імені В.Н. КАРАЗІНА

ТИХОМИРОВ Артем олександрович

УДК 576.311.348.4:546.62:616-001.28

ХАРАКТЕРИСТИКА БІЛКА ГЛІАЛЬНИХ ПРОМІЖНИХ ФІЛАМЕНТІВ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУРІВ ЗА УМОВ ВПЛИВУ ІОНІВ АЛЮМІНІЮ ТА ІОНІЗУЮЧОГО ОПРОМІНЕННЯ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Дніпропетровському національному університеті Міністерства освіти і науки України (м. Дніпропетровськ).

Науковий керівник – кандидат біологічних наук, доцент

НЕДЗВЕЦЬКИЙ Віктор Станіславович,

Дніпропетровський національний університет,

доцент кафедри біофізики та біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ШЕВЦОВА Алла Іванівна,

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України,

професор кафедри біохімії та загальної хімії,

м. Дніпропетровськ;

кандидат біологічних наук, доцент

ШЕЙКО Віталій Ілліч,

Луганський національний педагогічний університет ім. Тараса Шевченка,

доцент кафедри анатомії та фізіології людини та тварин,

м. Луганськ

Провідна установа – Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (відділ біохімії сенсорних та регуляторних систем), м. Київ

Захист відбудеться “ 21 ” вересня 2005 р. о 14:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий “ 5 ” липня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гліальний фібрилярний кислий білок (ГФКБ) – гістоспецифічний компонент проміжних філаментів (ПФ) цитоскелету астроцитів [Eng L., Ghirnikar R., 2000]. ГФКБ у складі ПФ відіграє важливу роль у модуляції руху астроцитів та забезпеченні стабільної морфології їх відростків при розвитку реактивного астроцитозу [Lepekhin E., 2001]. Більшість робіт, присвячених вивченню білка, стосуються його філаментної форми, тоді як характер змін співвідношення фібрилізованого та розчинного пулів ГФКБ, їх поліпептидна гетерогенність залишаються не з’ясованими. Пошкодження фізичної природи, хімічні та метаболічні інсульти призводять до розвитку реактивного астроцитозу, основними ознаками якого є підсилення синтезу ГФКБ та фібрилогенез у гіпертрофованих астроцитах [Graham D.,1999]. Запропоновано використання ГФКБ в якості молекулярного індексу нейротоксичності та маркеру пошкодження нервової тканини [O’Callaghan J., 1995]. З точки зору маркерної концепції вважається, що відповідь астроцитів на дію стрес-факторів є неспецифічною, а інтенсивність біосинтезу ГФКБ залежить від дози та тривалості впливу чинників, а не від їх природи. У зв’язку з цим актуальним постає питання порівняльної характеристики впливу несприятливих факторів різного походження, а також їх сумісної дії, на метаболізм двох форм ГФКБ. У попередніх роботах співробітників кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету [Недзвецький В.С. и др., 1990, 1991] детально досліджено ефекти іонізуючого опромінення на метаболізм нейроспецифічних білків та їх роль у розвитку пострадіаційного ЦНС-синдрому. Проблема впливу малих доз радіації залишається дуже гострою у зв’язку з підвищеним фоном у багатьох регіонах країни. Токсикологічні ефекти алюмінію (Al), найбільш поширеного металу біосфери, широко досліджуються з оглядом на його залучення до етіології різних нейродегенеративних розладів, зокрема, хвороби Альцгеймера [Grant W. et al., 2002]. Хронічні несприятливі впливи, яких зазнає організм людини в умовах техногенного пресингу, зумовлює необхідність пошуку адекватних показників ступеня пошкодження нервової тканини та ефективності дії препаратів-нейропротекторів при їх тестуванні. Комплексний підхід, який полягає в аналізі вмісту і поліпептидного складу ГФКБ за допомогою імунохімічних методів, може значно розширити межі прикладного застосування білка ПФ астроцитів. Отже, дослідження поліпептидної гетерогенності двох форм ГФКБ і специфіки їх кількісних змін за умов впливу іонів Al та іонізуючого опромінення є актуальним та науково обгрунтованим.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках договору про науково-технічне співробітництво між кафедрою біофізики та біохімії Дніпропетровського державного університету та кафедрою нормальної фізіології Дніпропетровської державної медичної академії (№ 1145, 2000-2001 р.р.). Дисертація відповідає основному плану теми “Дослідження механізмів порушень метаболізму з метою діагностики і корекції” (№ 4-075-04) науково-дослідних робіт кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи був аналіз поліпептидного складу і вмісту філаментної та розчинної форм ГФКБ головного мозку щурів за умов впливу іонів Al, іонізуючої радіації та засобів корекції патологічного стану ЦНС. Для досягнення поставленої мети були поставлені наступні задачі:

1. Провести імунохімічне визначення поліпептидного складу та вмісту ГФКБ у різних відділах головного мозку щурів за умов ізольованого впливу Al3+ і рентгенівського опромінення у низьких дозах.

2. Дослідити склад та кількісний вміст білка ПФ астроцитів під час сумісної дії означених чинників.

3. Охарактеризувати поліпептидний склад та провести кількісне визначення ГФКБ при превентивному введенні пірацетаму за умов опромінення.

4. Дослідити вплив вітаміну Е на поліпептидний склад та вміст білка ПФ астроцитів головного мозку щурів, інтоксикованих Al3+.

5. Оцінити токсичні ефекти Al3+ на ЦНС щурів за наступними критеріями: накопичення металу в тканині мозку, рівень пероксидації ліпідів у нервовій тканині, поведінкові реакції щурів.

Об’єкт дослідження – участь білка ПФ цитоскелету астроцитів у гліальній відповіді на пошкодження нервової тканини екзогенними чинниками.

Предмет дослідження – поліпептидний склад і вміст ГФКБ за умов впливу іонів Al, іонізуючого випромінювання і застосування фармакологічних засобів корекції патологічного стану ЦНС (пірацетам, вітамін Е).

Методи дослідження. У роботі використані такі методи: фотоколориметричні методи визначення вмісту білка (метод Лоурі, метод Бредфорд) та вмісту тіобарбітурат-активних сполук, електрофорез у градієнтному поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію (ДСН), іон-обмінна та адсорбційна хроматографії; імунологічні методи: продукція моноспецифічної антисироватки, різні види імуноелектрофорезу, імуноблотинг, імуногістохімія; метод визначення вмісту Al (атомно-абсорбційна спектрофотометрія); метод оцінки емоційно-поведінкового статусу щурів (тест “відкритого поля”).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено особливості впливу іонів Al та іонізуючого випромінювання на склад та вміст поліпептидів різних форм ГФКБ. Експериментально доведено, що філаментна форма ГФКБ більш чутлива до впливу Al3+, а розчинна форма зазнає істотних змін за умов опромінення у низьких дозах. Показані вперше відмінності поліпептидного складу полімерізованого і розчинного ГФКБ за умов впливу чинників різної природи свідчать про наявність функціональної гетерогенності двох різних пулів білка. Вперше показано, що астрогліальна відповідь на розвиток гіпералюмінійемії, крім збільшення вмісту ГФКБ та фібрилогенезу, супроводжується активною реконструкцією мережі ПФ цитоскелету астроцитів, стабільної за нормальних фізіологічних умов. Новими є дані щодо запобігання деградації білка ПФ, надмірного фібрилогенезу й активації астроцитозу пірацетамом під час радіаційного опромінення та вітаміном Е – за умов алюмінієвої інтоксикації. Встановлено існування прямого зв’язку між розвитком астрогліальної відповіді, інтенсифікацією Fe- та NADPH-залежних типів пероксидації ліпідів у тканині головного мозку та порушенням емоційно-поведінкових реакцій тварин при інтоксикації іонами Al.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати роботи дозволяють переглянути закріплені у літературі за ПФ цитоскелету астроцитів функції пасивного механічного інтегратору внутрішньоклітинного простору. Комплексний підхід з використанням імунохімічних методів значно розширює межі прикладного застосування ГФКБ як маркера патологічного стану ЦНС. Запропоновано аналіз не лише вмісту білка, але й поліпептидного складу його різних форм, у кліниці для скринінгу і тестування нових нейропротекторних препаратів. Зміни вмісту та поліпептидного складу білка ПФ астроцитів можна використовувати в якості чутливих і адекватних індикаторів ступеня нейротоксичності екзогенних полютантів у зрілій ЦНС. На цей час результати досліджень використовуються при викладанні спеціального курсу “Нейрохімія” на кафедрі біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету.

Особистий внесок здобувача. Розробка програми, основної робочої гіпотези наукової проблеми та задач дослідження виконана автором сумісно з науковим керівником – кандидатом біологічних наук, доцентом кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету Недзвецьким В.С. Дисертантом самостійно було виконано аналіз наукової літератури, планування та проведення експериментальних досліджень, статистичну обробку даних, узагальнення одержаних результатів. Дисертант безпосередньо приймав участь у виконанні усіх завдань роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були подані та особисто представлені на наукових семінарах кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ, 2000-2004), а також на II Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001), ІІ конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), VI Пущинській школі-конференції молодих вчених (Пущино, 2002), XVI з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002), IV регіональній конференції молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Біохімія” (Дніпропетровськ, 2003), V регіональній конференції молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2003), VIII Пущинській школі-конференції молодих вчених (Пущино, 2004), VI міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2004), науково-практичній конференції, присвяченої 175-річчю з дня народження І.М. Сеченова (Одеса, 2004); IASN 2004, Crimea – IBRO Advanced School Of Neuroscience (Ялта, 2004).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковано у 4 статтях в наукових фахових виданнях, які включені в перелік, затверджений ВАК України, а також в 11 тезах доповідей у збірках наукових симпозіумів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 164 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури (1 розділ), описів матеріалів та методів досліджень (1 розділ), результатів досліджень та їх обговорення (3 розділи), узагальнення результатів досліджень (1 розділ), висновків та списку використаних джерел. Робота містить 32 рисунка і 11 таблиць. Перелік цитованої літератури включає 354 джерела.

Основний зміст робоТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з трьох підрозділів, у яких розглянуто розвиток уявлень про структуру і функції білків ПФ цитоскелету клітин нервової тканини. Викладено сучасний погляд на доцільність використання ГФКБ в якості молекулярного маркеру патологій ЦНС. Висвітлено основні аспекти нейротоксичності іонів Al.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження були проведені на дорослих (8–12 місяців) щурах лінії Wistar. Для вивчення сумісного впливу радіації у малих дозах та іонів Al тварин тотально піддавали дії рентгенівського випромінювання у сумарній дозі 12,9 мКл/кг, яку щури набирали фракціоновано протягом 7, 14 і 21 дня; щури експериментальної групи, що опромінювалися протягом 21 дня, отримували 0,2%-ий розчин AlCl3 в якості питної води. Для дослідження ефекту пірацетаму на стан білка ПФ астроцитів тваринам, що опромінювалися протягом різних термінів, вводили інтраперітонеально пірацетам у дозі 0,2 г/кг за годину перед кожним сеансом. Для дослідження впливу вітаміну Е на білок астрогліальних ПФ за умов інтоксикації Al3+ щурам, що отримували 0,2%-ий розчин AlCl3 в якості питної води протягом 90 днів, внутрішньочеревно вводили токоферолу ацетат у дозі 10 мг/кг.

Розчинну форму ГФКБ одержували шляхом гомогенізації тканини головного мозку щурів у 50 мМ трис-HCl буфері (рН 7,4), який містив 2 мМ ЕДТО, 1 мМ 2-меркаптоетанолу, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфториду та 5 мМ соєвого інгібітору трипсину, і центрифугування при 30000 об./хв. Для екстрагування водонерозчинної фібрилізованої форми ГФКБ використовували той самий буфер, що додатково містив 4 М сечовини. Вміст загального білка у всіх пробах визначали за методом Лоурі з модифікаціями [Miller G., 1959] та методом Бредфорд [Bradford M., 1976].

У залежності від задач експерименту використовували дві основні методики очистки білка ПФ астроцитів: 1. Розчинну форму ГФКБ одержували шляхом центрифугування гомогенату тканини мозку в гіпотонічному буфері з наступним осадженням при рН 4,7 і ресуспендуванням у Na-фосфатному буфері (рН 8,0). З одержаною фракцією проводили хроматографію на гідроксилапатиті та НТР-біогелі. Ступінь очистки – 58,6. 2. Виділення і очистку філаментного ГФКБ проводили методом флотації аксонів [Vorgias C., 1983] і за допомогою хроматографії на СМ-сефарозі CL-6B та DEAE-целюлозі. Ступінь очистки – 42,4.

Розчинні і фібрилізовані поліпептиди ГФКБ виділяли методом препаративного гель-електрофорезу у пластині ПААГ з градієнтом 7,5–17% з наступною електроелюцією, використовуючи далі в якості антигенів при імунізації кролів для одержання моноспецифічних антисироваток проти ГФКБ [Karlson J.-E., 1989; Недзвецкий В.С., 1990]. Усі одержані антисироватки тестували на специфічність за допомогою перехресного електрофорезу та імуноблотингу.

Фракціонування білкових екстрактів головного мозку щурів проводили методом електрофорезу у градієнті ПААГ 7–18% у присутності ДСН [Laemmli U., 1970], поліпептидний склад обох пулів ГФКБ визначали за допомогою імуноблотингу з використанням моноспецифічних антисироваток [Towbin H., 1988]. З метою ідентифікації ГФКБ-імунореактивних ділянок in situ на зрізах різних структур головного мозку в роботі використовували імуногістохімічний метод [Gentilini M., 1975]. Кількісно ГФКБ визначали ракетним імуноелектрофорезом та імуноблотингом з використанням програми “LabWork_4.0” (UVP, Велика Британія, 2001) [Struzynska L. et al., 2001; Baydas G. et al., 2003]. Вміст ГФКБ виражали в умовних одиницях, які розраховували шляхом віднесення величини відносної густини відповідної поліпептидної зони після проведення імуноблотингу (%) до вмісту білка у пробі (мкг). Відносну кількість ГФКБ, що визначався ракетним імуноелектрофорезом, виражали в умовних одиницях, які дорівнюють площам (мм2) відповідних імунопреципітатів, у розрахунку на 1 мкг білка розчинної або філаментної фракцій.

Рівень пероксидації ліпідів у тканині мозку експериментальних та контрольних щурів визначали за вмістом кінцевих продуктів ПОЛ (ТБК-активних сполук) [Ohkawa H. et al., 1979; Чевари С. и др., 1991]. Визначення вмісту Al у головному мозку щурів виконували з використанням атомно-абсорбційної спектрофотометрії [Хавезов И., Цалев Д., 1983]. Тестування емоційно-поведінкових реакцій тварин проводили за методикою “відкритого поля” [Буреш Я. и др., 1991].

Результати досліджень обробляли з використанням параметричних і непараметричних статистичних критеріїв для малих виборок: t-критерію Ст’юдента і U-критерію Уілкоксона-Манна-Уітні [Кокунин В.А., 1975; Лакин Г.Ф., 1990]. Розрахунки проводились за допомогою IBM-сумісного комп’ютера з використанням програм “Statistica 6.0” та “Excel 2000” [Лапач С.Н. и др., 2000]. Зміни показників вважали достовірними при P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Контроль нейротоксичності AlCl3. На сьогоднішній день порушення біохімічних процесів та патофізіологічні явища, що виникають у ЦНС тварин внаслідок опромінення малими дозами, є добре дослідженими, а експериментальні моделі детально охарактеризовані та є загальноприйнятими [Белов А.Д., Киршин В.А., 1981]. Натомість нейротоксикологія Al, дозозалежні ефекти та критерії, за якими можна оцінювати ступінь пошкодження нервової тканини, чітко не визначені та не розроблені. Виникає проблема пошуку показників, що є надійними індикаторами метаболічних порушень у ЦНС, для перевірки адекватності моделі алюмінієвої інтоксикації. У представленій роботі було обрано три підходи для оцінки патологічного стану ЦНС, який розвивається у щурів внаслідок споживання розчину AlCl3 з питною водою: 1) визначення вмісту Аl у тканині різних структур головного мозку; 2) визначення маркерів ПОЛ (вибір цього показника ґрунтується на даних про індукцію іонами Al оксидативного стресу в нервовій тканині [Pratico D., 2002], з цього приводу визначення вмісту показників пероксидації ліпідів проводили у щурів експериментальної моделі, у якій досліджувався ефект антиоксиданту вітаміну Е за умов дії Al3+); 3) оцінка поведінкових реакцій за умов експериментальної гіпералюмінійемії – важливий критерій функціональних змін у ЦНС.

1) Вміст Al. Результати, отримані методом ААС (табл. 1), свідчать про відсутність статистично достовірного збільшення рівня Al у тканині кори великих півкуль і середнього мозку експериментальних тварин порівняно з контролем. Натомість, слід зазначити суттєве збільшення вмісту елементу у мозочку та гіпокампі.

Таблиця 1

Вміст Al (мг/г сирої ваги тканини) у різних

відділах головного мозку контрольних щурів

та щурів, які одержували AlCl3

(n= 7–8, * – P<0,05, ** – P<0,01)

Відділ мозку | Контроль | AlCl3

кора великих півкуль | 0,403 ± 0,160 | 0,368 ± 0,085

середній мозок | 0,250 ± 0,068 | 0,435 ± 0,095

мозочок | 0,329 ± 0,055 | 0,527 ± 0,035**

гіпокамп | 0,532 ± 0,028 | 0,728 ± 0,065*

Можливо, що Al індукує різні молекулярні події, які призводять до розвитку нейропатій, причому його накопичення у тканині мозку не є необхідною ланкою цих процесів. Природні ліганди мають виконувати роль буферних систем для захисту чутливих до дії Al органів. Тому частка загального Al мозку, що представлена розчинною, біоактивною формою (Al3+), ймовірно, є невеликою. Таким чином, зміни рівня цього мінорного пулу можуть й не бути виявленими, проте саме він володіє значними метаболічними ефектами.

2) Визначення вмісту маркерів ПОЛ (ТБК-активних сполук). Результати визначення кінцевих продуктів ПОЛ, головним з яких є малоновий діальдегід (МДА), у гомогенатах головного мозку експериментальних і контрольних щурів представлені на рис. 1.

Рис. 1. Вміст ТБК-активних сполук (нМ/мг білка) у гомогенатах мозку щурів: 1 – щури контрольної групи; 2 – щури, яким вводили вітамін Е; 3 – щури, які отримували розчин AlCl3; 4 – щури, які отримували AlCl3 і вітамін Е ( * – різниця по відношенню до контролю при Р<0,05; U-тест Уілкоксона-Манна-Уітні).

Слід відзначити, що тривалий вплив Al3+ не викликав достовірних змін вмісту ТБК-активних сполук у випадку вільної пероксидації. Натомість рівень ПОЛ збільшився на 12% у гомогенатах мозку, інкубованих з Fe2+ і аскорбатом, та на 150% після преінкубації з NADPH. Введення інтоксикованим AlCl3 щурам вітаміну Е сприяло зниженню вмісту МДА у 2,31 рази у випадку Fe-аскорбат-індукованого ПОЛ та у 3 рази – NADPH-залежного.

3) Оцінка емоційно-поведінкових реакцій у тесті “відкрите поле”. Тестування поведінки контрольних та інтоксикованих щурів, а також експериментальних тварин за умов антиоксидантної терапії, у “відкритому полі” показали, що надходження AlCl3 з питною водою протягом 90 днів відбивається на локомоторній діяльності. Про стимуляцію рухової активності свідчить достовірне у порівнянні з контролем збільшення кількості перетнутих ліній та відвіданих периферичних квадратів (рис. 2). При цьому дослідницька активність (норковий рефлекс) інтоксикованих AlCl3 щурів недостовірно знижалася (P>0,2). Таким чином, хронічна дія Al3+ впливає на локомоторну діяльність і емоційний стан тварин. Стан збудження, викликаний токсикантом, істотно обертався вітаміном Е та досягав контрольного рівня у щурів, які одержували вітамін Е при надходженні токсиканту.

Рис. 2. Показники емоційно-поведінкових реакції щурів у тесті “відкрите поле”: 1 – щури контрольної групи; 2 – щури, яким вводили вітамін Е; 3 – щури, які отримували розчин AlCl3; 4 – щури, які отримували AlCl3 і вітамін Е ( * – різниця по відношенню до контролю при Р<0,05; ^ – різниця по відношенню до групи AlCl3 при Р<0,05).

Таким чином, накопичення Al у тканині окремих структур головного мозку щурів, розвиток прооксидативного статусу та порушення поведінкової діяльності інтоксикованих тварин свідчать про індукцію іонами Al патологічного стану ЦНС. Отже, доведено, що створені моделі експериментальної гіпералюмінійемії є адекватними та такими, що відбивають найбільш важливі аспекти алюмінієвої нейротоксичності.

Вміст і поліпептидний склад ГФКБ при дії AlCl3 та іонізуючого випромінювання. Підвищене надходження AlCl3 і вплив радіації призвели до збільшення вмісту ГФКБ у всіх обстежених структурах головного мозку щурів. Дані кількісного визначення ГФКБ у різних відділах мозку за умов впливу AlCl3, ізольованого рентгенівського випромінювання і сумісної дії двох несприятливих чинників представлені у табл. 2. Іони Al більш істотно впливають на вміст філаментної форми ГФКБ (у дослідних тварин збільшення її рівня сягає 37% у мозочку, 30% – гіпокампі, 29% – середньому мозку, 28% – корі великих півкуль у порівнянні з контролем). Розрахунок та аналіз показників кореляції (r±mr) свідчить про зв’язок між накопиченням Al у тканині мозку піддослідних щурів зі зростанням вмісту фібрилізованих поліпептидів ГФКБ (кора великих півкуль 0,55±0,22, P<0,05; мозочок 0,80±0,16, P<0,01; середній мозок 0,42±0,24; P> 0,05; гіпокамп 0,84±0,14, P< 0,01).

Таблиця 2

Вміст розчинної і філаментної форм ГФКБ (умовні одиниці) у різних відділах головного мозку контрольних щурів, а також щурів, підданих дії радіації та AlCl3 протягом 21 дня (n=7-8, * – P<0,05, ** – P<0,01 – достовірність різниці відносно контролю, ^ – P<0,05 – достовірність різниці відносно групи щурів, опромінених протягом 21 дня;)

Відділ мозку | Форма ГФКБ |

Контроль |

AlCl3 | Опромінення

21 день | Опромінення

21 день + AlCl3

кора великих півкуль | розч. | 4,56±0,21 | 4,97±0,83 | 5,24±0,94 | 5,38±1,23

філ. | 62,32±3,42 | 79,77±3,98** | 80,39±4,03** | 94,10±2,67^

середній мозок | розч. | 20,83±2,68 | 30,61±4,45 | 32,17±2,75* | 29,03±2,67

філ. | 71,38±6,35 | 92,0±4,28* | 85,98±3,18 | 105,00±6,83

мозочок | розч. | 18,59±1,35 | 19,89±3,22 | 24,54±1,71* | 23,42±5,30

філ. | 90,37±7,33 | 123,81±3,05** | 106,64±5,65 | 132,84±1,36^

гіпокамп | розч. | 9,38±0,28 | 11,07±0,59* | 11,91±4,57 | 12,38±3,61

філ. | 84,19±2,76 | 109,45±9,51* | 103,55±1,46** | 134,7±0,88^

Примітки: розч. – розчинна форма ГФКБ; філ. – філаментна форма ГФКБ.

Вплив AlCl3 на фоні опромінення протягом 21 дня викликав збільшення співвідношення [вміст філаментних / вміст розчинних поліпептидів ГФКБ] у порівнянні з групою щурів, які підпадали дії лише радіації. Цей феномен не можливо пояснити лише деградацією розчинних поліпептидів ГФКБ. Ймовірно, що зростання співвідношення двох форм ГФКБ у бік філаментного пулу відбувається головним чином завдяки формуванню скупчень гліальних філаментів та інгібуванню протеолітичної деградації їх білка у інтоксикованих Al3+ астроцитах [Yokel R., 2000]. Cумісний вплив рентгенівського випромінювання у малих дозах і AlCl3 протягом 21 дня носить синергічний характер, що виявляється у збільшенні концентрації філаментної форми ГФКБ у мозку щурів у порівняні з ізольованим впливом цих чинників. Ці дані можуть свідчити про підсилення астроцитозу, гіпертрофії та (або) проліферації астроцитів внаслідок сумісної дії означених факторів.

Трактовка одержаних результатів значно полегшується, якщо враховувати дані аналізу поліпептидного складу розчинної та філаментної форм ГФКБ у мозку тварин, одержані методом імуноблотингу (рис. 3). За умов інтоксикації AlCl3 показано збільшення інтенсивності поліпептидної зони, яка відповідає інтактній субодиниці ГФКБ з Мm 49 кДа, у фракціях білків, солюбілізованих сечовиною. Крім того, надмірне надходження Al до організму щурів сприяло зростанню кількості та вмісту більш низькомолекулярних, деградованих поліпептидів ГФКБ з Mm у діапазоні ~ 46–37 кДа. Натомість, у розчинних фракціях не спостерігалося істотного збільшення інтенсивності зони головної субодиниці 49 кДа, однак, також зафіксовано появу пулу імунореактивних продуктів його деградації, але у більш обмеженому діапазоні Мm – до 42 кДа.

Рис. 3. Імуноблотинг сечовинних (А) і розчинних (Б) фракцій відділів головного мозку контрольних (к) та експериментальних (Al) щурів.

Зміни поліпептидного складу розчинної форми ГФКБ у порівнянні з філаментною є найбільш вираженими у випадку ізольованої дії випромінювання (рис. 4). Поява деградованих поліпептидів була характерною для всіх режимів опромінення, її пов’язують з дією Са2+-залежних протеїназ-кальпаїнів [Недзвецкий В.С. и др., 1991]. Проте при одночаснії дії радіації та Al3+ для філаментної форми ГФКБ було притаманне деяке зниження кількості деградованих поліпептидів. Це можна пояснити інгібуванням іонами Al кальпаїнів, що призводить до зниження рівня лімітованої протеолітичної деградації білка гліальних філаментів [Nixon R.A. et al., 1990].

Рис. 4. Імуноблотинг сечовинних (А) і розчинних (Б) фракцій гіпокампу контрольних та експериментальних щурів: 1 – контроль; 2 – опромінення 7 днів; 3 – опромінення 14 днів; 4 – опромінення 21 день; 5 – опромінення 21 день + AlCl3.

З представлених результатів очевидно, що низькомолекулярні поліпептиди характерні як для розчинної, так і для філаментної форм ГФКБ. Отже, розчинність і ступінь деградації, яка визначається за величиною Мm, не знаходяться у прямій залежності. На користь того, що розчинна форма білка астрогліальних ПФ не з’являється як продукт деградації філаментної форми свідчить той факт, що розчинний ГФКБ головного мозку щурів представлений у нормі також інтактним поліпептидом з Mm 49 кДа.

Перебудова астрогліальних ПФ за рахунок зсуву рівноваги між вмістом розчинних та філаментних поліпептидів ГФКБ може бути асоційованою також зі змінами фізико-хімічних властивостей ГФКБ. Іони Al здатні індукувати формування ?-складчастої структури у фосфорильованих фрагментах поліпептидів нейрофіламентів (НФ) [Hollosi M. еt al., 1994]. Наявність низькомолекулярних поліпептидів ГФКБ може свідчити про аберації зборки власне філаменту за рахунок зв’язування іонів Аl3+ з ділянками поліпептидного ланцюга ГФКБ так само, як це показано для інших білків цитоскелету: білків НФ і тау-білків. Одержані експериментальні результати і дані, представлені у роботах Hollosi M. еt al., 1994 та Zatta P., 2000, дозволяють запропонувати механізм індукції іоніми Al3+ фібрилярної дегенерації клітин ЦНС (рис. 5):

Рис. 5. Гіпотетичний механізм індукції іонами Al порушення метаболізму білків цитоскелету клітин ЦНС та розвитку фібрилярної дегенерації.

З літературних джерел відомо, що підвищення вмісту ГФКБ може відбуватися завдяки: а) підсиленню генної експресії, б) інгібуванню його катаболізму, в) збільшенню кількості астроцитів внаслідок їх прискореної проліферації, г) комбінації цих причин [Кимелберг Г., Норенберг М., 1989]. Про розвиток астроцитозу у відповідь на підвищене надходження Al до організму щурів свідчать дані імуногістохімічного аналізу (рис. 6). Зокрема, у мозочку спостерігається наявність ділянок з підвищеною ГФКБ-імунореактивністю, які відповідають зонам активної астрогліальної відповіді.

Рис. 6. Імуногістохімічне виявлення ГФКБ на зрізах мозочку щурів (х 200, стрілками позначені астроцитарні ділянки).

Використання ГФКБ для тестування препаратів-нейропротекторів. Одним зі шляхів скринінгу маркерних сполук вважається дослідження змін їх метаболізму при застосуванні засобів корекції патологічного стану ЦНС, ефекти яких широко охарактеризовано. Використання ноотропного препарату пірацетам та антиоксиданту вітаміну Е в якості тестерів є достатньо обґрунтованим. Дані засоби використовуються для підвищення резистентності організму до дії несприятливих екстремальних чинників. Протекторні ефекти ноотропів і антиоксидантів детально досліджено як на молекулярному рівні, так і з використанням різних фізіологічних тестів [Овсянникова Л.М., Носач Е.В., 2003]. Недостатність нейрохімічних даних, що характеризують структурно-функціональні закономірності дії протекторів, обмежує область їх фармакотерапевтичного застосування. Якщо позитивні ефекти антиоксидантної терапії із застосуванням вітаміну Е у ЦНС при опроміненні показано достатньо давно [Иванов И.И., 1975], то можливість використання пірацетаму для корекції радіаційного ЦНС-синдрому є сучасним перспективним напрямом у нейрофармакології [Мурзенок П.П., Чура Н.А., 1998]. Використання вітаміну Е для терапії алюмінієвої інтоксикації може бути доцільним, оскільки іони цього металу індукують розвиток оксидативного стресу в тканині головного мозку [Bondy S.C. et al., 1998]. Відомий антиоксидантний агент, вітамін Е, таким чином, також може бути використаний як надійний інструмент для тестування маркерних властивостей показників ПОЛ і астроцитозу.

1) Вплив пірацетаму на білок ПФ астроцитів головного мозку щурів при дії рентгенівського випромінювання. Дані кількісного визначення філаментного ГФКБ у мозку щурів при дії малих доз іонізуючого випромінювання і превентивному введенні пірацетаму представлені на рис. 7. Підвищення вмісту білка гліальних ПФ, викликане опроміненням у сумарній дозі 12,9 мКл/кг за різний термін часу, великою мірою запобігалося введенням пірацетаму протягом 14 та 21 дня. Показано, що вміст фібрилізованого ГФКБ істотно зменшувався у відділах мозку щурів, яким вводили ноотропний препарат перед сеансом опромінення, у порівнянні зі щурами, опроміненими той же термін.

Рис. 7. Вміст філаментної форми ГФКБ (умовні одиниці) у різних відділах головного мозку щурів за умов ізольованої дії радіації (світлі стовпці) та опромінення після превентивного введення пірацетаму (чорні стовпці): 1 – контроль; 2 – опромінення 7 днів; 3 – опромінення 14 днів; 4 – опромінення 21 день (* – P<0,05, ** – P<0,01 – достовірність різниці між групами відповідного терміну опромінення).

Вплив пірацетаму помітно позначився на поліпептидному складі ГФКБ, про що свідчить зменшення інтенсивності деградації інтактного поліпептиду 49 кДа, викликаної радіацією (рис. 8).

Рис. 8. Імуноблотинг сечовинних (А) і розчинних (Б) фракцій мозочку контрольних та експериментальних щурів: 1 – контроль; 2 – введення пірацетаму; 3 – опромінення 7 днів; 4 – опромінення 7 днів + введення пірацетаму; 5– опромінення 14 днів; 6 – опромінення 14 днів + введення пірацетаму; 7 – опромінення 21 день; 8 – опромінення 21 день + введення пірацетаму.

Механізми біологічної дії малих доз іонізуючого випромінювання мають множинні ефекти, які до кінця не зрозумілі, і пояснюються неоднозначно. Цілком ймовірно, що пірацетам справляє протекторний ефект на стан ПФ цитоскелету астроглії завдяки поліпшенню мікроциркуляції у мозку. За рахунок цього зменшується кількість ішемізованих ділянок тканини мозку, які характеризуються активацією гліозу і гіпертрофією астроцитів. Отримані результати дають підстави припускати, що один з механізмів підвищення радіорезистентності нервової тканини ноотропами реалізується за участю цитоскелетних структур.

2) Вплив вітаміну Е на білок ПФ астроцитів головного мозку щурів за умов інтоксикації AlCl3. Результати кількісного визначення білка гліальних ПФ за умов впливу AlCl3 протягом 90 днів та введення вітаміну Е (токоферолу ацетат) представлені у табл. 3. Слід зазначити, що вітамін Е призвів до вірогідних змін вмісту ГФКБ лише у сечовинних фракціях. Так, ?-токоферол сприяв істотному зниженню рівня фібрилізованого ГФКБ у порівнянні з даним показником у групі інтоксикованих тварин у корі великих півкуль на 66%, мозочку – на 64 %, гіпокампу – на 51 %. Одержані дані свідчать про зменшення інтенсивності астроцитозу, індукованого Al3+, завдяки антиоксидантній терапії із застосуванням вітаміну Е.

Таблиця 3

Вміст філаментної форми ГФКБ (умовні одиниці) у різних відділах головного мозку щурів, які отримували 0,2%-ий розчин AlCl3 з питною водою і вітамін Е внутрішньочеревно, (n= 7-8, * – P<0,05, ** – P<0,01 – достовірність різниці у порівнянні з контролем; ^ – P<0,05; ^^ – P<0,01 – у порівнянні з групою AlCl3.)

Відділ мозку | Контроль | Вітамін Е | AlCl3 | AlCl3 + вітамін Е

кора великих півкуль | 58,37±4,96 | 56,62±5,72 | 110,32±12,8* | 71,80±3,27^

середній мозок | 73,62±4,79 | 66,99±10,3 | 121,47±7,36* | 102,33±15,46

мозочок | 86,15±8,36 | 92,18±7,75 | 187,81±12,92** | 132,67±6,03^^

гіпокамп | 69,74±10,46 | 80,20±8,37 | 124,13±9,76* | 88,57±5,58^

Пролонгований вплив AlCl3 протягом 90 днів сприяв більш істотному зростанню вмісту філаментного ГФКБ у порівнянні з 21-денним терміном у корі на 38,3 % і мозочку – 51,7 % (Р<0,05) та не достовірно на обраному рівні значимості у середньому мозку на 51% і гіпокампі – 13,4 % (P>0,05).

Результати імуноблотингу, які свідчать про зміни поліпептидного складу ГФКБ за умов впливу AlCl3 та введення вітаміну Е, подані на рис. 9. Найбільш істотних порушень поліпептидного складу, викликаних інтоксикацією, зазнала філаментна форма ГФКБ мозочку і гіпокампу, про що свідчить збільшення деградації інтактного поліпептиду 49 кДа. Антиоксидантна терапія сприяла стабілізації

мережі астрогліальних ПФ, на що вказує зниження імунореактивності зони субодиниці 49 кДа та кількості низькомолекулярних поліпептидів.

Рис. 9. Імуноблотинг філаментних (А) і розчинних (Б) фракцій мозочку і гіпокампу щурів контрольної групи (1), щурів, яким вводили вітамін Е (2), щурів, які отримували розчин AlCl3 (3) і щурів, які отримували AlCl3 і вітамін Е (4).

Згідно з перекисно-кальцієвою теорією токсичної загибелі клітини, пошкодження мембранних структур як результат атаки вільних радикалів призводить до різкого підвищення у цитозолі та ядерному матриксі концентрації вільного Са2+ та наступного розвитку клітинної патології [Губский Ю.И., 2001]. Пряма дія вільних радикалів на процеси зборки гліальних ПФ може суттєво доповнюватися порушенням гомеостазу внутрішньоклітинного пулу Са2+. Можливо, що обмежений протеоліз ГФКБ кальпаїнами за умов хронічної інтоксикації Al3+ індукується високими рівнями цитоплазматичного Са2+. Вітамін Е, запобігаючи пероксидації ліпідів мембран, перешкоджає вивільненню Са2+ з внутрішньоклітинних сховищ і, відповідно, активації системи протеолізу ГФКБ. Той факт, що вітамін Е обертав ефекти Al3+ як на біохімічному, так і на фізіологічному рівнях, вказують на можливість впливу металу на синаптичну пластичність і (або) залучення гліальних ПФ до процесів інтеграції клітин ЦНС.

Дані про порушення динамічної рівноваги між неполімерізованою формою ГФКБ і філаментними поліпептидами, отримані у роботі, свідчать про особливості функціонування різних пулів білка ПФ за умов астрогліальної відповіді. Реорганізація ПФ астроглії, найбільш стабільних компонентів цитоскелету в нормі, за умов функціональної відповіді може бути тільки одним з багатьох етапів адаптації до несприятливих впливів. Пластичність цитоскелету астроцитів є одним з адаптивно-компенсаторних механізмів функціонування клітинного мікрооточення нейронів при пошкодженні ЦНС. Результати дослідження дають всі підстави розглядати апарат астрогліальних ПФ не лише в якості пасивного механічного інтегратору внутрішньоклітинного простору, але й активного модулятора клітинних процесів і функцій, здатного адекватно відповідати на несприятливі впливи. Комплексний підхід, який полягає в імунохімічному аналізі як вмісту, так і поліпептидного складу ГФКБ, значно розширює можливості прикладного застосування білка ПФ астроцитів у якості адекватного маркеру для тестування препаратів-нейропротекторів.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено нові дані про особливості змін вмісту і стану білка проміжних філаментів головного мозку щурів за умов ізольованої і сумісної дії іонів Al та іонізуючої радіації. Встановлено, що філаментна форма ГФКБ більш чутлива до впливу Al3+, а розчинні поліпептиди зазнають істотних змін при опроміненні у низьких дозах.

2. Показано, що інтоксикація Al3+ викликає збільшення вмісту філаментної форми ГФКБ (на 37% у мозочку, 30% – гіпокампі, 29% – середньому мозку, 28% – корі великих півкуль у порівнянні з контролем). Надмірний фібрилогенез корелює з накопиченням Al у корі великих півкуль, мозочку та гіпокампі.

3. Іони Al сприяють появі низькомолекулярних деградованих поліпептидів у діапазоні Mm 46-37 кДа. Вплив Al3+ призводить не лише до акумуляції цитоскелетного ГФКБ, але й до інтенсивної перебудови проміжних філаментів астроцитів за рахунок обмеженого протеолізу їх білка.

4. Сумісний вплив рентгенівського випромінювання і AlCl3 протягом 21 дня має синергічний характер, що проявляється у збільшенні концентрації філаментної форми ГФКБ у мозку щурів у порівняні з ізольованим впливом цих чинників.

5. Превентивне введення пірацетаму щурам суттєво попереджало збільшення концентрації ГФКБ у сечовинних фракціях кори і мозочку на 14%, середнього мозку – 12%, гіпокампу – 5% за умов фракціонованого опромінення протягом 21 дня; на 17% у середньому мозку і на 23% у гіпокампі – протягом 14 днів; на 5% у гіпокамі – протягом 7 днів. Рівень деградації інтактного поліпептиду ГФКБ 49 кДа значно знижувався при введенні пірацетаму за усіх термінів опромінення.

6. Експериментально доведено існування прямого зв’язку між ступенем накопичення фібрилізованого ГФКБ, інтенсифікацією Fe- та NADPH-залежних типів пероксидації ліпідів у тканині головного мозку та порушенням емоційно-поведінкових реакцій тварин при інтоксикації іонами Al.

7. Вітамін Е запобігав деградації ГФКБ і підвищенню вмісту філаментної форми ГФКБ при хронічному пероральному споживанні AlCl3 на 45% у корі великих півкуль і на 29% у мозочку і гіпокампі, сприяв зниженню рівня індукованого ПОЛ у нервовій тканині та нормалізації поведінкових реакцій інтоксикованих тварин.

8. На підставі проведених експериментальних досліджень встановлено, що кількісне визначення ГФКБ і аналіз поліпептидного складу білка проміжних філаментів астроцитів можуть використовуватися в якості адекватних маркерів несприятливих впливів на ЦНС і показників ефективності дії нових нейропротекторних препаратів при їх тестуванні.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. В.С. Недзвецький, П.О. Неруш, А.О. Тихомиров, Ж.О. Корякіна, Л.А. Романенко. Вплив іонізуючого випромінювання і хлориду алюмінія на проміжні філаменти нейронів мозку щурів // Мед. хімія. – 2000. – Т.2, №1. – с. 49-53. (Дисертантом отримано фракції цитоскелетних білків мозку, проведено їх електрофоретичне розділення та імуноблотинг, статистичну обробку отриманих даних).

2. А.О. Тихомиров. Вплив хлориду алюмінія на гліальні проміжні філаменти мозку щурів // Вісник Дніпропетровського національного університету. – 2001. – Т.2, № 9. – с. 87-92.

3. В.С. Недзвецький, П.О. Неруш, А.О. Тихомиров, Ж.О. Корякіна, Л.А. Романенко. Протекторна дія пірацетаму на проміжні філаменти гліальних клітин і нейронів за умов впливу малих доз іонізуючої радіації // Експ. фізіол. та біохімія. – 2001. – Т.15, № 3. – с. 28-34. (Дисертантом отримано фракції білків цитоскелета тканини головного мозку щурів, проведено їх електрофоретичне розділення та імуногістохімічне виявлення ГФКБ).

4. В.С. Недзвецький, П.О. Неруш, А.О. Тихомиров, Л.А. Романенко. Вплив іонізуючого випромінювання і хлориду алюмінія на білок проміжних філаментів головного мозку щурів // Нейрофизиология. – 2001. – Т.33, №1. – с. 33-38. (Дисертант приймав участь в одержанні фракцій білків цитоскелету тканини головного мозку щурів, проводив імунохімічний та гістохімічний аналіз ГФКБ, визначення вмісту алюмінію в тканині мозку, статистичну обробку результатів та інтерпретацію отриманих даних).

5. В.С. Недзвецький, А.О. Тихомиров, Ж.О. Корякіна, Л.А. Романенко. Вплив пірацетаму на зміни проміжних філаментів, індукованих іонизуючим випромінюванням // II Національний з’їзд фармакологів України (Дніпропетровськ). – 2001. – с. 174. (Дисертантом отримано фракції білків цитоскелета тканини головного мозку щурів, проведено їх електрофоретичне розділення та імуногістохімічне виявлення ГФКБ).

6. А.А.Тихомиров. Реконструкция глиальных промежуточных филаментов головного мозга крыс в условиях совместного действия ионов алюминия и ионизирующего излучения // ІІ конф. Укр. Товариства нейронаук (Донецьк).- Архив