonas spp) та анаеробні (Bifidobacterium sрp) бактерії не підтримували життєдіяльність у вказаних умовах. Конкурентні властивості факультативно-анаеробних мікроорганізмів (С.xerosis, E.coli, E.faecalis, S.mitis, S.salivarius) у контролі та досліді статистично не відрізнялись. Стимуляція інгібуючих властивостей в атмосфері зниженого парціального тиску кисню та підвищеного вмісту вуглекислого газу визначена у штамів A.viridans та Lactobacillus spp (збільшення зон затримки росту тест-культур у 1,5-4,8 та 1,2-2,3 рази відповідно).

Таблиця 3

Характеристика антагоністичної активності мукозної УПМФ з низьким потенціалом ферментативної активності

Мікроорганізми-антагоністи | Кіль-кість шта-мів | Розподіл тест-культур у % по чутливості до антагоністів (М±m) | Н. pylori (n=30) | мукозна мікрофлора (n=85) | нечу-тливі | мало-чут-ливі | висо-кочу-тливі | 3 | нечу-тливі | мало-чут-ливі | висо-кочу-тливі | 3 | A.viridans2 | 0 | 6,7±

7,1 | 93,3±7,1 | 12,8±4,7 | 12,8±

4,9 | 16,9±

7,6 | 70,3±

8,6 | 16,3±

5,8 | B.subtilis1 | 11,1±5,0 | 24,4±7,2 | 64,5±

11,3 | 7,8±

4,6 | 26,4±

6,6 | 26,8±7,2 | 46,8±8,9 | 12,5±6,8 | Bifidobacterium sрp2 | 23,4±9,4 | 71,7±7,1 | 4,9±

2,3 | 6,7±

4,1 | 42,1±

9,7 | 25,6±

5,5 | 32,3±

8,9 | 8,3±

2,9 | С.xerosis3 | 34,4±

11,1 | 63,9±9,0 | 1,7±

0,9 | 5,2±

3,4 | 84,8±

10,7 | 10,4±

3,2 | 4,8±

1,8 | 6,8±

2,5 | E.coli | 8 | 75,3±

16,8 | 24,7±

16,8 | 0 | 5,4±

2,5 | 75,0±

12,1 | 8,0±

5,6 | 17,0±

5,6 | 8,6±

4,3 | E.faecalis1 | 92,0±3,8 | 8,0±

3,8 | 0 | 4,4±

2,5 | 78,0±

8,5 | 16,0±

5,7 | 6,0±

2,8 | 4,0±

2,6 | Lactobacillus spp10 | 32,4±8,9 | 58,6±7,2 | 9,0±

3,7 | 8,8±

3,9 | 38,0±

6,0 | 42,0±

4,0 | 20,0±

8,6 | 7,8±

1,6 | Pseudomonas spp2 | 37,6±

7,3 | 40,3±

8,2 | 22,1±

10,5 | 7,7±

3,3 | 73,6±

10,4 | 4,8±

1,8 | 21,6±

6,8 | 10,4±

3,8 | S.mitis1 | 70,1±

8,4 | 29,9±

7,1 | 0 | 4,1±

2,5 | 100,0 | 0 | 0 | 4,6±

1,9 | S.salivarius2 | 80,5±

8,4 | 19,5±

7,1 | 0 | 4,1±

2,5 | 98,5±

1,0 | 1,5±

1,0 | 0 | 5,2±

2,0 | 32 | 50,5±

8,9 | 33,1±

12,1 | 16,4±

7,1 | 6,1±

3,2 | 72,9±

8,9 | 13,3±

4,1 | 13,8±

3,9 | 8,2±

3,6 | Примітки:

1. n – кількість штамів;

2. 3 – зони затримки росту тест-культур у мм (Mm).

Конкурентні властивості штаму A.viridans №167, що становить основу препарату А-бактерину, щодо тест-культур Н.pylori оцінювали за двома показниками - бактеріостатичною та бактерицидною дією. Дослідження показали, що при спільному вирощуванні впродовж семи діб ріст хелікобактерів був відсутній у всіх випадках при наявності росту в контролях. Через 3 години спільного культивування кількість життєздатних