КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

САВЧЕНКО ВІКТОРІЯ СТАНІСЛАВІВНА

УДК 616.155.3-008.13-097

ФУНКЦІОНАЛЬНА АКТИВНІСТЬ ІМУНОКОМПЕТЕНТНИХ

КЛІТИН ЗДОРОВИХ ТА ХВОРИХ НА ХРОНІЧНИЙ СЕЧОСТАТЕВИЙ

ХЛАМІДІОЗ В УМОВАХ ІМУНОТРОПНОГО ВПЛИВУ IN VITRO

03.00.09 – імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті урології АМН України, Міжвідомчому республіканському науково-дослідному центрі клінічної імунології.

Науковий керівник: доктор медичних наук Дріянська Вікторія Євгенівна, Інститут нефрології АМН України, заступник директора з наукової роботи, завідувачка лабораторією імунології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Бичкова Ніна Григорівна, Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, головний науковий співробітник відділу експериментальної та клінічної імунології НДЛЦ;

доктор медичних наук, професор Мельников Олег Феодосійович, завідувач лабораторії патофізіології та імунології Інституту оториноларингології ім. проф. О.С.Коломійченка АМН України

Провідна установа: Луганський державний медичний університет

Захист дисертації відбудеться “__27_” вересня 2005 року о _14__ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д: 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, (01033, м.Київ, проспект Академіка Глушкова, 2/12, Біологічний факультет, ауд.434).

Поштова адреса: 01033, м.Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м.Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий “__22__” червня 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В.Молчанець

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми: В останні два десятиріччя завдяки великим успіхам фундаментальної імунології була доведена провідна роль імунної системи в підтримці гомеостазу організму, у протиінфекційному та протипухлинному захисті, в розвитку запальних, алергічних, аутоімунних, імунодефіцитних захворювань [Драннік Г.М., 1999; Мавров Г.И., Бондаренко Г.М., 2004; Насонов Е.А., 2001]. Прогрес імунології як фундаментальної медико-біологічної науки відзначився явним підвищенням знань про роль імунної системи в життєзабезпеченні організму. Була встановлена тісна взаємодія імунної системи з центральною нервовою та ендокринною системами, системами травлення, кровотворної, дихальної та ін. [Пинегин Б.В., Юдина Т.И., Каронова М.И., 1998; Макаренкова В.П., 2002]. Лікування, а в ряді випадків і профілактика багатьох захворювань можуть стати більш ефективними за допомогою імунотропних препаратів.

На сьогодні в Україні склалась дуже загрозлива ситуація за своїми соціально-економічними та екологічними особливостями, яка, в першу чергу, впливає на стан імунітету і, як наслідок, призводить до погіршення стану здоров’я всього населення України. При цьому, з’явилося багато повідомлень про імуностимулюючий ефект нових синтетичних препаратів, засобів народної медицини, деяких харчових продуктів [Дранник Г.Н., 1996; Сепиашвили Р.И., 2001]. Тому ще більш актуальною являється проблема використання препаратів, які мають імунотропну дію.

Більшість імуномодуляторів мають добре вивчені механізми дії з переважним впливом на ту чи іншу ланку імунної системи, хоча, в залежності від різних умов, препарат може проявляти вплив і на інші її компоненти. Все це вказує на необхідність попередньої оцінки параметрів імунної системи в кожному конкретному випадку з подальшим призначенням відповідного препарату.

В останні роки проведена велика кількість досліджень по використанню імуномодуляторів для корекції імунологічних показників у хворих [Кадагидзе З.Г., 2002; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А., 1992]. В широкому спектрі таких засобів значний інтерес викликають препарати рослинного походження – наявність в них різних біологічно активних складових дозволяє діяти на багато ланок патологічного процесу. Однак, механізм впливу на різні ланки імунної системи часто потребує глибокого дослідження.

Серед імунотропних засобів привертає увагу новий препарат Манакс, який являється ліофілізованим екстрактом Uncaria tomentosa - гигантської ліани, відомої як “котячий кіготь”. Екстракт використовувався на протязі віків в народній медицині Південної Америки та в 1994 році рішенням ВОЗ був признаний лікарською рослиною (реєстраційне свідоцтво для застосування № З-1992 від 25.11.96). В цьому препараті представлені всі діючі компоненти рослини: тетра- та пентациклічні оксиіндолові алкалоїди; глікозиди хінної кислоти та тритерпенові сапоніни; поліфеноли, процианіди, флавоноїди та таніни, а також багато інших сполук, яких вже було відкрито більше семидесяти [Базыка Д.А., Клименко В.И., Цуприков В.А., 1999; Дранник Г.Н., Фролов В.М., 2003; Wagner H., Kreutzkamp B., Jurcic K., 1985].

В літературі є дані про виражені протизапальні та імуномодулюючі властивості Манаксу при різних патологіях [Базыка Д.А., Цуприков В.А., Штода Г.В., 2002; Борисов А.В., Костев Ф.И., Ухаль М.И., 1999]. Вивчені механізми дії свідчать про здатність препарату достовірно підсилювати метаболічну активність нейтрофілів, підвищувати фагоцитарну активність клітин.

Відомо, що дія імуномодуляторів визначається особливостями імунної системи, а саме, взаємозв’язаним та взаємозалежним функціонуванням клітинних елементів, що приймають участь в розвитку імунної відповіді. Це визначає реакцію багатьох форм імуноцитів на імуномодулятор, навіть діючий на якусь одну популяцію чи субпопуляцію клітин [Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов Р.М., 2002]. В звязку з цим, для клінічного використання важливо визначити ланку імунітету для адресного впливу імунотропних препаратів, тому що інакше їх використання буде неефективним, а може й недоцільним.

Дослідження імунології останніх років сприяли розвиткові напрямку, що присвячений проблемам імуномодуляції, який базується на успіхах вивчення механізмів функціонування імунної системи та регуляції імунних реакцій. Особливо це стосується вивчення функціональної активності імунокомпетентних клітин шляхом аналізу продукції цитокінів, які відіграють роль медіаторів, що забезпечують кооперативну міжклітинну взаємодію.

Інтерес до імуностимулюючої терапії зростає в останні роки в звязку з проблемами інфекційної патології та онкології. Тривалість інфекційного процесу підвищується, а терапія суттєво ускладнюється при пошкодженні імунної системи та механізмів неспецифічного захисту. Все це можна віднести до такої патології як хронічний хламідіоз, неефективність лікування якого в більшому числі випадків робить актуальною проблему використання імуностимулюючої терапії [Базарный В.В., Левчик Н.К., Белах О.А., 2001; Барабанов Л.Г., Козадавенко В.Б., Грибкова Н.В., 1999; Башмакова М.А., Бочкарев Е.Г., Говорун В.М., 2000].

Таким чином, проблема пошуку нових сучасних імунотропних препаратів є дуже актуальною для клінічної медицини. З другого боку, вивчення цитокінів, їх рецепторів та інгібіторів, механізмів фізіологічної регуляції та фармакологічної дії, участі в різних процесах контролювання імунної та кроветворної систем, патофізіології хвороб стало широким та перспективним напрямком знань [Гарвазиева В.Б., Димиева Г.М., Оспельникова Т.П., 1998; Дранник Г.М., 1999; Кадагидзе З.Г., 2002; Киселева И.В., 2002; Маркелова Е.В., 2003]. В зв’язку з вищесказаним, визначення механізмів впливу нового препарату Манакс на цитокінову ланку імунітету в нормі та особливостей дії на клітини пацієнтів з хронічним хламідіозом, однією з ланок імунопатогенезу якого можна вважати девіацію функціональної активності Т-хелперів, є сучасним, доцільним та обґрунтованим.

Зв’язок роботи з науковими планами і програмами – робота виконана в Інституті урології АМН України в рамках тем за планами: Міністерства науки (Державний комітет по науці і технології) "Розробка нових технологій імунодіагностики та імунотерапії хворих з урогенітальним хламідіозом з урахуванням імунних механізмів розвитку захворювання та нових методів імунокорекції" (напрямок 02.11-03997); МОЗ і АМН України “Вдосконалити існуючі методи етіотропної імунодіагностики і імунокорекції хворих з урогенітальними інфекціями, що передаються статевим шляхом, з урахуванням механізмів розвитку захворювань (№ державної реєстрації 0199U000609); “Вивчити генеративну функцію у чоловіків при хламідійній урогенітальній інфекції з метою покращення ефективності діагностики, лікування, профілактики неплідності (№ державної реєстрації 0101U000517).

Мета дослідження: Визначити in vitro механізми впливу Манаксу на функціональну активність імунокомпетентних клітин здорових осіб і напрямки його імунотропної дії у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз для обґрунтування доцільності і можливостей його використання.

Основні завдання дослідження:

Вивчити вплив різних доз Манаксу на функціональну активність моноцитарно-макрофагальної ланки за секрецією інтерлейкіну-1бета (ІЛ-1в) та фактору некрозу пухлин альфа (ФНП-б) у здорових донорів.

Вивчити вплив різних доз препарату Манакс на фагоцитарну активність нейтрофілів (фагоцитарний показник та число).

Оцінити зміни клітинного метаболізму за даними продукції NO та НСТ-тесту під впливом препарату Манакс.

Вивчити вплив різних доз Манаксу на функціональний стан Т-хелперів 1 типу (Т-х 1) здорових осіб за продукцією ними гама-інтерферону (-ІФ) .

Вивчити вплив різних доз Манаксу на функціональну активність клітин здорових донорів за секрецією протизапальних цитокінів ІЛ-4 та ІЛ-10.

Провести дослідження in vitro ефектів Манаксу у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз (ХССХ) за результатами впливу на оксид азоту (NO) та цитокін-продукуючу активність клітин та визначити можливості використання препарату у пацієнтів.

Об’єкт досліджень – імунокомпетентні клітини здорових донорів та хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз.

Предмет досліджень – механізми впливу препарату Манакс на функціональну активність клітин імунної системи за продукцією оксиду азоту та цитокінів (ІЛ-1в, -4, -10, г-ІФ, ФНП-б) у здорових та пацієнтів з ХССХ.

Методи досліджень – лабораторні, мікробіологічні, імунологічні, в т.ч. імуноферментні.

Наукова новизна одержаних результатів:

Вперше визначені імуностимулюючі механізми впливу Манаксу на фагоцитарну активність (фагоцитарний показник та число), клітинний метаболізм (НСТ-тест), продукцію активних форм азоту (NO) в системі in vitro у здорових донорів. Виявлено, що препарат підвищує функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагальної ланки здорових осіб по продукції ІЛ-1 в і ФНП-. Для цих показників продемонстрована залежність ефектів від дози Манаксу – оптимальними (20 мкг/мл) можна вважати ті, що відповідають терапевтичним дозам in vivo.

Манакс по-різному впливає на продукцію протизапальних цитокінів, підвищуючи активність ІЛ-4 та достовірно знижуючи ІЛ-10, що може бути пов’язано з тим, що ця секреція обумовлена різними клітинами (відповідно. Т-хелперами 2 і 3).

Отримані ефекти препарату зберігали свою спрямованість в умовах in vitro для імунокомпетентних клітин хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз, що дозволило вперше продемонструвати механізми дії препарату Манакс при цій патології. Позитивним фактом можна вважати те, що крім стимуляції моноцитарно-макрофагальної ланки, яке характерно для клітин здорових, зареєстровано достовірне підвищення зниженої у пацієнтів продукції -IF, тоді як у здорових не виявлено такого ефекту.

Проведені дослідження дозволяють визначити механізми дії нового препарату Манакс для хворих з ХССХ, головним напрямком якого є стимуляція імунної системи за рахунок підвищення цитокін-продукуючої здатності моноцитів-макрофагів (ІЛ-1 та ФНП-альфа), Т-хелперів 1 по продукції -IФ, а Т-лімфоцитів хелперів 2 - ІЛ-4. Зниження секреторної активності імунорегуляторних клітин по продукції ІЛ-10 може бути результатом як зростання активності Т-хелперів 1, так і впливом Манаксу на Т-хелпери 3 здорових осіб.

Практичне значення роботи: Визначено вплив різних концентрацій Манаксу (5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл) на функціональну активність імунокомпетентних клітин; показано, що найбільший ефект відмічений при використанні 20 мкг/мл, що відповідає добовій дозі, яка застосовується in vivo.

Встановлено виражений позитивний вплив препарату Манакс на показники неспецифічної резистентності організму – активність клітин моноцитарно-макрофагальної системи за даними фагоцитозу, продукції оксиду азоту, цитокінів (ФНП-б, ІЛ-1в).

Важливим практичним значенням є виявлення впливу Манаксу на підвищення секреції ІЛ-4, особливо при збереженні продукції гама-ІФ при використанні терапевтичної дози; тому препарат може використовуватись у здорових як фактор підвищення резистентності організму до інфекції. Але необхідно обгрунтовано підходити до застосування цього лікарського засобу, тому що стимулювання секреції ІЛ-4, який сприяє синтезу імуноглобулінів Е, може бути небезпечним для хворих з атопією.

Продемонстровані нами особливості імунопатогенезу ХССХ, що характеризується девіацією функціональної активності Т-хелперів 1 і 2,3 типів зі зниженням продукції цитокінів першими і підвищенням – другими, після визначення в експериментах in vitro можливостей корекції Манаксом Т-хелперної ланки імунітету (підвищення продукції -ІФ та зниження – ІЛ-10) свідчать про доцільність використання препарату у таких хворих.

Отримані дані дозволяють вважати доцільним використання препарату Манакс для підвищення, у разі зниження, функціональної активності моноцитарно-макрофагальної та Т-клітинної ланки імунітету. Визначення нами в експериментах in vitro можливостей корекції Манаксом Т-хелперної ланки імунітету у таких хворих дозволять клініцистам розробити алгоритм використання цього препарату у разі відповідних порушень імунітету при різних патологіях.

Особистий внесок здобувача: Матеріали, представлені в роботі, є особистим внеском автора у вирішення проблеми впливу імуномодуляторів на імунну систему. Ідеї дисертаційної роботи запропоновані зав. лаб. імунології Інституту урології АМН України доктором медичних наук, професором Дранніком Г.М. та реалізовані за допомогою наукового керівника доктора медичних наук Дріянської В.Є. Дисертантом самостійно проведений патентно-інформаційній пошук та аналіз літературних даних. Самостійно проводилась робота з матеріалами дослідження та лабораторне тестування продукції цитокінів під впливом різних доз препарату Манакс. Самостійно виконані всі етапи роботи з культурами клітин. Самостійно проведений статистичний аналіз та разом з керівником надано оцінку отриманим результатам, написана дисертаційна робота.

Апробація результатів роботи: головні результати роботи доповідались та обговорювались на: III Національному Конгресі патофізіологів України. - Одеса, вересень 2000 р.; II Міждисциплінарній науково-практичній конференції “Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика та лікування хламідіозу”. - Київ, 23-25 квітня 2001 р.; VI Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації. – Київ, 29-31 травня 2002 р; V Міждисциплінарній науково-практичній конференції "Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій". – Київ, 27-28 листопада 2003 р.; "Імунотропні препарати в клінічній практиці". - Київ, 17-18 травня 2004 р.

На міжнародних симпозіумах і конгресах: 3 Intern. Conference “Health effects of the Chernobyl Accident: Results of 15-year follow-up studies”. – Kyiv, Ukraine, June 4-8, 2001; “Цитокины. Воспаление. Иммунитет” - Санкт-Петербург, Россия, 23-26 июня 2002 г.; II World Congr. of Immunopathol. & Respiratory Allergy. - Moscow, Russia, June 2004.

Публікації: За матеріалами дисертації надруковано 14 наукових праць, серед них 10 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК, тез доповідей - 4.

Структура та обсяг дисертації: Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, обговорення, висновків, списку літератури.

Дисертація викладена на 160 сторінках машинописного тексту.

До списку літератури входить 293 джерела літератури, з них 167 вітчизняних і 126 іноземних. Дисертація ілюстрована 8 таблицями та 17 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для визначення впливу Манаксу на клітини здорових осіб досліджено показники фагоцитарного числа, фагоцитарного показника та НСТ-тесту – спонтанні та індуковані Манаксом (10 та 20 мкг/мл) у 17 донорів (75 зразків).

У 15 здорових донорів визначено 60 зразків супернатантів спонтанного та індукованого мітогеном і Манаксом (20 та 50 мкг/мл) рівня оксиду азоту NO.

Функціональна активність клітин по продукції ІЛ-1в, ФНП-б, г-ІФ, ІЛ-4, ІЛ-10 під впливом мітогенів і Манаксу в різних дозах визначалась у 15 здорових, проаналізовано 300 зразків.

Таким чином, отримано 435 зразків супернатантів, що характеризують вплив Манаксу на функціональну активність імунокомпетентних клітин здорових донорів.

Мікробіологічні дослідження для діагностики хламідійної інфекції були проведені в лабораторії мікробіології, вірусології та мікології Інституту урології АМН України (зав. лабораторією д.м.н., професор А.В.Руденко).

Досліджувались зразки різного патологічного матеріалу - зішкряби із слизової уретри, цервікального каналу, піхви, а також секрет передміхурової залози, еякулят і сеча пацієнтів, які звернулися з приводу запальних захворювань сечостатевої системи.

Для характеристики рівня NO і цитокінової ланки імунітету у хворих на ХССХ отримані наступні дані. Так, дослідження NO проводили у 42 пацієнтів до та після впливу Манаксу і отримали 126 зразків.

Для визначення впливу Манаксу на особливості продукції цитокінів аналізували середній рівень секреції ФНП-б, ІЛ-4, ІЛ-10, спонтанної та мітоген-індукованої, у 30 здорових і у 20 хворих до та після дії Манаксу в умовах in vitro – 300 зразків.

Спонтанна та індукована ФГА продукція лімфоцитами г-ІФ вивчена у 72 хворих на ХССХ, після впливу Манаксу досліджувалася інтерферон-секретуюча здатність клітин у 15 пацієнтів з хламідіозом, отримано 159 зразків супернатантів.

Таким чином, при дослідженні супернатантів, що характеризують активність цитокінів у хворих на хронічний хламідіоз, отримано 459 зразків.

Всього в роботі визначено и проаналізовано 1020 зразків супернатантів, які характеризують функціональну активність клітин імунної системи (лімфоцитарно-моноцитарної ланки та Т-хелперів 1 і 2 типів) до та після впливу препарату Манакс в різних дозах.

Імуноферментний метод дослідження

а) Одержання супернатантів. Виділені на стандартному градієнті фікол -верографіну (1,076-1,078) мононуклеарні клітини периферійної крові відмивали тричі в середовищі 199 і ресуспензували в культуральному середовищі RPMI-1640, що містило 10% ембріональної телячої сироватки, 40 мкг/мл гентаміцину, 5х10 М 2-меркаптоетанолу та 3% L-глютаміну. Клітинну суспензію в концентрації 1,5х106 кл/мл інкубували 24 години в СО2-інкубаторі при t=37С без стимулюючого агента та використовували різні розведення препарату Манакс – 5мкг/мл, 10мкг/мл, 20мкг/мл, 50мкг/мл, 100мкг/мл. Розведення 20мкг/мл відповідало добовій дозі препарату в перерахунку на кількість клітин лімфоцитарно-моноцитарного ряду в 1 мл культурального середовища (на 1,5х106 кл/мл). По закінченні строку інкубації клітини осаджували центрифугуванням при 1600 об/хв протягом 10 хвилин, збирали супернатанти і зберігали до тестування при t= -20 С.

Вміст цитокінів у супернатантах визначали за допомогою імуноферментного методу. Для визначення вмісту цитокіну використовували тест систему “DIACLON” (Франція), “IMMUNOTECH” (Франція) та “Протеїновий контур” (Санкт-Петербург, Росія). Тестування проводилось за допомогою імуноферментного методу на приладі Stat Fax 303 Plus.

b) Визначення вмісту цитокінів у супернатантах. До 96-лункових планшет додавали: по 100 мкл стандартів в відповідні лунки для побудови калібровочної кривої. В інші лунки вносили по 100 мкл супернатанту, що досліджувався. В усі лунки додавали по 50 мкл відповідних антицитокінових антитіл. Планшети інкубували при кімнатній температурі протягом 2 годин, потім лунки 5 разів ретельно промивали буфером і видаляли залишки рідини.

Далі в кожну лунку вносили по 100 мкл кон’югату (стрептовідін-пероксидазу), включаючи “нульову” пробу. Після цього проби інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Повторювали промивку планшети 5 разів та вносили до всіх лунок по 100 мкл TMB-субстрату (хромогену) агента, що утворює кольори. Після інкубації протягом 12-15 хвилин зупиняли ферментативно-субстратну реакцію, додаючи в кожну лунку по 100 мкл H2SO4. Далі проводили визначення оптичної щільності стандартів та зразків супернатантів при довжині хвилі 450 нанометрів.

Для вірогідної оцінки результатів калібрована стандартна крива при побудові повинна бути лінійною і вказувати на прямо пропорційний характер між рівнем концентрації цитокіну в супернатанті та оптичною щільністю. Дані аналізу проб щодо рівня синтезу цитокінів визначали шляхом їх інтерполяції з отриманою кривою.

Межі нормальних значень вказаних імунологічних параметрів були отримані на основі результатів дослідження умовно здорових 25 осіб відповідно до групи обстежених на ХССХ.

Супернатанти, отримані вищевказанною методикою, використовувалися для тестування продукції цитокінів.

Математична обробка одержаних результатів проводилася за стандартними методиками варіаційної статистики з урахуванням розбіжностей за t критерієм Ст’юдента, яку оцінювали за допомогою показника довірчої ймовірності (р), меншого за 0,05 (Ласкін Г.Ф., 1980) за допомогою програм Statistica 5,0 for Windows.

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення.

На початку досліджень була поставлена мета вивчити вплив різних доз препарату Манакс на клітини лімфоцитарно-моноцитарного ряду для уявлення про дію препарату на функціональну активність клітин в умовах in vitro.

Одним із важливих показників неспецифічного імунітету являються рівні фагоцитарного показника (ФП) та числа (ФЧ), тесту з нітросинім тетразолієм – НСТ-тест.

Додавання препарату Манакс в двох дозах (10 мкг/мл та 20 мкг/мл) до зразків, які тестуються, практично в кожному випадку викликало підвищення як ФП, ФЧ так і НСТ-тесту (табл. 1).

Таблиця 1

Динаміка показників ФП,ФЧ та НСТ-тесту під впливом різних доз Манаксу (Мm)

Показник |

Контроль

(n=17) | Доза Манаксу

10 мкг/мл | 20 мкг/мл

ФП | 48,25,8 | 65,04,0 | 67,45,2

ФЧ | 9,80,3 | 10,60,3 | 13,20,5

НСТ-тест | 19,90,4 | 23,90,6 | 25,00,9

Примітка: - різниця достовірна в порівнянні з спонтанною продукцією (p<0,05);

n - кількість обстежених

Вивчення впливу Манаксу in vitro на функціональну активність клітин 15 здорових донорів по продукції інтерлейкіну-1 (ІЛ-1) і фактору некрозу пухлин- (ФНП-) показало, що вже доза препарату 20 мкг/мл викликає достовірне підвищення секреції ІЛ-1. Під впливом Манаксу в більш високій концентрації (50мкг/мл) рівень продукції даного цитокіну також зростає. Препарат у цих же дозах вірогідно стимулював і продукцію ФНП- (табл. 2). Але подальше підвищення дози препарату до 100 мкг/мл викликає різке зменшення продукції ФНП- в порівнянні з попередньою дозою, однак секреція цього цитокіну все ж достовірно вище, ніж в контролі без впливу препарату.

Таблиця 2

Показники продукції ІЛ-1 та ФНП- (пкг/мл) клітинами моноцитарно-макрофагального ряду

здорових донорів під впливом різних доз Манаксу в умовах in vitro (Mm)

Показник | Спонтанна продукція

(n=15) | Дози препарату

20 мкг/мл | 50 мкг/мл | 100 мкг/мл

ІЛ-1 | 35,31,5 | 46,62,5 | 65,41,0 | -

ФНП- | 16,51,3 | 116,214,9 | 448,837,2 | 73,15,3

Примітка: - різниця достовірна в порівнянні з спонтанною продукцією для ІЛ-1 (p<0,05), для ФНП- (р<0,001); n - кількість обстежених

Продемонстрований вплив препарату Манакс на підвищення продукції таких важливих цитокінів як ІЛ-1 і ФНП-б викликає особливий інтерес. Відомо, що ІЛ-1 являється одним із ключових регуляторів імунітету і запальних реакцій з широким спектром біологічних ефектів. Так, ІЛ-1 впливає на проліферацію Т- і В-лімфоцитів, антитілогенез, індукцію синтезу цитокінів і адгезивних факторів плазміногенного активатору, стимуляцію проліферації стволових клітин кісткового мозку, фібробластів, ендотеліоцитів, активацію продукції білків гострої фази, кортикостероїдів і т.д. Frank M. Graziano, et al, 1999. Важлива роль ІЛ-1 в формуванні імунної реакції обумовлена тем, що він являється необхідним костимулятором індукції синтезу ІЛ-2 і експресії рецепторів до ІЛ-2 на Т-лімфоцитах, внаслідок чого являється ініціатором запуску інтерлейкінового каскаду Корнеева Е.А. и соавт., 1998.

Відомо, що ФНП-б завдяки своїм біологічним властивостям володіє плейотропним ефектом на організм. Як і ІЛ-1, він здатний підсилювати проліферацію Т-лімфоцитів, продукцію ІЛ-2 і експресію ІЛ-2 рецепторів, підвищувати фагоцитоз, продукцію супероксидів, приймають участь в реакціях гострофазової відповіді. Однак, при аналізі амінокислотних послідовностей гомології між ІЛ-1 і ФНП знайдено не було. Показано, що рекомбінантний ІЛ-1 не конкурує з ФНП за рецепторні зв’язки, а різні клітини-мішені проявляють неоднакову чутливість до цих цитокінів Ярилин А.А., 1999. В зв’язку з вищесказаним, оцінка продукції таких цитокінів як ІЛ-1 і ФНП, наряду с іншими показниками імунітету (ФП, ФЧ, НСТ-тест, рівень NO), представляє важливу характеристику визначених ланок імунітету. Продемонстрована нами динаміка цих показників під впливом Манаксу в умовах in vitro вказує на те, що препарат має виражену імунотропну дію, одним із важливих механізмів якого являється активація неспецифічних факторів захисту і підвищення фагоцитарної активності імунної системи.

Аналіз впливу різних доз препарату Манакс на продукцію -ІФ, який може характеризувати активність Т-хелперів 1 типу, показав, що у здорових донорів початкова доза препарату 20 мкг/мл практично не впливала на продукцію медіатору в добовій культурі лімфоцитів. Збільшення дози Манаксу до 50 мкг/мл приводило до достовірного зниження секреції -ІФ, а додавання до клітин дози 100 мкг/мл викликало зменшення продукції лімфокіну майже в 2,5 рази в порівнянні із спонтанним рівнем (табл. 3)

Таблиця 3

Показники продукції -ІФ (пкг/мл) мононуклеарними клітинами здорових донорів під впливом різних доз Манаксу в умовах in vitro (Mm)

Показник | Спонтанна продукція

(n=15) | Доза препарату

20 мкг/мл | 50 мкг/мл | 100 мкг/мл

-ІФ | 22,30,7 | 22,40,6 | 15,40,8 | 9,20,8

Примітка: - різниця достовірна в порівнянні з спонтанною продукцією

(р<0,05); n - кількість обстежених

Визначення медіаторів, що секретуються переважно Т-хелперами 2 і 3 типу, а саме ІЛ-4 та ІЛ-10, показало достовірне підвищення продукції ІЛ-4 під впливом Манаксу у дозах 20 мкг/мл та 50 мкг/мл (табл. 4). Індивідуальний аналіз показав, що концентрація Манаксу в дозі 100 мкг/мл призводила до різноспрямованих змін продукції ІЛ-4.

Таблиця 4

Показники продукції ІЛ-4 та ІЛ-10 (пкг/мл) мононуклеарними клітинами

здорових донорів під впливом різних доз Манаксу в умовах in vitro (Mm)

Показник | Спонтанна продукція

(n=15) | Доза препарату

20 мкг/мл | 50 мкг/мл | 100 мкг/мл

ІЛ-4 | 22,613,6 | 96,211,2 | 253,533,2 | 16,60,5

ІЛ-10 | 107,56,4 | 75,03,6 | 63,71,4 | 29,43,0

Примітка: - різниця достовірна в порівнянні з спонтанною продукцією;

n- кількість обстежених

Дослідження функціональної активності імунокомпетентних клітин по продукції ІЛ-10 продемонструвало її однорідність у здорових донорів. Додавання Манаксу в різних дозах до культивуючи клітин приводило до пропорційного зниження середніх показників продукції ІЛ-10 у групі обстежених осіб (табл. 4). Односпрямованість впливу Манаксу на секрецію цього медіатору при індивідуальному аналізі представлена в таблиці 5.

Таблиця 5

Динаміка продукції ІЛ-10 (пкг/мл) мононуклеарними клітинами здорових донорів під впливом Манаксу в різних дозах

№

n=15 | Спонтанна

(пкг/мл) | Манакс

20 мкг/мл | Манакс

50 мкг/мл | Манакс

100 мкг/мл

1 | 124,5 | 89,9 | 61,3 | 17,8

2 | 84,1 | 68,7 | 60,3 | 25,1

3 | 101,4 | 71,8 | 69,8 | 29,6

4 | 132,8 | 65,3 | 68,7 | 40,7

5 | 90,0 | 70,4 | 68,9 | 23,0

6 | 113,0 | 90,0 | 58,9 | 32,0

7 | 122,4 | 81,2 | 62,4 | 26,3

8 | 91,5 | 62,8 | 59,6 | 40,4

9 | 111,6 | 73,7 | 54,9 | 19,0

10 | 110,8 | 75,6 | 68,5 | 32,5

11 | 120,2 | 71,7 | 77,7 | 37,5

12 | 116,2 | 93,6 | 80,9 | 32,2

13 | 104,5 | 70,3 | 49,9 | 32,6

14 | 99,5 | 80,3 | 52,8 | 27,9

15 | 100,5 | 61,1 | 59,8 | 29,0

Мм | 107,56,4 | 75,03,6 | 63,72,4 | 29,43,0

p<0,05 | P<0,001 | p<0,001

Примітка: - різниця з контролем статистично достовірна;

n - кількість обстежених осіб

Вплив препарату Манакс на продукцію ІЛ-4 становить великий інтерес, відомо, що в присутності цього лимфокіну СД4-лімфоцити диференціюються в хелпери 2 типу, що далі починають продукувати ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-10 і запускають гуморальну імунну відповідь, тобто синтез специфічних антитіл – імуноглобулінів Драннік Г.М., 1999. Тобто, можна вважати позитивним факт впливу Манаксу на підвищення секреції ІЛ-4, особливо при збереженні продукції гама-ІФ при використанні терапевтичної дози, у здорових як фактор підвищення резистентності організму до інфекції. В той же час, відомо, що ІЛ-4 ингибує генерацію Т-хелперів 1 типу і продукцію ними гама-ІФ, цим, можливо, частково й пояснюється його низький рівень у даному експерименті при додаванні Манаксу в дозі (50 мкг/мл), що викликає найбільш різке підвищення продукції ІЛ-4. Можна припускати, що призначення Манаксу здоровим особам у високих дозах може бути недоцільним у зв'язку з впливом його на зниження продукції інтерферону. Однак, ефект цього препарату у випадках конкретної патології, на наш погляд, повинен вивчатися стосовно до визначених особливостей продукції цитокінів у хворих. Вважаємо за необхідне виявляти обережність при застосуванні цього лікарського засобу, який стимулює секрецію ІЛ-4 і тому сприяє синтезу імуноглобулінів Е, у хворих з атопією.

Виявлені ефекти Манаксу спонукали до наступного етапу досліджень, що був спрямований на визначення можливості використання препарату у пацієнтів з таким складним в медико-соціальному відношенні захворюванням як хронічний сечостатевий хламідіоз. Хронічна хламідійна інфекція наносить суспільству демографічний та економічний збиток, який оцінюється астрономічними сумами. Сечостатева інфекція є в значному числі випадків причиною безпліддя та пусковим механізмом при реактивних артритах у чоловіків, а також фактором ризику раку шийки матки та простати [Бобков Ю.А. и соавт., 1999; Башмакова М.А. и соавт., 2000]. В зв’язку з цим зрозумілий інтерес науковців до розробки нових ефективних методів терапії даної патології.

Особливості урогенітальних інфекцій обумовлюють значимість факторів протимікробної резистенції хазяїна для результату взаємодії мікро- і макроорганізму. У ряді експериментальних робіт показано визначальне значення імунних реакцій макроорганізму в розвитку інфекційного процесу при зараженні збудниками, переданими статевим шляхом, до яких відносяться такі розповсюджені патогени як хламідії [Арал С.О., 2001; Базарный В.А. и соавт., 1999; Гастон Дж., 2001; Гомберг М.А. и соавт., 1996]. Встановлено важливу роль у локалізації і ліквідації сечостатевих інфекцій клітинно-опосередкованих і фагоцитарних реакцій, у тому числі за участю факторів міжклітинної взаємодії – інтерлейкінів, інтерферонів, фактору некрозу пухлин та ін. [Кетлинский С.А. и соавт., 1992; Лебедюк В.В., 1999].

В зв'язку з вищевикладеним, зрозуміло, чому дослідники і клініцисти зайняті пошуком нових, ефективних засобів для лікування хворих на хронічний хламідіоз. І одним із шляхів пошуку є розробка схем лікування за участю нових імунотропних препаратів.

Дослідження, проведені в лабораторії імунології Інституту урології АМН України, дозволили продемонструвати особливості деяких факторів, що характеризують функціональну активність імунокомпетентних клітин, та показати, що зниження функціональної активності Т-хелперів 1 типу на фоні високої – Т-хелперів 2 і 3, можуть бути важливими ланками імунопатогенезу хронічного хламідіозу.

Дослідження показали, що середній показник спонтанної продукції ФНП- у хворих на ХССХ вірогідно вище, ніж у здорових – 21,80,3 в порівнянні з 16,51,3 пкг/мл (р<0,05). Додавання ж в умовах in vitro до клітин хворих Манаксу сприяло підвищенню продукції ФНП- майже в 6 разів, що становило 129,7 0,7 пкг/мл (р<0,001).

Приймаючи до уваги важливу роль оксиду азоту в патогенезі хламідійної інфекції [Малишев І.Ю., 1997; Igietseme G.U. et all., 1997; Calabrese V., et al, 2000], однією з задач було дослідження цього фактору кисневонезалежного механізму резистентності клітин до інфекції. Вивчалась продукція оксиду азоту у 42 хворих з ХССХ та 15 здорових донорів з використанням методу [Houli Joang, Balazy Michael, 1998], який базується на здатності поліморфноядерних лейкоцитів синтезувати NO з амінокислоти L-аргініну за допомогою ферменту NO-синтази, яка продукується макрофагами в відповідь на бактеріальні ендотоксини або прозапальні цитокіни. Отримані дані свідчать, що спонтанна та стимульована продукція оксиду азоту у хворих з ХССХ перевищувала показники у здорових відповідно в 3 рази. Індукція in vitro за допомогою Манаксу призводила до стимуляції у здорових і ще більшого підвищення рівня оксиду азоту у хворих – майже в 2,5 рази в порівнянні з спонтанною продукцією хворих до лікування (що свідчить про задовільний резерв клітин пацієнтів).

Дослідження функціональної активності клітин показали, що у хворих з сечостатевим хламідіозом спонтанна продукція лімфоцитами -ІФ в середньому складає 14,21,0 пкг/мл, що в 2 рази нижче рівня у здорових донорів. Інкубація клітин з Манаксом (20 мкг/мл) призводила до підвищення показника до 26,82,5 пкг/мл (р<0,001), що свідчить про можливості використання препарату з метою стимуляції ІФ-продукуючої здатності клітин (головним чином, Т-хелперів 1) у хворих на ХССХ.

Відомо, що високі дози г-ІФ повністю інгібують ріст хламідій, низькі ж – навпаки, індукують розвиток морфологічно аберантних форм включень [Brooks B.M. et al, 2003]. Тому виявлені нами можливості підвищення продукції цього лімфокіну дуже важливі для запобігання формуванню патологічних морфологічних форм Ch. Trachomatis.

Вивчення функціональної активності Т-хелперів 3 показало, що рівень спонтанної продукції ІЛ-10 у хворих на хламідіоз більше ніж у 2 рази перевищує спонтанну продукцію цього лімфокіну у здорових донорів. Це свідчить про високу активність імунорегуляторних клітин по продукції цього протизапального цитокіну, що являється негативним фактором в імунопатогенезі хронічного процесу. При інкубації клітин хворих з ХССХ з препаратом Манакс у дозах 20 та 50 мкг/мл відбувалося достовірне зниження продукції ІЛ-10. Висока активність імунорегуляторних клітин по продукції ІЛ-10 у пацієнтів асоціювала з високою продукцією ІЛ-4 – рівень спонтанної продукції у хворих з хламідіозом в середньому в 5 разів перевищує спонтанну продукцію ІЛ-4 у здорових донорів – 66,111 в порівнянні 12,20,8 пкг/мл. При стимулюванні клітин хворих з ХССХ препаратом Манакс у терапевтичній дозі (20 мкг/мл) відбувалося підвищення продукції цитокіну, рівень якої більше ніж у 2 рази перевищував стимульовану секрецію у здорових. Таким чином, Манакс стимулює продукцію ІЛ-4 у хворих на ХССХ, що свідчить про можливість і доцільність його використання у пацієнтів.

Таким чином, Манакс в умовах in vitro демонструє аналогічні ефекти на імунокомпетентні клітини як здорових донорів, так і хворих на хронічний хламідіоз: достовірно підвищує продукцію ФНП-, NO, ІЛ-4 та знижує - ІЛ-10, що може позитивно впливати на стан імунної системи та протихламідійний захист у пацієнтів. Відмічена різниця впливу препарату на функціональну активність імунокомпетентних клітин (в основному, Т-хелперів 1) здорових та хворих на ХССХ може бути пов’язана з тим, що у хворих продукція -ІФ була знижена, а резервні можливості клітин зберігались, тому для таких пацієнтів Манакс продемонстрував можливості стимуляції зниженої функціональної активності лімфоцитів по продукції даного цитокіну.

Виявлені в результаті роботи можливості впливу на ліквідування дисбалансу активності Т-хелперів та корекцію продукції цитокінів у пацієнтів з ХССХ за допомогою Манаксу дозволяють використовувати препарат як для комплексної терапії у випадках сечостатевого хламідіозу, так і для розробки перспективних напрямків імунотерапії при інших патологіях.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуальної медико-біологічної проблеми по встановленню впливу препарату Манакс на функціональну активність клітин імунної системи по продукції ними медіаторів імунної відповіді.

В умовах in vitro Манакс сприяє покращенню функціонування клітин моноцитарно-макрофагальної системи здорових через підвищення фагоцитарного показника та числа, клітинного метаболізму по оцінці рівнів NO та НСТ-тесту, продукції ІЛ-1 та ФНП-, що свідчить про активацію неспецифічних факторів захисту організму.

В умовах in vitro Манакс підвищує продукцію ІЛ-4 у дозі 20 та 50 мкг/мл та пригнічує продукцію ІЛ-10 в цих же дозах, що свідчить про різноспрямований вплив на Т-хелпери 2 та Т-регуляторні клітини (Т-хелпери 3) здорових осіб.

Манакс підвищує в умовах in vitro продукцію оксиду азоту клітинами хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз, що свідчить про можливість підвищення кисневонезалежного шляху захисту від інфекції при використанні його у пацієнтів.

В умовах in vitro Манакс підвищує ФНП--продукуючу здатність клітин імунної системи хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз, що свідчить про можливості використання препарату для підвищення неспецифічного захисту організму при хламідіозі.

Виявлено в умовах in vitro, що Манакс здатний підвищувати знижену в порівнянні з нормою секрецію -ІФ та продукцію ІЛ-4 імунокомпетентними клітинами хворих, що свідчить про доцільність його використання у пацієнтів з хронічним хламідіозом.

Культивування з Манаксом in vitro сприяє зниженню високої активності імунорегуляторних клітин пацієнтів з хронічним хламідіозом по продукції протизапального цитокіну ІЛ-10. При використанні у хворих можна прогнозувати позитивний вплив препарату на зниження пригнічуючого впливу цього лімфокіну на Т-хелпери 1 і підвищення продукції ними відповідних цитокінів, що є необхідним для успішної боротьби з внутрішньоклітинною (хламідійною) інфекцією.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ващенко В.В., Дриянская В.Е., Фесенкова В.И., Папакина В.С., Федорук Г.В., Дранник Влияние Манакса на функциональную активность Т-хелперов 1 и 2, оцененную по продукции гамма-ИФ, ИЛ-4 и –10 у здоровых лиц в условиях in vitro // Таврический медико-биологический вестник. – 2000. – том 3, №1-2. – С.16-20.

2. Фесенкова В.И., Ващенко В.В., Дриянская В.Е., Папакина В.С., Дранник Г.Н. Влияние Манакса на некоторые показатели, характеризующие фагоцитарную активность иммунной системы в условиях in vitro // Імунологія та алергологія. – 2000. - №4. – С.42-45.

3. Дриянская В.Е., Фесенкова В.И., Папакина В.С., Ващенко В.В., Федорук Г.В., Дранник Г.Н. Исследование in vitro продукции ИЛ-1, ФНО и ИЛ-4 клетками здоровых доноров при воздействии препарата Манакс // Таврический медико-биологический вестник. - 2001. – Т.4, №1-2. – С.156-160.

4. Драннік Г.М., Дріянська В.Є., Ващенко С.М., Папакіна В.С., Дріянська В.В. Результати лікування хворих на урогенітальний хламідіоз з використанням імунотропної терапії // Імунологія та алергологія. – 2002. - №3. – С. 29-31.

5. Драннік Г.М., Ващенко С.М., Дріянська В.Є., Фесенкова В.Й., Папакіна В.С. Функціональна активність імунокомпетентних клітин за продукцією ІЛ-1 та ФНП- хворих на хронічні запальні сечостатеві захворювання хламідійної етіології // Таврический медико-биологический вестник. – 2003. – Т.6, №2. – С. 46-49.

6. Возіанов О.Ф., Драннік Г.М., Руденко А.В., Ващенко С.М., Фесенкова В.Й., Папакіна В.С. Аналіз показників імунітету за даними імунограми та цитокінового статусу у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз в залежності від характеру (моно- чи мікст-) інфекції // Імунологія та алергологія. – 2003. - №4. – С. 39-42.

7. Драннік Г.М., Дріянська В.Є., Ващенко С.М., Папакіна В.С., Фесенкова В.Й., Дріянська В.В. Вплив Манаксу на продукцію цитокінів in vitro лімфоцитами здорових донорів і хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз // Імунологія та алергологія. - 2004. - №1. – С. 15-17.

8. Савченко В.С., Ващенко С.М., Фесенкова В.Й., Драннік Г.Г., Дріянська В.В. Вплив Манаксу на продукцію оксиду азоту та ФНП- імунокомпетентними клітинами здорових донорів та хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз // Імунологія та алергологія. – 2004. - №4.