НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Сомов Олександр Юрійович

УДК: 616-005.4: 615.832.9:

576.311.347:57.085.2.

ЕНЕРГЕТИЧНИЙ СТАН ПЕЧІНКИ ПРИ ГІПОТЕРМІЧНОМУ ЗБЕРІГАННІ ТА НОРМОТЕРМІЧНІЙ РЕПЕРФУЗІЇ

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії,

м.Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор.

Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії і біохімії,

м.Харків

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник.

Падалко Володимир Ілліч, Науково-дослідний інститут біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, заступник директора,

м.Харків

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ

України, кафедра біохімії,

м.Харків

Захист відбудеться “_27__” грудня_2005 р. о 13.30_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий “24” листопада__2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Ортотопічна трансплантація часто стає єдиним методом лікування при цілому ряді гострих і хронічних захворювань печінки. Для збереження функціональної цілісності органа при його консервації суттєвого значення набуває розчин гіпотермічного зберігання (ГЗ) [Delmas-Beauvieux M.C. et al., 1993; Kim J.S. et al., 1999]. З огляду на важливість енергетичного обміну печінки як одного з показників життєздатності органа, існує об’єктивна необхідність у дослідженнях впливу консервуючих розчинів на продукцію енергії у клітині.

Актуальність теми. Наразі застосування гіпотермії у трансплантології є методом вибору, який дозволяє успішно зберігати серце, печінку, нирки й інші органи [Belzer F.O. et al., 1990]. Звичайне ГЗ органів у розчинах, які містять непроникаючі осмотичні компоненти, стало одним із досягнень, що дозволило суттєво збільшити кількість проведених трансплантацій. Американські дослідники запропонували розчин Університету Вісконсин (UW), який за останні два десятиріччя став найбільш розповсюдженим консервуючим середовищем, що замінило мінімальні сольові розчини [Michel A. et al., 1990]. Застосування розчину UW для ГЗ печінки дозволило подовжити термін її безпечної консервації в експерименті до 24–48 год і досягти найбільшої виживаності реципієнтів [Jamieson N.V. et al., 1988]. Але ж дослідження клінічної трансплантології засвідчують, що тривалість безпечного зберігання печінки не перевищує 10–12 год [Padbury R.T. et al., 1994], що явно недостатньо для її транспортування на значні відстані.

На цей час накопичено численний матеріал щодо дослідження метаболічного стану печінки за умов ішемії/реперфузії, проте цих даних недостатньо для розуміння механізмів розвитку функціональних порушень органа. Однією з очевидних причин, які призводять до втрати життєздатності печінки після гіпоксії, є порушення енергетичного обміну. Не викликає сумнівів, що найбільш чутливою ланкою енергетичного метаболізму до дії ішемії та низьких температур є мітохондрії [Nishida T. et al., 1987; Sammut I. et al., 1998]. Окрім того, останнім часом прийнято розглядати мітохондрії не лише як головне джерело АТФ, але й як безпосереднього ініціатора програмованої клітинної загибелі. Низка досліджень вказує на тісну кореляцію між ураженням енергетичної функції печінки та реалізацією апоптотичних і некротичних сигналів під час ішемії [Kowaltowski A.J. et al., 1999; Ockner R.K., 2001; Teoh N.C. et al., 2003; Rudiger H.A. et al., 2003;]. Протягом гіпоксії та зниження температури можуть формуватися латентні пошкодження мітохондрій [Petrenko A.Yu., 1992], що мають тенденцію до посилення під час повернення до фізіологічних умов. Відомо, що так звані реперфузійні ушкодження органів, що викликаються комплексом реакцій за участю ендотеліальних клітин судинного русла, макрофагів та низки прозапальних факторів [Jaeschke H., 1998; Lichtman S.N. et al., 1999; Teoh N.C. et al., 2003], неминуче супроводжуються порушеннями функції мітохондрій, що є однією з причин утрати життєздатності органа [Rosser B.G. et al., 1995; Shaked A. et al., 1997; Bilzer M. et al., 2000]. У зв’язку з цим уявляється перспективним більш детальне вивчення енергетичного стану печінки та функціональної цілісності мітохондрій за умов ГЗ печінки.

Дослідження, що виконувалися в ІПКіК НАНУ, свідчать про те, що ізольовані гепатоцити зберігають свої метаболічні характеристики протягом довготривалого ГЗ у сахарозо-вміщуючому розчині (СВР) та подальшої нормотермічної інкубації в мінімальному сольовому середовищі [Кравченко Л. П. та ін., 2001]. Оцінка життєздатності за функціональними тестами свідчить, що СВР не поступається UW, забезпечує високий вміст АТФ у клітинах та найменший вихід амінотрансфераз до перфузату. Було показано [Шанина И. В., 2000], що при ГЗ гепатоцитів та цілої печінки у розчинах, що попереджують розвиток набряку за рахунок непроникаючих компонентів (сахароза, лактобіонат), первинним є порушення енергозабезпечення клітин. Проте механізми пригнічення енергетичної функції залишаються недостатньо вивченими. Одержані результати щодо ГЗ ізольованих гепатоцитів у СВР, а також невисока вартість його інгредієнтів служать обґрунтуванням перспективності застосування цього середовища для консервації цілої печінки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у відділі кріобіохімії в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 87 “Вивчення механізму біологічної дії кріоконсервованих препаратів ембріональної печінки на метаболізм гепатоцитів в умовах функціональної недостатності печінки”, № ДР 0202U000833; № 7 “Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їхньої кріочутливості й механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів”, № ДР 0102U002026. Роботу виконано за підтримки гранту “Welcome Trust” № 069472 (Велика Британія).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – порівняльна оцінка енергетичного стану печінки після гіпотермічного зберігання у розчині UW або СВР та подальшої нормотермічної реперфузії (НР).

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Визначити вміст АТФ у печінці на різних етапах ГЗ та НР.

2. Вивчити дихальні параметри мітохондрій після ГЗ та НР печінки.

3. Дослідити вплив ГЗ та НР печінки на вміст калію в мітохондріях.

4. Оцінити стійкість ключових ферментів дихального ланцюга мітохондрій після ГЗ та НР органа.

5. Дослідити вплив альбуміну на функціональні параметри мітохондрій після ГЗ та НР печінки.

Об’єкт дослідження – гіпотермічне зберігання печінки щурів у консервуючих розчинах різного складу.

Предмет дослідження – енергетичний стан печінки щурів і функціональна активність мітохондрій після ГЗ у розчинах різного складу та НР.

Методи дослідження. У роботі використано методи: полярографії – для виміряння показників дихання мітохондрій; спектрофотометрії – для визначення рівня АТФ у гомогенатах печінки і активності Н+-АТФази мітохондрій; атомно-абсорбційної спектрофотометрії – для визначення вмісту калію в мітохондріях.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі методів порівняльного аналізу енергетичного стану печінки щурів уперше були показані особливості змінювання процесів дихання та окислювального фосфорилювання мітохондрій після довготривалого ГЗ печінки у розчинах різного складу та подальшої НР. Встановлено, що при ГЗ печінки у СВР підвищується дихальна активність мітохондрій, яка зберігається протягом 24 год консервації. Показано, що розвиток ушкоджень системи окислювального фосфорилювання мітохондрій після ГЗ печінки у двох середовищах має загальні закономірності. Альбумін, що входить до складу СВР, сприяє збереженню високих функціональних параметрів мітохондрій та ефективно попереджує роз’єднання дихання та окислювального фосфорилювання при ГЗ і НР. В ході моделювання фізіологічних умов при реперфузії органа вперше було продемонстровано високі показники збереження та швидкості відновлення енергетичного обміну печінки після консервації у СВР.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати сприяють з’ясуванню механізмів пошкодження енергетичного обміну та окислювального фосфорилювання за умов холодової гіпоксії та подальшої реперфузії органа. Представлені в роботі дані можна використовувати для вдосконалення існуючих методів ГЗ печінки, що базуються на застосуванні розчинів, які містять осмотично активні компоненти. Одержані результати дозволяють рекомендувати СВР для розробки методу ГЗ печінки людини.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно здійснено аналіз даних літератури, отримано результати експериментальних досліджень, проведено їхню статистичну обробку. Автором особисто проведено первинний аналіз даних і сформульовано попередні висновки. Разом із науковим керівником автором визначено мету, задачі роботи та засоби їх вирішення, інтерпретовано отримані результати та зроблено остаточні висновки. В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1,2,3,4,5] у полярографічному визначенні швидкості поглинання кисню ізольованими мітохондріями печінки після ГЗ;

- у роботах [5,6] у вивченні стійкості ферментів дихального ланцюга ізольованих мітохондрій після ГЗ та НР.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на конференції молодих учених Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, 2002), Міжнародній конференції по кріобіології “Cryobiomol” (м. Коїмбра, Португалія, 2003), на конференціях молодих учених ІПКіК НАН України (м. Харків, 2002, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 4 статті, з яких 3 у наукових фахових виданнях, та 2 тези доповідей.

Структура дисертації. Дисертацію викладено на 110 сторінках. Вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів, заключення і висновків. Роботу проілюстровано 9 таблицями і 11 рисунками. Список літератури містить 305 джерел та розміщений на 32 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Для виконання роботи було використано 80 білих безпорідних ситих щурів масою 250–300 г. Експерименти проводили згідно з правилами „Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших дослідних цілях” (м. Страсбург, 1985 р.). Оперативні втручання виконували під наркозом, використовуючи діетиловий ефір. Об’єктом досліджень служили ціла печінка та ізольовані мітохондрії.

Після гіпотермічної перфузії печінки консервуючим розчином in situ, її вилучали та переносили до пластикових бюксів із відповідним розчином зберігання при 4 oС. ГЗ печінки проводили у холодильнику при 4 oС протягом 1 або 24 год.

Як контроль використовували печінку, котру було ізольовано без насичування консервуючим розчином і проведення ГЗ.

У роботі використовували такі консервуючі середовища:

1. СВР – ізотонічний розчин сахарози, збалансований сольовими компонентами з додаванням 1% бичачого сироваткового альбуміну (БСА) [Кравченко Л.П., 1993].

2. Розчин UW, спрощений [Mitchell S. et al., 1996].

Після зберігання печінку реперфузували мінімальним бікарбонатним розчином Кребс-Рингера при температурі 37 оС протягом 60 хв у закритій перфузійній системі. Перед початком реперфузії на додаткову долю накладали лігатуру та відрізали фрагмент печінки для визначення вмісту АТФ у гомогенаті тканини.

Мітохондрії печінки виділяли після різних термінів ГЗ і НР за допомогою диференціального центрифугування [Мосолова И.М., 1975].

Вміст АТФ визначали спектрофотометрично за методом H. Adams (1963), використовуючи експрес-набір Sigma” (США).

Оцінка дихальних параметрів виконувалася за допомогою закритого платинового електрода Кларка у комірці об’ємом 1 мл при 26 ?С на полярографі “Rank Brother” model 20 (Велика Британія), що з’єднувався з персональним комп’ютером.

Активність сукцинатоксидази (КФ 1.3.99.3) досліджували полярографічно у присутності відновленого цитохрому с при 26 С після одноразового швидкого заморожування мітохондрій у рідкому азоті та швидкого відігріву на водяній бані при 38 ?С [Петренко А.Ю., 1986].

Визначення внутрішньомітохондріального вмісту калію провадили на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115 (“Семі”, Україна) із сумішшю пропан-повітря, довжина хвилі 766,5 нм.

Активність мітохондріальної Н+-АТФази (КФ 3.6.3.14) досліджували спектрофотометрично (“Cary 50”, Австралія) за швидкістю зниження екстинції НАДН при 340 нм, при 30 ?С [Soper J.W., 1978], після одноразового швидкого заморожування мітохондрій у рідкому азоті та швидкого відігріву на водяній бані.

Концентрацію білка визначали біуретовим методом [Gornall A.G. et al., 1949] за допомогою експрес-набору “Sigma” (США).

Одержані результати обробляли на персональному комп’ютері з використанням програми Origin 6.1. Достовірність змін оцінювали за допомогою параметричного t-критерію Ст’юдента-Фішера (р < 0,05).

Результати власних досліджень та їх обговорення

Вплив ГЗ і НР на вміст АТФ у печінці. У дослідженнях щодо енергетичного стану печінки при ГЗ було показано, що високий вміст АТФ у клітинах корелює з відновленням функції органа після трансплантації [Lanir A. et al., 1988]. Цей показник є також досить інформативним при оцінюванні ефективності консервуючого розчину. У низці робіт було встановлено, що перевагою розчинів, які базуються на непроникаючих осмотично активних компонентах (UW, Бретшнайдера), перед мінімальними сольовими середовищами при консервації цілої печінки є забезпечення найшвидшого відновлення синтезу АТФ [Reckendorfer H. et al., 1992; Smrekova R. et al., 2000]. У зв’язку з цим у роботі здійснювався порівняльний аналіз вмісту АТФ у тканині печінки після ГЗ у СВР, UW та подальшої НР.

Концентрація АТФ у печінці після 1 год ГЗ достовірно не відрізнялася у двох середовищах і складала близько 3,5 мкмоль/г тканини (рис. 1). Подальша НР печінки призводила до зниження вмісту АТФ на 20% незалежно від складу консервуючого розчину.

Рис. 1. Вміст АТФ у печінці після ГЗ () та подальшої НР ().

# – достовірно відносно 1 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05.

Після 24 год ГЗ печінки рівень АТФ складав близько 50% від значень після 1 год незалежно від типу середовища. Подальша НР не впливала на цей показник. Отримані результати свідчать про те, що застосування СВР для ГЗ дозволяє зберегти вміст АТФ в органі на рівні розчину UW.

Вплив ГЗ печінки на вміст іонів калію у мітохондріях. Можна припустити, що збереження вмісту АТФ у печінці після консервації в UW обумовлюється високою концентрацією калію у цьому розчині, що призводить до його накопичення у клітинах та мінімізації енергетичних витрат на підтримку концентраційного градієнта катіона. Мітохондріальний транспорт іонів К+, з одного боку, має потужний вплив на реакції окислювального фосфорилювання, а з іншого – може істотно змінювати концентрацію катіона в цитозолі, модулюючи потенціал спокою та інші функції клітин [Кудзина Л.Ю. та ін., 1978]. У зв’язку з цим уявлялося за доцільне вивчити вплив ГЗ печінки у СВР і UW та подальшої НР на вміст калію в мітохондріях.

Встановлено, що після 1 год ГЗ печінки в UW концентрація калію була більш ніж на 40% вищою у порівнянні з контрольними та СВР-значеннями і залишалася високою після НР (рис. 2), що, вірогідно, пов’язано з перерозподілом іонів K+ у мітохондріях за концентраційним градієнтом.

Рис. 2. Вміст іонів калію в мітохондріях після ГЗ() і НР () печінки.

Примітки:

* – достовірно відносно контролю; р < 0,05;

# – достовірно відносно ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05.

Подовження терміну ГЗ до 24 год у СВР спричиняло зниження вмісту K+ на 50%. У мітохондріях, які було ізольовано з печінки після ГЗ у UW, цей показник не змінювався і був вищий, аніж у СВР-групі. Однак подальша НР приводила до зменшення концентрації катіона до рівня значень, отриманих після ГЗ у СВР.

Одержані результати демонструють більш низький порівняно з UW вміст калію в мітохондріях після 24 год ГЗ печінки у СВР, а також відсутність чіткої кореляції з рівнем АТФ після відповідного терміну консервації. Таким чином, можна припустити, що підтримання енергозабезпечення печінки при ГЗ в UW обумовлюється не тільки збереженням вмісту калію в мітохондріях.

Зміна функціональних параметрів ізольованих мітохондрій за умов ГЗ печінки та НР. Відомо, що найбільш ранньою ознакою впливу гіпоксії й охолодження органа на систему окислювального фосфорилювання є зміна протонної провідності внутрішньої мембрани мітохондрій у стані 4 (V4), яка викликає зменшення енергетичного сполучення [Nishida T. et al., 1987; Sammut I. et al., 1998]. У зв’язку з цим вивчалися дихальні параметри мітохондрій при ГЗ печінки у консервуючих розчинах, які містять непроникні осмотично активні компоненти.

Мітохондрії контрольної групи характеризувалися низькою швидкістю дихання в енергетичному стані V4 за Чансом, на субстратах малат + глутамат і сукцинат (табл. 1). Добавка АДФ (стан V3) багаторазово збільшувала швидкість поглинення кисню, що свідчить про високу сполученість окислювального фосфорилювання. Після вичерпання АДФ та переходу дихання у стан V4 роз’єднувач (стан V3р) збільшував швидкість поглинання кисню до 17 нмолей O2/мг білка/хв. Дихальний контроль (ДК) свіжоізольованих мітохондрій при окислюванні малат + глутамат становив 8, на сукцинаті – 3,7 (табл. 2).

Таблиця 1

Швидкість дихання мітохондрій (нмоль O2/мг білка/хв) після ГЗ печінки та НР

(М ± m, n = 7–14)

Групи |

Параметри

Малат + глутамат | Сукцинат

V4 | V3 | V4 | V3

Контроль | 1,6 0,2 | 11,0 1,3 | 3,8 0,5 | 13,7 1,6

СВР

1 год ГЗ | 5,4 0,4 | 23,2 1,6 | 8,7 1,1 | 27,0 3,4

+ НР | 4,6 0,8 | 16,5 0,9# | 7,7 1,25 | 17,7 1,5#

24 год ГЗ | 6,5 0,9 | 16,6 1,6# | 10,0 1,7 | 18,6 2,7#

+НР | 5,6 0,6 | 10,0 0,6‡* | 7,3 0,6 | 11,5 0,6‡

Розчин UW

1 год ГЗ | 3,4 0,4 | 16,6 1,5 | 5,1 0,6 | 13,8 1,5*

+ НР | 3,8 0,4 | 15,0 2,5 | 5,0 0,5 | 13,5 1,3*

24 год ГЗ | 6,0 1,3# | 14,0 1,6 | 5,8 0,7 | 13,0 1,1*

+ НР | 6,5 1,6 | 10,3 1,8‡ | 6,3 0,1 | 9,0 0,5‡

Примітки:

Усі значення, крім позначених * достовірно відрізняються від контролю;

р < 0,05;

# – достовірно відносно 1 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05;

‡ – достовірно відносно 24 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05.

Після 1 год ГЗ печінки відбувалося зниження ДК на субстратах малат + глутамат на 47% і 41% для СВР та середовища UW відповідно. При окислюванні сукцинату зниження ДК спостерігалось у розчині UW (табл. 2). Збільшення термінів ГЗ до 24 год призводило до зниження ДК у СВР на 47% і 44%, а в UW –– на 43% і 21% порівняно з 1 год ГЗ у випадку окислення малат + глутамат або сукцинату відповідно. Наступна НР викликала практично повне роз’єднання дихання та фосфорилювання (табл. 2).

Таблиця 2

Дихальний контроль мітохондрій після ГЗ печінки та НР

(М ± m, n = 7–14)

Групи |

Параметри

ДК малат + глутамат | ДК

сукцинат

Контроль | 8,1 1,0 | 3,7 0,2

СВР

1 год ГЗ | 4,3 0,2 | 3,2 0,2*

+ НР | 3,6 0,3# | 2,6 0,3#

24 год ГЗ | 2,7 0,2# | 1,8 0,1#

+НР | 2,0 0,2‡ | 1,5 0,1‡

Розчин UW

1 год ГЗ | 4,8 0,4 | 2,8 0,1

+ НР | 4,0 0,4 | 2,7 0,1

24 год ГЗ | 2,7 0,5# | 2,2 0,3#

+ НР | 1,8 0,1‡ | 1,5 0,2‡

Примітки:

Усі значення, крім позначених * достовірно відрізняються від контролю;

р < 0,05;

# – достовірно відносно 1 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05;

‡ – достовірно відносно 24 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05.

Викликає увагу той факт, що зниження ДК, яке спостерігалося після 1 год ГЗ печінки в обох середовищах, супроводжувалося підвищенням швидкості дихання у станах V4 і V3. Зростання швидкості дихання V4 вказує на збільшення пасивної проникності внутрішньої мембрани мітохондрій для іонів водню [Kacser H. et al., 1973], яка не змінювалася при наступній НР печінки та подовжені терміну ГЗ до 24 год (табл. 1). У той же час дихання у стані V3, при окисленні НАДН-залежних субстратів, достовірно збільшувалося після 1 год ГЗ печінки в СВР і розчині UW на 110% і 50% відповідно. Швидкість дихання у стані V3р при окисленні малат + глутамат також підвищувалася на 95% незалежно від розчину зберігання. Визначною особливістю 1 год ГЗ печінки в СВР було підсилення сукцинат-залежного дихання у станах V4 і V3 на 120% і 95%, відповідно, як порівняно з UW. НР печінки після 1 год ГЗ органа в СВР знижувала швидкість дихання у стані V3 на 35%, тоді як у UW змін не спостерігалося. Збільшення швидкості дихання у стані V3, що відбувалося після ГЗ у СВР, може пояснюватися підвищенням активності переносників дихального ланцюга і АТФ-синтази [Krasinskaya I.P. et al., 1984; Hafner R.P. et al., 1990].

Після 24 год ГЗ в СВР відбувалося подальше зниження швидкості V3. При ГЗ у розчині UW головною особливістю було підвищення швидкості у стані V4, тоді як швидкість V3 не змінювалась і була аналогічною з 1 год ГЗ (табл. 1). Той факт, що швидкість дихання у стані V3 після 1 та 24 год ГЗ печінки у розчині UW була значно нижчою за швидкість дихання у присутності роз’єднувача, свідчить про інгібування АТФ-синтази або про зниження контролю фосфорилювання з боку таких систем, як аденілаткіназа, транслоказа аденінових нуклеотидів, фосфатний переносник [Groen A. K. et al., 1982].

Спираючись на результати полярографічних досліджень, можна зробити висновок, що ГЗ печінки значно впливає на основні енергетичні параметри мітохондрій. Це, в першу чергу, знаходить свій прояв у підвищенні протонної проникності внутрішньої мембрани незалежно від використаного розчину та терміну зберігання. Іншою особливістю є збільшення швидкості дихання V3 при окисленні малат + глутамат після 1 год ГЗ в обох середовищах, що можна пов’язати зі зміною активності АТФ-синтази мітохондрій.

Активність Н+-АТФази мітохондрій при ГЗ та НР. У роботах щодо вивчення функціонального стану мітохондрій при консервації органів було встановлено, що найбільш чутливим до ГЗ і НР компонентом системи окислювального фосфорилювання є АТФ-синтаза [Nishida T. et al., 1987; Sammut I.et al., 1998].

Результати, які представлені на рис. 3, свідчать про стійкість Н+-АТФази до ГЗ протягом 1 год та наступної НР. Збільшення термінів ГЗ до 24 год викликало статистично значуще інгібування каталітичної активності у СВР і UW до 65% і 70%, відповідно, відносно 1 год ГЗ. При цьому спостерігалося підвищення олігоміцин-нечутливої активності на 16% у СВР та на 25% – у UW. Слід зазначити, що реперфузія печінки після 24 год ГЗ у СВР призводила до підвищення каталітичної активності, що може свідчити про здатність Н+-АТФази частково відновлювати свою функцію після холодової ішемії.

Наразі ще не вивчено молекулярний механізм стійкості АТФ-синтази при ГЗ органів. Інактивація ферменту при гіпотермії може спричинятися модифікацією некаталітичного нуклеотид-зв’язуючого сайта (субодиниці 1,2,3), що пояснює підвищення швидкості інгібування субкомплексу F1. Таким чином, при зниженні температури необхідна трансформація тільки однієї субодиниці, тоді як для аналогічного гальмування при 30 oС потрібно змінення трьох сайтів зв’язування [Jault J.M. et al., 1994].

Рис. 3. Активність H+-АТФази мітохондрій після 1 та 24 год ГЗ у СВР (1, 2) і UW (3, 4) до (1, 3) і після (2, 4) НР.

Примітки:

* – достовірно відносно контролю; р < 0,05;

# – достовірно відносно 1 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05.

Щодо питання впливу консервуючих розчинів на активність АТФ-синтази відомо, що її пошкодження при тривалому зберіганні печінки у розчині UW відбувається в результаті дії протеаз і зв’язування інгібіторного білка с каталітичною субодиницею F1 [Tsunekawa S. et al., 1991].

Активність сукцинатоксидази мітохондрій після ГЗ і НР. Той факт, що активність H+-АТФази змінювалася тільки після 24 год ГЗ, дозволяє припустити, що збільшення швидкості дихання у стані V3 могло зумовлюватися активацією ферментів, які беруть участь у перенесенні електронів до дихального ланцюга. Для з’ясування цього питання досліджувалася дихальна активність при додаванні роз’єднувача та сукцинату до мітохондрій, ізольованих з печінки після ГЗ і НР. Отримані значення порівнювалися з активністю сукцинатоксидази, яка визначалася за швидкістю дихання мітохондрій у присутності відновленого цитохрому с. Проникність зовнішньої мембрани для цитохрому с досягалася швидким заморожуванням – швидким відігріванням суспензії мітохондрій [Petrenko A.Yu., 1986]. Встановлено, що швидкість дихання у стані V3р після 1 год ГЗ у СВР зростала більш ніж на 120% відносно контролю (рис. 4А) і не змінювалася після 24 год ГЗ. В UW вказаний параметр не змінювався (рис. 4В). НР після 1 год ГЗ печінки в обох розчинах не змінювала швидкість дихання у стані V3р, але значно інгібувала її після 24 год ГЗ (рис. 4В).

Рис. 4. Швидкість дихання мітохондрій у стані V3р (А, В) і активність сукцинатоксидази (Б, Г) після 1 і 24 год ГЗ печінки в СВР (1, 2) і UW (3, 4) до (1, 3) та після (2, 4) НР.

Примітки:

* – достовірно відносно контролю; р < 0,05;

# – достовірно відносно активності сукцинатоксидази у відповідному середовищі; р < 0,05;

‡ – достовірно відносно 24 год ГЗ у відповідному середовищі; р < 0,05.

Активність сукцинатоксидази, що вимірювалася у присутності екзогенного цитохрому с, не змінювалась на всіх етапах ГЗ і НР в обох середовищах (рис. 4Б, Г) і становила в середньому 26 та 30 нмоль O2/мг білка/хв у СВР і UW, відповідно, що свідчить про стійкість ферментів комплексів II-III до ГЗ. Результати, які було отримано після ГЗ печінки у СВР свідчать, що швидкість дихання у стані V3р на 46% перевищувала швидкість поглинання О2 у сукцинатоксидазній реакції, але це підвищення було короткочасне і зникало при наступній НР та подовженні строків консервування. На відміну від СВР, у групі UW активність сукцинатоксидази більш, ніж вдвічі, перевищувала значення параметра V3р. протягом 24 год ГЗ (рис. 4А, В).

Наведені результати дозволяють припустити, що підвищення швидкості дихання у присутності сукцинату та роз’єднувача після 1 год ГЗ у СВР (табл. 1) обумовлюється накопиченням при ішемії ендогенних субстратів, зокрема сукцинату та відновленого НАД [Кондрашова М.Н., 1981].

Вплив альбуміну на функціональні параметри мітохондрій при ГЗ і НР. Дослідження з вивчення енергетичного стану печінки при консервації показали [Kim J.S. et al., 1990], що одним із чинників, які викликають роз’єднання дихання й окислювального фосфорилювання, є накопичення вільних жирних кислот (ВЖК). Припускалося, що більш висока швидкість дихання у станах V3 і V3р при окисленні сукцинату мітохондріями, виділеними з печінки після ГЗ у СВР порівняно з UW зумовлюється присутністю БСА у консервуючому розчині. Для з’ясування впливу БСА на процеси дихання й окислювального фосфорилювання проводилася серія експериментів, у яких до середовища інкубації мітохондрій додавали 1% БСА V фракції для зв’язування ВЖК [Matsuoka H. et al., 1979].

Було встановлено, що після 1 год ГЗ печінки БСА інгібував дихання у стані V4 при окисленні малат + глутамат на 50% і 40% у СВР і UW відповідно. Швидкість дихання у стані V3 також знижувалася, проте залишалася статистично вищою за контрольні значення. ДК у присутності БСА підвищувався на 48% і 38% для СВР і UW, відповідно (рис. 5).

Після 24 год зберігання БСА також пригнічував швидкість поглинення кисню у стані V4 у присутності малат + глутамат, тим самим підвищуючи ДК на 40%. Найбільш виражена дія БСА виявлялася після 24 год ГЗ і НР: сполучення дихання й окислювального фосфорилювання збільшувалося на 70% у СВР і на 120% – в UW. Цей факт свідчить про значний внесок ВЖК у зниження ефективності окислювального фосфорилювання мітохондрій. Втрата АТФ-синтезуючої функції мітохондрій після 24 год ГЗ печінки та НР, вірогідно, пов’язана не тільки зі збільшенням пасивної проникності внутрішньої мембрани (про що свідчить параметр V4), але також із пригніченням активності АТФ-синтазного комплексу. Цим пояснюється той факт, що додавання БСА до середовища ГЗ відновлювало ДК лише частково.

На відміну від дихальної активності при окисленні малат + глутамат параметри сукцинат-залежного дихання у присутності БСА мали ряд додаткових ознак. Зокрема, окислення сукцинату у стані V4 відбувалося з високою швидкістю як після консервації у СВР, так і в UW. Привертає увагу той факт, що при зміні швидкості поглинання кисню після 1 год ГЗ у СВР БСА практично не впливав на V3 (рис. 5А). Більш того, додавання альбуміну до мітохондрій, ізольованих з печінки після ГЗ у UW (рис. 5А), призводило до підвищення швидкості V3 на 50%.

Рис. 5. Вплив БСА на швидкість дихання мітохондрій у стані V3 при окисленні сукцинату після 1 та 24 год ГЗ печінки у СВР (1, 2) і UW (3, 4) до (1, 3) і після НР (2, 4). – за відсутності БСА; – за присутності 1% БСА у середовищі інкубації.

Примітки:

* – достовірно відносно вимірів за відсутності альбуміну; р < 0,05;

# – достовірно відносно контролю + БСА; р < 0,05;

‡ – достовірно відносно СВР + БСА; р < 0,05.

Наведені результати свідчать, що однією з причин роз’єднання дихання і фосфорилювання після ГЗ і НР печінки є накопичення ВЖК, які мають протонофороподібну дію. Крім того, слід відзначити різну дію БСА на швидкість дихання у стані V3 при окисленні НАДН-залежних субстратів і сукцинату. Так, після 1 год ГЗ печінки у UW додавання БСА збільшувало швидкість V3 при окисленні сукцинату. Зазначений ефект не спостерігався після ГЗ у СВР. У той же час при використанні НАДН-залежних субстратів за тих же експериментальних умов швидкості V3 і V4 після ГЗ зменшувалися. Описані відмінності дихальних параметрів у залежності від субстратів окислення, можливо, пояснюються не тільки зв’язуванням ВЖК альбуміном, але й виникненням змін стехіометрії H+/e– у пунктах сполучення [Pietrobon D. et al., 1983]. На користь цього свідчить також і збереження високої швидкості дихання V4 у присутності БСА після ГЗ у СВР.

Таким чином, порівняльне вивчення енергетичного стану печінки при гіпотермічному зберіганні у СВР і UW показало, що характер дії ГЗ на функціональні параметри мітохондрій є однонаправленим і свідчить про те, що підтриманню енергетичного обміну сприяє підвищення швидкості окислення субстратів, ступінь вираженості якої залежить від композиційного складу середовища.

ВИСНОВКИ

Однією з головних причин, що викликають загибель клітин за умов холодового зберігання органа є ішемічне пошкодження мітохондрій. У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, спрямованої на з’ясування характеру порушень енергетичного метаболізму, що виникають при гіпотермічному зберіганні печінки у консервуючих середовищах на основі осмотично активних компонентів і наступній нормотермічній реперфузії органа.

1. ГЗ ізольованої печінки у досліджуваних середовищах протягом 24 год і наступна НР призводять до зниження рівня АТФ, що супроводжується пригніченням активності H+-АТФази та підвищенням її олігоміцин-нечутливої компоненти. При ГЗ печінки у СВР каталітична активність H+-АТФази може частково відновлюватися в ході реперфузії.

2. Вміст іонів калію в мітохондріях після 24 год ГЗ печінки у розчині UW вищий, аніж при використанні СВР. Наступна реперфузія нівелює виявлену різницю.

3. ГЗ печінки у СВР призводить до більш вираженого збільшення швидкості окислення субстратів, особливо сукцинату, мітохондріями порівняно з розчином UW. Виявлене підвищення не обумовлюється зміненням активності ферментів дихального ланцюга, котрі беруть участь в окисленні сукцинату.

4. Підвищення дихальної активності мітохондрій після ГЗ печінки у СВР пов’язано з присутністю альбуміну, оскільки може моделюватися в системі in vitro на мітохондріях печінки, що зберігалася в розчині UW.

5. Енергетичний стан печінки після ГЗ у СВР і розчині UW змінюється подібним чином, що свідчить про перспективність використання СВР у трансплантології.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Kravchenko L.P., Petrenko A.Yu., Somov A.Yu., Grischenko V.I., Fuller B.J. Respiratory activity of isolated rat hepatocytes following cold storage and subsequent rewarming: a comparison of sucrose-based and University of Wisconsin solutions // Cryobiology. – 2001. – Т. 42, № 3. – С. 218–221.

2. Кравченко Л.П., Петренко А.Ю., Сомов А.Ю., Фуллер Б.Дж. Дыхательная активность изолированных гепатоцитов при длительном холодовом хранении и последующей нормотермической инкубации // Пробл. криобиол. – 2001. – № 1. – С. 1–19.

3. Сомов А.Ю. Чувствительность системы окислительного фосфорилирования к гипотермическому хранению печени // Пробл. криобиол. – 2002. – № 1. – С. 129–131.

4. Петренко О.Ю., Черкашина Д.В., Сомов О.Ю., Семенченко О.А., Ткачова О.М., Фуллер Б.Дж. Експериментальне обґрунтування застосування консервуючих розчинів при трансплантації печінки // Трансплантологія. – 2004. – Т. 7, № 3. – С. 167–169.

5. Петренко А.Ю., Сомов А.Ю., Кравченко Л.П., Фуллер Б.Дж. Изменение дыхательной активности и окислительного фосфорилирования митохондрий после гипотермического хранения и последующей нормотермической реперфузии печени / Матер. VIII Укр. біохім. з’їзду, м. Чернівці, 2002 р. // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4а (додаток 1). – С. 170–171.

6. Somov A.Yu., Semenchenko O.A.,. Petrenko A.Yu and Fuller B.J. The liver energetic state after cold storage in UW and sucrose-based solution // Abstracts of International Conf. on Cryobiology “Cryobiomol”. – Coimbra (Portugal), 2003. – P. 73.

АНОТАЦІЇ

Сомов О. Ю. Енергетичний стан печінки при гіпотермічному зберіганні та нормотермічній реперфузії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2005.

Дисертаційна робота присвячена вивченню енергетичного стану печінки щурів при гіпотермічному зберіганні (ГЗ) у сахарозо-вміщуючому розчині (СВР) або середовищі Університету Вісконсин (UW) і нормотермічній реперфузії (НР). Показано, що використання СВР дає можливість зберегти вміст АТФ у печінці при її тривалому ГЗ і наступній НР на рівні загальноприйнятого консервуючого середовища UW. Встановлено, що зберігання печінки у UW протягом 1 год, викликає підвищення вмісту в мітохондріях іонів калію, яке зберігається після подовження терміну ГЗ до 24 год. При використанні СВР як середовища для зберігання змінення вмісту іонів K+ відбувається тільки після 24 год ГЗ. Наступна НР нівелює виявлену різницю за рахунок втрати катіона мітохондріями печінки, що зберігалася у UW. Показано, що після 24 год ГЗ печінки в обох розчинах, що порівнювалися, однією з причин зниження швидкості дихання мітохондрій при фосфорилюванні АДФ є пригнічення активності АТФ-синтази та підвищення олігоміцин-нечутливої компоненти. Альбумін, що входить до складу СМР, забезпечує захисний ефект і частково запобігає роз’єднанню дихання й окислювального фосфорилювання, що спостерігається на етапі 24-годинного ГЗ.

Ключові слова: гіпотермічне зберігання печінки, нормотермічна реперфузія, ізольовані мітохондрії, окислювальне фосфорилювання, енергетичний обмін.

Сомов А. Ю. Энергетическое состояние печени при гипотермическом хранении и нормотермической реперфузии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2005.

Диссертационная работа посвящена изучению энергетического состояния печени крыс при гипотермическом хранении (ГХ) в сахарозо-содержащем растворе (ССР), среде Университета Висконсин (UW) и нормотермической реперфузии (НР). Показано, что применение ССР позволяет сохранить содержание АТФ в печени при ее длительном ГХ и последующей НР на уровне общепринятой консервирующей среды UW.

Установлено, что хранение печени в UW в течение 1 ч вызывает повышение содержания в митохондриях ионов калия, которое сохраняется при увеличения сроков ГХ до 24 ч. При использовании ССР в качестве среды хранения изменение содержания ионов K+ происходит только после 24 ч ГХ. Последующая НР нивелирует выявленную разницу за счет потери катиона митохондриями печени, хранившейся в UW.

Показано, что после 24 ч ГХ печени в обоих сравниваемых растворах одной из причин снижения скорости дыхания митохондрий при фосфорилировании АДФ является угнетение активности АТФ-синтазы и повышение доли её олигомицин-нечувствительной компоненты.

Консервация печени на протяжении 1 ч в ССР и UW оказывает различное действие на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий. В отличие от UW хранение в ССР вызывает более выраженное повышение скорости окисления субстратов в присутствии разобщителя, что особенно проявляется при окислении сукцината. Увеличение скорости окисления сукцината не связано с изменением активности ферментов дыхательной цепи.

Альбумин, входящий в состав ССР, оказывает защитный эффект и частично предотвращает разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования, наблюдаемое на этапе 24-часового ГХ. Показано, что инкубация с альбумином митохондрий, изолированных из печени после различных сроков ГХ, приводит к снижению пассивной протонной проницаемости митохондрий, уровень которой зависит от субстрата окисления. Альбумин ингибирует скорость дыхания в состоянии V4 в обеих экспериментальных группах при окислении малат + глутамат и не влияет на скорость сукцинат-зависимого дыхания. Активация скорости дыхания в состоянии V3 при окислении сукцината, отмеченная после ГХ в ССР, также связана с присутствием альбумина в консервирующем растворе и может быть воспроизведена при