МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Шевченко Олександр Миколайович

УДК 616-002-036.12:616.15

ГЕМАТОЛОГІЧНІ МЕХАНІЗМИ

ХРОНІЗАЦІЇ ЗАПАЛЕННЯ

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Клименко Микола

Олексійович, Харківський державний медичний

університет МОЗ України, завідувач кафедри

патологічної фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Звягінцева Тетяна Володимирівна, Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології та медичної рецептури;

доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, заслужений діяч науки і техніки України, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної та клінічної патофізіології;

доктор медичних наук Березнякова Марина Євгеніївна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України (м. Харків), професор кафедри клінічної лабораторної діагностики.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця (м. Київ) МОЗ України, кафедра патологічної фізіології.

Захист відбудеться “26” січня 2006 р. об 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському державному медичному університеті (61022, м. Харків, пр. Правди, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна,4).

Автореферат розісланий “14” грудня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, професор Терещенко А. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Запалення складає основу більшості хвороб людини та є центральною і актуальною проблемою медицини протягом всієї історії. Більше за те, медична й соціальна значущість запальних захворювань із кожним роком зростає в усьому світі. Гострі запальні процеси зустрічаються все частіше і частіше набувають затяжного перебігу; зростає кількість первинно хронічних запальних захворювань (Маянский Д.Н., 1991; Труфакин В.А., Трунова Л.А., 1994; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1999; Петров Р.В., 1999). Це, очевидно, пов'язано з погіршенням екологічної ситуації, змінами загальної та імунологічної реактивності через несприятливий вплив факторів зовнішнього середовища (Pionke N.B., Gloffelty D.E., 1989; Kaiser L., Couch R.B., Glasso G.J. et al., 1999; Черешнев В.А., Кеворков Н.Н., Бахметьев Б.А. и др., 2001).

Загальновідомо, що запалення в еволюційному плані – захисно-пристосувальна реакція у формі патології, аварійний спосіб захисту цілого організму ціною пошкодження його частини (Альперн Д.Е., 1959; Чернух А.М., 1979; Серов В.В., Пауков В.С., 1995). Однак, хронічне запалення (ХЗ) характеризується невідповідністю між еволюційно-біологічною захисно-пристосувальною сутністю запальної реакції та її користю для конкретного організму (Маянский Д.Н., 1991; Пауков В.С., Салтыков Б.Б., Ермакова Н.Г. и др., 1998). Водночас механізми ХЗ вивчені недостатньо. Незважаючи на велику кількість досліджень, присвячених хронічним запальним захворюванням (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2000; Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Ганковская Л.В. и др., 2000), загальна патологія ХЗ досліджується недостатньо. Тим більше недостатньо вивчені патогенетичні особливості різних видів ХЗ. Особливий практичний інтерес становлять механізми переходу гострого запалення в хронічне (вторинно хронічне запалення), а також механізми імунного хронічного запалення, оскільки дуже часто розвиток ХЗ пов’язаний з персистенцією в організмі антигену.

Оскільки в реалізації запалення вирішальна роль належить системі крові, можна припустити, що на ефекторному рівні хронізація запалення пов'язана насамперед з недостатністю системи крові – вихідними змінами в системі крові або тим, що звичайні реакції системи крові виявляються недостатніми через персистенцію флогогену. Разом з тим, конкретні механізми причетності системи крові до хронізації запалення вивчені недостатньо (Гаврилов О.К., Козинец Г.І., Черняк Н.Б., 1985; Klebanoff S.J., Vadas M.A., Harlan J.M. et al., 1986; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Маянский Д.Н., 1991; Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Клименко Н.А., 1997; Чертков И.Л., Дризе Н.И., 1998; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2000; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2001; Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2001).

Відсутні спеціальні комплексні порівняльні дослідження гематологічних реакцій з боку всіх ланок системи крові – лейкоцитів вогнища, кістковомозкового кровотворення та периферичної крові – при різному за перебігом та етіологією запаленні. Менш за все вивчено гемопоез, функціональний стан лейкоцитів, імуногістохімічні реакції вогнища та кісткового мозку, продукцію колонієстимулюючих факторів (КСФ), можливість використання КСФ для профілактики та лікування ХЗ (Сапрыкин В.П., Харченко Н.Н., 1998; Kodaki S., Sawa Y., Sano T. et. al., 1999; Kokura S., Wolf R.E., Yoshikawa T. et. al., 1999; Клименко Н.А., 2000; Долгушин И.И., Зурочка А В., Чукичев А.В. и др., 2000; Hundelshausen P., Weber K.S.C., Huo Y. et. al., 2001).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Харківського державного медичного університету МОЗ України; комплексна тема: “Міжклітинні взаємодії та їх механізми в патогенезі запалення” (номер державної реєстрації U ). Дисертант є одним з виконавців цієї теми.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – з'ясування клітинних і гуморальних гематологічних механізмів хронізації запалення, обґрунтування застосування гемомодуляторів для профілактики та лікування ХЗ.

Завдання дослідження:

1. Виявити розбіжності в реакціях системи крові при різному за перебігом та етіологією запаленні – гострому, вторинно хронічному, неімунному та імунному первинно хронічному:

1.1. У клітинному складі й експресії адгезивних молекул вогнища запалення.

1.2. У кістковомозковому кровотворенні.

1.3. У клітинному складі та імуногістохімічних реакціях кісткового мозку.

1.4. У лейкоцитарній реакції та функціональній активності лейкоцитів периферичної крові.

1.5. У вмісті гемопоетичних КСФ – гранулоцитарного (Г-КСФ) та гранулоцитарно-макрофагального (ГМ-КСФ) – у периферичній крові.

2. Дослідити ефективність застосування Г-КСФ людини в комплексній протизапальній терапії у хворих при хронічних запальних захворюваннях.

Об'єкт дослідження - патогенез хронічного запалення.

Предмет дослідження - гематологічні механізми хронізації запалення.

Методи дослідження: гістологічні, гістохімічні, імуногістохімічні, гематологічні, імуноферментні, клініко-лабораторні, функціональні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено низку нових гематологічних механізмів хронізації запалення; показано, що первинно вона характеризується більш значною тривалістю нейтрофільної та посиленням Т-лімфоцитарної інфільтрації; остання передує макрофагальній та фібробластичній реакціям. Значно знижується експресія у вогнищі CD54-, а особливо, CD44- антигенів, стає інтенсивнішою експресія CD11с-, CD31- та CD61-антигенів. Відбуваються повторні активація гемопоезу та вихід лейкоцитів у кров, фазні зміни CD-позитивності в кістковому мозку, підвищення кількості CD11с+ -, CD3+ -, CD4+ -, CD25+ -, CD45RA+-клітин, менш виражене зменшення числа CD71+ -, CD61+ - клітин. Спостерігаються початкове зниження активності нейтрофілів та лімфоцитів та підвищення активності моноцитів крові, у подальшому – зменшення активності моноцитів і підвищення активності лімфоцитів; зростання потреби й нестача КСФ. На цій підставі вперше експериментально показано можливість застосування гемомодуляторів для профілактики та лікування ХЗ, доведено ефективність застосування Г-КСФ і розкрито ряд механізмів його протизапальної дії при ХЗ, пов'язаних саме зі збільшенням продукції функціонально активних лейкоцитів.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють існуючі уявлення про механізми хронізації запалення і можуть бути використані в подальшій науково-дослідній роботі та при викладанні. Показано також, що вміст КСФ у крові можна використати для ранньої діагностики хронізації гострого запалення, а також для диференціації первинно та вторинно хронічного, імунного та неімунного хронічного запалення. Розроблено спосіб діагностики хронізації запального процесу за співвідношеннями між Г-КСФ і ГМ-КСФ у периферичній крові, на який отримано патент України (№ 5918). Визначено ефективність застосування рекомбінантного людського Г-КСФ нейпогену в комплексній протизапальній терапії при хронічних запальних захворюваннях. Це відкриває нові перспективи в діагностиці, профілактиці та терапії ХЗ, а також обґрунтовує доцільність подальших клініко-експериментальних досліджень щодо вибору гемомодуляторів, методів, схем і доз їхнього застосування.

Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах патофізіології Харківського, Буковинського, Донецького, Луганського, Одеського, Тернопільського державних медичних університетів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконано патентно-інформаційний пошук, сформульовано мету й завдання дослідження, проаналізовано наукову літературу за темою дисертації, проведено експерименти, опрацьовано отримані результати, проведено їх аналіз та зроблено узагальнення, сформульовано висновки, написано й оформлено всі розділи дисертації. Основною є участь автора в підготовці статей до друку та наукових розробок для оформлення патенту. У тій частині актів упровадження, що стосується наукової новизни, наводяться дані, що були отримані автором у процесі виконання роботи.

Апробація результатів дослідження. Матеріали дисертації були оприлюднені й обговорювалися на ІV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004); ІІІ Російському конгресі з патофізіології з міжнародною участю (Москва, 2004); ІІІ Читаннях ім.В.В.Підвисоцького (Одеса, 2004); науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю від дня утворення ХДМУ (Харків, 2005); Всеукраїнській конференції з міжнародною участю "ІV Читання ім.В.В.Підвисоцького" (Одеса, 2005); Всеукраїнській конференції з міжнародною участю "Нейроендокринні та імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології" (Запоріжжя, 2005); II Міжнародній науковій конференції “Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія та клініка” (Одеса, 2005); засіданнях Харківського товариства патофізіологів (1999 - 2005); наукових сесіях ХДМУ (1999 - 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 29 наукових праць, з них 22 статті у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України, 6 тез у матеріалах конгресів і конференцій, отримано 1 деклараційний патент України на корисну модель,

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладено на 297 сторінках друкованого тексту. Робота має такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріал та методи дослідження, 3 розділи результатів дослідження, аналіз та узагальнення отриманих даних, висновки, перелік використаних першоджерел літератури, який містить 380 назв: 149 робіт вітчизняних авторів та 231 – іноземних. Дисертаційна робота ілюстрована 92 рисунками, 46 таблицями (обсяг 76 сторінок).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 246 щурах-самцях лінії Wіstar масою 180-200г, розведених у віварії Харківського державного медичного університету.

Піддослідних тварин утримували на звичайному харчовому раціоні з вільним доступом до води по 10-12 голів у стандартних металевих клітках. Для усунення впливу сезонних і добових коливань на досліджувані показники основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період у ранкові години. Дослідження здійснювалися відповідно до національних "Загальних етичних принципів досліджень на тваринах" (Україна, 2001), які узгоджені з положеннями "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 18.03.1986 р.). Умертвіння тварин здійснювали шляхом декапітації під ефірним наркозом. Як матеріал для досліджень було використано тканини вогнища запалення, кістковий мозок стегна, периферичну кров.

Моделями запалення були: гостре інфекційне запалення, відтворене внутрішньом’язовим уведенням 2 млрд. мікробних тіл Stарhуlососсus aureus, штам АТСС-25923, в 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (Чернух А.М., 1965); карагіненове асептичне запалення, викликане підшкірним уведенням 5 мг л-карагінену (Sіgma, США) в 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (Клименко Н.А., ); хронічне асептичне гранульоматозне запалення, відтворене підшкірним уведенням сефадексу А-25 у дозі 1 мг в 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію (Макарова О.В., Ковалева В.Л., Сладкопевцев А.С., 1996); хронічне імунне запалення на зразок ад`ювантного артриту, викликане введенням в субплантарний апоневроз повного ад`юванту Фрейнда в дозі 0,1 мл (Чернух А.М., 1979). Моделі запалення характеризували шляхом вивчення його основного показника – клітинно-тканинної динаміки вогнища.

Клітинно-тканинну динаміку вогнища запалення досліджували на парафінових зрізах товщиною 5-6 мкм за допомогою оглядового забарвлення гематоксиліном-еозином та за Ван Гізоном (виявлення колагенізації), ШИК + альціановим синім (диференціювання основних і кислих глікозаміногліканів), галоціаніном за Ейнарсоном (виявлення загальних нуклеїнових кислот) (Меркулов Г.А., 1961).

У докладній динаміці запалення, починаючи з 6-ї год до 28-ї доби, досліджували реакції системи крові: клітинний склад та експресію адгезивних молекул вогнища запалення, кістковомозкове кровотворення, клітинний склад та імуногістохімічні реакції кісткового мозку, лейкоцитарну реакцію та функціональну активність лейкоцитів периферичної крові, вміст у периферичній крові Г-КСФ і ГМ-КСФ.

Клітинний склад вогнища запалення визначали шляхом підрахунку кількості нейтрофілів, еозинофілів, лімфоцитів, моноцитів, макрофагів, тканинних базофілів, фібробластів, плазматичних та епітеліоїдних клітин за допомогою оглядового забарвлення гематоксиліном-еозином (Меркулов Г.А., 1961).

Експресію адгезивних молекул вогнища запалення досліджували імуногістохімічно непрямим методом Кунса за методикою Brosman (Brosman M., 1979) на ідентичних гістологічних препаратах. Використовували набори люмінесцентних моноклональних антитіл проти поверхневих антигенів клітин щурів виробництва фірми SEROTEC (Велика Британія). Визначали експресію CD54-антигенів лейкоцитів; CD44 – нейтрофільних гранулоцитів; CD11с – клітин мієлоїдного ряду; CD31 – моноцитів, гранулоцитів, В-лімфоцитів, ендотеліальних клітин; CD61 – макрофагів, тромбоцитів та їхніх попередників.

Кістковомозкове кровотворення вивчали шляхом підрахунку загальної кількості мієлокаріоцитів у кістковому мозку стегна та мієлограм за стандартними методами (Меньшиков В.В., 1987).

Клітинний склад кісткового мозку досліджували на гістологічних парафінових зрізах стегнової кістки товщиною 5-6 мкм за допомогою диференціювального забарвлення за Папенгеймом (Меркулов Г.А., 1961).

Імуногістохімічні реакції кісткового мозку досліджували використовуючи набори люмінесцентних моноклональних антитіл проти поверхневих антигенів клітин гематологічного ряду щурів виробництва фірми SEROTEC (Велика Британія). На гістологічних препаратах кісткового мозку визначали: експресію CD43-антигенів мієлоїдних клітин та Т-лімфоцитів; CD11с – клітин мієлоїдного ряду; CD11b – клітин нейтрофільного та моноцитарного ряду; CD3 – Т-лімфоцитів та їхніх попередників; CD4 – Т-лімфоцитів-хелперів; CD25 – активованих Т- і В-лімфоцитів; CD45RA – В-лімфоцитів різного ступеня зрілості; CD71 – клітин, які експресують рецептори до трансферину; CD61 – макрофагів, тромбоцитів та їхніх попередників.

При імуногістохімічних дослідженнях ідентифікацію клітин проводили в люмінесцентному мікроскопі Jenaval (Karl Zeiss, Йена, Німеччина) з використанням світлофільтра л = 480/520 нм; х400. Спочатку підрахунок проводили у світловому полі, потім мікроскоп переводили в режим флюоресценції та підраховували кількість клітин, які світяться, на підставі чого обчислювали відсотки їх вмісту за формулою:

Кількість клітин, які флюоресціюють в режимі відбитого світла

Загальна кількість клітин в режимі прохідного світла

Неспецифічне сяйво визначали за забарвленням відповідними ізоспецифічними контролями.

Лейкоцитарну реакцію периферичної крові визначали шляхом підрахунку загальної кількості лейкоцитів (ЗКЛ) у крові та лейкоцитарної формули за стандартними методами (Меньшиков В.В., 1987). Про функціональний стан лейкоцитів крові робили висновки за активністю їхніх маркерних ферментів. Маркерами функціональної активності нейтрофілів були мієлопероксидаза (МПО) / К.Ф. 11.1.7/ і кисла фосфатаза (КФ) / К.Ф. 3.1.3.2/, моноцитів-макрофагів - -нафтилацетат-естераза (-НАЕ), лімфоцитів - -НАЕ і КФ, які визначали цитохімічно за методами Грехема-Кнолля, Лефлера та Берстона (Меньшиков В.В., 1987).

Вміст Г-КСФ і ГМ-КСФ у периферичній крові визначали імуноферментним методом за допомогою відповідних тест-систем виробництва Рenіnsula (США) і ТОВ "Протеїновий контур" (Санкт-Петербург). Дослідження виконували на аналізаторі імуноферментному, фотоелектричному АІФ-Ц-01З, (заводський номер 604), виготовленому на ВО "Витязь".

Дослідження ефективності залучення гемомодуляторів до комплексу традиційної протизапальної терапії у хворих із хронічними запальними захворюваннями проведені на кафедрі факультетської педіатрії Харківського державного медичного університету з люб'язної згоди та під керівництвом керівника клініки, зав. кафедри, д.м.н., проф. Ю.В. Одинця та у нефрологічому відділенні міської дитячої клінічної лікарні № 16 м. Харкова (головний лікар – Т.В. Харченко), що є базою кафедри.

Під спостереженням перебували 19 дітей віком від 5 до 15 років, що страждають на хронічний вторинний рецидивуючий пієлонефрит із частими рецидивами, у період загострення, з рефрактерністю до проведеної терапії. З них 11 дітей складали групу контролю; за віком: 5-10 років – 5 хворих, 11-15 років – 6 хворих; за статтю: 1 хлопець і 10 дівчат. Діти контрольної групи одержували базову терапію. Основну групу складали 8 хворих, які відповідали контрольній за тяжкістю та тривалістю захворювання. Усі хворі основної групи були дівчатами віком: 5-10 років – 2 дітей, 11-15 років – 6 дітей. Вони одержували аналогічну базову терапію плюс рекомбінантний людський Г-КСФ нейпоген (філграстим) фірми "Roche" (Швейцарія) підшкірно з розрахунку 5мкг/кг маси тіла один раз на добу протягом 3-х днів.

Усім хворим проведено повне клінічне обстеження з аналізом даних анамнезу, об'єктивних і додаткових методів дослідження. Діагноз захворювання обґрунтовували відповідно до розробленого А.Ф. Возіановим та ін. (Возианов А.Ф., Майданик В.Г., Бидный В.Г., 2002) критеріями діагностики й формулювали відповідно до класифікації М.Я. Студенікіна зі співавторами (Студеникин М.Я., Наумова В.И., Мурванидзе Д.Д., 1982).

Для верифікації, постановки діагнозу захворювання, контролю динаміки запального процесу й ефективності терапії, вирішення поставлених завдань проводили дослідження периферичної крові, випорожнень на яйця глистів і сечі загальноприйнятими методами (Меньшиков В.В., 1987). Крім того, проводили оцінку сечового синдрому з використанням кількісного методу дослідження за А.З. Нечипоренко (Нечипоренко А.З., 1969); визначення активних лейкоцитів, клітинного складу (уролейкоцитограми) сечового осаду (Майданик В.Г., 1993); мікробіологічного дослідження сечі та мікрофлори, ступеня бактеріурії та чутливості виявленої мікробної флори до антибіотиків (Базарнова М.А., Воробьев А.И., Баркаган З.С., 1991). Визначали показники добової екскреції солей (оксалати, урати) із сечею за Г.А. Сивориновською (Сивориновская Г.А., 1969).

Усім хворим проведено інструментальні дослідження: ультразвукове дослідження нирок, рентгенологічні дослідження (екскреторна урографія, мікційна цистографія).

Функціональний стан нирок оцінювали за результатами проби за Зимницьким, показниками геморенальних проб: визначали рівень сечовини уніфікованим методом, креатиніну сироватки крові – методом Поппера, кліренси сечовини й ендогенного креатиніну, показники фільтрації та реабсорбції – за кліренсом ендогенного креатиніну, призведеному до стандартної поверхні тіла (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982).

Крім того, для вирішення поставлених завдань досліджували деякі показники неспецифічного та специфічного захисту організму, вивчаючи фагоцитоз (фагоцитарне число) (Шахбазян И.Е., Улыбина О.В., Белокриницкий Д.В. и др., 1987), киснезалежні [за допомогою тесту спонтанного поглинання та відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) за J. Stuart et al. (Меньшиков В.В., ) у модифікації Б.С. Нагоєва (Нагоев Б.С., ) та активності МПО] та кисненезалежні [за рівнем лізосомальних катіонних білків (ЛКБ)] механізми мікробіцидної активності поліморфнонуклеарних лейкоцитів крові. Обчислювали середньоцитохімічний коефіцієнт (СЦК) активності МПО в нейтрофілах за методом Грехема-Кнолля (Меньшиков В.В., ) і СЦК вмісту ЛКБ за методом М.Г. Шубича (Шубич М.Г., Нагоев Б.С., 1980; Белокриницкий Д.В. и др., 1987). Вміст основних класів імуноглобулінів (Ig) – А, М, G – у сироватці крові визначали методом радіальної імунодифузії за G. Mancіnі et al. (Mancini G., Carbonara A.O., Haremans J.M., 1965), циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) – за V. Haskova et al. (Haskova V., Kaslik J., Mate I., 1977). Визначення субпопуляцій лімфоцитів (CD3, CD4, CD8, CD19) проводили за допомогою моноклональних антитіл методом імунофлюоресценції з використанням наборів фірми "Сорбент" (Москва), обчислюючи імунорегуляторний індекс (ІРІ) CD4/CD8.

Дослідження проводили в динаміці – під час надходження до стаціонару (у гострий період захворювання) і на 10-й день від першого дня призначення нейпогену, а деякі показники – на 2-й, 3-й, 4-й, 10-й дні від призначення нейпогену й через один і три місяці.

Статистичне оброблення результатів дослідження проводили з використанням комп'ютерної програми Stadіa - 6.0 й t - критерію Стьюдента на ПЕОМ “Pentіum-3”, а також за допомогою пакетів прикладних програм для ПЕОМ “S-Plus 2000”, “Exсel” (Кулаичев А.П., 1999).

Результати дослідження та їх аналіз. Насамперед на підставі основної характеристики запалення – клітинно-тканинних реакцій вогнища – у докладній динаміці, починаючи з 6-ї год до 28-ї доби, були схарактеризовані вибрані моделі запалення.

Підшкірне стафілококове запалення в щурів відповідає типовим закономірностям гострого гнійного запалення. На 6-у год відзначається наявність гнійного ексудату. Прогресування гнійної інфекції відбувається у вигляді затіків перивазально та периневрально. Формування грануляційної тканини спостерігається на 3-ю добу. В останній термін спостереження (на 28-у добу) виявляється переважно загоєння з різним ступенем дозрівання грануляційної тканини, подекуди – ще й локуси гнійного запалення, оточені грануляційною, а на периферії – уже зрілою сполучною тканиною.

Особлива увага була приділена моделюванню вторинно хронічного запалення. Таке запалення є негативним виходом гострого, характерне для клініки, але адекватні моделі його відсутні. Принципово воно може бути відтворене викликанням гострого запалення в умовах експериментально зміненої загальної та імунологічної реактивності тварин. Разом з тим, останнє відбивається на “чистоті” моделі. Ми припустили, що таке запалення може бути викликане неіндиферентними чужорідними тілами, тобто такими, які мають достатню подразнювальну дію, щоб викликати виражене гостре запалення, і які водночас важко піддаються елімінації, тобто здатні до персистенції в тканинах. Багаторічний досвід роботи з флогогенами підказав, що такою речовиною може бути карагінен – високосульфатований глікозаміноглікан, виділений із ірландського морського моху Chondrus. На цей час карагінен найчастіше використовується в загальній патології для моделювання гострого запалення. В експериментальній фармакології це класичний агент для відтворення гострого ексудативного запалення з метою тестування лікарських засобів на протизапальну активність. Разом з тим, як речовина, яка є гранулярною, карагінен важко елімінується. В експериментальній гематології k-карагінен використовується для блокади макрофагів (Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992). У зв’язку з цим, була вивчена клітинно-тканинна динаміка вогнища карагіненового запалення на предмет можливості використання його як моделі вторинного хронічного запалення. Виявлено, що при підшкірному карагіненовому запаленні в перші години інфільтрат представлений в основному нейтрофілами, але через добу на периферії вогнища відзначаються проліферативні явища, мігрують макрофаги та лімфоцити. Звертає на себе увагу велика кількість тканинних базофілів і еозинофілів у прилеглих тканинах. Через дві доби реєструється формування грануляційної тканини. На 5-у – 7-у добу відзначається наявність сполучнотканинної капсули. При цьому кількість нейтрофілів в інфільтраті зменшується, макрофагів – збільшується. Надалі зростає макрофагально-лімфоцитарна інфільтрація. Таким чином, карагіненове запалення, розпочинаючись як гостре, згодом переходить у хронічне, тобто є таким, що хронізується (вторинно хронічним), запаленням.

Внутрішньом’язове введення гранул сефадексу обумовлює розвиток продуктивного (первинно хронічного) запалення з формуванням макрофагальних гранульом навколо кожної гранули, а саме: гранульом гігантських багатоядерних клітин чужорідних тіл. При цьому відбувається повільна утилізація сефадексу з неповним його лізисом, у перші дні – нейтрофілами, надалі – макрофагами. Протягом експерименту грануляційна тканина між гранулами сефадексу, що сформувалася вже через дві доби після ін'єкції, повільно дозріває, накопичуючи компоненти сполучної тканини та утворюючи загальну сполучнотканинну капсулу навколо вогнища.

При ад’ювантному артриті запалення характеризується макрофагально-лімфоцитарною інфільтрацією тканин суглоба, починаючи з 2-ї – 3-ї доби після субплантарного введення ад’юванту Фрейнда, формуванням грануляційної тканини в порожнині та тканинах суглоба з 3-ї – 5-ї доби, що відбиває розвиток хронічного запального процесу. Запалення досягає піку на 10-у добу, характеризується васкулітами та макрофагальними гранульомами. Надалі відбувається стихання запалення, утворення сполучнотканинних спайок у порожнині суглоба; макрофагально-лімфоцитарна інфільтрація виражена в зовнішніх шарах суглобової сумки. Рання лімфоцитарна інфільтрація вогнища свідчить про імунний характер запалення.

Далі були вивчені клітинні реакції всіх ланок системи крові при запаленні (вогнища, кісткового мозку, периферичної крові), вміст Г-КСФ і ГМ-КСФ у периферичній крові при зазначених запальних процесах з 6-ї год до 28-ї доби.

При гострому інфекційному запаленні у клітинному складі вогнища в перші дві доби переважають нейтрофіли з максимумом на 6-у год (81,3%); на 3-ю й 5-у добу – макрофаги (відповідно 37,3% й 32,2%), на 7-у – 14-у – фібробласти з піком на 7-у добу (46%), на 21-у й 28-у – плазматичні клітини (37,9% й 83,8%). Нейтрофільна реакція практично спостерігається протягом першого тижня, моноцитарно-макрофагальна – упродовж двох тижнів, фібробластична – протягом трьох тижнів. Запалення в основному завершується протягом 2-х тижнів, регенерація – у строк до 4-х тижнів.

При карагіненовому асептичному запаленні до 5-ї доби переважають нейтрофіли з максимумом на 3-ю добу (78,3%), на 7-у – 28-у добу – макрофаги з піком на 14-у (38,3%), фібробластична реакція спостерігається з 5-ї доби і досягає першого піка на 7-у добу (11,3%). Лімфоцитарна реакція характеризується першим максимумом на 5-у добу (18,7%). Відбувається повторна лімфоцитарна й макрофагальна інфільтрація, відповідно на 14-у – 21-у й 28-у добу, фібробластична реакція на 21-у – 28-у добу, що відбиває хронізацію запалення.

При хронічному гранульоматозному запаленні в перші п'ять діб у вогнищі переважають макрофаги, особливо на 6-у год (79,3%); на 7-у – 21-у добу – фібробласти, особливо на 14-у (50,2%), на 28-у добу – плазматичні клітини (90%). Відбувається інтенсивна плазматизація лімфоцитів, перетворення макрофагів на епітеліоїдні клітини. Нейтрофільна реакція спостерігається протягом 7-и діб і виражена слабко (пік – 28,3% на 1-у добу), моноцитарно-макрофагальна – протягом трьох тижнів, фібробластична – упродовж чотирьох тижнів. Кількість нейтрофілів, макрофагів, фібробластів і плазмоцитів змінюється фазно у зв'язку з персистенцією запалення.

При хронічному імунному запаленні на зразок ад’ювантного артриту нейтрофільна реакція у вогнищі відсутня, моноцитарно-макрофагальна реакція спостерігається з 2-ї доби до закінчення експерименту, лімфоцитарна – з 3-ї доби, фібробластична – з 7-ї доби. Кількість лімфоцитів, макрофагів, фібробластів, епітеліоїдних клітин змінюється фазно. З 6-ї год до 3-ї доби переважають епітеліоїдні клітини (76,8% на 3-ю добу), з 5-ї до 10-ї доби – макрофаги, особливо на 10-у добу (73%), на 14-у – 21-у – фібробласти, особливо на 14-у добу (54%). На 28-у добу знову переважають макрофаги, багато лімфоцитів, фібробластів та епітеліоїдних клітин. Відбувається плазматизація лімфоцитів (на 5-у добу), перетворення макрофагів на епітеліоїдні клітини, особливо на 14-у добу.

Порівняно з гострим, запалення, що хронізується, відрізняється більш тривалою нейтрофільною інфільтрацією (до 28-ї доби замість 14-ї) зі зрушенням піку з 6-ї год на 3-ю добу, відстроченням макрофагальної та фібробластичної реакцій, менш вираженою фібробластичною та більш вираженою лімфоцитарною реакціями, наявністю повторної лімфоцитарної, макрофагальної та фібробластичної реакцій.

ХЗ відрізняється від гострого менш вираженою та більш короткочасною нейтрофільною інфільтрацією зі зрушенням піку на 1-у добу замість 6-ї год, але більш вираженою ранньою макрофагальною інфільтрацією, наявністю повторної лімфоцитарної, макрофагальної та фібробластичної реакцій.

Первинно хронічне запалення відрізняється від вторинно хронічного менш вираженою та більш короткочасною нейтрофільною та лімфоцитарною інфільтрацією, але більш вираженою та ранньою макрофагальною і фібробластичною реакціями.

Становить інтерес також порівняння клітинного складу вогнищ хронічного імунного та неімунного (гранульоматозного) запалення. Як підкреслювалося, нейтрофільна реакція відсутня у вогнищі при хронічному імунному запаленні, у той час як при гранульоматозному спостерігається протягом перших 7-и діб з піками на 1-у й 5-у добу. Навпаки, лімфоцитарна реакція більш виражена в першому випадку. Судячи з того, що при імунному запаленні плазматизація незначна, а при неімунному – виражена, можна вважати, що імунне запалення характеризується переважно реакцією Т-лімфоцитів, а гранульоматозне – В-лімфоцитів. Моноцитарно-макрофагальна реакція більш рання при гранульоматозному запаленні, як і фібробластична, але й закінчується вона раніше, очевидно, через формування гранульоми. Таким чином, хронічне імунне запалення відрізняється від гранульоматозного більш пізнім і менш інтенсивним початком, більшою тривалістю, більшою виразністю лімфоцитарної реакції, а саме Т-клітинної. Це, на нашу думку, є зрозумілим через різницю в етіології та патогенезі цих видів запалення (Чернух А.М., 1979; Маянский Д.Н., 1991; Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992). Імунне запалення виникає та стає ітенсивнішим у міру сенсибілізації організму і, якщо воно ґрунтується на гіперчутливості уповільненого типу, як ад’ювантний артрит, то пов'язане з Т-лімфоцитами в ролі основних ефекторів реакції. Клінічно ад’ювантний артрит виражений приблизно на 10-у добу і посилюється до 20-ї – 30-ї доби, потім поступово стихає, при цьому деформація суглобів залишається (Чернух А.М., 1979). Гранульоматозне ж запалення, як пов'язане з надходженням флогогену ззовні, характеризується більш інтенсивним початком (за участю нейтрофілів), відповідними моноцитарно-макрофагальною і фібробластичною реакціями. Як свідчать отримані дані, сефадексна гранульома активна, в основному, протягом 3-х тижнів.

Одним з показників завершення запалення є кількість епітеліоїдних клітин. Як відомо, елімінуючи залишки лейкоцитів і зруйнованої тканини, макрофаги усувають одне з найважливіших джерел власної хемотаксичної стимуляції, що веде до стихання лейкоцитарної інфільтрації. У вогнищі макрофаги руйнуються або переносяться з течією лімфи в регіонарні лімфовузли, де гинуть. У міру очищення вогнища, кількість макрофагів там зменшується, головним чином, через зменшене надходження їх із крові. У міру зниження активності, через стихання запалення, макрофаги трансформуються в епітеліоїдні клітини. При гострому запаленні їхній вміст значний уже на 10-у – 21-у добу і знижується до 28-ї, у той час як при запаленні, що хронізується, помітний лише на 28-у добу. Як видно, епітеліоїдні клітини особливо характерні для гранульоматозного й взагалі для ХЗ, швидше за все, через ранню інтенсивну макрофагальну інфільтрацію.

Значна кількість плазматичних клітин також відбиває закінчення запалення й при інфекційному запаленні, очевидно, свідчить про формування інфекційного імунітету. Відомо, що після закінчення запалення В-лімфоцити частково гинуть, частково перетворюються на плазматичні клітини – продуценти антитіл, які потім поступово елімінуються (Чернух А.М., 1979; Маянский Д.Н., 1991; Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992). При інфекційному запаленні велику кількість плазмоцитів можна виявити вже на 14-у добу, вони переважають на 21-у і, особливо, на 28-у добу, у той час як при карагіненовому вони виявляються в невеликій кількості, очевидно, через те, що це запалення й асептичне, і є таким, що хронізується. У зв’язку з тим, що лімфоцитарна інфільтрація тут виражена сильніше, можна вважати, що хронізація гострого запалення пов’язана з Т-лімфоцитами. Велика рання кількість плазматичних клітин характерна для ХЗ, очевидно, у зв'язку зі значним залученням В  лімфоцитів до цього запалення. Хронічне імунне запалення, природно, характеризується Т-клітинною реакцією.

Продовження нейтрофільної інфільтрації при первинно хронічному запаленні, вірогідно, є компенсаторною реакцією на неможливість адекватної елімінації флогогену; відповідно збільшується термін до початку макрофагальної та фібробластичної реакцій; слабшає остання, оскільки вони зворотно взаємозалежні з терміном закінчення й інтенсивністю нейтрофільної інфільтрації (Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Серов В.В., Пауков В.С., 1995). Цим, мабуть, також пояснюється ослаблення й скорочення нейтрофільної інфільтрації на тлі більшої виразності макрофагальної при первинно хронічному запаленні. Рання інтенсивна макрофагальна інфільтрація в цьому випадку, очевидно, пов'язана з більшими розмірами часток флогогену і, відповідно, неможливістю їхньої елімінації нейтрофілами, тобто є також компенсаторною. Різниця в хімічних механізмах інфільтрації при цих видах запалення, вірогідно, обумовлена більш сильним подразненням тканини карагіненом і менше – сефадексом, різними наборами, кількістю та співвідношеннями первинних медіаторів. Очевидно, у першому випадку більше залучаються до процесу продукти тучних клітин, у другому – резидентних макрофагів. Тучні клітини більш реактивні та уразливі при подразненні тканини, ніж макрофаги та інші елементи сполучної тканини (Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Серов В.В., Пауков В.С., 1995).

Наявність повторних лімфоцитарної, макрофагальної та фібробластичної реакцій відбиває спроби до загоєння.

Лімфоцитарна інфільтрація не тільки більш виражена, але й передує макрофагальній і фібробластичній реакціям, що підтверджує припущення про регуляторну роль лімфоцитів у хронізації запалення, яке ґрунтується на здатності лімфоцитів стимулювати макрофаги та фібробласти (Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Серов В.В., Пауков В.С., 1995).

Зміна макрофагальної та фібробластичної реакцій показує, що до основних ефекторів ХЗ можна віднести не тільки макрофаги, але й фібробласти, і це узгоджується з уявленням про ХЗ як про повторні ушкодження й спроби до загоєння.

Показником хронізації запалення може бути також значна кількість епітеліоїдних і плазматичних клітин через посилене залучення макрофагів та В-лімфоцитів і, відповідно, епітеліоїдну трансформацію макрофагів та плазматизацію В-лімфоцитів.

При імуногістохімічному дослідженні вогнища гострого інфекційного запалення виявлено, що в перші три доби була виражена експресія CD54 й CD44 з максимумом на 6-у год (відповідно 89,5% й 78,2%). Експресія CD11c була виражена на 2-у (61,8%) і 3-ю добу (46%), CD31 підвищувалася фазно на 2-у (10,3%), 7-у (14,2%) і 14-у добу (9,11%), CD61 досягала максимуму на 7-у добу (75,4%).

При карагіненовому асептичному запаленні експресія CD54 й CD44 також була виражена з 6-ї год до 3-ї доби, але з максимумом на 2-у добу (відповідно 81,5% й 54,7%), CD11c зростала фазно з максимумами на 2-у (66,5%) - 3-ю (65,8%), 7-у (55,5%) і 14-у добу (21,2%), CD31 – була істотною на 3-ю (29,5%), 7-у (18,3%), 21-у (29,3%) і, особливо, 28-у добу (38,7%), CD61 - підвищеною з 5-ї (37,7%) до 28-ї доби (47,2%).

При хронічному гранульоматозному запаленні експресія CD54, CD44 й CD11c була вираженою з 6-ї год до 5-ї доби з максимумом на 2-у добу (відповідно 36,7%, 23,2%, 21,5%), CD31 до 3-ї доби з піком на 2-у добу (21,8%), а потім на 7-у – 14-у з максимумом на 14-у добу (15%), CD61 – з 6-ї год до 5-ї доби з піком на 6-у год (81,8%), а також на 21-у добу (26,7%).

При хронічному імунному запаленні експресія CD54 була вираженою з 2-ї (14,5%) до 7-ї доби (20,8%) і знову – на 28-у добу (15,5%), CD44 була відсутня у вогнищі. Експресія CD11c була підвищеною до 3-ї доби з піком на 1-у добу (73,2%) і була відсутня у вогнищі з 14-ї доби, CD31 – вираженою протягом усього часу експерименту, CD61 була істотною з 5-ї (66,8%) до 10-ї доби (59%) і знову підвищувалася на 21-у (40,3%) і 28-у добу (34%).

Експресія CD54 й CD44 при гострому інфекційному та карагіненовому асептичному запаленні була виражена протягом перших 3-х діб, але при гострому була більш значною та ранньою (6-а год проти 2-ї доби). При карагіненовому запаленні експресія CD11c була виражена не тільки в початкові терміни (2-а – 3-я доба), але й на 7-у й 14-у добу. Експресія CD31 й CD61 при карагіненовому запаленні була значною протягом усього досліду з істотним підвищенням на 21-у й 28-у добу, у той час як при гострому інфекційному запаленні вона була менш вираженою і з максимумом на 7-у добу.

Хронічне гранульоматозне запалення відрізняється від гострого більш пізнім виникненням піку (2-а доба замість 6-ї год), меншою виразністю й більшою тривалістю (до 5-ї доби проти 3-ї доби) експресії СD54, CD44 й CD11c. Експресія CD31 й CD61 була більш вираженою та ранньою, ніж при гострому запаленні.

При первинно хронічному запаленні, на відміну від вторинно хронічного, експресія CD54, CD44, CD11c й CD31 була менш вираженою та тривалою. Експресія CD61 була виражена більше в ранній термін і менше – у пізній.

При хронічному імунному запаленні, порівняно з неімунним, експресія CD54 була виражена менше, але більш тривало в ранній термін (до 7-ї доби замість 5-ї). При імунному запаленні експресія CD44 була відсутня, а при гранульоматозному збігалася з експресією CD54. Експресія CD11c була більш вираженою (пік на 1-у добу – 73,2% проти 2-ї доби – 21,5%). Більш вираженою, ранньою та тривалою була й експресія CD31. Експресія CD61, хоча й запізнювалася, у цілому була виражена інтенсивніше.

Динаміка експресії CD54 і CD44 збігається, що вказує на те, що зміни експресії CD54 в основному відбивають адгезивність нейтрофілів, але й, як вказує кількісна різниця, інших клітин. Експресія CD11с збігається з притоком до вогнища мієлоїдних клітин у зв’язку з активацією гемопоезу, CD31 – з моноцитарною та фібробластичною реакціями з утворенням грануляційної тканини та ангіогенезом, CD61 – з макрофагальною реакцією. Разом з тим, відсутність повної відповідності з динамікою кількості відповідних клітин свідчить також про зміни функціональної активності клітин.

Під час вивчення кістковомозкового кровотворення на моделі гострого інфекційного запалення показано, що перерозподільне зменшення кількості каріоцитів, головним чином, гранулоцитів, у кістковому мозку відбувається на 1-у добу, відновлення клітинності за рахунок активації гемопоезу – на 2-у добу. На 3-ю добу зафіксовано повторний вихід каріоцитів, особливо моноцитів, у кров; на 5-у добу – повторна, менш виражена активація кровотворення, переважно моноцитопоезу; на 7-у добу – повторний, менш інтенсивний порівняно з 3-ю добою, вихід каріоцитів у кров; на 10-у – 14-у добу – зниження інтенсивності кровотворення, особливо гранулоцитопоезу; на 21-у добу – помітне відновлення кровотворення.

Швидкий вихід клітин з кісткового мозку в кров при запаленні пов'язаний з їхнім вимиванням із кровотворної тканини, що забезпечується рефлекторним і гуморальним прискоренням кровотоку в кістковому мозку. Гуморальне прискорення кровотоку обумовлене дією медіаторів запалення, таких як простагландин Е, окис азоту, інтерлейкін-1, фактор некрозу пухлини (ФНП) (Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992).

Збільшення клітинної продукції забезпечується відповідними нервовими механізмами, гормонами, факторами росту, кровотворення. У регуляції проліферації та диференціювання стовбурових і комітованих кровотворних клітин особливе значення надають таким факторам кровотворення й медіаторам запалення, як цитокіни (Gupta P., Oegema T.R., Brasil J.J. et al, 1992; Vaday G.G., Lider O., 2000).

Відкрито цитокіни, що стимулюють проліферацію та впливають на функції більш зрілих клітин кровотворної системи, такі як еритропоетин, КСФ. Саме такі тканинні гормони визначають, коли і скільки клітин того чи іншого виду буде вироблено. Відкрито й фактори, активні, в першу чергу, у верхніх поверхах кровотворення, – фактори стовбурових клітин, FL-ліганд (фактор, виявлений в ембріональній печінці, необхідний не тільки для проліферації, але