У нас: 141825 рефератів
Щойно додані Реферати Тор 100
Скористайтеся пошуком, наприклад Реферат        Грубий пошук Точний пошук
Вхід в абонемент





ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Токар Сергій Леонідович

УДК 576.311.3/612.014.2/616.453

Морфо-функціональні особливості регуляції активності

адренокортикоцитів щура

03.00.13 – фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Наукові керівники: академік НАН України, Костюк Платон Григорович

директор Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

зав. відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС)

кандидат біологічних наук Лук'янець Олена Олександрівна

провідний науковий співробітник відділу ЗФНС Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця

НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Стеченко Людмила Александрівна, професор кафедри гістології,

цитології та ембріології національного медичного університету ім. О.О.Богомольця НАН України;

Кандидата біологічних наук Войтенко Лариса Павлівна, старший науковий співробітник відділу нейрональних мереж інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Провідна установа: Інститут ендокрінології ім. В.П. Комісаренко АМН України.

Захист відбудеться "15" березня 2005 р. о "14" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий "09" березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Основною функцією секреторних клітин кори надниркових залоз є синтез стероїдних гормонів, серед яких найбільш відомими є кортизол, альдостерон та кортикостерон. Починаючи із 50-60 років минулого сторіччя було проведено багато досліджень, дозволивших виявити основні ферменти, які беруть участь у стероїдогенезі. Було також встановлено, що різні стадії стероїдогенезу відбуваються у різних компартментах клітини. Так загальним попередником усіх типів стероїдних гормонів є холестерол, він депонується, головним чином, у ліпідних краплях. Для залучення у першу реакцію стероїдогенезу холестерол транспортується до внутрішньої мембрани мітохондрії, де він перетворюється на прегненолон, за участю особливого ферменту (цитохрому Р450scc) та системи транспортування електронів, до якої входять ферредоксин оксидоредуктаза та ферредоксин. Наступне перетворення прегненолону на прогестерон або на 17–окси-прегненолон відбувається на мембранах гладенького ендоплазматичного ретикулуму (гЕПР). Вважається, що з мембранами гЕПР пов’язане проходження також і наступних реакцій стероїдогенезу, але для остаточного синтезу альдостерону та кортизолу проміжні продукти стероїдогенезу (11-дезоксикортикостерон або 17?-окси-11-дезоксикортикостерон) повинні знову потрапити на внутрішню мембрану мітохондрій, де і відбуваються остання стадія стероїдогенезу. Після проходження усіх перетворень готова молекула стероїдного гормону потрапляє у позаклітинне середовище і далі до кров’яного русла.

Дослідження, що проводилися останнім часом в різних лабораторіях світу, показали, що синтез та секреція стероїдних гормонів в клітинах кори надниркових залоз контролюється біологічно активними речовинами, що мають різну природу та походження. Вони потрапляють у кору надниркових залоз з током крові або за рахунок дифузії крізь міжклітинну порожнину. Механізм дії цих біологічно активних агентів залишається ще багато в чому не вивченим. Так, до недавнього часу вважалось, що вплив адренокортикотропного гормону (АКТГ) на структуру та функцію клітин кори надниркових залоз опосередкований головним чином активацією цАМФ залежного каскаду, тоді як результати більш пізніх досліджень показали що месенджерні системи, які опосередковують дію АКТГ, по-перше, багатоканальні, по-друге містять вздовж каскадів пункти “входу” та “виходу” різноманітних модулюючих впливів. Таким чином, дуже важливим постає питання дослідження участі різних систем внутрішньоклітинних посередників, у регуляції життєдіяльності адренокортикоцитів.

Одним із напрямків вирішення цієї проблеми є вивчення впливу іонів кальцію на ультраструктуру клітин кори надниркових залоз.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми Інституту фізіології ім О.О. Богомольця НАН України: „Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур” № гос. Реєстрації 0100U002062

Мета дослідження. Мета даної роботи полягала у вивченні особливостей ультраструктури клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз, за нормальних умов (контроль), після збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі, після аплікації гуморального (АКТГ) та нейронального (ацетилхоліну) факторів, здатних прискорювати стероїдогенез та після дії агоніста мускаринових ацетелхолінових рецепторів пілокарпіну. Для виключення можливого опосередкування впливу зазначених речовин на ультраструктуру адренокортикоцитів через клітини інших типів, дослідження проводилися в умовах диссоційованої культури. Вивчення ультраструктури клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз проводилося із застосовуванням методів електронної мікроскопії. Для вивчення змін концентрації іонів кальцію у цитоплазмі клітини в умовах експерименту застосовували оптичней метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію.

Завдання дослідження.

1. Дослідити ультраструктуру культивованих клітин кори надниркових залоз в контрольних умовах і виявити основні типи ультраструктури, характерні для цих клітин.

2. Виявити зміни в ультраструктурі культивованих клітин пучково-сітчастої зони після аплікації АКТГ, кальцієвого іонофору А23187 та гіперкалієвого розчину.

3. Провести порівняльний аналіз впливу АКТГ та речовин, що підвищують вміст іонів кальцію у цитоплазмі, на ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз.

4. Виявити зміни в ультраструктурі культивованих клітин пучково-сітчастої зони після аплікації ацетилхоліну та пілокарпіну.

5. Провести порівняльний аналіз впливу ацетилхоліну та пілокарпіну на ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз, порівняти виявлені зміни в ультраструктурі із змінами, які виникають після аплікації інших речовин, здатних підвищувати вміст іонів кальцію у цитоплазмі.

6. Дослідити здатність АКТГ, ацетилхоліну та пілокарпіну впливати на концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі адренокортикоцитів.

Наукова новизна отриманих результатів. Виявлено три морфологічні типи культивованих клітин, що походять із пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз, показано, що різниця в ультраструктурі цих клітин не є строго детермінованою а може змінюватися під впливом зовнішніх факторів. Було встановлено, що десятихвилинна інкубація із АКТГ стимулює зменшення площі мітохондрій і одночасне збільшення щільності їх розташування у цитоплазмі. Також показано, що зростання концентрації іонів кальцію у цитоплазмі впливає на ультраструктуру мітохондрій і зокрема стимулює утворення везикулярних крист; сприяє реорганізації мембран гЕПР. Показана наявність одночасних структурних контактів мембран гЕПР із мітохондріями та плазматичною мембраною, це може свідчити про участь мембран гЕПР у секреції стероїдних гормонів. Вперше показана наявність декількох типів осміофільності матриксу ліпідних крапель клітин кори надниркових залоз; також встановлено, що специфіка осміофільності матриксу ліпідних крапель корелює із наявністю в ультраструктурі клітин ознак прискореного стероїдогенезу. Було встановлено, що збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі стимулює зменшення діаметру ліпідних крапель і одночасне збільшення щільності їх розташування у цитоплазмі. Було також встановлено, що збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі після аплікації кальцієвого іонофору А23187 викликає зміни в ультраструктурі, дуже подібні до тих, що спостерігаються після аплікації АКТГ. Це свідчить про те, що іони кальцію можуть бути важливим внутрішньоклітинним посередником, що опосередковує гострий вплив АКТГ на ультраструктуру адренокортикоцитів. Отримані дані доповнюють сучасні уявлення про ультраструктуру клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз та участь у її регуляції механізмів чутливих до концентрації іонів кальцію у цитоплазмі.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Отримані в даній роботі результати мають як теоретичне, так і можливе практичне значення. Так, були виявлені деякі раніше невідомі особливості ультраструктури клітин кори надниркових залоз, які можуть відігравати важливу роль у процесі стероїдогенезу. Разом із тим висловлені в цій роботі припущення можуть створити основу для проведення подальших досліджень, що допоможуть з’ясувати функціональне значення виявлених особливостей ультраструктури клітин кори надниркових залоз. Важливе значення мають отримані в цій роботі дані, щодо ролі іонів кальцію у регуляції ультраструктури клітин кори надниркових залоз. Так, було показано, що збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі може бути одним із головних механізмів, що опосередковує швидкі зміни в ультраструктурі клітин кори надниркових залоз у відповідь на аплікацію АКТГ.

Отже, виявлена чутливість ультраструктури клітин кори надниркових залоз, особливо тих органел, що приймають участь у стероїдогенезі, до концентрації іонів кальцію у цитоплазмі, може бути використана при розробці лікарських препаратів, здатних впливати на секреторну функцію адренокортикоцитів.

Особистий внесок здобувача. Аналіз отриманих електронограм, експерименти із дослідженням вмісту іонів кальцію у цитоплазмі клітин, комп’ютерні розрахунки із використанням непараметричного критерію Уілкоксона проводилось особисто автором. В розробці концепції роботи, обговоренні та редагуванні приймали активну участь співавтори публікацій. В роботі по приготуванню культури, підготовці препаратів для електронно-мікроскопічних досліджень та отриманні електронограм допомагали співробітники відділу ЗФНС Коваль Л.М. та Яворська О.М.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи висвітлювались на засіданнях наступних наукових зібрань: міжнародній школі-семінарі ”Мембрани та сигнали” (Київ, 3-8 вересня 2000р.), на конференції “Bogomoletz-Nencki Meeting” (Сулейов, Польща, 7-8 травня 2001р.), на міжнародній конференції „ Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System” (Київ, 16-17 червня 2002р.), на “Second Bogomoletz-Nencki Symposium. Intracellular signalling in excitable cells” (Київ, 1-3 вересня 2002р.), на конференції для молодих вчених Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАНУ „Перспективні напрямки досліджень сучасної фізіології” (Київ, 17-18 листопада 2003) та на IBRO Advanced school of neuroscience “Receptors, channels, messengers” (Ялта 16-28 вересня 2005).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 4 статті та тези 3 доповідей в наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 183 найменувань. Робота викладена на 151 сторінках та ілюстрована 51 рисунками та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність дослідження ультраструктури кори надниркових залоз щура та механізмів її регуляції.

В розділі 1 „Огляд літератури” наводиться історичний розвиток уявлень про структуру та функції надниркової залози. Також відображено сучасні погляди, що до будови надниркової залози ссавців та значення гормонів кори надниркових залоз в регуляції гомеостазу організму. Описані основні етапи синтезу мінерало- та глюкокортикоїдів. У цьому розділі також наведено сучасні уявлення, що до участі деяких внутрішньоклітинних механізмів у процесі транспорту холестеролу до внутрішньої мембрани мітохондрій. Проаналізовані літературні дані, що до гуморальної та нейрональної регуляції функції клітин кори надниркових залоз, та участі іонів кальцію у опосередкуванні цих регулюючих впливів.

В розділі 2 „Матеріали і методи” описано методичні підходи використані для досягнення поставленої мети:*

Виділення ізольованих клітин кори надниркових залоз щура.*

Приготування культури клітин кори надниркових залоз щура. *

Фіксації клітин, вміщення клітин в аралдит, контрастування та приготування

ультратонких зрізів.*

Вивчення ультраструктури клітин за допомогою електронного мікроскопу.*

Оптичне вимірювання концентрації вільних іонів кальцію в цитоплазмі клітини

Виділення клітин кори надниркових залоз. Експерименти проводили на статевозрілих білих нелінійних щурах масою 180-230 грамів. Процедуру декапітації щура проводили у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Виділені надниркові залози поміщали у розчин №1 (NaCl-155мМ, Hepes-10мМ, Глюкоза-10мМ, KCl-6мМ рН 7.4) з додаванням фонового антибіотика гентоміцину (40мкл/10мл). Ферментативну обробку тканини проводили у розчині №1, в який також додавали 2.5 мг/мл колагенази типу А та 5 мг/мл альбуміну сироватки крові бика (Sigma, США). В ферментативному розчині тканини витримували протягом 25 хвилин при температурі +37оС. Після цього фермент видаляли із тканини, повністю змінюючи розчин 5 разів у пробірці. Відмиту тканину пропускали крізь стерильне нейлонове сито із діаметром пори 100мкм. Отриманий після цього гомогенат центрифугували протягом 6-7 хвилин при швидкості 1000 обертів на хвилину. Надосадову рідину зливали, а об’єм суспензії доводили до 1 мл розчином №1. Окремі клітини отримували за допомогою м’якого, повільного піпетування із використанням піпеток різного диаметру. Після цього клітини поміщали на покриті поліарнітином (Sigma, США) акларові пластинки (Nunc Inc. USA).

Умови культивування клітин. Через п’ятнадцять хвилин клітини закріплювалися на акларових пластинках. Далі їх переносили в чашку Петрі, що містила 2мл розчину №2 (Dolbecco’s Мodified Еagles medium (DME), без соди-13.4г/л, NaHCO3-2.2г/л, HEPES-2.38г/л, пеніцілін/стрептоміцин-5мл/л, гентаміцин-2мл/л, кінську сироваткау крові-100мл/л ). Після цього чашки Петрі поміщали в СО2-інкубатор (Ули-20, Россія). Кількість СО2 в камері інкубатора підтримувалася на рівні 5%, а вологість 95%. Інкубація клітин проводили при +37оС, рН 7.4.

Інкубація із досліджуваними речовинами. Досліджувані речьовини аплікувались у насичуючій концентрації, що за даними літератури спричиняє найбільший ефект. Так у першому експерименті первинну культуру клітин занурювали у розчин №3 (NaCl-150мМ, Hepes-10мМ, CaCl2-2мМ, MgCl2-2мМ, KCl-5мМ рН 7.4), що також містив АКТГ (фрагмент 4-10) у концентрації 10 мкМ. Через 10 хвилин пластинки із клітинами переносили у фіксуючий розчин. В іншому досліді пластинки із клітинами на 30 хвилин занурювали у розчин №1, що не містив іонів кальцію, але містив кальцієвий іонофор A23187 у концентрації 10мкМ після цього клітини на 30 секунд переносили в розчин №2, що містив 2.5мМ CaCl2. Далі; акларові пластинки поміщали у фіксуючий розчин. В наступному досліді збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі досягалося за рахунок активації потенціал керованих кальцієвих каналів. Потенціал чутливі кальцієві канали активувались при зануренні клітин у розчин який зменшував потенціал на клітинній мембрані. Так акларові пластинки із культурою клітин ми поміщали на 2 хвилини у розчин №4 (NaCl-60мМ, Hepes-100мМ, CaCl2-2мМ, MgCl2-2мМ, KCl-100мМ рН 7.4), потім їх переносили у фіксуючий розчин. Для вивчення впливу ацетилхоліну, акларові пластинки із одноденною культурою занурювали на 90 секунд у розчин №2, що також містив ацетилхолін у концентрації 1 мМ. Після цього клітини поміщали у фіксуючий розчин. Для вивчення впливу пілокарпіну на ультраструктуру кори надниркових залоз акларові пластинки із одноденною культурою занурювали у розчин №2, що містив пілокарпіну гідрохлорид у насичуючій концентрації, що дорівнювала 300 мкМ. Через 10 хвилин акларові пластинки переносили у фіксуючий розчин.

Приготування препаратів для електронно-мікроскопічних досліджень. Акларові пластинки з контрольними клітинами, а також із тими що інкубували у присутності досліджуваної речовини, поміщали у фіксуючий розчин, який містив 2.5% глютаральдегіда, розчиненого у фосфатному буфері (KH2PO4-28мМ, Na2HPO4-181мМ, та 4%-сахарози), і витримували протягом 2-4 годин. Потім їх промивали фосфатним буфером 2 рази протягом 5 хвилин. Після цього проводили дофіксацію, шляхом занурення акларових пластинок на 1-2 години у 1% розчин OsO4 (в тому ж фосфатному буфері). Далі фіксуючий розчин знову відмивали, а отримані препарати зневоднювали етанолом у зростаючій концентрації. Отримані акларові пластинки занурювали у абсолютний ацетон, де відбувалася їх остаточна дегідратація. Далі препарати заливали аралдитом (Fluka), при цьому концентрацію аралдиту в розчині в три етапи збільшували до 100%, а концентрацію ацетону відповідно зменшували до 0%.

Желатинові капсули, заповнені аралдитом, поміщали на вибраних, за допомогою інвертованого мікроскопу (World Precision Instruments USA), ділянках культури. Після цього акларові пластинки для полімеризації поміщали до термостату із температурою 56-60 оС на дві доби. Отримані желатинові блоки відділяли від акларових пластинок. За допомогою леза ділянку, що містить експериментальний матеріал, вирізали у формі невисокої пірамідки. Приготування зрізів проводилася за допомогою ультрамікротому (LKB, Швеція). Отримані ультратонкі зрізи мали товщину від 200 до 500 A. Їх поміщали на округлі мідні сіточки діаметром 3мм. Далі отримані препарати контрастували за методом Рейнольда.

Електронно-мікроскопічні дослідження та морфометричний аналіз ультраструктури адренокортикоцитів. Фотографування ультраструктури клітин кори надниркових залоз проводилася за допомогою електронного трансмісійного мікроскопа (JEM 100X Японія) при збільшенні від 2000х до 40000х. Під час проведення експериментів була отримано значна кількість електронограм, що відображали особливості ультраструктури 110 клітин. Площу цитоплазми та розташованих в ній ліпідних крапель і мітохондрій, а також кількість органел підраховували із використанням ЕОМ та спеціальної програми Kslite (Kontron Electronics Німеччина). Після цього розраховувалися такі параметри: діаметр ліпідної краплі, щільність розташування органел у цитоплазмі, відносна площа компартменту органели. Діаметр ліпідної краплі розраховувався за формулою:

де D- діаметр ліпідної краплі, S-площа краплі, що розраховувалася за допомогою пЕОМ. Щільність розташування органел у цитоплазмі підраховували як кількість органел (мітохондрій або ліпідних крапель) на зрізі, віднесена до загальної площі цитоплазми на зрізі, і нормована до 1мкм2 площі цитоплазми. Відносну площу компартменту різних органел (мітохондрій або ліпідних крапель) розраховували як частину площі цитоплазми клітини, що припадає на органели певного типу, виражали у відсотках від загальної площі цитоплазми клітини на зрізі. Кінцеву матиматичну обробку отриманих данних проводили за допомогою пакету програм Origin 5.0 (Microcal Software Inc. U.S.A.). Статистичну достовірність отриманих результатів аналізували із використанням непараметричного критерію Манна-Уітні (в різних наукових джерелах цей метод також називають критерієм Уілкоксона), який розраховувався за допомогою програми SPSS 10.0.7 (SPSS Inc.).

Оптичний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Для введення кальцій чутливого зонду в клітину, акларові пластинки з культурою клітин кори надниркових залоз занурювалися в розчин №3, що містив барвник фура-2 (ацетоксиметилестер)(Probes,США) у концентрації (1 мМ/л), із доданням детергенту плуронік F-127 (0.002%) (Sigma, США). Фарбування клітини проводилося у спеціальній камері протягом 45 хвилин при 37оC. Після фарбування скельця переносилися в розчин №3, де вони витримувалися протягом 40 хвилин для повної деестерифікації зонду фура-2/АМ. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалося при довжині хвилі 360 та 380нм за допомогою монохроматора (T.I.L.L. Photonics GmbH, Мюнхен, Німеччина). Процеси запису даних контролювалися за допомогою комп’ютерної програми „Pulse” (HEKA, Ламбрехт, Німеччина), яка в реально масштабі часу розраховувала відношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах хвиль R=F1/F2.

В розділі „Результати досліджень” описується ультраструктура клітин пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура в нормі та в умовах експерименту, а також здатність досліджуваних біологічно активних речовин впливати на концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі адренокортикоцитів.

На першому етапі роботи досліджували ультраструктуру культивованих клітин кори надниркових залоз щура в контролі. Ми виявили чотири типи клітин, які відрізнялися за рядом морфологічних ознак. Мітохондрії клітин перших трьох типів мали головним чином везикулярні, трубчасто-везикулярні, і рідко трубчасті кристи, тому ми зробили висновок, про те, що ці клітини походять із пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз. Дані морфометричних розрахунків для клітин перших трьох типів наведені в таб.1. Клітини четвертого типу зустрічалися

Таблиця 1. Порівняння досліджуваних морфометричних параметрів у різних типах секреторних клітин, пучково-сітчастої кори надниркових залоз щура.

Типи клітин | Дані морфометричних досліджень ультраструктури ліпідних крапель та мітохондрій в умовах контролю.

Середній діаметр ліпідних крапель(нм.) | Середня щільність розташування ліпідних крапель

(кількість

/мкм2). | Середня площа компартменту ліпідних крапель

(% від площі цитоплазми) | Середня площа мітохондрій (мкм2). | Середня щільність розташування мітохондрій

(кількість

/мкм2). | Середня площа компартменту мітохондрій

(% від площі цитоплазми)

1 | 831,0+/-18,0 | 0,304+/-0,071 | 16,9+/2,8 | 0,273+/-0,007 | 1,111+/-0,047 | 30+/-1,8

2 |

616,1+/- 43,7 |

0,333+/-0,169 |

11,0+/-6,0 | ***

0,159+/-0,010 |

1,736+/-0,458 |

27,7+/-4,1

3 | ***

1057,6+/-38,6 |

0,252+/-0,027 |

26,4+/-4,1 |

0,276+/-0,013 | ***

0,619+/-0,105 | ***

18,4+/-1,7

***–р<0,001

уже рідко і складали лише 5% від загальної маси клітин. Вони мали мітохондрії із електронно-щільним матриксом і пластинчастими кристами. Взявши до уваги будову мітохондрій, ми зробили висновок про те що, ці клітини походять з клубочкової зони.

Клітини першого типу складали майже 42% від загальної кількості досліджених нами клітин. Цитоплазма клітин першого типу, містила велику кількість мембран гладенького ендоплазматичного ретикулуму (гЕПР). Мембрани гЕПР мали структурні контакти із мітохондріями та ліпідними краплями. Середня площа мітохондрій дорівнювала 0,273+/-0,007 мкм2 (n=814). Матрикс мітохондрій завжди був помітно темнішим у порівнянні із оточуючою цитоплазмою. Мітохондрії містили велику кількість світлих везикулярних крист. Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі дорівнювала 1,111+/-0,047 на мкм2 (n=10). Разом з тим середня площа компартменту мітохондрій складала 30,0+/_,8% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=10). Середній діаметр ліпідних крапель в клітинах першого типу складав 831,0+/-18,0 нм (n=180). Дослідження електронограм показало, що існує два типи крапель, які відрізняються за щільністю матриксу. Так, матрикс крапель першого типу має значно більшу щільність, ніж матрикс розташованих поруч мітохондрій, біля поверхні таких крапель завжди спостерігалася щільна окантовка. Навпаки ліпідні краплі другого типу мали таку ж саму або навіть меншу щільність, ніж матрикс розташованих поруч мітохондрій, у таких краплях електронно-щільна окантовка була відсутня. Ліпідні краплі обох типів можна було спостерігати на одній електронограмі. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі дорівнювала 0,304+/-0,071 крапель на мкм2 (n=10). Середня площа компартменту ліпідних крапель складала 16,9+/-2,8% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=10). В клітинах першого типу часто зустрічалися щільні тільця, що могли являти собою, як пероксисоми, так і лізосоми. Вони мали сірий вміст із одним або декількома острівцями електронно-щільної речовини. Вони утворювали структурні контакти із мембранами гЕПР, мітохондріями і рідше із ліпідними краплями. Іноді щільні тільця містили одне або декілька ліпідних включень, що свідчить про участь цих структур у метаболізмі холестеролу, а також про можливість їх участі у процесі стероїдогенезу.

Клітини другого типу складали 16% від загальної маси досліджених клітин кори надниркових залоз. Мембрани гЕПР в цих клітинах зустрічалися у меншій кількості, ніж у цитоплазмі клітин першого типу. Середня площа мітохондрій складала 0,159+/-0,010% мкм2 (n=149). Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі складала 1,736+/-0,458 на мкм2 (n=3). Разом із тим середня площа компартменту мітохондрій дорівнювала 27,7+/-4,1% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=3). Середній діаметр ліпідних крапель дорівнював 616,1+/-43,7 нм (n=30). Цей показник був меншим у порівнянні із клітинами першого типу (таб.1). Різниця між вибірками була достовірною (р<0,001). За своєю структурою матрикс ліпідних крапель був однорідним. Вміст ліпідних крапель по своїй щільності був подібним до матриксу мітохондрій. Отже, у клітинах другого типу спостерігалися головним чином краплі другого типу. Ліпідні краплі часто мали структурні контакти із ядром. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі дорівнювала 0,3334+/-0,1688 крапель на мкм2 (n=3). На долю компартменту ліпідних крапель приходилося в середньому 11,0+/-6,0% (n=3) від загальної площі цитоплазми на зрізі. Ультраструктура щільних тілець була такою ж, як і в клітинах першого типу.

Клітини третього типу складали 37% від загальної кількості клітин. Мембрани гЕПР в клітинах третього типу частіше мали вигляд пухирців, мішечків або невеликих трубочок. Середня площа мітохондрій складала 0,276+/-0,013 мкм2 (n=380), і була більшою ніж у клітинах другого типу. Різниця між вибірками була достовірною (р<0,001). Щільність матриксу мітохондрій була подібною до щільності навколишньої цитоплазми. У матриксі мітохондрій виявлялися трубчасті і у меншій кількості везикулярні кристи. Середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі клітин третього типу дорівнювала 0,619+/-0,105 мітохондрій на мкм2 (n=8) і була меншою ніж у клітинах першого типу. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001). Середня площа компартменту мітохондрій складала 18,4+/-1,7% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=8) і була меншою, ніж в клітинах першого та другого типів. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001). Ліпідні краплі могли істотно відрізнятися за своїми розмірами. Середній діаметр ліпідних крапель складав 1057,6+/-38,6 нм (n=155), і був більшим ніж в клітинах першого та другого типів. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001). Матрикс ліпідних крапель клітин третього типу був завжди структурованим: спостерігалась щільна окантовка на внутрішній стороні мембрани ліпідної краплі та більш просвітлена центральна частина. Не зважаючи на це, ліпідні краплі можна було також поділити на два типи, які істотно розрізнялися за щільністю матриксу. Так, краплі першого типу мали темний матрикс, щільність якого була значно більшою ніж щільність матриксу мітохондрій, тоді як краплі другого були світлішими. Обидва типи крапель ми могли спостерігати на одному зрізі в різних клітинах або навіть у одній і тій самій клітині. Ліпідні краплі часто мали структурні контакти із ядром і рідко із мембранами гЕПР та плазматичною мембраною. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі клітин третього типа дорівнювала 0,252+/-0,027 крапель на мкм2 (n=8). Середня площа компартменту ліпідних крапель складала 26,4+/-4,1% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=8) і була більшою, ніж у клітинах першого та другого типів, але різниця між вибірками була недостовірною. Щільні тільця у клітинах третього типу зустрічалися досить рідко; вони мали невеликі розміри і рідко мали структурні контакти із іншими органелами.

Після інкубації з АКТГ та кальцієвим іонофором ультраструктура адренокортикоцитів була більш однотипною, ніж у контролі. Таким чином, можна зробити висновок про те, що аплікація АКТГ та збільшення концентрації іонів кальцію у цитоплазмі спричиняють активацію певних внутрішньоклітинних процесів, здатних зменшувати або нівелювати різницю в ультраструктурі клітин 1-3 типів. Зважаючи на це, при проведенні морфометричних досліджень ми вивчали вплив АКТГ та кальцієвого іонофору на всі клітини пучково-сітчастої зони без поділу їх на типи (таб 2.). Після інкубації клітин із АКТГ, мембрани гЕПР, частіше мали вигляд каналів, об’єднаних у сітку. Вони мали структурні контакти із мітохондріями, ліпідними краплями та щільними тільцями. Середня площа мітохондрій дорівнювала 0,223+/-0,006 мкм2 (n=1727) і була меншою ніж у контролі (таб 2). Різниця між контрольною та експериментальною вибірками була

Таблиця 2. Порівняння досліджуваних морфометричних параметрів клітин, пучково-сітчастої кори надниркових залоз щура в контролі та після інкубації с АКТГ або з кальцієвим іонофором А23187

Речовина, що досліджу-валась. | Типи клітин | Дані морфометричних досліджень ультраструктури ліпідних крапель та мітохондрій.

Середній діаметр ліпідних крапель

(нм.). | Середня щільність розташування ліпідних крапель

(кількість

/мкм2). | Середня площа компартменту ліпідних крапель

(% від площі цитоплазми) | Середня площа мітохондрій (мкм2). | Середня щільність розташування мітохондрій

(кількість

/мкм2). | Середня площа компартменту мітохондрій

(% від площі цитоплазми)

Конт. |

Всі типи | 909,6+/-20,3 | 0,291+/-0,038 | 21,3+/-2,5 | 0,261+/-0,006 | 0,923+/-0,089 | 24,4+/-1,8

АКТГ | Всі типи | ***

692,9+/-9,6 | ***

0,644+/-0,086 |

26,7+/-2,5 | ***

0,223+/-0,06 | **

1,301+/-0,064 |

29,4+/-2,2

А23187 | Всі типи | ***

751,7+/-12,9 | ***

0,793+/-0,136 | **

40,2+/-4,2 | ***

0,177+/-0,006 |

1,096+/-0,101 |

19,1+/-1,4

Конт.-контроль. **–р<0,01; ***–р<0,001

достовірною (p<0,001) (рис. 1). У порівнянні із оточуючою цитоплазмою матрикс мітохондрій завжди був більш щільним. Трубчасті кристи після аплікації АКТГ розбухали, а на їх поверхні можна було спостерігати утворення нових везикул. Середня площа компартменту мітохондрій після аплікації АКТГ збільшувалася до 29,4+/_,2% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=20) (таб.2), але різниця між вибірками була не достовірною. При цьому середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі після аплікації АКТГ збільшувалася до 1,301+/-0,064 мітохондрій на мкм2 (n=20) різниця між вибірками була достовірною (p<0,01). Можливо, що такі зміни пов’язані із прискоренням процесу фрагментації мітохондрій. В умовах експерименту також зменшувався середнійдіаметр ліпідних крапель до 692,9 +/-9,6 нм. Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 2). Після інкубації із АКТГ клітини, майже завжди, містили, електронно-світлі краплі без окантовки. Ці краплі часто мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ядром клітини, рідше із мембранами гЕПР та плазматичною мембраною. Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі клітини після аплікації АКТГ збільшувалася до 0,644+/-0,086 крапель на 1мкм2 (n=20). Відмінність між вибірками була достовірною (p<0,001). Після аплікації АКТГ середня площа компартменту ліпідних крапель збільшувалася до 26,7+/-2,5% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=20) в умовах експерименту. Але різниця між вибірками булла недостовірною. У цитоплазмі також можна було спостерігати значну кількість крапель, що мали тісні структурні контакти між собою. Можливо, що присутність таких структур пов’язана із активацією процесу дроблення ліпідних крапель. Після інкубації із АКТГ у цитоплазмі адренокортикоцитів виявлялась велика кількість щільних тілець, що мали значні розміри. Вони містили світлий матрикс із грудками електронно-щільної речовини, часто вони також містили ліпідні включення. Щільні тільця мали структурні контакти із ліпідними краплями, мітохондріями, мембранами гЕПР і рідше із ядром.

В клітинах, що інкубувалися з кальцієвим іонофором сітка каналів гЕПР займала значну частину цитоплазми. Мембрани гЕПР часто мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ліпідними краплями рідше із плазматичною мембраною. Ультраструктура мітохондрій, їх форма, характер розташування у цитоплазмі і особливості структурних контактів із іншими органелами були такими ж, як і після інкубації із АКТГ. Але, проведення морфометричних розрахунківдозволило виявити певні особливості. Так, після аплікації кальцієвого іонофору середня площа мітохондрій зменшувалася до 0,177+/-0,006 мкм2 (n=857) (таб.2). Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 3). Одночасно ми спостерігали зменшення середньої площі компартменту мітохондрій до 19,1+/-1,4% (n=11) від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=11) і одночасне збільшення середньої щільності розташування мітохондрій у цитоплазмі до 1,096+/-0,1011 мітохондрій на мкм2 (n=11) (таб.2). Але для обох останніх параметрів різниця між вибірками була не достовірною. Після застосування кальцієвого іонофору електронно-щільні краплі в цитоплазмі клітини більше не виявлялися. Разом із тим зникала або була досить слабо помітною електронно-щільна окантовка на внутрішній мембрані ліпідної краплі. Середній діаметр ліпідних крапель у порівнянні із контролем зменшувався до 751,7+/-12,9нм (n=531) (таб.2). Різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис. 4). Також як і після аплікації АКТГ, після застосування кальцієвого іонофору ліпідні краплі часто мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ядром клітини, мембранами грЕПР та гЕПР. Іноді ліпідні краплі могли також мати структурні контакти із плазматичною мембраною. Середня площа компартменту ліпідних крапель після інкубації з кальцієвим іонофором зростала до 40,2+/-4,2% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=11) (таб.2), різниця між вибірками, у цьому випадку, також була достовірною (p<0,01). Одночасно ми спостерігали зростання середньої щільності розташування ліпідних крапель до 0,793+/-0,136 крапель на мкм2 (n=11) (таб.2), різниця між вибірками була також достовірною (p<0,001). Таким чином, можна зробити припущення про те, що застосування кальцієвого іонофору активізує процес дроблення ліпідних крапель. Після аплікації кальцієвого іонофору в компартменті щільних тілець спостерігалися ті ж самі зміни, що і після аплікації АКТГ. В наступній частині нашої роботи ми досліджували вплив на ультраструктуру адренокортикоцитів гіперкалієвого розчину, ацетилхоліну та пілокарпіну. Застосування всіх зазначених речовин не призводило до нівелювання різниці в ультраструктурі клітин різних типів, але навпаки всі типи ультраструктури клітин що були виявлені у контролі також легко ідентифікувалися в умовах експерименту. Разом із тим клітини другого типу зустрічалися дуже рідко, тому зміни їх ультраструктури не аналізувалися. Результати розрахунків морфометричних параметрів ультраструктури адренокортикоцитів пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура після аплікації зазначених речовин наведені в таб.3. В клітинах першого типу, що інкубувалися у гіперкалієвому розчині, сітка, утворена каналами гЕПР займала значну частину цитоплазми. Мембрани гЕПР мали структурні контакти із мітохондріями, щільними тільцями, ліпідними краплями та плазматичною мембраною. За своєю формою та щільністю матриксу, мітохондрії в експериментальних та контрольних клітинах істотно не відрізнялись. Середня площа мітохондрій у порівнянні із контролем зменшувалася до 0,214+/-0,005 мкм2 (таб.3), розбіжність між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис 5). Разом із тим, середня щільність розташування мітохондрій у цитоплазмі майже не змінювалась, а середня площа компартменту мітохондрій зменшувалася до

24,6+/-2,1% від загальної площі цитоплазми на зрізі (n=18) (таб.3), але різниця між вибірками була недостовірною. Проведення морфометричних розрахунків також показало, що в клітинах першого типу після інкубації у гіперкалієвому розчині відбувається збільшення середнього діаметру ліпідних крапель до 930,4+/-14,0 нм (n=444) (таб. 3). При цьому різниця між контрольною та експериментальною вибірками була достовірною (p<0,001). Середня щільність розташування ліпідних крапель у цитоплазмі, змінювалася мало. Разом із тим, було виявлене зростання середньої площі компартменту ліпідних крапель до 24,8+/-3,4% (n=18) від загальної площі цитоплазми але різниця між вибірками була недостовірною. Таким чином, аплікація деполяризуючого розчину викликає збільшення середніх розмірів ліпідних крапель. За даними літератури збільшення концентрації іонів кальцію у клітині є одним із чинників який може призводити до активації процесів

Таблиця 3. Зміни досліджуваних морфометричних параметрів у клітинах першого та третього типів після аплікації гіперкалієвого розчину, ацетилхоліну та пілокарпіну. |

Типи клітин | Дані морфометричних досліджень ультраструктури ліпідних крапель та мітохондрій.

Середній діаметр ліпідних крапель

(нм.). | Середня щільність розташування ліпідних крапель

(кількість

/мкм2). | Середня площа компа-ртменту ліпідних крапель

(% від площі цитоплазми) | Середня площа мітохондрій (мкм2). | Середня щільність розташу-вання мітохондрій

(кількість

/мкм2). | Середня площа компа-ртменту мітохондрій

(% від площі цитоплазми)

Конт. | 1 | 831,0+/-18,0 | 0,304+/-0,071 | 16,9+/2,8 | 0,273+/-0,007 | 1,111+/-0,047 | 30+/-1,8

3 | 1057,6+/-38,6 | 0,252+/-0,027 | 26,4+/-4,1 | 0,276+/-0,013 | 0,619+/-0,105 | 18,4+/-1,7

KCl | 1 | ***

930,4+/-14,0 |

0,334+/-0,041 |

24,8+/-3,4 | ***

0,214+/-0,005 |

1,167+/-0,113 |

24,6+/-2,1

3 | ***

732,2+/-31,7 |

0,291+/-0,052 | ***

14,7+/-2,9 | *

0,278+/-0,011 |

0,623+/-0,079 |

17,8+/-2,3

Ацетил-холін | 1 | **

764,3+/-9,6 |

0,360+/-0,065 |

18,3+/-2,6 |

0,252+/-0,005 |

1,026+/-0,064 |

25,3+/-1,3

3 | **

906,1+/-18,5 | **

0,4041+/-,034 |

27,3+/-3,2 | **

0,217+/-0,005 |

0,893+/-0,073 |

19,7 +/-2,0

Піло-

карпін | 1 | ***

707,9+/-16,9 |

0,359+/-0,068 |

15,6+/-3,6 | ***

0,228+/-0,007 | **

1,486+/-0,107 |

33,6+/-2,8

3 | 994,0+/-40,0 | 0,274+/-0,071 | 26,3+/-7,3 | 0,239 +/-0,012 | 0.802 +/-0,06 | 28,3+/-8,8

Конт.-контроль. *–р<0,05;**–р<0,01; ***–р<0,001

стероїдогенезу, що в свою чергу супроводжується виходом холестеролу із ліпідних крапель, тому зростання середнього діаметру та середньої площі компартменту ліпідних крапель на зрізі в умовах нашого експерименту важко пояснити. Ми припускаємо, що такі зміни в ультраструктурі ліпідних крапель є характерними для клітин першого типу лише на початковому етапі активації стероїдогенезу.

Особливою рисою ультраструктури клітин третього типу після інкубації із гіперкалієвим розчином була наявність у матриксі мітохондрій цих клітин головним чином трубчастих крист, тоді як везикулярні виявлялися у незначній кількості Мембрани гЕПР у порівнянні із контролем не зазнавали суттєвих змін. Мітохондрії рівномірно розташовувалися у цитоплазмі, при цьому вони часто мали структурні контакти із ліпідними краплями і помітно менше з елементами гЕПР та ядром. Після інкубації із гіперкалієвим розчином середній діаметр ліпідних крапель клітин третього типу зменшувався до 732,2+/-31,7 нм. (n=110) (таб.3), різниця між вибірками була достовірною (p<0,001) (рис 6). Ліпідні краплі часто мали структурні контакти із розширеними цистернами апарату Гольджі, рідше із ядром. Середня щільність розташування ліпідних крапель у порівнянні з контролем майже не змінювалася (таб 3). Але при цьому спостерігалося зменшення середньої площі компартменту ліпідних крапель до 14,7+/-2,9% від площі компартменту ліпідних крапель (n=6) (таб.3). Відмінність між вибірками була достовірною (p<0,001). Таким чином, в клітинах третього типу, інкубація із деполяризуючим розчином призводила до зменшення розмірів компартменту ліпідних крапель, що можна пояснити прискоренням мобілізації депонованого у них холестеролу. Ультраструктура щільних тілець після аплікації гіперкалієвого розчину залишалася без змін.

Після інкубації із ацетилхоліном мембрани гЕПР в клітинах першого типу були представлені довгими каналами об’єднаними у сітку. Вони часто мали структурні контакти із мітохондріями, рідше із щільними тільцями та ліпідними краплями. Разом із тим суттєвих змін в ультраструктурі мітохондрій клітин першого типу не спостерігалося. Після інкубації із ацетилхоліном середній діаметр ліпідних крапель у порівнянні із контролем зменшувався до 764,3+/-9,6нм (n=429) (таб. 3), розбіжність між вибірками була достовірною (p<0,01). Разом із тим, після інкубації із ацетилхоліном в клітинах першого типу спостерігалося недостовірне збільшення середньої щільності розташування ліпідних крапель у цитоплазмі при відсутності, істотних змін у середній площі компартменту ліпідних крапель. Такі зміни можуть вказувати на прискорення процесу дроблення ліпідних крапель. Щільні тільця мали округлу, овальну або неправильну форму. Розташовані у щільних тільцях ліпідні включення по центру просвітлювались, тоді як по краях містили скупчення електронно-щільної речовини. Іноді також можна було побачити щільні тільця, що мали суцільно чорний матрикс. Таким чином, ацетилхолін стимулював помітні зміни в ультраструктурі щільних тілець і можливо, що він також впливає на метаболізм холестеролу у цих органелах.

Після інкубації із ацетилхоліном ультраструктура мембран гЕПР в клітинах третього типу майже не змінювалась. Також не зазнала змін форма мітохондрій та характер їх розташування у цитоплазмі. Разом із тим в окремих клітинах ми спостерігали перебудову ультраструктури крист; так, від трубчастих крист починали активно відділятися везикули. Щільність матриксу мітохондрій при цьому не змінювалась. Можливо, що такі клітини являють собою перехідну форму між третім та другим типами. Після інкубації із ацетилхоліном мітохондрії часто мали структурні контакти із ліпідними краплями та мембранами гЕПР, рідше із щільними тільцями та ядерною мембраною. Середня площа мітохондрій, після інкубації клітин із ацетилхоліном зменшувалася до 0,217+/-0,006 мкм2 (n=499) (таб.3).


Сторінки: 1 2





Наступні 7 робіт по вашій темі:

ПРОФІЛАКТИКА УСКЛАДНЕНОГО ПЕРЕБІГУ ВАГІТНОСТІ ТА ПОЛОГІВ у ЖІНОК групи РИЗИКУ ЩОДО синдрому РАПТОВОЇ СМЕРТІ НЕМОВЛЯТИ - Автореферат - 26 Стр.
ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН системи НЕЙРОПЕПТИДІВ У ДІТЕЙ, ХВОРИХ НА ЕКЗЕМУ ТА НЕЙРОДЕРМІТ, КОМПЛЕКСНЕ ЇХ ЛІКУВАННЯ З ВИКОРИСТАННЯМ НЕЙРОПЕПТИДОМОДУЛЮЮЧОЇ ТЕРАПІЇ - Автореферат - 23 Стр.
УПРАВЛІННЯ ЕКОНОМІЧНОЮ СТІЙКІСТЮ ПІДПРИЄМСТВА - Автореферат - 24 Стр.
ОСОБИСТІСНО-СИТУАЦІЙНА ДЕТЕРМІНАЦІЯ АГРЕСИВНОЇ ПОВЕДІНКИ ЛЮДИНИ - Автореферат - 28 Стр.
Синдром Ейзенменгера: клінічний перебіг, морфо - функціональний стан серця та результати лікування при довготривалому спостереженні - Автореферат - 27 Стр.
СТАН IМУННО СИСТЕМИ I ОСОБЛИВОСТI МОРФОЛОГI ПЕРИФЕРИЧНО КРОВI ПРИ ЗАЛIЗОДЕФIЦИТНIЙ АНЕМI ВАГIТНИХ - Автореферат - 23 Стр.
ПІДРОБЛЕННЯ ЯК СПОСІБ ВЧИНЕННЯ ЗЛОЧИНУ - Автореферат - 24 Стр.