імені Тараса ШЕвченка

ШКОРБАТОВ Юрій Георгійович

УДК 576. 315. 4.

СТРУКТУРНІ ТА ЕЛЕКТРОКІНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ЯДЕР КЛІТИН БУКАЛЬНОГО ЕПІТЕЛІЮ ЛЮДИНИ У ЗВ’ЯЗКУ З ДІЄЮ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ФАКТОРІВ ТА ЗМІНОЮ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ОРГАНІЗМУ

Спеціальність 03. 00. 11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському національному університеті

імені В. Н. Каразіна

Науковий консультант: доктор біологічних наук, академік АН Вищої школи України, професор Шахбазов Валерій Гайович, професор кафедри генетики і цитології Харківського національного університету

Офіційні опоненти: |

доктор медичних наук, професор Гордієнко Вадим Максимович, професор кафедри спортивної медицини Національного університету фізичного виховання і спорту України

доктор біологічних наук, Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, завідувач лабораторії морфології і цитології Інституту геронтології АМН України

доктор біологічних наук, професор Стойка Ростислав Степанович, завідувач відділу регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України

Провідна установа: Харківський медичний університет (м. Харків).

Захист відбудеться “20” квітня 2005 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 001. 38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, просп. Акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий ”14” березня 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 О. В.Цимбалюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження реакцій клітини на пошкоджуючі та регулюючі екзогенні та ендогенні фактори є актуальним питанням сучасної цитології. Розв’язання цієї проблеми дозволить дати відповідь, у чому полягають механізми відгуку організму на дію екзогенних факторів, основи процесу старіння, реакції організму на стрес. Відомо, що морфологічний стан ядра клітини залежить від рівня його функціональної активності, що підтверджують останні дані цитологічних досліджень. Зокрема, показано, що у ядрі процеси біосинтезу РНК відбуваються на межі між хромосомними територіями та міжхроматиновим доменом та що активність цих процесів залежить від площі поверхні хромосомних територій (Swedlow, Lamond, 2001). Електростатичні взаємодії відіграють важливу роль у різних біологічних процесах. На кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету під керівництвом професора В.Г.Шахбазова проводяться дослідження електрокінетичних властивостей клітинних яядер у зв’язку з їх функціональним станом. Електрокінетичний потенціал на межі розподілу між хроматином та каріоплазмою та електрокінетичні властивості ядра в цілому пов’язані з функціональною активністю ядер (Шкорбатов, Шахбазов, 1992). Наявність електричного заряду молекул ДНК дозволяє розділити клітини за рівнем плоїдності завдяки методу ємкісної цитометрії (Sohn, et al., 2000). Зміна ступеня конденсованості хроматину також є важливим механізмом регуляції функціональної активності ядра (Therman, Susman, 1993). Екзогенні та ендогенні фактори впливають на стан функціональної активності ядра, зміна морфологічних і біоелектричних властивостей є індикатором і, водночас, механізмом регуляції функціональної активності клітинних ядер, тому вивчення змін цих властивостей клітинних ядер під впливом екзогенних та ендогенних факторів є актуальним, але зв’язки між станом хроматину у ядрі та електрокінетичними властивостями ядер дотепер не було досліджено. Раніше у експериментах на вилученому з ядер хроматині було показано, що електричний заряд хроматину є чинником, який впливає на ступінь конденсації хроматину (Hilder, Maclean, 1974). Таким чином, на рівні вилученого з ядер хроматину існує зв’язок між зарядом хроматину, ступенем його конденсації та, як наслідок, з функціональною активністю. Паралельне визначення морфологічних та біоелектричних властивостей ядра клітини є актуальною проблемою, яка відкриває новий підхід до вивчення реакції клітин на дію пошкоджуючих та регулюючих факторів та регуляції функціональної активності клітинного ядра.

Важливим аспектом впливу на клітину зовнішніх факторів є зміна бар’єрної функції мембран клітин. Цей процес пов’язаний з внутрішньоклітинними механізмами регуляції, з регуляцією активності клітинного ядра. На клітинах людини це питання досліджено недостатньо. Вивчення цього питання є важливим для розуміння механізмів впливу зовнішніх факторів на клітину.

Усе вищенаведене зумовлює актуальність теми дослідження даної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт відділу генетики НДІ біології Харківського національного університету та кафедри генетики і цитології ХНУ у межах таких тем: „Дослідити вплив ступеня гетерозиготності на процес старіння та розробити метод визначення біологічного віку за біоелектричними властивостями клітинного ядра”, № держреєстрації 02.910042364 (1988 – 1990); „Вивчити генетичні, цитологічні, біохімічні та біофізичні параметри проявів інбредної депресії та гетерозису” № держреєстрації 029U002570 (1991-1993); “Залежність біологічного віку і тривалості онтогенезу від генотипу, різних видів опромінювання та інших екологічних факторів”, № держреєстрації 019U021375 (1993-1995), ”Дослідити генетичні та біофізичні основи гетерозису в онтогенезі на різних рівнях еволюції та розробити практичні засоби прогнозування гетерозису та неспецифічної стійкості”, № держреєстрації 0297U002197 (1996-1997), “Вивчити генетичні та епігенетичні основи життєздатності та стійкості організмів, розробити методи визначення та підвищення цих властивостей для медицини та селекції”, № держреєстрації 0198 U 005753 (1998-1999), “Вивчити прояви кількісної спадковості у зв’язку з генетичними та фізичними параметрами ядерного геному у нормі та за умов впливу електромагнітних хвиль різних частот”, № держреєстрації 0198U005756 (2000-2002).

Мета та задачі дослідження. Метою дослідження було встановлення закономірностей змін стану конденсації хроматину у зв’язку зі змінами електрокінетичних властивостей ядер клітин та можливості використання клітин букального епітелію людини як модельного об’єкту для вивчення змін функціональної активності ядер у залежності від дії екзогенних та ендогенних чинників.

При вирішенні цієї загальної задачі автором були поставлені та вирішені такі конкретні задачі:

розробка та обґрунтування моделі змін структурно-функціонального стану хроматину та ядра клітини у випадку дії на клітину зовнішніх факторів та при змінах функціонального стану організму;

встановлення закономірностей змін стану хроматину в інтерфазних ядрах та показника електронегативності ядер унаслідок дії на клітину біологічно активних речовин: речовин гормональної природи (гідрокортизону, адреналіну, норадреналіну, мелатоніну), поліаніонної речовини гепарину та інгібіторів метаболізму (актиноміцину D та циклогексиміду);

встановлення закономірностей процесів гетерохроматинізації хроматину в інтерфазних ядрах, змін показника електронегативності ядер та бар’єрної функції мембран унаслідок дії на клітину електромагнітних полів різних діапазонів (випромінювання мікрохвильового діапазону, випромінювання He-Ne лазера, ультрафіолетового випромінювання) та низькочастотного електричного поля;

встановлення закономірностей процесу гетерохроматинізації хроматину в інтерфазних ядрах та змін електронегативності ядер унаслідок інкубації клітин в умовах гіпо- та гіпертермії;

визначення закономірностей процесу гетерохроматинізації хроматину та змін електронегативності ядер унаслідок змін фізіологічного стану організму (при фізичному навантаженні на організм, яке пов’язане з тренувальними навантаженнями та виконанням службових обов’язків, у зв’язку з процесом старіння та у зв’язку з циркадним ритмом).

Об’єкт дослідження – морфологічний стан та електрокінетичні властивості ядер клітин при змінах функціонального стану ядра.

Предмет дослідження – залежність ступеня конденсації хроматину в інтерфазному ядрі від його електричного заряду при дії на клітини зовнішніх факторів та у зв’язку зі зміною функціонального стану організму.

Методи дослідження.

При виконанні роботи були використані такі методи дослідження:

метод визначення ступеня конденсації хроматину у інтерфазних ядрах клітин букального епітелію за вмістом гранул гетерохроматину (ВГГ) після забарвлення орсеїном (Shckorbatov, 1999), завдяки якому визначали середню кількість гранул гетерохроматину на одне ядро та підраховували середню величину ВГГ на 30 ядер;

метод дослідження електрокінетичних властивостей ядер за допомогою внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу (Шахбазов, Лобынцева, 1971). Суспензію клітин піддавали дії електричного поля у плоскій камері для електрофорезу у 3,03 мМ фосфатному буфері, рН= 7,0 з додаванням 2,89 мМ хлориду кальцію (Шкорбатов, 1992) та обчислювали відсоток клітин з ядром, які мали негативний заряд за стандартних умов електрофорезу (напруга – 15 В/см, струм – 100 мкА). Цей показник визначали як електронегативність ядер (ЕНЯ, %). Під час визначення показника ЕНЯ спостерігали 1000 клітин;

метод визначення проникності мембран за допомогою визначення забарвленості клітин індигокарміном (Shckorbatov et al., 1995). За цим методом визначали відсоток клітин, які забарвлювались індигокарміном за 5 хвилин. Показник забарвленості клітин індигокарміном (ЗКІ) визначали у 1000 клітин. Цей показник дозволяє оцінити зміни у бар’єрній функції мембран;

метод електронної мікроскопії;

метод визначення життєздатності клітин завдяки наявності процесу гранулоутворення після забарвлення клітин індигокарміном (Shckorbatov et al., 2001).

Наукова новизна одержаних результатів.

Запропоновано модель вивчення стану організму людини, яка дозволяє по змінам стану хроматину клітин букального епітелію судити про вплив різноманітних факторів на стан організму. Розроблено новий напрям наукових досліджень – комплексне вивчення електрокіне-тичних властивостей ядер та стану хроматину при реакції клітин на дію екзогенних та ендогенних факторів. Запропоновано загальний механізм реагування ядер клітин на пошкоджуючі та регулюючі впливи, суть якого полягає в тому, що електричний заряд хроматину впливає на ступень конденсації хроматину і виходячи з цього на функціональну активність ядра.

У модельних експериментах при дії на клітину біологічно активних речовин (адреналін, норадреналін, інсулін, мелатонін, гідрокортизон, гепарин, інгібітори біосинтезу РНК і білка та УФ- випромінювання) встановлено зв’язок між змінами стану хроматину у ядрі та електронегативністью ядер. У випадку підвищення електронегативності ядер ступінь конденсованості хроматину зменшується і, навпаки, зниження електронегативності ядер супроводжується підвищенням ступеня конденсованості хроматину. На базі цих експериментів зроблено висновок про вплив електричного заряду хроматину на стан хроматину та функціональний стан ядра.

Завдяки запропонованим методам показано, що навіть дуже малі інтенсивності електромагнітних випромінювань (мікрохвильове та лазерне випромінювання) та електричні поля викликають значні зміни ступеня конденсації хроматину та електронегативності ядер. Встановлено, що електромагнітні випромінювання викликають підвищення ступеня конденсації хроматину. Вплив на клітини електричного поля приводить до деконденсації хроматину та до підвищення електронегативності ядер. Ефект мікрохвильового випромінювання на електронегативність ядер клітин залежить від початкового рівня цього показника і може бути як інгибіруючим, так і стимулюючим. Лазерне випромінювання викликає зниження електронегативності ядер. Показано, що електромагнітні випромінювання (за винятком лазерного випромінювання), а також електричні поля викликають підвищення проникності мембран клітин. При малих дозах лазерного опромінювання спостерігається зниження проникності мембран клітин до індигокарміну (молекулярна маса 422 в.о.).

Встановлено загальний зв’язок між електрокінетичними властивостями клітинних ядер та станом хроматину в експериментах по вивченню ефектів гіпо- та гіпертермії на клітини людини. Доведено, що вплив на клітини гіпо- та гіпертермії приводить, як правило, до підвищення вмісту гранул гетерохроматину та зниження електронегативності ядер.

Показано, що неспецифічні впливи на організм людини (підвищені фізичні навантаження, зміни стану організму у циркадному ритмі та при старінні) приводять до структурних змін у ступені конденсованості хроматину.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані у роботі, можуть бути застосовані при розробці методів індивідуальної оцінки відмінностей у реакції клітин на дію факторів, які застосуються в медицині, зокрема, мікрохвильового випромінювання міліметрового та сантиметрового діапазонів та лазерного світла, а також біологічно активних речовин. Одержані результати дають підставу для розробки методів оцінки якості препаратів інсуліну in vitro за реакцією електрокінетичних властивостей ядер клітин людини. Визначення електрокінетичних властивостей ядра клітини під впливом зовнішніх факторів було застосовано при розробці способу оцінки інтенсивності впливу зовнішніх факторів, зокрема, іонізуючого випромінювання та ультрафіолетового світла на клітину [Шахбазов В. Г., Колупаева Т. В., Набоков А. Л., Шкорбатов Ю. Г., Страшнюк В. Ю. Способ определения повреждений клеток экстремальным физическим воздействием. А. с. №1451600 СССР // Открытия, изобретения 1989. - №2]. Дослідження електрокінетичних властивостей ядер людини може бути використано при оцінці змін у функціональному стані людини. На основі проведених досліджень було розроблено спосіб визначення функціонального стану людини за зміною зміщення ядра в електричному полі [Шахбазов В. Г., Шкорбатов Ю. Г. Способ определения функционального состояния человека. - 1994. -. Патент № 2009494. РФ. 15. 03. 94.]. Визначення стану хроматину у клітинах людини може бути використано при оцінці інтенсивності впливу зовнішніх факторів на організм людини. Дослідження змін стану хроматину при впливі фізичного навантаження на організм людини дозволило розробити спосіб визначення стану втомленості [Шкорбатов Ю. Г., Шахбазов В. Г., Сутюшев Т. А., Григор’єва Н. М. Спосіб визначення втомленості людини. Патент України №2000042134 від 15. 05. 2001]. Цей спосіб застосується в дослідженнях, які проводяться в Інституті ВПС України (м. Харків).

Особистий внесок здобувача. Формування напрямку досліджень здійснено автором у співробітництві з науковим керівником – професором В.Г.Шахбазовим. Авторові належать формулювання теми й мети досліджень, вибір об’єктів а також вибір і розробка методів досліджень, постановка експериментів. Експериментальні вимірювання, обробка даних, їх теоретичний аналіз виконані автором або за його безпосередньою участю. Автором особисто проведений аналіз літературних даних за темою роботи, сформульовані та обґрунтовані підсумкові висновки та узагальнення. Автор брав безпосередню участь у впровадженні результатів дослідження у практику. Він є автором одноосібної статті та 4 одноосібних тез та матеріалів наукових конференцій. У роботах, опублікованих зі співавторами [3-6, 8-14, 10-14, 16-24], особистий внесок автора полягає в постановці задачі, розробці методів досліджень, у проведенні експериментів та аналізі одержаних результатів. У роботах [1, 7] особистий внесок автора полягає частково у проведенні експериментів, у аналізі одержаних результатів, а також аналізі даних літератури. В оглядових роботах [2, 17, 25] особистий внесок автора складається у постановці задачі, аналізі даних літератури та аналізі результатів особистих експериментальних досліджень.

Апробація одержаних результатів. Основні результати дисертації були представлені та обговорювались на таких наукових з’їздах та конференціях: Установча конференція “Біоелектричні властивості клітинного ядра та стан організму” (Харків, 1989); Третій Міжнародний симпозіум з родинної медицини у Литві (Вільнюс, 1993); Симпозіум “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1994); I З’їзд Українського біофізичного товариства (Київ, 1994); II Національний конгрес геронтологів і геріатрів України (Київ, 1994); Перший російський з’їзд геронтологів та геріатрів (Самара, 1999); IV Міжнародний симпозіум “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2000); 13 Міжнародний вроцлавський симпозіум з електромагнітної сумісності (Вроцлав, 1996); II з'їзд Українського біофізичного товариства (Харків, 1998); II З’їзд біофізиків Росії (Москва, 1999); 6, 9, 10 та 11 Міжнародні Кримські конференції "НВЧ-техніка і телекомунікаційні технології" (Севастополь 1996, 1999, 2000, 2001); 42 Міжнародні дні біології (Париж, 1997): 5 Міжнародний конгрес Європейської біоелектромагнітної асоціації (EBEA), (Хельсінкі, 2001); XVII Всесвітній геронтологічний конгрес (Ванкувер, 2001); V, XII, XV Міжнародні науково-практичні конференції “Застосування лазерів у медицині та біології” (Харків, 1995, 1999, 2001); IV Міжнародний харківський симпозіум “Фізика міліметрових та субміліметрових хвиль” (Харків, 2001); VIII Міжнародний конгрес Європейської медичної лазерної асоціації (EMLA), (Москва, 2001); Наукова конференція “Наукова спадщина академіка И. Н. Буланкіна та її розвиток у сучасній біохімії” (Харків, 2001); II Всесвітня конференція зі старіння (Валенсія, 2002); 7 З’їзд Українського Товариства генетиків і селекціонерів ім. М. І. Вавілова (Сімферополь 2002); III з’їзд Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); 16 Міжнародний вроцлавський симпозіум з електромагнітної сумісності (Вроцлав, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 55 наукових робіт, з них 20 статей у фахових виданнях, 2 патенти на винаходи та 1 авторське свідоцтво.

Зміст та обсяг роботи. Текст дисертації включає вступ, 11 розділів, висновки, список використаних джерел. Текст дисертації викладено на 349 сторінках машинописного тексту, містить 83 таблиці, 30 рисунків, список літератури містить 622 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету досліджень та задачі, які необхідно вирішити для її досягнення, визначено наукову та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертаційної роботи.

У першому розділі наведено дані про структурну організацію та молекулярний склад хроматину. Особлива увага надана ролі структури хроматину у регуляції його функціональної активності та ролі електричного заряду компонентів хроматину у структурній організації хроматину. Зроблено висновок про важливість рівня надмолекулярної організації хроматину у процесі регуляції активності генів у еукаріот та про значну роль електричного заряду компонентів хроматину в цьому процесі. Розглянуто результати, які свідчать про наявність електричного заряду нативного клітинного ядра та роль цього показника в регуляції активності ядра. Розглянуто основні шляхи впливу мікрохвильового та лазерного випромінювання на біологічні об’єкти.

Матеріали і методи

Характеризовано головний експериментальний об’єкт – клітини букального епітелію людини. На рис. 1 наведена електронна мікрофотографія ядра клітини букального епітелію.

Рис. 1. Ядро клітини букального епітелію людини (збільшення х 8000)

Дано опис оригінального метода оцінки стану хроматину за вмістом гранул гетерохроматину (ВГГ). Описано метод визначення електронегативності ядер (ЕНЯ) за допомогою методу внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу. На рис. 2 наведена мікрофотографія клітини букального епітелію людини, де на один кадр зроблено два знімки при двох положеннях ядра – у відсутності електричного поля та при зсуві ядра в бік аноду. Описано метод визначення проникності мембран клітин за допомогою забарвлення клітин барвником індигокарміном та метод електронної мікроскопії.

Дію зовнішніх чинників на клітини здійснювали за такими методами:

метод впливу на клітини мікрохвильового випромінювання, УФ – радіації, світла He-Ne лазера. Суспензію клітин (25 мкл) уміщували на поверхні покривного скла та піддавали впливу електромагнітних випромінювань різних діапазонів. Джерелами мікрохвильового випромінювання був прилад для НВЧ-терапії - „ЯВЬ-1” (довжина хвилі леф = 7,1 мм, частота f = 42,25 ГГц) та генератор сигналів високочастотний Г4-141 (довжина хвилі леф = 8 мм, частота f = 37,50 ГГц). Джерелом мікрохвильового випромінювання з довжиною хвилі л = 16 мм та частотою f = 18,75 ГГц був прилад, сконструйований на кафедрі прикладної електродинаміки Харківського національного університету. Щільність потоку потужності на опромінюваній поверхні в усіх трьох випадках складала Е = 2,0; 0,2 та 0,02 мВт/см2. Як джерело випромінювання з довжиною хвилі леф=632,8 нм застосовували He-Ne лазер ЛГН-120, який забезпечував випромінювання з потоком потужності на рівні препарату Е=1мВт/см2;

метод впливу на клітини електричного поля. Клітини піддавали впливу електричного поля напруженістю від 5 до 110 В/см, при частоті 50 Гц протягом 5 хвилин;

метод впливу на клітини біологічно активних речовин. Клітини піддавали впливу розчинів біологічно активних речовин протягом 5, 10, 15, 30, 60 хвилин. Розчини біологічно активних речовин готували на тому ж самому розчині, у якому знаходились клітини;

метод впливу на клітини високої та низької температури. Суспензію клітин витримували під впливом температур у діапазоні від +15о до + 48о протягом 20 хвилин.

Рис. 2. Зсув ядра вбік аноду при внутрішньоклітинному мікро електрофорезі (збільшення х 700)

ЗМІНА СТАНУ КЛІТИННОГО ЯДРА ПРИ ДІЇ ГОРМОНІВ ТА ІНГІБІТОРІВ БІОСИНТЕЗУ

У зв’язку з загальною метою роботи – встановленням закономірностей змін стану клітинного ядра у випадку дії на клітину зовнішніх факторів та при зміні стану організму, було проведено дослідження впливу на клітину біологічно активних речовин. Дослідження дії на клітину стресових гормонів адреналіну, норадреналіну, гідрокортизону проводили у зв’язку з вивченням впливу фізичного навантаження на організм. Гормон інсулін було досліджено як фактор, котрий викликає активацію генної активності та синтезу РНК; на фоні дії цього фактора досліджували вплив інгібіторів синтезу РНК та білка на показники ВГГ та ЕНЯ. Дослідження проводили in vitro на клітинах букального епітелію. В експериментах з дослідження впливу катехоламінів на стан хроматину в ядрах клітин було показано, що адреналін викликає збільшення ВГГ у ядрах (рис. 3).

Рис. 3. Вплив адреналіну у концентрації 2,28 та 4,55 нМ на вміст гранул гетерохроматину у клітинному ядрі

Таку ж реакцію конденсації хроматину викликає і норадреналін. Під впливом гідрокортизону також спостерігається підвищення ВГГ (рис. 4).

З метою дослідження механізмів морфологічних змін ядер вивчали також вплив перелічених гормональних факторів на ЕНЯ. У випадку дії катехоламінів, (дані про вплив адреналіну наведені на рис. 5) та гідрокортизону (рис. 6) спостерігали зниження ЕНЯ.

Рис. 4 . Вплив гідрокортизону у концентрації 138, 276 та 414 нМ на вміст гранул гетерохроматину у клітинному ядрі

Рис. 5. Вплив адреналіну у концентрації 2,28 та 4,55 нМ на електронегативність ядер (ЕНЯ)

Було досліджено дію на клітини широкого спектра концентрацій адреналіну та норадреналіну, але найбільш ефективно знижують ЕНЯ адреналін у таких концентраціях (2,28 та 4,55 нМ), які спостерігаються у крові людини в умовах фізичного навантаження (Hartley L. H. et al., 1976).

При більш високих концентраціях ефект адреналіну зменшується. Певно, зменшення ефекту гормонів з ростом концентрації вище 4,55 нМ може бути пов’язано з явищем десенсибілізації рецепторів гормонів на поверхні клітин, яке відомо вже давно (Goldstain D., 1995). Унаслідок впливу катехоламінів та гідрокортизону спостерігались процеси зниження ЕНЯ та підвищення ВГГ, які протікають паралельно. За умов впливу адреналіну в концентрації 2,28 нМ та 4,55 нМ коефіцієнт кореляції між ЕНЯ та ВГГ складав, відповідно, r = -0,92 та r = -0,82.

Рис. 6. Вплив гідрокортизону у концентрації 138, 276 та 414 нМ на електронегативність ядер (ЕНЯ, %)

У випадку дії на клітини гідрокортизону, кореляція між ЕНЯ та ВГГ при концентрації гідрокортизону 138, 276 та 414 нМ складала, відповідно, r = -0,75, r = -0,84 та r = -0,94. Таким чином, на даній експериментальній моделі показаний зв’язок процесів конденсації хроматину та зниження ЕНЯ.

Показано вплив біологічно активних речовин на стан хроматину та електрокінетичні властивості ядра (табл. 1). Встановлено, що через 4 год. після початку впливу інсулін (стимулятор синтезу РНК та білка) знижує ступінь конденсованості хроматину та підвищує електронегативність ядер, актиноміцин D (інгібітор синтезу РНК) та циклогексимід (інгібітор синтезу білка) – викликають ефект конденсації хроматину та знижують електронегативність ядер.

Таблиця 1

Вплив інсуліну (0,05 мОд/мл), актиноміцину D (10 мкг/мл) та циклогексиміду (15 мкг/мл) на показники ВГГ та ЕНЯ

Вплив Показник Час впливу

20 хв 4 год 24 год

Контроль ВГГ 18,3±0,4 14,9±0,3 15,3±0,4

ЕНЯ 44,2±1,0 58,6±1,2 45,4±2,1

Інсулін ВГГ 17,9±0,4 13,3±0,3* 12,7±0,3*

ЕНЯ 42,2±1,1 64,5±3,2 52,6±1,0*

Акт. D ВГГ 20,2±0,4* 16,2±0,4* 14,9±0,4

ЕНЯ 43,3±0,8 47,7±1,2* 43,2±1,4

ЦГИ ВГГ 19,3±0,6 16,3±0,4* 15,1±0,4

ЕНЯ 40,8±1,8* 45,5±2,4* 40,9±1,3*

Інсулін + Акт. D ВГГ 20,5±0,4* 16,4±0,3* 14,7±0,4

ЕНЯ 42,2±1,1 47,7±1,9* 45,2±1,1

Інсулін + ЦГИ ВГГ 19,4±0,4 15,9±0,4 15,6±0,4

ЕНЯ 41,4±2,1 46,6±2,2* 43,5±1,3

* - вірогідність відмін від контролю P<0,05

Таким чином, зміни електрокінетичних властивостей ядер та стану хроматину свідчать про зв’язок деконденсації хроматину зі збільшенням ЕНЯ, та навпаки, конденсація хроматину пов’язана зі зниженням ЕНЯ. Актиноміцин D таким же чином, як і циклогексимід, знімав дію інсуліну на показники ВГГ та ЕНЯ. При спільній дії інсуліну та актиноміцину D, а також інсуліну та циклогексиміду спостерігалось підвищення ВГГ та зниження ЕНЯ відносно рівня цих показників у випадку дії інсуліну.

Інсулін викликає значне підвищення показника ЕНЯ за умов інкубації клітин букального епітелію у розчині інсуліну протягом 4 годин (табл. 2). За нашими даними, інсулін великої рогатої худоби в концентрації 2 мОд/мл виявляє менший ефект на показник ЕНЯ, ніж інсулін свині. Одержані результати дають підставу для розробки методів оцінки якості препаратів інсуліну in vitro за реакцією електрокінетичних властивостей ядер клітин людини на інсулін.

Таблиця 2

Вплив інсуліну свині та інсуліну великої рогатої худоби у різних

концентраціях на показник ЕНЯ клітин трьох донорів

Концент-рація інсуліну

МОд/мл Інсулін свині

Інсулін великої рогатої худоби

Донор A Донор B Донор C Донор A Донор B Донор C

0 66,1±0,7 76,4±0,9 34,6±0,9 66,1±0,7 76,4±0,9 34,6 ±0,9

0,2 79,9±0,9* 86,6±0,7* 64,1±1,2 * 77,3±1,0 * 83,1±1,1 * 58,9±1,3 *

0,1 75,2±0,7 * 78,9±0,9 49,9±1,5 * 72,8±0,9 * 77,5±0,6 42,9±1,3 *

0,05 71,9±0,9 * 77,9±0,8 47,7±1,3 * 73,8±1,0 * 77,5±0,7 42,9±1,1 *

0,025 68,9±0,8 * 77,5±0,5 40,1±1,1 * 67,9±0,9 77,1±0,5 38,7±0,9 *

* - вірогідність відмін від контролю P<0,05

ЗМІНА СТАНУ ЯДРА ТА КЛЕТИННИХ МЕМБРАН пІд вПЛИВОм УЛЬТРАФІОЛЕТОВОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ

Наведено результати експериментів з вивчення впливу УФ випромінювання на стан хроматину, електрокінетичні властивості ядер та стан клітинних мембран. Було показано, що УФ випромінювання викликає підвищення показнику ВГГ, тобто, процеси конденсації хроматину (рис.7).

Рис. 7. Вплив ультрафіолетового світла на кількість гранул гетерохроматину у ядрі

УФ радіація у наших експериментах викликала також процеси підвищення проникності клітинних мембран для молекул барвника індигокарміну, та зниження електронегативності ядер (рис. 8).

Рис. 8. Вплив ультрафіолетового світла на забарвлення клітин індигокарміном (ЗКІ,%) та електронегативність ядер (ЕНЯ,%)

Процес підвищення забарвленості клітин індигокарміном (ЗКІ, %) свідчить про пошкодження клітинних мембран при УФ випромінюванні. Коефіцієнти кореляції між ВГГ та ЕНЯ при УФ опромінюванні для клітин чотирьох донорів складали r = -0,98, r = -0,86, r = -0,97 и r = -0,98. Зниження інтенсивності процесів транскрипції під впливом УФ випромінювання – добре знаний факт. Виявлене підвищення ступеня гетерохроматинізації хроматину в ядрах та зниження ЕНЯ може розглядатися як свідчення біосинтетичної активності ядер під впливом ультрафіолетового світла.

Таким чином, на цій моделі також продемонстрований зв’язок між процесами конденсації хроматину та зниженням ЕНЯ в ході зниження функціональної активності ядер.

ЗМІНи СТАНУ ЯДРА При іНкубації клітин В УМОВАХ ГІПЕР- ТА

ГІПОТЕРМІЇ

Наведено результати впливу гіпо- та гіпертермії на стан хроматину та електрокінетичні властивості клітинних ядер букального епітелію людини. Під впливом інкубації клітин за умов теплового шоку спостерігається значне зростання показника ВГГ, що свідчить про конденсації хроматину під впливом температури 40 – 48о (рис. 9). Ступінь конденсованості хроматину зростає з підвищенням температури. У наших експериментах конденсація хроматину спостерігалась не тільки в умовах теплового, але й холодового шоку. При цьому значне підвищення ВГГ спостерігалось у клітинах усіх донорів при температурі +15 о С. У клітинах двох донорів з чотирьох конденсація хроматину відбувалась також при температурі +32о С. Екстремальні температури, як високі, так і низькі, викликали зниження ЕНЯ. Виняток складала температура +40 о С, при якій у клітинах двох донорів має місце достовірне підвищення ЕНЯ (рис. 9).

Рис. 9. Вплив інкубації клітин людини при різних температурах на показники ВГГ (вміст гранул гетеро хроматину) та ЕНЯ (електронегативність ядер) у % від контролю

Виявлений ефект підвищення ЕНЯ внаслідок дії температури +40 о С, може бути інтерпретований як прояв реакції на температурний стрес у “фізіологічних” умовах, з якими клітина може зустрітися у випадку захворювання. При тепловому шоку при цій температурі, на відміну від дії більш високих температур, не спостерігається подальше зниження метаболічної активності клітини (Plehn-Dujowich, 2000).

Таким чином, унаслідок дії екстремальних температур на клітини букального епітелію спостерігаються процеси конденсації хроматину та зниження ЕНЯ. У більшості випадків ці процеси протікають узгоджено, про що свідчать достатньо високі коефіцієнти множинної кореляції (ступінь поліному n = 3) між показниками ВГГ та ЕНЯ, вираженими в % від контролю. Так, для клітин різних донорів цей коефіцієнт складає: r = 0,63; r = 0,76; r = 0,91; r = 0,90.

Зміни ступеня конденсованості хроматину в клітинах букального епітелію людини, які спостерігаються, добре узгоджуються з даними про зниження загального рівня функціональної активності ядер внаслідок дії високої температури (Lengyel, 1975). Відомо, що процес конденсації хроматину супроводжується зниженням його електричного заряду (Leake e. a., 1972), а це, у свою чергу, проявляється в зниженні показника ЕНЯ. Необхідно відзначити, що в окремих випадках процес конденсації хроматину супроводжується не зниженням, а підвищенням ЕНЯ. Така реакція має місце у випадку дії температури +40 о С. Можливо, що в цьому випадку напрямок зміни ЕНЯ пов’язаний не зі зміною стану хроматину, а з процесами, які ідуть в цитоплазмі, зокрема, зі змінами міцності фіксації ядра в клітині структурами цитоскелету та вмісту води у цитоплазмі.

ЗМІНА СТАНУ ЯДРА ТА КЛІТИННИХ МЕМБРАН ПІД ВПЛИВОМ МІКРОХВИЛЬОВОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ

Електромагнітні випромінювання можуть безпосередньо впливати на заряджені структури клітини, зокрема на хроматин та мембрани. Можливий прямий вплив електромагнітних випромінювань на ядерні структури. Крім того, електромагнітне випромінювання, з одного боку, становить потенціальну небезпеку для здоров’я людини, а з другого боку, застосовується в медичній практиці, що обумовлює практичне значення дослідження біологічних ефектів електромагнітного випромінювання. У роботі вперше отримані дані про зміну ступеня компактизації хроматину, електрокінетичних властивостей ядер та проникності мембран клітин під впливом мікрохвильового випромінювання. Показано, що усі види мікрохвильового випромінювання, викликають в ядрах клітин людини підвищення ступеня конденсації хроматину, зміну ЕНЯ, підвищення забарвлення клітин індигокарміном (ЗКІ) (рис. 10-12).

Рис. 10. Вплив мікрохвильового опромінювання (л=8 мм) на показник вмісту гранул гетерохроматину у клітинах двох донорів

Дані цього експерименту свідчать про збільшення ступеня конденсованості хроматину у ядрах у випадку дії мікрохвильового випромінювання, ефект випромінювання зростає зі збільшенням експозиції.

З наведених на Рис. 11даних видно, що зміни ЕНЯ внаслідок дії мікрохвильового випромінювання можуть носити різноспрямований характер, залежно від рівня ЕНЯ в контролі. У клітинах донорів з високим початковим рівнем ЕНЯ спостерігалося зниження показника під впливом мікрохвильового випромінювання, в клітинах донорів із низьким початковим рівнем ЕНЯ спостерігалось підвищення цього показника.

Рис. 11. Вплив мікрохвильового опромінювання (л = 8 мм) на показник електронегативності ядер (ЕНЯ,%) у клітинах двох донорів

Рис. 12. Вплив мікрохвильового опромінювання (л = 8 мм) на показник забарвленості клітин індигокарміном (ЗКІ,%) у клітинах двох донорів.

Підвищення показника ЗКІ, тобто забарвленості клітин індигокарміном, свідчить про підвищення проникності мембран під впливом мікрохвильового випромінювання , яке спостерігалось у клітинах усіх донорів. Зміни проникності мембран спостерігались при експозиції 5-15 секунд, тобто при менших експозиціях, ніж зміни ЕНЯ (15-60 секунд). Подібні зміни можуть свідчити про пошкодження мембран клітин.

Таким чином, зміни ЕНЯ, які були викликані випромінюванням, (підвищення або зниження ЕНЯ) не можуть бути обумовлені зміною мембранної проникності. По-перше, зміни ЕНЯ носять різноспрямований характер, а зміна показника ЗКІ – односпрямований. По-друге, оскільки молекула індигокарміну має більшу молекулярну масу (422 д. ), підвищення забарвленості клітин індигокарміном повинно супроводжуватися і підвищенням проникності мембран для більш дрібних молекул та неорганічних іонів. Згідно із відомими фізико-хімічними закономірностями, підвищення провідності клітинних мембран повинно було б привести до збільшення електрофоретичної рухомості ядер.

Не було виявлено значної різниці у реакції ВГГ, проникності мембран клітин та ЕНЯ на випромінювання різної довжини хвилі (7,1, 8 и 16 мм).

Ми вважаємо, що збільшення ступеня конденсованості хроматину під впливом мікрохвильового випромінювання є проявленням неспецифічної реакції клітини на випромінювання. Як відомо, конденсація хроматину супроводжує процеси зниження його біосинтетичної активності, саме тому спостережений ефект конденсації хроматину, певно, свідчить про зниження активності синтезу РНК.

ЗМІНА СТАНУ ЯДРА ТА КЛІТИННИХ МЕМБРАН ПІД ВПЛИВОМ

ВИПРОМІНЮВАННЯ ГЕЛІЙ-НЕОНОВОГО ЛАЗЕРА

Досліджували вплив на клітину світла гелій-неонового лазера як фактора, який викликає зміни стану клітинного ядра. Даний фактор у цей час все ширше застосовується в медицині і в зв’язку з цим дослідження біологічних ефектів лазерного світла, крім теоретичного, має і практичне значення. При дослідженні впливу лазерного світла на клітини донорів різного віку спостерігали зростання ВГГ та зниження ЕНЯ після опромінювання. У експерименті, результати якого представлені на рис. 13, зростання ВГГ спостерігалось при експозиції 150 та 300 с, а зниження ЕНЯ вже при мінімальній експозиції 1 с. Одержаний результат конденсації хроматину під впливом лазерного світла є новим, оскільки раніше були описані ефекти деконденсації та активації хроматину внаслідок дії лазерного світла.

Відомо, що процес конденсації хроматину супроводжує зниження його функціональної активності. Це дозволяє припустити, що і в випадку дії лазерного світла на клітини букального епітелію спостерігається зниження функціональної активності ядер. На користь такого висновку свідчить і знайдене зниження ЕНЯ в клітинах внаслідок дії лазерного випромінювання, оскільки зниження негативного заряду ядер також є свідоцтвом їх інактивації.

Рис 13. Вплив опромінювання клітин світлом гелій-неонового лазера на вміст гранул гетерохроматину (ВГГ) та електронегативність ядер (ЕНЯ %)

Під впливом лазерного випромінювання у деяких дозах спостерігали зниження проникності мембран.

ЗМІНА СТАНУ ЯДРА ТА КЛІТИННИХ МЕМБРАН ПІД ВПЛИВОМ

ЕЛЕКТРИЧНОГО ПОЛЯ

Наведено результати вивчення впливу електричних полів низької частоти (50 Гц) різної напруженості на ступінь конденсованості хроматину, електрокінетичні властивості ядер та проникність клітинних мембран. На рис. 14 наведені дані про зміни показників електронегативності ядер (ЕНЯ %), кількості клітин, які мають гранули коломембранного гетерохроматину (КГК, %) та забарвленості клітин індигокарміном (ЗКІ, %) під впливом електричних полів. Одержані результати свідчать про те, що під впливом поля електронегативність ядер підвищується, а ступінь конденсованості хроматину знижується. Коефіцієнт кореляції між ВПГ та ЕНЯ складав для клітин різних донорів: r = -0,93, r = -0,94, r = -0,63, r = -0,77. Отримані результати вказують на те, що в процесі деконденсації хроматину під впливом електричного поля підвищення заряду хроматину відіграє важливу роль.

Рис. 14. Вплив електричного поля на показники електронегативності ядер (ЕНЯ, %), кількості клітин, які мають гранули коломембранного гетерохроматину (КГК%) та забарвленості клітин індигокарміном (ЗКІ, %)

ЗМІНИ СТАНУ ЯДРА ТА МЕМБРАН КЛІТИН букального епітелію ПІД ВПЛИВОМ НА ОРГАНІЗМ ЛЮДИНИ ФІЗИЧНИХ НАВАНТАЖЕНЬ ТА ПРИ СТАРІННІ

Наведено результати дії впливу фізичних навантажень на організм людини, котрі впливають на стан хроматину і заряд клітинних ядер, а також про вікові зміни стану хроматину.

Як фізичне навантаження використовували тренувальні походи, у яких брали участь особи чоловічої статі у віці від 18 до 48 років. Тривалість походів становила 8-10 год. На одному етапі тренувального походу енерговитрати становили близько 1 МДж. Результати, які були отримані у одному з тренувальних походів, наведені на рис. 15. У даному випадку досліджували клітини донора у віці 18 років. У всіх обстежуваних фізичне навантаження викликає підвищення показника ВГГ (особливо на останніх етапах походу), що свідчить про підвищення ступеня конденсації хроматину. Ступінь підвищення рівня конденсованості хроматину залежить від навантаження та рівня спортивної підготовки обстежуваних. У краще тренованих людей підвищення ступеня конденсованості хроматину відбувається при більшому навантаженні, та у меншій мірі, ніж у не дуже добре тренованих людей. Відпочинок протягом 9 год. не завжди приводить до відновлення контрольного рівня ВГГ, але після тривалого відпочинку (48 год. ) ВГГ у більшості випадків знижується.

Рис. 15. Зміни показника вмісту гранул гетерохроматину на різних етапах тренувального походу

Можливо, що ефект конденсації хроматину після фізичного навантаження пов’язаний із дією на клітини стресових гормонів. Одержані результати добре узгоджуються з даними, викладеними в розділі 3, в якому показано, що конденсація хроматину в ядрах клітин букального епітелію спостерігається у випадку дії на клітини in vitro гормонів стресу – адреналіну, норадреналіну, гідрокортизону.

Показано, що різні види фізичного навантаження викликають зниження ЕНЯ. Наприклад, після інтенсивного фізичного навантаження (20 віджимань від підлоги на руках за 40 секунд) відбувається різке зниження показника ЕНЯ. Так, якщо в контролі ЕНЯ складає, у середньому, 40,7±4,6%, то після фізичного навантаження - 23,2±4,4%.

У групах студентів, які виконували спортивні вправи (біг підтюпцем), до фізичного навантаження систолічний артеріальний тиск (АТС) корелює з показником електронегативності ядер тільки в групі людей зі зниженим АТС. Після фізичного навантаження показник ЕНЯ знижується у всіх обстежених групах. У групах недостатньо тренованих людей у цьому випадку спостерігається негативна кореляція між ЕНЯ та АТС, у групі добре тренованих людей (важка атлетика) така кореляція відсутня. У групі зі зниженим АТС виявлена достовірна негативна кореляція між ЕНЯ і частотою пульсу.

Значні зміни ЕНЯ спостерігали у групі студентів Харківського інституту Військово-повітряних сил України (середній вік - 20 років) після тренування в умовах зниженого атмосферного тиску. Величина ЕНЯ в контролі значно варіює у різних донорів, складаючи, у середньому, 61,5+3,7 %. Через 10 хв. після досягнення мінімального тиску в барокамері в більшості обстежуваних спостерігали зниження ЕНЯ, що привело до зниження середнього показника ЕНЯ в групі до 54,5+4,7 %. Виключення з цього правила рідкі, у 7 донорів з 27 спостерігали підвищення ЕНЯ в момент тренування. Через 2 хвилини після закінчення тренування в барокамері показник ЕНЯ в середньому в групі ще трохи знижувався (до 51,1+5,3 %). Це зниження ЕНЯ в цілому в групі обстежуваних відбувається за рахунок значного зниження ЕНЯ у 16 чоловік, хоча у 10 чоловік у цей період спостерігається підвищення ЕНЯ. Тренування в барокамері сполучені зі значним емоційним навантаженням, про що свідчить і зростання частоти серцевих скорочень від 71,1+б,9 уд./хв.. у контролі до 99,3+2,6