Міністерство охорони здоров’я України

Луганський державний медичний університет

Шабельник Олег Іванович

УДК 579:[612. 336.3+612.112.95

Вплив різних методів інактивації токсинів сальмонел на продукцію цитокінів і циклічних нуклеотидів моноцитами, нейтрофілами та ентероцитами in vitro

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Луганськ-2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Гайдаш Ігор Славович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський державний медичний університет, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології

доктор медичних наук, професор Абрамов Андрій Володимирович, Запорізький державний медичний університет, професор кафедри патологічної фізіології

Провідна установа: Кафедра загальної та клінічної патологічної фізіології ім. В.В. Підвисоцького, Одеський державний медичний університет МОЗ України, м. Одеса

Захист відбудеться 07 жовтня 2005р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 29.622.01 при Луганському державному медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1)

Автореферат розісланий 02.09. 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сальмонельоз - це гостре інфекційне захворювання, яке викликають різні серотипи бактерій роду Salmonella. Захворюваність на сальмонельоз в Україні в 2004 р. складала 17,52 випадків на 100 000 населення (Сенченко В.С., 2004). Основними джерелами збудників сальмонельозу є синантропні гризуни, велика рогата худоба, свині, кури, індики і водоплавна птиця (Beach J.C. et al., 2002; Dargatz D.A. et al., 2003). Сальмонели викликають в домашньої птиці гострі захворювання, які особливо тяжко протікають в пташенят віком до 1 місяця і призводять нерідко до падежу, який сягає 80 %. У дорослої птиці інфекція часто протікає в формі безсимптомного носійства, яке триває місяцями (Сидорова Л.В. та співавт., 1992). Встановлено, що сальмонели, які викликають захворювання у тварин і птиці, нерідко є збудниками окремих захворювань у людей і навіть причиною спалахів. При цьому фактором передачі збудників сальмонельозу є переважно інфіковані м'ясо і яйця (Baron F. et al., 2004).

Патогенез сальмонельозу обумовлений рядом факторів, результат взаємодії яких призводить до розвитку того або іншого ступеня вираження інфекційного процесу. Ці фактори, з одного боку, обумовлені збудником (патогенністю та антигенною чужорідністю для макроорганізму сальмонел та їх токсинів), з іншого боку - макроорганізмом (станом гомеостазу даного конкретного індивідуума і, в першу чергу, імунної системи) (Бунін К.В., 1980). Сальмонели виділяють 2 види токсинів: ендотоксин і ентеротоксин (ЕТ); ендотоксин входить до складу клітинної стінки бактерій і виділяється в навколишнє середовище при їх дезінтеграції і лізисі. Структурним компонентом ендотоксину є ліпополісахарид (ЛПС), первинною мішенню в механізмі дії якого є моноцити і тканинні макрофаги, які виробляють медіатори (інтерлейкіни (ІЛ), фактор некрозу пухлини (ФНП), простагландини (ПГ), лейкотрієни (ЛТ) та ін.), відповідальні за розвиток ендотоксичних реакцій (Iankov L. et al., 2004). Зазначені медіатори викликають лихоманку, ранню гіпотонію, інфекційно-токсичний шок, агрегацію тромбоцитів, скорочення гладенької мускулатури; активують аденілатциклазу, що призводить до посиленої секреції води та електролітів ентероцитами та до розвитку діареї (Андрейчин М.А., Ивахив О.Л., 1998).

Сальмонельозний ЕТ є екзотоксином, який продукується бактеріями в навколишнє середовище в процесі життєдіяльності. Механізм дії ЕТ зводиться до стимуляції через систему ПГ активності аденілатциклази ентероцитів і власної платівки слизової оболонки тонкої кишки, що призводить до накопичення циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) і, як наслідок, до розвитку діареї (Камзолкіна Н.Б., 1983). Дотепер секреторна функція моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів під дією сальмонельозних токсинів вивчена недостатньо, що потребує більш глибокого дослідження цієї проблеми (Gabriel P. et al., 2002).

Сальмонели здатні зберігатись в навколишньому середовищі і протистояти впливу багатьох фізичних і хімічних факторів. В різних харчових продуктах сальмонели можуть залишатись життєздатними від декількох днів до місяців, а при сприятливих умовах - і розмножуватись. Накопичення в сировині, харчових продуктах й обладнанні вегетативних форм сальмонел та їх токсинів обумовлює потенційну загрозу виникнення окремих випадків і спалахів сальмонельозу в людей (Logue C.M. et al., 2003).

Встановлення ступеня резистентності сальмонел до впливу фізичних і хімічних факторів має велике практичне значення, насамперед, для наукового обгрунтування заходів, спрямованих на переривання шляхів передачі збудника. При виробництві м'ясних напівфабрикатів важливою складовою виробничого процесу є дезинфекція і санітарна обробка сировини, готових продуктів та обладнання. Особливу актуальність подає використання бактерицидів для зменшення або знищення бактеріального обсіменіння на тушах тварин і птиць. Дослідження останніх років сконцентровані на використанні певних речовин, таких, як окислений хлористий натрій, перекис водню, тринатрієвий фосфат і цетилпіридиніум хлорид, а також на застосуванні активованого електрохімічного розчину. Кожний з них має власний механізм впливу на мікрофлору, тільки йому властиву ефективність і відповідну перевагу (Botteldoorn N. et al., 2004). Можливими засобами дезинфекції та інактивації токсинів є слабкі розчини органічних кислот, гідроперекису (ГП), етилового спирту та їх суміші. Проте в науковій літературі даних про їх бактеріцидний та антитоксичний потенціал немає.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом наукової роботи кафедри патологічної фізіології Луганського державного медичного університету № 0198U005713 “Запалення як наслідок дії бактерій”.

Мета роботи: Розробити патогенетично обгрунтовані способи інактивації токсинів сальмонел на основі вивчення продукції медіаторів та циклічних нуклеотидів моноцитами, нейтрофілами і ентероцитами in vitro.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Об'єкт дослідження: моноцити і нейтрофіли периферійної крові людини, ентероцити кишечника курей in vitro.

Предмет дослідження: (1) вплив ЛПС і ентеротоксину сальмонел in vitro на секреторну функцію і стан внутрішньоклітинної системи циклічних нуклеотидов моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів; (2) вплив розчинів оцтової кислоти, гідроперекису та їх суміші на токсичну активність ЛПС і ентеротоксину.

Методи дослідження: бактеріологічні (виділення ЛПС, вивчення бактерицидної дії розчинів оцтової кислоти, перекису водню та їх суміші), біологічні (встановлення половинної летальної дози ЛПС й ЕТ), імунологічні (виділення моноцитів і нейтрофілів з периферійної крові, визначення вмісту медіаторів і циклічних нуклеотидів).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлена здатність сальмонельозного ентеротоксину стимулювати секрецію моноцитами і нейтрофілами ІЛ-1?, -6, -8, ФНП-, ПГЕ2 і ЛТС4 і впливати на внутрішньоклітинний вміст циклічних нуклеотидів (викликати переважне збільшення цАМФ). Встановлена здатність ентероцитів секретувати ІЛ-1?, -6, -8, ФНП-. Секреція медіаторів ентероцитами посилюється під впливом сальмонельозних ЛПС та ентеротоксину. Встановлений дозозалежний вплив токсинів сальмонел на секреторну функцію і внутрішньоклітинну систему циклічних нуклеотидов ентероцитів, моноцитів і нейтрофілів. Встановлена переважна чутливість моноцитів до ЛПС, а ентероцитів - до ентеротоксину. Вперше показано, що розчини 1 % оцтової кислоти (ОК), 3 % ГП та їх суміш викликають дозозалежну інактивацію сальмонельозних токсинів, що супроводжується зменшенням або повною втратою їх здатності стимулювати секреторну функцію моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів; найбільш повну інактивацію ЛПС й ЕТ викликає суміш розчинів оцтової кислоти і гідроперекису.

Практичне значення отриманих результатів. Дано патогенетичне обгрунтування використання суміші розчинів 1 % оцтової кислоти і 3 % гідроперекису для інактивації токсинів сальмонел в курячому м’ясі та м’ясопродуктах. Отримані дані використовуються в навчальному процесі двох медичних ВНЗ України: Луганського і Донецького ім. М. Горького державних медичних університетів, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, планування експерименту були здійснені науковим керівником роботи. Автором самостійно проведений: інформаційний пошук, аналіз літератури, виконана експериментальна частина роботи (виділення сальмонел, імунологічні дослідження), написані всі розділи дисертації та автореферат.

Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації були викладені та обговорені на: наукової конференції “Четверті читання ім. В.В. Підвисоцького” (Одеса, 26-27 травня 2005 р.), а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів в 2001-2005 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 наукові статті в фахових часописах та 1 тези.

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 121 сторінці машинописного тексту (комп'ютерний набір) та складається з вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 54 таблицями (загальний обсяг – 6 сторінок), 2 малюнками. Список літератури включає 122 джерела вітчизняних та іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Об'єктом дослідження служили 1109 культур моноцитів, 1145 культур нейтрофілів периферійної крові здорових донорів, а також 1090 культур ентероцитів тонкої кишки курей. Культури моноцитів і нейтрофілів були виділені з периферійної крові 35 дорослих практично здорових чоловіків і 45 жінок віком 30-45 років за допомогою центрифугування на градієнті щільності 1,077 і 1,093 фіколу-верографіну. Суспензію ентероцитів одержували з кишечників здорових курей, забитих перед дослідом.

ЛПС одержували з культур Salmonella gallinarum-pullorum, S. typhimurium, S. enteritidis водно-феноловою екстракцією. Ідентифікацію сальмонел проводили з використанням діагностичних наборів “Ентеротест-24” (АТ “Лахема”, Чехія). Для визначення концентрацій токсинів, призначених для стимуляції клітин, було проведено встановлення ЛД50 ЛПС (2 мкг/мл) та ЛД50 ЕТ (1,5 мл супернатанту).

З метою вивчення ефективності інактивації ЛПС і ЕТ були використані наступні речовини: 1 % розчин ОК; 3 % розчин ГП; суміш розчинів 1,0 % ОК і 3 % ГП. Бактеріцидну дію кожної концентрації ОК, ГП та їх суміші визначали на живих культурах S. gallinarum-pullorum.

Визначення ІЛ-1?, -6, -8 і ФНП-? проводили в супернатантах моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів (концентрація 6 lg клітин/мл) з допомогою комерційних наборів ELISA (Medgenix Diagnostics, Бельгія). Визначення ПГЕ2, ЛТС4, цАМФ і цГМФ в клітинах-мішенях проводили радіоімунним методом з використанням тест-систем (Amersham, Велика Британія). Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної статистики на ЕОМ.

Результати дослідження та їх аналіз. Вплив ЛПС та ЕТ на секреторну активність моноцитів. Моноцити in vitro без дії на них ЛПС продукували певні кількості медіаторів, які були прийняті в якості референтної норми. Додавання до моноцитів ЛПС викликало посилення секреції зазначених монокінів: при використанні дози ЛПС 0,001 мкг/л кратність збільшення секреції ІЛ-1? порівняно з референтною нормою склала 1,7 рази, ІЛ-6 - 1,5 рази, ІЛ-8 - 1,8 рази, ФНП-, ПГЕ2 і ЛТС4 - 1,4, 1,6 і 1,35 раз відповідно (р<0,05 в усіх випадках). Підвищення концентрації ЛПС до 0,01 мкг/мл супроводжувалось збільшенням секреції моноцитами ІЛ-1? в 2,8 рази, ІЛ-6 - в 2,3 рази, ІЛ-8 - в 2,5 рази, ФНП- - в 2,6 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 2,7 і 1,9 раз відповідно. Абсолютні показники вмісту даних монокінів в супернатантах культур моноцитів в усіх випадках були вищими аналогічних показників референтної норми. Стимуляція моноцитів ЛПС в дозі 0,1 мкг/л супроводжувалась підйомом секреції ІЛ-1? в 4,2 разів, ІЛ-6 - в 3,7 рази, ІЛ-8 - в 3,9 рази, ФНП-, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 4,1, 3,9 разів та 3,3 раз (р0,05 порівняно з нормою в усіх випадках). При використанні концентрації ЛПС 0,5 мкг/л відбувалось збільшення секреції монокінів від 4,7 разів для ЛТС4 до 6,4 разів - для ІЛ-1? відносно референтної норми, ступінь збільшення продукції інших медіаторів коливався в цих межах. Внесення до культури моноцитів ЛПС в дозі 1,0 мкг/л супроводжувалось зростанням секреції в 7,4-8,8 разів порівняно з вихідним рівнем. Найбільша продукція монокінів була зареєстрована при використанні 2,0 мкг/л ЛПС. В усіх випадках секреція моноцитами ІЛ-1? переважала над секрецією інших медіаторів, а секреція ЛТС4 була найменшою.

При вивченні впливу нативного ЕТ на секреторну активність моноцитів встановлено, що розчинення ЕТ 1:100 викликало найменшу стимуляцію секреції: вміст ІЛ-1? в супернатанті був в 1,35 рази вищим аналогічного показника норми, ІЛ-6 - в 1,3 рази, ІЛ-8 – в 1,27 рази, ФНП- - в 1,32 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 – в 1,45 і 1,23 рази відповідно (р0,05 в усіх випадках). Використання ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:10 супроводжувалось більш інтенсивним збільшенням секреторної функції. Вплив на моноцити ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:2 супроводжувався підвищенням секреції від 3,74 рази (ЛТС4) до 5,8 разів (ІЛ-1?). Кратність збільшення секреції інших медіаторів знаходилась в даному діапазоні (р0,05 порівняно з нормою). Найбільші показники секреції зареєстровані при дії на моноцити ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:1: продукція ІЛ-1? порівняно з референтною нормою зросла в 10,8 разів, ІЛ-6 - в 9,6 разів, ІЛ-8 - в 8,5 разів, ФНП- - в 11,3 разів, ПГЕ2 і ЛТС4, відповідно, і 10,3 і 7,3 разів (р0,05 в усіх випадках).

Вплив ЛПС та ЕТ на секреторну активність нейтрофілів. При дії на нейтрофіли ЛПС в дозі 0,001 мкг/л секреція ІЛ-1? перевищувала нормативний показник в 1,53 рази, ІЛ-6 – в 1,42 рази, ІЛ-8 - в 1,46 рази, ФНП- - в 1,36 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 1,46 і 1,73 рази відповідно (р0,05 в усіх випадках). Взаємодія нейтрофілів з ЛПС в дозі 0,01 мкг/мл супроводжувалась збільшенням секреції ІЛ-1? проти референтної норми в 2,6 рази, ІЛ-6 - в 2,1 рази, ІЛ-8 - в 2,34 рази, ФНП-, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 2,43, 2,26 і 2,81 рази відповідно. Аналогічна динаміка змін секреторної активності нейтрофілів зареєстрована і при використанні концентрацій ЛПС 0,1, 0,5 і 1,0 мкг/л. ЛПС в дозі 2,0 мкг/л викликав найбільшу стимуляцію секреції медіаторів.

Під дією ЕТ, розведеного 1:100, кратність збільшення секреції ІЛ-1? порівняно з референтною нормою склала 1,37 рази, ІЛ-6 - 1,27 рази, ІЛ-8 - 1,33 рази, ФНП- - 1,29 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 - 1,54 і 1,66 рази відповідно (р0,05 в усіх випадках). При розчиненні 1 ЛД50 ЕТ 1:10 секреція зростала, аналогічна тенденція зареєстрована при використанні ЕТ в розчиненнях 1:2 та 1:1 (р0,05 в усіх випадках). При порівнянні секреторної активності нейтрофілів і моноцитів, підданих впливу однакових концентрацій ЕТ, встановлено, що секреторна активність нейтрофілів була нижчою.

Вплив ЛПС та ЕТ на секреторну активність ентероцитів. При дослідженні впливу ЛПС на секреторну активність ентероцитів встановлено, що найменша реакція мала місце при використанні ЛПС в дозі 0,001 мкг/л. Дія ЛПС в дозі 0,01 мкг/л супроводжувалась збільшенням продукції ІЛ-1? в 2,5 рази порівняно з референтним показником, ІЛ-6 і ІЛ-8 - в 2,2 і 2,3 рази, ФНП- - в 1,87 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 – в 2,54 і 2,76 рази. Стимуляція ЛПС в дозі 0,1 мкг/л викликала подальше збільшення секреції, однак дія ЛПС в дозі 2,0 мкг/л викликала виснаження секреторних ресурсів ентероцитів (кратність збільшення секреції була незначною порівняно з ефектом, викликаним ЛПС в дозі 1,0 мкг/мл).

Додавання 1 ЛД50 ЕТ в розчиненні 1:100 викликало збільшення секреції ІЛ-1?, -6 і -8 в 1,3 рази проти аналогічних показників норми, ФНП- - в 1,27 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 1,74 та 1,83 раз (р0,05 в усіх випадках). Дія ЕТ, розведеним 1:10, викликала підйом секреції ІЛ-1? проти норми в 2,39 рази, ІЛ-6 - в 2,47 рази, ІЛ-8 - в 2,56 рази, ФНП- - в 2,11 рази, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 3,91 і 3,73 рази відповідно. Аналогічна реакція зареєстрована й у випадку використання ЕТ в розчиненні 1:2. Дія ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:1 супроводжувалась збільшенням секреції ІЛ-1? в 9,1 разів порівняно з нормою, ІЛ-6 – в 8,3 разів, ІЛ-8 – в 9,14 разів, ФНП- - в 7,32 разів, ПГЕ2 і ЛТС4 – в 10,6 і 9,6 разів відповідно (р0,05).

Порівняння секреторної активності моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів дозволило відзначити, що ентероцити мали найменший секреторний потенціал при дії на них ЛПС та ЕТ (за винятком продукції ними ПГЕ2 і ЛТС4, яка в ряді випадків була підвищеною).

Вплив ЛПС та ЕТ на систему циклічних нуклеотидів (ЦН) в моноцитах, нейтрофілах і ентероцитах. Загальною тенденцією у всіх типів клітин було відносне переважання вмісту цГМФ над вмістом цАМФ, в результаті чого коефіцієнт цАМФ/цГМФ в усіх клітинах був нижчим 1. Індивідуальні особливості різних типів клітин полягали в різному абсолютному вмісті ЦН, найбільшим розходженням рівнів цАМФ і цГМФ характеризувались ентероцити, в яких був найбільший вміст цГМФ при найменшому рівні цАМФ.

Дія ЛПС на моноцити супроводжувалась збільшенням вмісту цАМФ при всіх концентраціях ЛПС (р<0,05 в усіх випадках). Однак контакт моноцитів з ЛПС не призводив до вірогідного збільшення рівня цГМФ навіть при концентрації 2,0 мкг/л (р>0,05), внаслідок чого коефіцієнт цАМФ/цГМФ мав чітко виражену спрямованість до збільшення.

Аналогічна динаміка змін цАМФ під впливом ЛПС зареєстрована і в нейтрофілах. При дозі ЛПС 2,0 мкг/л вміст цАМФ був в 1,72 рази вищим норми і в 1,19 рази нижчим порівняно з аналогічним показником для моноцитів (р<0,05). Дана обставина свідчить про те, що при рівних концентраціях ЛПС динаміка збільшення цАМФ в нейтрофілах була менш інтенсивною порівняно з такою в моноцитів. Відмінною рисою впливу ЛПС на нейтрофіли було зменшення внутрішньоклітинного вмісту цГМФ. В результаті різноспрямованих змін рівнів цАМФ і цГМФ показник цАМФ/цГМФ знижувався, сягаючи своїх найбільших змін при дозі ЛПС 2,0 мкг/л (зниження в 2,2 рази проти показника норми, р<0,05).

Реакція ентероцитів на присутність ЛПС була типовою порівняно з моноцитами і нейтрофілами, але мала певні особливості. При загальній тенденції до збільшення вмісту цАМФ під дією ЛПС ступінь цього збільшення істотно перевищував такий показник для моноцитів і нейтрофілів. Рівень цГМФ також збільшувався: при дозі ЛПС 2,0 мкг/л кратність збільшення склала 1,3 рази порівняно з аналогічним показником при концентрації 0,001 мкг/л (р<0,05). Зміни цАМФ і цГМФ супроводжувались збільшенням цАМФ/цГМФ: при дозі ЛПС 0,001 мкг/л - в 1,6 раз проти референтної норми, при 2,0 мкг/л – в 3,0 рази (р<0,05 в обох випадках).

Таким чином, при впливі ЛПС на клітини-мішені зареєстровано прямо пропорційне (залежно від його концентрації) збільшення рівня цАМФ і цАМФ/цГМФ. Вміст цГМФ мав тенденцію до збільшення в моноцитах, вірогідно збільшувався в ентероцитах і мав тенденцію до зниження в нейтрофілах.

Внесення до культури моноцитів ЕТ викликало помірне збільшення в даних клітинах цАМФ і цГМФ, що вело до підвищення показника цАМФ/цГМФ. Найменші зміни зареєстровані при використанні ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:100; вони зростали при використанні 1 ЛД50 в розчиненнях 1:10 і 1:2 і сягали максимуму при взаємодії моноцитів з ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:1.

Взаємодія нейтрофілів з ЕТ супроводжувалась збільшенням вмісту цАМФ при тенденції до зниження вмісту цГМФ. Зміни були найбільшими при використанні розчинення 1 ЛД50 ЕТ 1:1. Вірогідні зсуви вмісту цАМФ і коефіцієнту цАМФ/цГМФ зареєстровані також при використанні ЕТ в розведеннях 1:2 і 1:10. При розчиненні ЕТ в співвідношенні 1:100 вірогідних розходжень в змінах рівнів ЦН і їх співвідношення порівняно з референтною нормою не виявлено.

Найбільш чутливими до ЕТ виявились ентероцити, їх реакція була значно більш вираженою, ніж при дії ЛПС. При дії ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:100 вміст цАМФ збільшився проти референтної норми в 2,55 раз (р<0,05), що було в 1,7 і 1,93 рази більше порівняно з аналогічними змінами в моноцитах і нейтрофілах (р<0,05 в обох випадках). Водночас, вміст цГМФ в ентероцитах при контакті з ЕТ, розведеним 1:100, збільшувався невірогідно. В зв'язку з цим коефіцієнт цАМФ/цГМФ для ентероцитів перевищував показник референтної норми в 2,2 рази (р<0,05). При дії на ентероцити ЕТ в розчиненні 1:10 ступінь підвищення цАМФ склав 3,54 рази, при розчиненні 1:2 - 4,41 разів. Темпи збільшення вмісту цГМФ в ентероцитах були менш значними, тому коефіцієнт цАМФ/цГМФ при розчиненнях ЕТ 1:10 і 1:2 перевищував, відповідно, референтну норму в 3,0 і 3,6 рази. Найбільші зміни вмісту ЦН були відзначені при дії на ЕТ в розчиненні 1:1. При цьому рівень цАМФ збільшився проти референтної норми в 5,6 разів, рівень цГМФ - в 1,37 рази, коефіцієнт цАМФ/цГМФ - в 4,2 разів (р<0,05 в усіх випадках). Примітно, що середні абсолютні показники цАМФ в ентероцитах були вищими аналогічних в моноцитах і нейтрофілах в 2,14 і 3,02 рази, рівень цГМФ перевищив показник в моноцитах в 1,3 раз, в нейтрофілах - в 2,36 рази (р<0,05). Зіставлення коефіцієнта цАМФ/цГМФ для ентероцитів з такими показниками для моноцитів і нейтрофілів вказувало на те, що дисбаланс в системі ЦН в ентероцитах був більш значним.

Ефективність інактивації ЛПС та ЕТ 1 % розчином ОК. Про токсичний потенціал ЛПС і ЕТ, оброблених 1 % розчином ОК, судили за їх впливом на секреторну активність та стан системи ЦН в клітинах-мішенях. Обробка ЛПС 1 % розчином ОК не знижувала секрецію медіаторів моноцитами порівняно з такою для клітин, які контактували з нативним ЛПС, навіть в концентрації 0,001 мкг/л: відмінностей між показниками при стимуляції нативним ЛПС і ЛПС, обробленим розчином 1 % ОК, не виявлено (р>0,05 в усіх випадках).

Навпаки, 1 % розчин ОК істотно знижував токсичність ЕТ, що виражалось у вірогідному зменшенні секреторної активності моноцитів відносно групи порівняння й у відсутності розходжень порівняно з показниками норми (при розчиненні 1 ЛД50 ЕТ 1:100 і 1:10). Контакт інактивованого ЕТ в розчиненні 1:1 з моноцитами супроводжувався зниженням секреції ІЛ-1? в 6,9 разів (порівняно з ефектом нативного ЕТ), ІЛ-6 - в 6,0 разів, ІЛ-8 - в 5,7 разів, ФНП- - в 8,1 разів, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 6,3 і 3,9 разів відповідно.

Секреція медіаторів нейтрофілами під дією інактивованого 1 % розчином ОК ЛПС порівняно з нативним ЛПС вірогідних відмінностей не мала навіть при використанні останнього в концентрації 0,001 мкг/л. ЕТ, оброблений 1 % розчином ОК, втрачав здатність стимулювати секреторну функцію нейтрофілів, найбільша інактивація була відзначена при використанні ЕТ в розчиненні 1:100 - секреторна активність нейтрофілів не відрізнялась від такої в групі референтної норми. При використанні ЕТ, розведеного 1:10 і обробленого 1 % розчином ОК, кратність зниження секреції ІЛ-1? та -6 була в 1,5 рази нижчою такої для клітин, стимульованих нативним ЕТ, секреція ІЛ-8 і ФНП- знижувалась в 1,8 раз, ПГЕ2 і ЛТС4 - в 1,55 і 2,8 раз відповідно (р0,05 порівняно з групою зіставлення в усіх випадках). ЕТ в розчиненні 1:1, оброблений розчином ОК, частково зберігав здатність стимулювати секреторну функцію нейтрофілів.

ЛПС, оброблений 1 % розчином ОК, не втрачав здатності стимулювати секрецію ентероцитів, причому токсичний потенціал ЛПС зберігався незалежно від його концентрації. Про це свідчила відсутність вірогідних відмінностей між показниками секреції медіаторів ентероцитами, стимульованими нативним та інактивованим ЛПС (р>0,05 у всіх серіях). ЕТ, оброблений 1 % розчином ОК, не стимулював секрецію ентероцитів. Ефект 1 % розчину ОК був тим вищим, чим нижчою була концентрація ЕТ, найбільш повна інактивація наступала при дії на ЕТ в розведенні 1:100.

Вплив ЛПС, обробленого 1 % ОК, на вміст ЦН в клітинах-мішенях не відрізнявся від такого при використанні нативного ЛПС у всіх концентраціях. Це, можливо, пов'язано з тим, що 1 % розчин ОК не інактивував ЛПС, внаслідок чого останній впливав на клітини-мішені аналогічно нативному ЛПС.

ЕТ, інактивований 1 % ОК, частково втрачав здатність викликати зміни вмісту ЦН в клітинах-мішенях: при дії його в розведенні 1:100 на моноцити вірогідних змін вмісту цАМФ і цГМФ порівняно з референтною нормою не виявлено. В межах нормативних значень залишався і коефіцієнт цАМФ/цГМФ, але абсолютний показник цАМФ був вірогідно нижчим, ніж при використанні нативного ЕТ. Показники цГМФ і цАМФ/цГМФ в групах порівняння вірогідних відмінностей не мали.

При використанні інактивованого ЕТ в розчиненні 1:10 вміст ЦН і співвідношення між ними також вірогідно не відрізнялись від таких порівняно з нормою. Однак показники вмісту ЦН вірогідно перевищили нормативні (р<0,05 в усіх випадках).

Аналогічно впливав на систему ЦН ентероцитів інактивований ЕТ: стимуляція ним супроводжувалась збільшенням вмісту цАМФ проти норми в 1,18 рази (розчинення ЕТ 1:100), в 1,3 рази (1:10) і в 1,5 рази (1:1). Абсолютні показники рівнів цАМФ відповідно зазначених розчинень ЕТ були нижчими, ніж при стимуляції ентероцитів нативним ЕТ, в 2,15, 2,7 і 3,5 рази (р<0,05 в усіх випадках), більш низькими були і рівні цГМФ. Внаслідок цього коефіцієнт цАМФ/цГМФ знизився проти аналогічних показників в групах зіставлення в 1,8, 2,3 і 2,8 раз залежно від розчинення ЕТ.

Динаміка змін ЦН в нейтрофілах була подібною з описаною для ентероцитів і моноцитів: зсуви рівнів цАМФ, цГМФ і коефіцієнта цАМФ/цГМФ були нижчими, ніж в групі клітин, стимульованих нативним ЕТ.

Ефективність інактивації ЛПС та ЕТ 3 % розчином ГП. Дія 3 % розчином ГП на ЛПС в дозі 0,1 мкг/л супроводжувалась зниженням секреції медіаторів від 2,6 до 3,1 рази (р0,05 в усіх випадках), але абсолютні показники секреції перевищували аналогічні показники норми (р0,05 в усіх випадках). Ефективність інактивації ЛПС 3 % розчином ГП ще більше знижувалась при дозі ЛПС до 1,0 мкг/л.

Перекис водню (3 % розчин) інактивував ЕТ, найбільш повна інактивація зареєстрована при його концентрації 1:100 від 1 ЛД50. Секреція моноцитів не стимулювалась, що підтверджувалось відсутністю вірогідних розходжень між аналогічними показниками в досліді і в референтній нормі. Відсутність активації секреторної функції спостерігали також при використанні інактивованого ЕТ в розчиненні 1:10. Дія 3 % розчином ГП на ЕТ в розчиненні 1:1 істотно знижувала токсичність останнього, проте повної інактивації токсину не наступало, про що свідчили вірогідно більш високі (порівняно з нормою) показники секреції моноцитів (р0,05 в усіх випадках).

Вплив ЛПС і ЕТ, підданих інактивації 3 % розчином ГП, на нейтрофіли був подібним з таким для моноцитів. Розчин ГП знижував токсичний потенціал ЛПС, але його повної інактивації не відбувалось навіть при концентрації 0,001 мкг/л. Нейтрофіли, які контактували з ЛПС, обробленим ГП, відповідали більш високою, ніж в нормі, секрецією медіаторів, але рівні продукції були вірогідно нижчими таких в нейтрофілів, стимульованих нативним ЛПС. Аналогічні зсуви, але більш виражені, зареєстровані при дії на нейтрофіли ЛПС в концентраціях 0,1 і 1,0 мкг/л. В той же час, абсолютні показники секреції ІЛ-1? при зазначених концентраціях ЛПС були в 2,8 і 3,6 рази нижчими проти аналогічних показників для нейтрофілів, стимульованих нативним ЛПС. Подібні тенденції зареєстровані і відносно інших показників.

Секреторна реакція нейтрофілів на ЕТ, оброблений ГП, була значно нижчою такої при використанні нативного ЕТ. При дії на нейтрофіли ЕТ в розчиненні 1:100, обробленого ГП, секреція медіаторів вірогідних відмінностей з показниками референтної норми не мала. Аналогічна ситуація мала місце і при використанні інактивованого ЕТ в розчиненні 1:10. При використанні ЕТ в розчиненні 1:1 (обробленого ГП) повної його інактивації не наступало, внаслідок чого показники секреції відносно референтної норми були вірогідно підвищеними. Водночас, у всіх випадках секреторна активність нейтрофілів, стимульованих інактивованим ЕТ, була істотно нижчою такої при використанні нативного ЕТ (р0,05).

Під дією ГП ЛПС втрачав здатність стимулювати секрецію медіаторів ентероцитами, зазначений ефект найбільш повно виявлявся при стимуляції інактивованим ЛПС в концентрації 0,001 мкг/л. При концентраціях ЛПС, обробленого ГП, 0,1 і 1,0 мкг/л секреторна активність ентероцитів підвищувалась, перевищуючи нормативні показники (р<0,05), однак була значно нижчою такої для клітин, стимульованих нативним ЕТ.

Внаслідок вираженої інактивуючої дії ГП на ЕТ останній в значній мірі втрачав здатність стимулювати секрецію медіаторів ентероцитами. Зазначений ефект був найбільш вираженим відносно ЕТ в розчиненнях 1:100 і 1:10 - рівні секреції вірогідно не відрізнялись від таких в групі референтної норми. Секреція виявилась підвищеною при використанні інактивованого ЕТ в розчиненні 1:1 - рівень ІЛ-1? виявився вищим референтного в 1,12 рази (р>0,05), ІЛ-6 - в 1,17 рази (р0,05), ІЛ-8 - в 1,4 рази (р0,05), ФНП- - в 1,3 рази (р0,05), ПГЕ2 і ЛТС4 - в 1,2 і 1,1 рази відповідно (р0,05 та р>0,05).

Повністю інактивовані ЛПС і ЕТ не викликали змін вмісту ЦН в моноцитах, нейтрофілах й ентероцитах. Навпаки, неповна інактивація токсинів супроводжувалась зсувами в системі ЦН клітин, проте ці зсуви були менш значними, ніж у клітинах, підданих дії нативних ЛПС і ЕТ. Дія на клітини інактивованим ЛПС в дозі 0,001 мкг/л не супроводжувалась значними змінами вмісту цАМФ, цГМФ і співвідношення між ними порівняно з контролем. Аналогічна ситуація мала місце і при дії на моноцити і нейтрофіли інактивованим ЛПС в концентрації 0,1 мкг/л. В культурах ентероцитів подібна дія супроводжувалась достовірним збільшенням вмісту цАМФ при тенденції до збільшення цГМФ, внаслідок чого коефіцієнт цАМФ/цГМФ в ентероцитах вірогідно не відрізнявся від показника референтної норми. При дії на ЛПС в дозі 1,0 мкг/л 3 % розчином ГП повної інактивації ЛПС не наступало, що супроводжувалось збільшенням рівнів ЦН і співвідношення між ними у клітинах-мішенях. В моноцитах рівень цАМФ і показник цАМФ/цГМФ були вищими в 1,44 і 1,34 разів аналогічних показників контролю (p<0,05). В нейтрофілах збільшення вмісту цАМФ супроводжувалось зниженням цГМФ, що призводило до вираженого (в 1,45 рази до референтної норми) збільшення коефіцієнта цАМФ/цГМФ. В ентероцитах збільшення цАМФ було найбільшим порівняно з моноцитами і нейтрофілами, що, поряд зі збільшенням цГМФ, призводить до зростання цАМФ/цГМФ в 1,7 рази проти референтного показника.

Зазначені зсуви рівнів ЦН у клітинах, стимульованих ЛПС, обробленим ГП, були вірогідно нижчими аналогічних в клітинах, стимульованих нативним ЛПС. Це свідчило про те, що ЛПС в концентрації 1,0 мкг/л, оброблений 3 % розчином ГП, інактивувався не повністю.

Результати вивчення впливу ЕТ, обробленого 3 % розчином ГП, на вміст ЦН в моноцитах, нейтрофілах та ентероцитах показали, що ГП повністю інактивував ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:100, в результаті чого клітини не реагували при контакті з ним зміною концентрацій ЦН. Аналогічні результати отримані при стимуляції інактивованим ЕТ більш високої концентрації (розчинення 1 ЛД50 1:10). Виняток склав рівень цАМФ в ентероцитах, вірогідно збільшений порівняно з референтною нормою.

Оскільки 3 % розчин ГП повної інактивації ЕТ не викликав, стимуляція клітин даним ЕТ супроводжувалась змінами цАМФ і цГМФ. В усіх типах клітин мало місце вірогідне збільшення цАМФ, цГМФ і показника цАМФ/цГМФ порівняно з референтною нормою. Водночас, ці рівні ЦН були вірогідно нижчими аналогічних показників у клітинах, підданих дії нативного ЕТ в розчиненні 1 ЛД50 1:1.

Ефективність інактивації ЛПС та ЕТ сумішшю розчинів 1 % ОК і 3 % ГП. Суміш ОК і ГП цілком інактивувала ЛПС в концентраціях 0,001 і 0,1 мкг/л, який втрачав здатність стимулювати секрецію моноцитів; рівні продукції медіаторів не мали достовірних розходжень з аналогічними показниками референтної норми і були значно нижчими таких показників для клітин, стимульованих нативним ЛПС (p<0,05). ЛПС в концентрації 1,0 мкг/л при обробці сумішшю ОК і ГП істотно втрачав здатність впливати на секреторну активність моноцитів (р0,05 в усіх випадках).

Суміш 1 % ОК і 3 % ГП викликала повну інактивацію ЕТ у всіх концентраціях, про що свідчила відсутність вірогідних розходжень між показниками секреції в моноцитів, стимульованих інактивованим ЕТ, і показниками референтної норми. Водночас, рівні секреції монокінів моноцитами, які контактували з інактивованим ЕТ, були істотно нижчими таких для клітин, оброблених нативним ЕТ. Подібні процеси спостерігали і при вивченні впливу на нейтрофіли токсинів, оброблених сумішшю ОК і ГП. При обробці ЛПС в концентрації 0,001 мкг/л останній цілком втрачав свою токсичність, в зв'язку з чим секреторна активність нейтрофілів не відрізнялась від нормативних показників. При використанні ЛПС в концентрації 0,1 мкг/л інактивація останнього сумішшю ОК і ГП була значною, але неповною, та рівні секреції медіаторів були вірогідно нижчими, ніж в нейтрофілів, стимульованих нативним ЛПС. Найбільшу залишкову токсичність ЛПС, обробленого сумішшю ОК і ГП, спостерігали при його концентрації 1,0 мкг/л: секреція нейтрофілами ІЛ-1? перевищувала нормативний показник в 1,6 рази, ІЛ-6 - в 1,4 рази, ІЛ-8 - в 1,7 рази, ФНП- - в 1,4 рази, ПГЕ2 - в 1,5 рази, ЛТС4 - в 1,3 рази (р0,05 в усіх випадках). Водночас, рівні секреції даних медіаторів були вірогідно нижчими таких в нейтрофілів, стимульованих нативним ЛПС.

Суміш 1 % ОК і 3 % ГП цілком інактивувала ЕТ незалежно від його концентрації. Секреторна активність нейтрофілів, стимульованих ЕТ, обробленим зазначеною сумішшю, не відрізнялась від показників контрольних дослідів як в мінімальній, так і в максимальній концентрації ЕТ.

Результати вивчення впливу на ентероцити токсинів, підданих обробці розчинами 1 % ОК і 3 % ГП, показали, що найбільш повній інактивації сумішшю піддавався ЕТ, який повністю втрачав здатність стимулювати секреторну активність, внаслідок цього показники секреції вірогідних розходжень з контролем не мали. Відзначений ефект мав місце при всіх концентраціях ЕТ, підданого інактивації. ЛПС, оброблений сумішшю 1 % ОК і 3 % ГП, зберігав свою залишкову токсичність при концентрації 1,0 мкг/л і втрачав її при нижчих дозах.

Зниження токсичності ЛПС і ЕТ під впливом суміші розчинів ОК і ГП виражалось також в зменшенні змін в системі ЦН. Дія на моноцити і нейтрофіли ЛПС в концентраціях 0,001-1,0 мкг/л, підданим інактивації не супроводжувалась значними зсувами в системі цАМФ/цГМФ. Аналогічна ситуація мала місце в ентероцитах, стимульованих ЛПС в концентраціях 0,001 і 0,1 мкг/л. При використанні інактивованого ЛПС в дозі 1,0 мкг/л ентероцити реагували невірогідним збільшенням цАМФ і цАМФ/цГМФ. Дія на клітини ЕТ, обробленого сумішшю ОК і ГП, також не супроводжувалась істотними змінами вмісту ЦН. Відзначена тенденція була властива для всіх типів клітин-мішеней, а також при різних концентраціях інактивованого ЕТ.

Порівняльний аналіз ефективності інактивації ЛПС та ЕТ розчинами 1 % ОК, 3 % ГП і їх сумішшю. Встановлено, що найбільш повну інактивацію токсинів забезпечувало використання суміші розчинів 1 % ОК і 3 % ГП, що було особливо ефективно при обробці нею високих концентрацій токсинів. Про ефективність інактивації токсинів судили на підставі зниження їх активуючої дії на секреторну функцію клітин-мішеней. В культурах моноцитів ЛПС в концентрації 0,001 мкг/л, підданий дії суміші ОК і ГП, цілком втрачав здатність активувати секрецію монокінів, чого не спостерігали при використанні тільки ОК і тільки ГП. Аналогічний ефект зареєстрований при дії зазначеною сумішшю на ЛПС в концентрації 0,1 і 1,0 мкг/л. Абсолютні показники факторів секреції у випадку використання ЛПС, інактивованого сумішшю ОК і ГП, були вірогідно нижчими таких при використанні ЛПС, обробленого окремо ГП та окремо ОК. Найбільш повна інактивація ЕТ наступала при дії на нього суміші ОК і ГП. Про це свідчили незначно змінені, в порівнянні з референтною нормою, показники секреції моноцитів. В той же час, в групах порівняння аналогічні показники істотно перевищували контрольні. Токсини, оброблені сумішшю ОК і ГП, не викликали істотних змін секреторної функції нейтрофілів та ентероцитів. Навпаки, ЛПС та ЕТ, оброблені одним з компонентів суміші, зберігали здатність впливати на секрецію медіаторів в нейтрофілах і ентероцитах.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягає в патогенетичному обгрунтуванні застосування суміші слабких розчинів оцтової