ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н. КАРАЗІНА

Ткаченко Валентина Миколаївна

УДК 577.15.03.04

NADH-ЗАЛЕЖНА МОНООКСИГЕНАЗНА СИСТЕМА МІКРОСОМ ПЕЧІНКИ ТВАРИН ПРИ ДІЇ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ ТА АЛІМЕНТАРНИХ ФАКТОРІВ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: - доктор фізико-математичних наук, професор

Товстяк Володимир Васильович,

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,

завідувач кафедри біологічної і медичної фізики

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник

Мітряєва Наталія Андріївна,

НДІ медичної радіології

АМН України,

зав. відділом радіаційної біології (м. Харків),

- доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Розанов Леонід Федорович

Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків),

провідний науковий співробітник

Провідна установа:

Львівський національний університет імені Івана Франка

(кафедра біохімії) Міністерства освіти і науки України,

м. Львів

Захист дисертації відбудеться 02.11. 2005 р. о 14_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи 4.

Автореферат розісланий 01 вересня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ________________ Падалко В.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Реальні умови існування сучасної людини характеризуються істотним впливом на організм таких факторів, як: емоційний стрес, несприятливі хімічні (ксенобіотики, лікарські сполуки, харчові добавки та ін.) і фізичні фактори середовища (іонізуюче випромінювання різної природи, статична електрика та ін.), а також різний ступінь оптимальності раціону харчування (забезпеченість необхідними білками, вітамінами і т.д). Ці фактори можуть приводити до значних змін процесів метаболізму, що може викликати появу цілого ряду таких негативних явищ, як захворювання різної етіології, передчасне старіння і т.д.

З огляду на важливість і різноманіття функцій, що виконують мембрани в живому організмі, стає зрозумілим, чому ці порушення процесів метаболізму виявляються в першу чергу на рівні структурно-функціонального стану біомембран.

Одним з відомих експериментальних підходів до вивчення біомембран є дослідження в конкретних умовах експерименту стану мембранозв’язаних ферментів або ферментних систем. Однією з таких систем є електронтранспортна система мікросом печінки, яка виконує такі найважливіші функції, як метаболізм цілого ряду ендогенних сполук, детоксикація ксенобіотиків, десатурація жирних кислот і ряд інших [А.И. Арчаков, 1975, А.В. Карякин, А.И. Арчаков, 1981, А.И. Арчаков, 1983, В.В. Шуянцева и др., 1999]. Незважаючи на значну кількість робіт, ця ферментна система (і особливо її NADH-залежний ланцюг) при цілому ряді несприятливих впливів на організм залишається ще недостатньо вивченою, а наявні дані літератури досить суперечливі. Дані сучасної літератури свідчать про те, що одним з могутніх факторів-модифікаторів біомембран є іонізуюча радіація [С.Т. Рыскулова, 1986, Б.И. Поливода и др., 1990, А.Ю. Сунгуров, 1989, В.В. Товстяк, 1999], причому ступінь її впливу на організм істотно залежить від повноцінності раціону харчування, який може приводити як до посилення ушкоджуючої дії радіації, (при незбалансованості раціону харчування) [В.Я. Береза, Г.С. Яцула, 1994], так і значному її зменшенню (при повноцінному раціоні харчування, збагаченому вітамінами, іншими біологічно-активними сполуками і т.д) [Тутельян В.А., 1996, В.М. Корзун и др., 2002, В.В. Ванханен и др., 2003].

З огляду на вищесказане, вивчення структурно-функціонального стану біомембран, зокрема, мікросомальних (і особливо, вивчення стану NADH-залежного електронтранспортного ланцюга) в умовах впливу іонізуючої радіації і модифікуючої дії ступеня збалансованості раціону харчування представляється досить актуальною проблемою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових досліджень кафедри біологічної і медичної фізики Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна по темах:

-

-

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи явилося встановлення закономірностей функціонування NADH-залежної монооксигеназної системи мікросом печінки тварин при дії іонізуючої радіації та аліментарних факторів в умовах in vitro та in vivo .

Виходячи з мети, були визначені наступні задачі:

1. Дослідження змінення вмісту та активності мембранозв’язаних ферментів NADH-залежної електронтранспортної системи у мікросомах печінки щурів під впливом гамма-опромінення та сумісній дії опромінення і незбалансованої по тваринних білках і вітамінам антиоксидантного ряду дієти, а також харчової добавки (борошна ароніі чорноплідної).

2. Вивчення структурного стану мембран мікросом печінки щурів при дії гамма-опромінення та сумісній дії опромінення та різного складу дієти, а також харчової добавки аронії чорноплідної.

3. Дослідження інтенсивності аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ, вмісту гідроперекисів ліпідів, швидкості генерації супероксидного радикала та активності антиоксидантних ферментів (глутатіонпероксидази і глутатіон-S-трансферази) в мікросомах печінки тварин під впливом одноразового гамма-опромінення, незбалансованого раціону та харчової добавки аронії чорноплідної. 4. Вивчення в умовах in vitro закономірностей змінення NADH-редуктазної активності мікросомальних мембран печінки під впливом гамма-опромінення, а також вивчення ролі процесів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) у формуванні радіаційних ефектів, що спостерігаються.

5. Вивчення в умовах in vitro впливу агентів, що модифікують структурний стан мембран (тритона Х-100 та глутарового альдегіду), на характер радіаційно-індукованих змін NADH-редуктазної активності мікросом печінки.

Об’єкт дослідження. Функціонування NADH-залежної монооксигеназної системи мікросом печінки тварин під впливом іонізуючого випромінювання та аліментарних факторів.

Предмет дослідження. Активність та вміст мембранозв’язаних ферментів NADH-залежної електронтранспортної системи, інтенсивність перекісних процесів, активність антиоксидантних ферментів, структурно-функціональний стан мікросомальних мембран.

Методи дослідження. Були використані методи диференціального центрифугування, а також спектрофотометричні та флуориметричні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що найбільш чуттєвою до опромінення складовою електронтранспортного ланцюга мікросом є NADH-залежний флавопротеїд. Встановлено, що опромінення тварин, які утримувалися на незбалансованому по білкам і вітамінам антиоксидантного ряду раціоні харчування приводить до більш вираженого збільшення інтенсивності процесів ПОЛ, що може бути пов'язано зі збільшенням швидкості генерації супероксидного радикалу і зниженням глутатіонпероксидазної та глутатіон-S-трансферазної активностей мікросом. Показано, що одноразове гамма-опромінення тварин, які одержували незбалансований раціон харчування, приводить до більш виражених змін вмісту та активності компонентів NADH-залежного електронтранспортного ланцюга мікросом печінки, ніж у тварин, які утримувалися на оптимальному раціоні харчування. В експериментах в умовах in vitro при дії опромінення і агентів, що модифікують структурний стан мікросомальних мембран (тритона Х-100 та глутарового альдегіду) встановлено, що найбільше радіочутливим є NADH-залежний флавопротеїд, що узгоджується з даними, отриманими в умовах in vivo.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень по вивченню зміни ферментативної активності мікросомальних мембран під впливом різних модифікуючих факторів, поглиблюють та розширюють сучасне розуміння молекулярних механізмів впливу іонізуючих випромінювань на структурно-функціональні властивості ферментів і можуть стати основою для розробки науково-обгрунтованих схем захисту біомембран від радіаційного ушкодження.

Отримані результати також вказують на можливість підвищення радіорезистентності мембранних систем шляхом модифікації їхнього структурного стану і фізико-хімічних властивостей, у тому числі за допомогою застосування оптимального раціону харчування, особливо з використанням харчових добавок.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автор особисто проаналізував сучасну наукову літературу за темою дослідження, підібрав методи вирішення поставлених завдань та провів експериментальні роботи щодо вимірювання вмісту гемопротеїдів та активності NADH-залежної монооксигеназної системи мікросом з використанням різних субстратів окислення.

Планування напрямків досліджень та інтерпретація отриманих результатів здійснена спільно з науковим керівником, д.ф-м.н., проф. Товстяком В.В. Дослідження в умовах in vivo стану антиоксидантних ферментів було проведено сумісно зі ст. наук. співр., канд. біол. наук Нікітченко Ю.В, в умовах in vitro визначення структурного стану мікросомальних мембран були проведені сумісно зі ст. наук. співр., д.ф._м.н. Горбенко Г.П., що знайшло відображення у спільних публікаціях. Опромінення експериментальних тварин було здійснено сумісно зі ст.н. співр. Крупіним В.Д. та Ніколовим О.Т.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, що увійшли в дисертаційну роботу, були представлені та обговорені на: Радіобіологічному з'їзді (Київ, 1993); II з'їзді біофізиків Росії (Москва, 1999); науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження акад. І.М. Буланкіна (Харків, 2001), VII Міжн.наук.-практ. конф. “Наука і освіта” (Дніпропетровськ, 2004), Між.наук.-практ. конф. “Біологічні основи продуктивності та здоров'я тварин (м. Львів, 2004), III Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2004).

Публікації. Основні положення роботи викладені в 11 друкованих працях, з яких 6 статей та 5 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури по проблемі, 6 розділів, що відображають результати власних досліджень, закінчення, висновків, списку використаних джерел, що включає 269 найменувань. Повний обсяг дисертації складає 152 сторінки, 20 ілюстрацій, 12 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Для виконання роботи було використано 100 щурів-самців лінії Wistar та 20 кролів. Усі тварини утримувалися у стандартних умовах віварія Інституту біології ХНУ ім. В.Н. Каразіна і ІПКІКМ НАН України. Маніпуляції з тваринами проводили згідно до Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних наукових цілей (Страсбург, 1986).

Експериментальні щури були розбиті на 6 груп. Тварини 1-ї та 2-ї груп одержували протягом 50 днів стандартний раціон віварію [Западнюк И.П. и др., 1983], доповнений полівітамінною сумішшю “Ревіт”.

В 3-й-6-й групах експериментальних тварин недостатність раціону по тваринних білках і вітамінам антиоксидантного ряду моделювали протягом 50 днів шляхом виключення з дієти полівітамінної добавки “Ревіт”, проварюванням рослинної олії (+ 1800 С, 3 години) [З. З. Хакимов, 1988 ], а також зернової суміші та овочів (+ 1000 С, 1 година). М'ясну добавку раціону піддослідних тварин заміняли такою ж по кількості добавкою провареної зернової суміші. Тварини 5-ї та 6-ї груп на фоні незбалансованої дієти після 30 днів експерименту протягом 20 днів одержували додатково харчову добавку борошна плодів Aronia melanocarpa у концентрації 0.6 мг на одну тварину.

Опромінення щурів проводили одноразово дозою 8 Гр на установці “Дослідник”. Джерело г -опромінення Со60, потужність експозиційної дози 1.95 Гр/хв. Ізольовані мікросоми опромінювали одноразово дозами 10, 100, 1000 і 10000 Гр на лінійному прискорювачі електронів “ЛУЕ-6” [А.И. Панасенко, В.Г. Рудычев, 1991; V.G. Rudichev, I.I. Zalubovsky, 1993]. Енергія електронів при опроміненні зразків складала 5 Мев, середній струм пучка 30 мка, потужність пучка прискорених електронів 5.6 Квт, частота посилок від одноразової до 50 Гц, щільність потоку електронів на об'єктах з лінійними розмірами до 15 см до 1012 ел/см2 при неоднорідності меншої 10% (частота проходження 100 імпульсів за 1сек.).

Експериментальні тварини були розбиті на 6 груп, яким надалі було присвоєно такі позначення :1 – стандартний раціон харчування віварію, 2 – стандартний раціон харчування + -опромінення, 3 – незбалансована (по тваринним білкам та вітамінам антиоксидантного ряду) дієта, 4 – незбалансована дієта + -опромінення, 5 – незбалансована дієта + добавка аронії чорноплідної, 6 – незбалансована дієта + добавка борошна аронії чорноплідної + -опромінення.

Мікросоми печінки тварин виділяли методом диференціального центрифугування як описано у роботах [В.В. Лемешко, 1980; В.Н. Орехович, 1987].

Визначення NADH-редуктазних активностей проводили як описано в роботі [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1987] з субстратами: К3[Fe(CN)6] при довжині хвилі 420 нм, з неотетразолєвим синім при 550 нм та з 2,6-ДХФІФ - при 600 нм на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV VIS” (Німеччина) при постійному перемішенні і термостатуванні при 370С. Активність виражали в нмоль продукта, що утворюється, використовуючи коефіцієнти молярної екстинкції 1.02?103 М_?см-1 для К3[Fe(CN)6], 28.8?103 М-1?см-1 для неотетразолєвого синього та 21?103 М-1?см-1 для 2,6-ДХФІФ, відповідно [А.И. Арчаков, ].

Вміст цитохромів Р-450 і в5 визначали по Omura T. and Sato R. як описано в роботі [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1987]. Спектри поглинання гемопротеїдів записували на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV VIS”. Вміст цитохромів виражали в пмоль на 1 мг білка, використуючи коефіцієнти молярної екстинкції 91?103 М_?см-1 та 164?103 М-1?см-1 для цитохромів Р-450 та в5, відповідно.

Структурний стан мембран мікросом досліджували за допомогою флуоресцентних зондів: 1-аніліно-8-сульфоната (1,8-АНС) при довжині хвилі збудження 365 нм і флуоресценції – 470 нм, а також пірена – довжина хвилі збудження 337 нм. Коефіцієнт ексимеризації пірена розраховували по відношенню інтенсивності флуоресценції ексимерів (480 нм) і мономерів (390 нм) [Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов, 1980]. Спектри флуоресценції реєстрували на спектрофлуориметрі СМ-2203 (Беларусь) та на установці з монохроматорами МДР-23 та МСД-2 [В.А. Кобяков и др, ].

Дослідження інтенсивності аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ мікросом проводили як описано в роботі [Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков, 1972] при постійному перемішуванні та термостатуванні при 370С. Спектри поглинання пофарбованого продукту записували на спектрофотометрі “Specord UV VIS”, виміряли різницю екстинкції при довжинах хвиль 532 і 580 нм та розраховували кількість МДА, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, рівний 1.56?105 М-1?см-1.

Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів у мікросомах печінки тварин проводили за методом [Ohkawa et.al.,1979 ] з незначними змінами [В.В. Лемешко, Ю.В Никитченко, 1986]. Спектр поглинання пофарбованого продукту записували на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV VIS”, вимірюючи потім різницю екстинкції при 532 і 520 нм. Вміст гідроперекисів ліпідів виражали в еквівалентній кількості МДА.

Визначення вмісту вторинних продуктів ПОЛ - МДА в мікросомах печінки тварин проводили в безбілкових пробах мікросом (після осадження 10% ТХУ), як описано в роботі [В.Н. Орехович,1987].

Ефективність перехоплення ОН? радикалів аронією чорноплідною визначали з дезоксірібозою як описано в [B. Halliwell, et.al, 1987]. Спектр поглинання пофарбованого продукту записували на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV VIS”.

Антиокислювальну активність аронії чорноплідної визначали на моделі жовточних ліпопротеїдів, як описано в [Г.И. Клебанов и др.,1983]. Спектр поглинання пофарбованих продуктів записували на двопроміневому спектрофотометрі “Specord UV VIS”, при вимірюванні різниці екстинкції при 535 та 588 нм. Результати виражали в % по відношенню до контролю.

Дослідження швидкості генерації супероксидного радикала в мікросомах печінки щурів визначали по окисленню адреналіна в адренохром спектрофотометрично при довжині хвилі 480 нм [Р.А. Гуськова, 1980]. Швидкість генерації розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції адренохрома 4.04?103 М_?см-1 та враховуючи те, що для окислення 1 М адреналіна необхідно 1.4 М [Р.А. Гуськова 1980].

Визначення глутатіонпероксидазної активності проводили в мікросомах печінки щурів спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм як описано в [В.З. Ланкин, С.М. Гуревич, 1976]. Активність виражали в нмоль NADPH/хв. мг білка, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 6.22?103 М-1?см-1

Визначення глутатіон-S-трансферазної активності проводили в мікросомах печінки щурів спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм як описано в роботі [M. Jones еt.al,1980]. Активність розраховували з використанням коефіцієнта молярної екстинкції 9.6·103 М-1·см-1.

Вміст білка в досліджуваних зразках визначали по методу Лоурі і співавторів в модифікації Міллера [S.I. Miller 1959].

Статистичну обробку результатів було проведено за допомогою комп’ютерного пакета програм “Exel та Statistika 6,0” з використанням t критерія Ст’юдента та кореляційного аналізу по Спірману. Відміни вважали значущими при P < 0.05.

Результати власних досліджень та їх обговорення

NADH-редуктазна активність і вміст цитохромів у мікросомах печінки щурів при дії гамма-опромінення та аліментарних факторів. Дослідження показали, що NADH-феррицианід редуктазна активність мікросом, яка каталізується безпосередньо NADH-специфічним флавопротеїдом [А.И. Арчаков, 1975], у відповідь на гамма-опромінення щурів, що одержували стандартний раціон харчування, дещо збільшувалася (на 19.0%, 0.05 < р < 0.10 ). Опромінення щурів, які утримувалися на незбалансованому раціоні харчування, приводило до значно більшого достовірного зниження досліджуваної активності. Додавання протягом 20 днів до незбалансованого раціону щурів харчової добавки аронії чорноплідної запобігало інгібуючу дію гамма-опромінення на NADH-феррицианід редуктазну активність мікросом печінки (Рис. 1).

NADH-неотетразолій редуктазна активність мікросом печінки, яка каталізується, як відомо, комплексом NADH-залежний флавопротеїд-фосфоліпіди-цитохром в5 [А.И. Арчаков,1975], на відміну від NADH-феррицианід редуктазної активності, вірогідно не змінювалася при усіх вивчених впливах. Відсутність значних змін досліджуваної активності у відповідь на гамма-опромінення тварин може бути обумовлена впливом іонізуючої радіації на ефективність взаємодії флавопротеїд-цитохром в5, або на рівень гемопротеїда.

Рис. 1. NADH-феррицианід редуктазна активність мікросом печінки щурів при дії гамма-опромінення та аліментарних факторів.

Примітки: 1 – стандартний раціон харчування віварію, 2 – стандартний раціон харчування + -опромінення, 3 – незбалансована (за тваринними білками та вітамінами антиоксидантного ряду) дієта, 4 – незбалансована дієта + -опромінення, 5 – незбалансована дієта + добавка аронії чорноплідної, 6 – незбалансована дієта + добавка аронії чорноплідної + -опромінення. P < 0,05 у порівнянні з 3 дослідною групою.

Проведені дослідження впливу гамма-опромінення та аліментарних факторів на вміст цитохрома в5 у мікросомах печінки щурів дозволило установити, що опромінення тварин 2-ї групи, які знаходилися на стандартному раціоні харчування, приводило до достовірного збільшення (на 25.6%) рівня гемопротеїда (Рис. 2).

Рис. 2. Вміст цитохрому в5 в мікросомах печінки щурів.

Примітки: * - P < 0,05 у порівнянні з 1-ю групою; ** - P < 0,05 у порівнянні з 3-ю групою; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Вміст цитохрома в5 у мікросомах печінки щурів, що одержували незбалансований раціон харчування, був також дещо підвищеним (на 19.5 %, 0.05 р 0.10 ) у порівнянні з рівнем гемопротеїда тварин контрольної групи. Разом з тим, опромінення тварин 4-ї групи, які знаходилися на незбалансованій дієті, приводило до достовірного зниження вмісту цитохрома в5 (Рис. 2) у порівнянні з тваринами 3-ї групи. Внесення в раціон харчування борошна аронії чорноплідної нормалізувало вміст цитохрома в5 у мікросомах печінки щурів 5-ї групи і запобігало зниженню вмісту гемопротеїда при опроміненні тварин 6-ї групи (Рис. ).

Проведені дослідження вмісту цитохрома Р-450 дозволило установити, що опромінення тварин 2-ї групи, які одержували оптимальний раціон харчування, дещо збільшувало рівень гемопротеіду (на 23.2%), а 4-ї групи (незбалансований раціон харчування) вірогідно знижувало його концентрацію (Рис. 3).

Рис. 3. Вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів.

Примітки: * - P < 0,05 у порівнянні з 3 групою; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Внесення борошна аронії чорноплідної запобігало зниженню вмісту цитохрома Р-450, яке було викликане гамма-опроміненням тварин (Рис. 3). У зв'язку з тим, що зниження концентрації цитохрома Р-450, викликане іонізуючим випромінюванням, часто пов'язують з активацією вільнорадикального окислювання ліпідів [Т.И. Ґудзь и др. 1986; Л.Г. Глушакова и др. 2000; В.В. Шуянцева и др. 1999], можна припустити, що нормалізуюча дія аронії чорноплідної пов'язана з антиоксидантними властивостями досліджуваної харчової добавки, або з її здатністю підвищувати надійність ендогенної антиоксидантної системи організму.

Зокрема, у нашій лабораторії показано, що водо- та жиророзчинні екстракти з плодів аронії чорноплідної сповільнювали збільшення концентрації продуктів вільнорадикального окислювання ліпідів в опромінених тимоцитах щурів [В.В. Товстяк, 1992].

У цілому, розглянуті дані свідчать, що гамма-опромінення тварин, які отримували незбалансований раціон харчування, приводить до зниження NADH-феррицианід редуктазної активності, а також значного зниження вмісту цитохромів Р-450 і в5 мікросом печінки.

При цьому, виявлена незмінність NADH-неотетразолій редуктазної активності може пояснюватися зміною рухливості цитохрома в5 у ліпідному біслої мембрани, що суттєво для передачі електрона з флавопротеїда на акцептор неотетразолій синій. З іншого боку, виявлене збільшення NADH-феррицианід редуктазної активності і вмісту цитохрома в5 у мікросомах печінки тварин 2-ї групи (опромінені тварини, що знаходилися на стандартному раціоні харчування) може бути обумовлено однією зі складових адаптаційної відповіді організму на одноразове гамма-опромінення. Застосування на фоні незбалансованої дієти харчової добавки аронії чорноплідної нормалізувало усі вивчені показники монооксигеназної системи.

Сруктурний стан мембран мікросом печінки щурів при дії гамма-опромінення та аліментарних факторів. Однією з основних причин зниження активності та вмісту мембранозв’язаних ферментів мікросом при дії іонізуючої радіації може бути зміна структури самих мембран ендоплазматичного ретикулума [Е.П. Сидорик, А.П. Бурлака, 2000]. Численні дані свідчать про зростання плинності ліпідного бішару [A.Yu. Sungurov et al. 1985; S. Yonei et al., 1979; E. Grzelinska et al. 1979], збільшенні швидкості обертальної та латеральної дифузії ліпідних молекул під впливом іонізуючого випромінювання [J. al., 1984].

Представлені на Рис. 4 дані свідчать, що у відповідь на гамма-опромінення інтенсивність флуоресценції 1,8-АНС у мікросомах печінки тварин, які отримували стандартний раціон харчування, збільшувалася. При цьому, більш виражене збільшення інтенсивності флуоресценції спостерігалося при додаванні відносно малих концентрацій зонда.

Рис. 4. Інтенсивність флуоресценції 1,8-АНС в мікросомах печінки щурів в залежності від концентрації зонда.

Примітки: позначення 1-6 див. Рис. 1.

Інтенсивність флуоресценції 1,8-АНС мікросом печінки щурів, які отримували протягом 50 днів незбалансований раціон харчування, вірогідно не відрізнялася від інтенсивності флуоресценції зонда у тварин, що містилися на стандартній дієті. Разом з тим, у відповідь на гамма-опромінення щурів, що одержували незбалансований раціон харчування, інтенсивність флуоресценції 1,8-АНС у мікросомах збільшувалася більш виражено, ніж у опромінених тварин, які утримувались на стандартному раціоні харчування (2 група). Опромінення тварин, що містились на незбалансованій дієті та одержували протягом 20 днів додатково харчову добавку борошна аронії чорноплідної (6 група), не приводило до збільшення інтенсивності флуоресценції 1,8-АНС у мікросомах печінки ні при одній з досліджуваних концентрацій зонда (Рис. 4).

Константа зв'язування (Ks) 1,8-АНС мікросом печінки у відповідь на гамма-опромінення тварин, які отримували збалансований раціон харчування (2 група), знижувалась у 1.9 рази в порівнянні з неопроміненими шурами. Ще більш виражене зниження Ks 1,8-АНС (в 2.6 рази) було виявлено у опромінених щурів, що містяться на незбалансованому раціоні харчування (Рис. 5). Опромінення тварин, які отримували додатково харчову добавку ароніі чорноплідної, не приводило до істотних змін Ks 1,8-АНС у мікросомах печінки, тобто знаходилося на рівні контролю.

Рис. 5. Константи зв'язування (KS) 1,8-АНС в мікросомах печінки щурів при впливі гамма-опромінення та аліментарних факторів.

Примітки: * - P < 0,5 у порівнянні з 1 групою; ** - P < 0.05 у порівнянні з 3 групою; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Виявлене зниження Ks 1,8-АНС у відповідь на гамма-опромінення свідчить про збільшення спорідненості зонда до мікросомальної мембрани, що може бути головною причиною збільшення інтенсивності флуоресценції 1,8-АНС. Збільшення інтенсивності флуоресценції 1,8-АНС при дії ряду факторів обумовлено, в основному, зниженням негативного заряду на поверхні мембран [Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов, 1980]. Тому можна припустити, що одноразове гамма-опромінення тварин викликає зміну розподілу заряджених груп на поверхні мембран мікросом печінки. При цьому важливо підкреслити, що незбалансований раціон харчування підсилює ці зміни, а харчова добавка борошна аронії чорноплідної цілком їх нівелює.

Дослідження структурного стану мембран мікросом печінки за допомогою іншого флуоресцентного зонда – пірена, дозволило установити, що інтенсивність флуоресценції ексимерів та мономерів пірена при дії гамма-опромінення, аліментарних факторів, а також їхньої спільної дії, істотно не змінювалася.

Таким чином, отримані експериментальні дані свідчать про те, що гамма-опромінення тварин (особливо тих, що одержували незбалансований раціон харчування), приводить до вираженої перебудови мембран, яка супроводжується зниженням кількості негативно заряджених груп на ліпід-білковій поверхні мембран мікросом. Внесення харчової добавки борошна аронії чорноплідної нівелювало структурні зміни мембран.

Інтенсивність вільнорадикального окислювання ліпідів та його регуляція в мікросомах печінки щурів при дії гамма-опромінення та аліментарних факторів. Зміна структурно-функціонального стану мембран ендоплазматичного ретикулума при дії радіації може визначатися багатьма факторами, провідну роль серед яких займає вільнорадикальне окислювання ліпідів [В.А. Барабой, Д.А. Сутковой, 1997; Е.П. Сидорик, А.П. Бурлака 2000].

Представлені на рис. 6 дані свідчать про те, що у відповідь на гамма-опромінення вміст гідроперекисів ліпідів у мікросомах печінки тварин, які отримували стандартний раціон харчування, збільшувався.

Ще більш виражене збільшення вмісту гідроперекисів ліпідів у відповідь на опромінення виявлено в мікросомах печінки щурів, що одержували незбалансований раціон харчування. У цьому випадку, концентрація продуктів ПОЛ зростала на 65% у порівнянні з неопроміненими тваринами 1-ї групи (Рис. ). Більш виражене збільшення гідроперекисів ліпідів в мікросомах печінки опромінених тварин, які отримували незбалансований раціон, очевидно пов'язане з тим, що сама по собі незбалансована дієта вірогідно збільшувала концентрацію продуктів ПОЛ в мікросомах (Рис. 6, 3-я група).

Виявлене збільшення вмісту продуктів ПОЛ у відповідь на незбалансовану дієту узгоджується з даними роботи [Е.П. Сидорик, А.П. Бурлака, 2000] і може свідчити про активацію вільнорадикального окислювання ліпідів. Однак, більш конкретніше на це питання можна відповісти при дослідженні інтенсивності безпосередньо ПОЛ. Представлені на Рис. 7 дані свідчать, що змінення швидкості накопичення МДА при аскорбат-індукованому ПОЛ мікросом у відповідь на гамма-опромінення були подібними зі зміненнями вмісту гідроперекисей ліпідів. При цьому, більш виражене збільшення інтенсивності аскорбат-індукованого ПОЛ мікросом було у опромінених тварин, які отримували незбалансований раціон харчування.

Рис. 6. Вміст гідроперекисів ліпідів в мікросомах печінки щурів при дії гамма-опромінення та аліментарних факторів.

Примітки: * - P < 0,05 у порівнянні з 1 групою; ** - P < 0,05 у порівнянні з 3 групою; *** - P < 0,05 у порівнянні з 4 групою; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Опромінення тварин, що одержували на фоні незбалансованого раціону харчування аронію чорноплідну, дещо збільшувало інтенсивність ПОЛ і вміст гідроперекисів ліпідів, однак по абсолютній величині ці показники ПОЛ залишались вірогідно нижче, ніж в опроміненій 4-й групі тварин (Рис. 7). Ці результати узгоджуються з раніше отриманими нами даними про антиоксидантні властивості водо- та жиророзчинних екстрактів з плодів аронії чорноплідної на ізольованих тимоцитах щурів [В.В. Товсґяк,1992].

В нашій роботі дослідження ефективності антиоксидантної та антирадикальної дії плодів аронії чорноплідної, показали, що антиокислювальна активність досліджуваної харчової добавки була одного порядку з активністю відомого антиоксиданту ?-токоферолу. Також було встановлено, що здібність аронії чорноплідної перехоплювати реакційно здібний гідроксильний радикал була порівняна з таким відомим перехоплювачем ОНрадикалів як манніт.

Рис. 7. Інтенсивність аскорбат–Fe2+-індукованого перекісного окислення ліпідів в мікросомах печінки щурів під впливом гамма-опромінення та аліментарних факторів.

Примітки : * - P < 0,05 у порівнянні з 1 групою; ** - P < 0,05 у порівнянні з 3 групою; *** - P < 0,05 у порівнянні з 4 групою; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Проведені дослідження швидкості генерації супероксидного радикала в мікросомах печінки свідчать, що у відповідь на гамма-опромінення тварин, які отримували стандартний раціон харчування і незбалансований по білкам і вітамінам раціон, швидкість генерації збільшувалась в обох досліджуваних групах (Табл. 1).

При цьому, найбільш виражене збільшення (на 61.1%) швидкості генерації було в мікросомах печінки опромінених щурів, що одержували незбалансоване харчування. Збільшенням швидкості генерації супероксидного радикала можна пояснити виявлене нами збільшення інтенсивності ПОЛ в мікросомах печінки щурів, які отримували незбалансований раціон харчування, і, особливо виражене збільшення ПОЛ, при опроміненні цих тварин. Про провідну роль радикалів в активації ПОЛ мікросом можуть свідчити отримані дані щодо зниження швидкості генерації і інтенсивності ПОЛ у мікросомах печінки 5-ї (незбалансована по тваринних білкам і вітамінам антиооксидантного ряду дієта) і 6-ї (незбалансована по тваринних білкам і вітамінам антиоксидантного ряду дієта + гамма-опромінення) груп, які протягом 20 днів одержували харчову добавку борошна аронії чорноплідної. Аналіз отриманих даних дозволив встановити, що показники швидкості генерації , інтенсивності аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ і вмісту гідроперекисів ліпідів добре корелюють. Коефіцієнт кореляції склав 0.889 (Р = 0.018) і 0.962 (Р = 0.020) відповідно.

Відомо, що інтенсивність ПОЛ біомембран знаходиться під контролем антиоксидантних ферментів [В.А.Барабой, Д.А. Сутковой 1997, И.Н.Верхогляд, Б.А. Цудзенвич, 1992]. Проведені нами дослідження глутатіонпероксидазної активності мікросом, яку виявляють, як відомо, ряд ізоферментів мембранозв’язаної глутатіон-S-трансферази [K. Yamaoka et al, 1991], дозволили установити, що ця активність у відповідь на гамма-опромінення, незбалансовану дієту, а також на їхню спільну дію знижувалася на 19.7, 22.9 і 38.9%, відповідно, в порівнянні з аналогічною активністю у тварин 1-ї групи (Табл.1).

Таблиця 1

Швидкість генерації , глутатіонпероксидазна та глутатіон-S-трансферазна активності в мікросомах печінки щурів під впливом гамма-опромінення та аліментарних факторів

Варіанти дієти | Визначені параметри

Генерація ,

нмоль /хв мг білка | Глутатіонперокси-дазна активність нмоль NADРH/хв мг білка | Глутатіон-S-

трансфераз-

на активність нмоль ХДНБ/хв мг білка

1 | 28,3 2,6 | 12,74 0,84 | 55,9 4,7

2 | 38,2 3,6 * | 10,23 0,91 | 52,0 4,2

3 | 40,5 3,4 * | 9,82 0,55 * | 68,1 5,0

4 | 45,6 5,2 * | 7,78 0,43 *, ** | 47,5 1,9 *

5 | 34,9 4,1 | 9,35 0,67 *, ** | 61,9 5,6

6 | 36,9 2,8 | 1,36 0,50 *, **, *** | 50,9 3,4 *

Примітки: Р 0.05 у порівнянні з 1-ю групою тварин; ** Р 0.05 у порівнянні з 3-ю дослідною групою тварин; *** Р 0.05 у порівнянні з 5-ю групою тварин; позначення 1-6 див. Рис.1.

У цьому випадку важливо відзначити, що глутатіонпероксидазна активність мікросом печінки опромінених щурів, які отримували незбалансований раціон харчування, була найбільше низькою, а інтенсивність аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ і вміст гідроперекисів ліпідів найбільш високими, у порівнянні з іншими групами експериментальних тварин.

Добавка борошна аронії чорноплідної не приводила до нормалізації глутатіонпероксидазної активності в мікросомах печінки тварин, які одержували незбалансований раціон харчування. Не виявлено уповільнення зниження глутатіонпероксидазної активності при додаванні харчової добавки і у щурів 6-ї групи (Табл. 1).

Глутатіон-S-трансферазна активність мікросом з 1-хлор-2,4-дінітробензолом в якості субстрату (з яким активні практично всі ізоферменти цього ферменту) у відповідь на гамма-опромінення тварин, що одержували стандартний раціон харчування, істотно не змінювалася (Табл. 1). Незбалансована дієта протягом 50 днів приводила до деякого збільшення (на 21.8%, 0.10 > Р > 0.05) активності, а опромінення цих тварин до достовірного зниження (на 30.3%, Р < 0.05). Добавка борошна аронії чорноплідної істотно не впливала на глутатіон-S-трансферазну активність мікросом печінки тварин 5-ї групи і не сповільнювала зниження активності ферменту при опроміненні щурів 6-ї групи (Табл. 1).

Разом з тим, той факт, що добавка борошна аронії чорноплідної нормалізувала інтенсивність аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ і вміст гідроперекисів ліпідів у мікросомах печінки опромінених щурів може свідчити про більш складний механізм захисту від радіаційного ушкодження мікросом, у якому глутатіон-S-трансфераза є не єдиним компонентом захисту.

Взагалі, отримані дані дозволяють зробити висновок, що гамма-опромінення тварин приводить до збільшення інтенсивності аскорбат-Fe2+-індукованого ПОЛ і концентрації гідроперекисів ліпідів у мікросомах печінки, що пов'язано зі збільшенням швидкості генерації супероксидних радикалів і зниженням глутатіонпероксидазної та глутатіон-S-трансферазної активностей. При цьому виявлено, що більш виражений зсув прооксидантно-антиоксидантного балансу в напрямку прооксидантів спостерігали при незбалансованому по тваринним білкам і вітамінам антиоксидантного ряду раціоні харчування. Внесення в їжу борошна аронії чорноплідної, яка в умовах in vitro володіла вираженою антиоксидантною та антирадикальною активностями, в умовах in vivo нормалізувала інтенсивність процесів ПОЛ в мікросомах печінки опромінених тварин, ймовірно, за рахунок збільшення надійності неферментативної антиоксидантної системи.

Зміна NADH-редуктазної активності мікросом печінки під впливом іонізуючого випромінювання в умовах in vitro. При аналізі променевих реакцій живих організмів стає очевидною їхня залежність від нескінченної безлічі важко контрольованих фактів, що ускладнює інтерпретацію ключових моментів процесу радіаційного ушкодження та його результат. Тому в даній роботі було проведено дослідження в умовах in vitro закономірностей зміни NADH-редуктазної активності мікросомальних мембран печінки під впливом одного з видів іонізуючої радіації – електронного опромінення.

Проведені дослідження ступеня радіочутливості NADH-редуктази від концентрації мікросомального білка печінки дозволили установити, що концентрація мембранного білка 0.23 мг/на 1 мл опроміненої суспензії є найбільш оптимальною при дослідженні активності фермента з двома типами акцепторів (К3[Fе(СN)6] та 2,6-ДХФІФ) електронів.

Дослідження в залежності від дози опромінення показали, що достовірне зниження NADH-редуктазної активності спостерігалось при дозі 1104 Гр (табл. 2).

При цьому NADH-феррицианід редуктазна активність, яка визначається в основному NADH-залежним флавопротеїдом, знижувалась більш виразно (на 67%), ніж NADH-2,6-ДХФІФ-редуктазна активність (на 36%). Більш виражені радіаційні зміни NADH-феррицианід редуктазної активності по відношенню з NADH-2,6-ДХФІФ-редуктазною виявлені і при холодовій інкубації (протягом 1  і   год.) опромінених мікросом печінки.

Таблиця 2

Залежність NADH-2,6-ДХФІФ- та NADH-K3[Fe(CN)6]-редуктазних активностей суспензії мікросом печінки тварин від дози опромінення

Доза опромінення, Гр | NADH-2,6-ДХФІФ- редуктазна активність,

нмоль/хвмг білка | NADH-K3[Fe(CN)6] редуктазна активність, мкмоль/хвмг білка

Контроль | 335.3 24.1 | 2.30 0.22

10 | 339.1 29.2 | 2.31 0.22

1102 | 323.3 32.1 | 2.29 0.21

1103 | 294.1 26.4 | 1.96 0.18

1104 | 215.2 20.2* | 0.77 0.09*

Примітки:* - Р ? 0.05 у порівнянні з відповідним контролем; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Інтенсивність ПОЛ в опромінених зразках мікросом значно збільшувалась (в 4.0 рази) уже при дозі 1102 Гр, а при дозі 1104 Гр перевищувала рівень ПОЛ контрольної групи мікросом більш, ніж в 17.0 разів. Водорозчинний антиоксидант – тіосечовина, в концентрації 100 мМ суттєво сповільнював (в 3.0 рази) інтенсивність ПОЛ опроміненої суспензії мікросом. Однак, практично не впливав на радіаційно-індуковане зниження NADH-редуктазної активності з двома акцепторами електронів.

Дослідження впливу мембранотропних агентів (детергента тритона Х-100 та так званого “зшиваючого” агента – глутарового альдегіда) на характер радіаційно-індукованих змін NADH-редуктазної активності мікросом печінки дозволило установити, що тритон Х-100 в концентраціях 0.01 та 0.05% збільшував NADH-редуктазну активність, а глутаровий альдегід в цих же концентраціях суттєво її знижав (табл. 3). При цьому в обох випадках ефект змінення NADH-K3[Fe(CN)6]- редуктазної активності був більш вираженим, ніж у випадку NADH-2,6-ДХФІФ- редуктази.

При дослідженні сумісної дії модифікуючих агентів та іонізуючого випромінювання на NADH-редуктазну активність мікросом печінки, виявлено, що опромінення мікросомальних суспензій високоенергетичними електронами модифікує ефект впливу тритону Х_на активність досліджуваного ферменту (табл. 4). Пострадіаційна зміна NADH-2,6-ДХФІФ редуктазної активності в присутності тритону Х-100 виражена в набагато більшій мірі і складає 51% інгібування на відміну від 35% інгібування, що спостерігається під час відсутності детергенту.

Таблиця 3

Змінення NADH-2,6-ДХФІФ- та NADH-K3[Fe(CN)6]-редуктазних активностей мікросом печінки тварин в присутності тритона Х-100 та глутарового альдегіда (М ± m; n = 10)

Концентрація

агента, % | NADH-2,6-ДХФІФ- редуктазна активність

нмоль/хвмг білка | NADH-K3[Fe(CN)6]

редуктазна активність

нмоль/хвмг білка

Тритон Х-100

0 (Контроль) | 175.3 ± 1.2 | 1023.0 ± 42.6

0.01 | 178.7 ± 2.4 | 1435.1 ± 68.4*

0.05 | 196.0 ± 3.2* | 1804.5 ± 24.6*

Глутаровий альдегід

0 (Контроль) | 160.1 ± 1.2 | 1081.4 ± 24.6

0.01 | 144.2 ± 1.2* | 781.5 ± 24.6*

0.05 | 83.5 ± 3.2* | 142.1 ± 65.1*

Примітки:*- Р < 0.05 у порівнянні з відповідним контролем; позначення 1_6 див. Рис.1.

Таблиця 4

Змінення NADH-2,6-ДХФІФ- та NADH-K3[Fe(CN)6]-редуктазних активностей мікросом печінки тварин в присутності модифікуючих агентів після дії радіації

Умови експерименту | NADH-2,6-ДХФІФ

редуктазна активність,

нмоль/хвмг білка | NADH-K3[Fe(CN)6] редуктазна активність,

нмоль/хвмг білка

Контроль | 108.3 ± 0.8 | 1019.1 ± 83.2

Опромінення 1104 Гр | 70.4 ± 3.2* | 632.2 ± 20.1*

Тритон Х-100, 0.05%

Контроль | 120.0 ± 1.0 | 1783.4 ± 107.2

Опромінення 1104 Гp | 59.0 ± 2.4* | 642.0 ± 3.1*

Глутаровий альдегід, 0.001%

Контроль | 107.1 ± 7.0 | 1015.3 ± 30.1

Опромінення 1104 Гр | 60.3 ± 3.1* | 325.0 ± 30.2*

Примітки: *- Р < 0.05 у порівнянні з відповідним контролем; позначення 1-6 див. Рис. 1.

Подібний ефект спостерігається і у випадку радіаційної модифікації NADH3[Fe(CN)6]-редуктазної активності мікросомальних мембран, попередньо проінкубованих з детергентом. При цьому слід зазначити, що тритон Х-100 сенсибілізує даний вид активності ферменту до дії опромінення в більшому ступені, ніж NADH-2,6-ДХФІФ-редуктазну активність.

Важливо відзначити, що при радіаційній модифікації мікросомальних мембран, що були оброблені глутаровим альдегідом, більш виражене змінення NADH-редуктазної активності також було при використанні в якості акцептора електронів K3[Fe(CN)6].

Отримані результати свідчать про те, що в умовах in vitro при опроміненні ізольованих мікросом та мікросом, оброблених тритоном Х-100 та глутаровим альдегідом найбільш радіочутливим є NADH-залежний флавопротеїд, що узгоджується з даними, отриманими в умовах in vivo.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено збільшення активності компонентів NADH-залежного електронтранспортного ланцюга мікросом при гамма-опроміненні тварин, які отримували збалансований по білкам і вітамінам раціон харчування. Опромінення тварин, які містились на незбалансованому раціоні харчування, приводило до зниження NADH-феррицианід редуктазної активності і вмісту цитохромів в5 і Р-450. Причому, найбільш істотні зміни спостерігалися у випадку NADH-феррицианід редуктазної активності, каталізуємої безпосередньо відповідним флавопротеїдом.

2. Опромінення тварин, які одержували незбалансований раціон харчування, приводило також до вираженої перебудови мембран мікросом (що вимірювалась по зміненню інтенсивності флуоресценції пірена і 1,8-АНС).

3. Встановлено збільшення інтенсивності