ІНСТИТУТ УРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ

ВОРОБЕЦЬ ДМИТРО ЗІНОВІЙОВИЧ

УДК 616.697-02:616.69-007.5

Порушення антиоксидантної та іон-транспортувальних систем сперматозоїдів при чоловічій неплідності та їх корекція

14.01.06 – УРОЛОГІЯ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на базі відділення сексопатології та андрології Інституту урології АМН України та кафедри урології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бойко Микола Іванович

Інститут урології АМН України, головний науковий співробітник

відділення сексопатології та андрології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Щербак Олександр Юрійович,

Київська медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Щупика МОЗ України,

професор кафедри урології

доктор медичних наук, професор Лісовий Володимир Миколайович,

Харківська державний медичний університет МОЗ України

завідувач кафедри урології та андрології

Провідна установа: Одеський державний медичний університет імені М.І. Пирогова

МОЗ України, кафедра урології та нефрології

Захист дисертації відбудеться 18.10.2005 р. о 15 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.615.01 в Інституті урології АМН України за адресою: 04053, м. Київ, вул. Ю. Коцюбинського, 9а.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту урології АМН України за адресою: 04053, м. Київ, вул. Ю. Коцюбинського, 9а.

Автореферат розісланий 16.09.2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, старший науковий співробітник Л.М. Старцева

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За інформацією ВООЗ (WHO, 1987, 1992, 1999) в кінці ХХ століття кількість бездітних сімей у світі досягла 10-15%. Але, якщо дотепер безплідний шлюб, головним чином, пов’язували з патологічними процесами в органах статевої системи жінок, причиною яких переважно є ендогенні чинники, то постійно зростаюча дія на організм екзогенних чинників фізичної, хімічної та біологічної природи, а також негативного впливу стресових навантажень обумовили появу у чоловіків патоспермії. Як наслідок, чисельність безплідних шлюбів з їх вини зросла до 24-61% (Возианов А.Ф., Горпинченко И.И., 1998; Бойко Н.И., Добровольская Л.И., 2003; Haidl G., 2002).

До найбільш поширених захворювань, які викликають чоловічу субфертильність або неплідність належать: хронічний простатит – 39-46%; варикоцелє – 8-27%; епідидиміт – 9-12%; обтураційна аспермія – 6-10% і крипторхізм – 4-5% (Козловський І.В., 2000; Юнда И.Ф., 1990; Shaeffer A.J., 2003).

Патологічні процеси, які відбуваються у сім’яниках і придаткових залозах, змінюють структуру і форму сперматозоїдів, що знижує їх рухливість і запліднюючу здатність (Бойко Н.И., 2005; Aitken R.J., 1995, 1999; Storey B.T., 1997). Загальноприйняті методи діагностики неплідності, а саме: клініко-морфологічні, цитологічні, бактеріологічні тощо не завжди вказують на причину зниження життєздатності і біологічної повноцінності сперматозоїдів, не розкривають механізму змін, а також недостатньо точно і повно його відображають (Горпинченко І.І., Гула Н.М.,

Маргітіч В.М., 2001; Leijonhufvud K.G., 1997).

У цьому зв’язку відомо, що пероксидна оксидація ліпідів – універсальний механізм ушкодження клітинних мембран при різних патологіях (Agarwal A., 2002; Aitken R.J., Buckingham D.W., 1992). У знешкодженні вторинних продуктів пероксидації та інших окиснених речовин головну роль відіграє глутатіонова антипероксидна система (Dandekar, G.D., 2002; Garrido N., 2004; Raijmakers M.T., 2004).

Na+,K+-АТФаза та Ca2+,Mg2+-АТФаза належать до основних систем, що здійснюють первинний активний транспорт іонів та формують на мембрані електрохімічні градієнти, енергія яких використовується для забезпечення життєдіяльності клітини і підтримання гомеостазу Са2+ (Болдырев А.А., 2001; Carafoli E., 1991).

Іонізований кальцій, як відомо, є одним з основних внутрішньоклітинних месенджерів, який регулює десятки клітинних функцій (Костюк П.Г., 1986; Guerin D., 1998). Ймовірно, активність транспортувальних АТФаз у підтриманні гомеостазу Са2+ повинна корелювати з активністю інших метаболічних систем, зокрема з комплексом глутатіонзалежних ферментів, які є основою антиоксидантної системи (Wennemuth G., Babcock D.F., 2003). Зважаючи на це, можна припустити, що Са2+ бере безпосередню чи опосередковану участь у регуляції активності глутатіонової антиоксидантної системи. До того ж іони кальцію, як внутрішньоклітинні месенджери, регулюють процеси, які ініціюють рухливість, капацитацію і акросомну реакцію сперматозоїдів (Breitbart H., Rubinstein S., 2000; Dorval V., Dufour M., 2002; Williams K.M., Ford W.C. 2003). Тому дослідження, спрямовані на вивчення антиоксидантної системи та механізмів енергозалежного та енергонезалежного трансмембранного переміщення іонів, повинні призвести до встановлення закономірностей, які лежать в основі рухливості, акросомної реакції і запліднювальної здатності сперматозоїдів і розробки методів корекції якості сперми.

З огляду на важливу роль структурно-функціональної повноцінності сперматозоїдів у репродукції людини, проведені нами дослідження спрямовані на вивчення активності глутатіонової антиоксидантної системи і спроби її корекції, а також іонного гомеостазу та активності АТФаз при різних формах неплідності чоловіків, що має як теоретичне, так і практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в рамках трьох тем: "Роль іонів кальцію, калію, натрію і транспортних АТФаз у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів" (шифр державної реєстрації № 0196И024411), "Вивчити механізми регуляції обмінних процесів у репродуктивних органах, ооцитах і ембріонах та розробити способи стимуляції процесів відтворення. Удосконалити склад інкубаційних середовищ для запліднення in vitro" (шифр державної реєстрації № 198U009013) та "Регуляторна роль іонів кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин" (шифр державної реєстрації № ІН 07.00.0001.04).

Мета та задачі дослідження. Підвищення ефективності діагностики та лікування чоловічої неплідності шляхом встановлення критеріїв якості сперми з врахуванням активності глутатіонової антиоксидантної системи та іонного гомеостазу і застосування препаратів з антиоксидантними властивостями.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Проаналізувати етіологічні фактори, які спричинили патоспермію та розвиток неплідності чоловіків.

2. Встановити оптимальні умови для визначення глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної активності та транспортувальних АТФаз сперматозоїдів.

3. При різних формах неплідності дослідити вміст малонового діальдегіду та активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи сперматозоїдів, та продемонструвати здатність Са2+ регулювати ці процеси.

4. У здорових та неплідних чоловіків виявити корелятивні співвідношення між показниками еякуляту та концентрацією Са2+, активністю ферментів глутатіонової антиоксидантної системи, транспортувальних АТФаз.

5. Розробити метод діагностики чоловічої неплідності шляхом встановлення комплексної ролі показників пероксидації ліпідів, активності ферментів антиоксидантної системи, Са2+ гомеостазу та Na+,K+-, Ca2+,Mg2+-АТФаз.

6. Визначити співвідношення іонів Са2+ в спермі неплідних чоловіків, які здатні забезпечити збереження максимально можливої кількості життєздатних і функціонально повноцінних сперматозоїдів в еякулятах.

Об’єкт дослідження. Пацієнти з патоспермією при екскреторній та секреторній формах неплідності; глутатіонова антиоксидантна система сперматозоїдів; вміст Са2+ і активність Na+,К+-, Са2+-,Мg2+-АТФаз у спермі чоловіків.

Предмет дослідження. Вплив препаратів з антиоксидантними властивостями на активність глутатіонової антиоксидантної системи сперматозоїдів та їх морфо-функціональні показники при різних формах неплідності; зміни гомеостазу іонів та активності транспортувальнихних АТФаз при патоспермії; взаємозв’язок глутатіонової антиоксидантної та іон-транспортувальних систем.

Матеріали і методи дослідження. Клінічне обстеження пацієнтів в динаміці, загальноклінічні лабораторні, мікробіологічні, бактеріологічні культуральні методи дослідження, імуноферментні методи діагностики. Центрифугування, виділення сперматозоїдів, пермеабілізація сперматозоїдів сапоніном, визначення концентрації білка, визначення активності глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази та глутатіонтрансферази, оцінка стану ПОЛ, визначення Са2+,Mg2+- та Na+,К+-АТФазних активностей, полум’яна фотометрія, світлова та електронна мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. При різних формах неплідності отримані нові дані про стан пероксидації ліпідів та антиоксидантний захист за участю ферментів глутатіонової системи сперматозоїдів.

Вперше у хворих з екскреторно-токсичною та секреторною неплідністю виявлено взаємозв’язок між активністю ферментів глутатіонової антиоксидантної системи, транспортувальних АТФаз та морфо-функціональними характеристиками сперматозоїдів.

Отримані нові дані стосовно впливу лікарських препаратів з антиоксидантними властивостями (вітамін Е, вітамін С) та сульфату цинку на активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи і якість сперми в процесі лікування різних форм неплідності.

Уперше доведено, що препарати з антиоксидантними властивостями призводять до зростання кількості рухливих сперматозоїдів та зменшення кількості патологічних форм тільки при екскреторно-токсичній формі неплідності.

Уперше фертильну повноцінність сперми визначено за вмістом та розподілом іонів кальцію у сперматозоїдах та спермальній плазмі.

Уперше встановлено, що збільшення концентрації Са2+ та зростання активності транспортувальних АТФаз у сперматозоїдах свідчить про розвиток патоспермії. Лікування хворих з екскреторно-токсичною формою неплідності стабілізує активність АТФаз.

Практичне значення роботи Запропоновані нові додаткові методи діагностики патологічних процесів за співвідношенням активності ферментів глутатіонової антиоксидантної системи до активності процесів пероксидного окиснення ліпідів, а також за концентраціями і співвідношенням Са2+ у плазмі та сперматозоїдах еякулятів неплідних чоловіків з патоспермією. Отримані дані можуть служити основою для розробки методів корекції патологічних змін та клітинного гомеостазу сперматозоїдів за допомогою антиоксидантної терапії, особливо при лікуванні екскреторно-токсичної форми чоловічої неплідності. Матеріали досліджень можуть бути використані як теоретичний, практичний і демонстраційний матеріал на лекціях з урології, біохімії, патологічної фізіології у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно, за винятком електронно-мікроскопічних досліджень, налагодив методи, виконав експериментальну частину, провів статистичний аналіз, сформулював основні висновки і підготував до друку матеріали роботи. При сумісному виконанні дослідів із співробітниками лабораторії співвиконавці приводяться як співавтори публікацій. Визначення завдань, аналіз і обговорення результатів досліджень здійснено спільно з науковим керівником. При виконанні електронно-мікроскопічних досліджень автор співпрацював з лабораторією електронної мікроскопії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на International scientific conference for students and young Physicians in Lviv State Medical University (Львів, 1999), 61-ій загальноуніверситетській студентській науковій конференції (Львів, 2001), 5-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2001), International Congress of Medical Students and Young Physicians (Poznan, 2001), II Polsko-Ukrainskie Sympozjum Urologiczne (Rzeszow, 2001),

4th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and Their Target Enzymes” (Wrocіaw, 2002), 4th Congress of the Central European Association of Urology (Јуdџ, 2002), 3-?у Польсько-Українському симпозіумі урологів „Актуальні питання сучасної урології” (Ужгород, 2003), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Першому з’їзді сексологів та андрологів України (Київ, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клітинної біохімії” (Тернопіль, 2004).

Публікації. Результати досліджень висвітлено у 15 друкованих роботах, 7 з яких опубліковані у наукових фахових виданнях (згідно з переліком ВАК України), а 8 у тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів і результатів досліджень, їх аналізу й обговорення, узагальнень, висновків, а також списку використаної літератури. Матеріал надруковано на 139 сторінках, ілюстровано 23 рисунками і 14 таблицями. Бібліографічний показник включає 230 використаних літературних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Основу роботи склали результати обстеження 253 чоловіків, серед яких клінічно обстежено 116 пацієнтів у віці 20-47 років. Серед обстежених були як умовно здорові так і неплідні чоловіки, які за період з 1998 по 2004 р. пройшли обстеження та отримували консервативне лікування у Львівській обласній консультативній поліклініці та клініці урології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та підлягали динамічному спостереженню протягом року. Всього обстежено чотири групи пацієнтів: група 1 (n=20) – контрольна – складалась з практично здорових чоловіків, котрі звернулись в медичні установи без скарг, пов’язаних з непліддям або інфекційними захворюваннями сечо-статевої системи. Група 2 (n=68) – пацієнти з екскреторно-токсичною формою неплідності. Залежно від проведеного лікування дану групу розділено на: підгрупу 2.1 (n=36) – пацієнтам призначалось базисне лікування, що включало імуномодулюючу, етіотропну, патогенетичну (антибактеріальну протизапальну) терапію, протигрибкові препарати на час прийому антибіотиків, гепатопротектори, фізіотерапевтичні процедури за показами; підгрупу 2.2 (n=32) – пацієнти приймали окрім такого ж базисного лікування ще і препарати з антиоксидантними властивостями (вітамін Е по 600 мг/день, вітамін С по 500 мг/день) та цинку сульфат по 250 мкг/день. Ці препарати, як рекомендовано, пацієнти приймали перорально протягом 3 місяців. Групу 3 (n=28) складали пацієнти з секреторною формою неплідності – 17 пацієнтів з лівобічним варикоцелє, котрі відмовились від оперативного лікування, 11 пацієнтів з одностороннім паховим крипторхізмом. Групу 4 (n=253) становили чоловіки з нормозооспермією (n=30), та різним ступенем олігозооспермії (n=223), еякуляти яких використовували для досліджень АТФазних активностей і концентрацій Са2+.

Використовувався в динаміці широкий комплекс загальноклінічних, лабораторних, спеціальних урологічних, інструментальних, мікробіологічних, імунологічних, радіоімунних, електронно-мікроскопічних досліджень з метою виявлення причини розвитку неплідності, топічної діагностики патологічного процесу, встановлення його етіології, змін спермограми, дослідження окисних процесів та стану антиоксидантної глутатіонової системи сперматозоїдів при цьому, дисбалансу функціонування іон-транспортувальних систем, а також оцінки ефективності режимів лікування, що застосовувалось, у тому числі і антиоксидантної терапії.

В роботі використовувались критерії ВООЗ для оцінки морфологічних характеристик сперми (WHO, 1992, 1999). Для розкриття латентних глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної та АТФазних латентних активностей сперматозоїдів використовували методику Орлова С.Н. (1989). Активність глутатіонпероксидази визначали за методикою Моина В.М. (1986), глутатіонредуктази - Власова С.Н. (1990), глутатіонтрансферази -Mannervik B. (1991). Na+,K+-АТФазну активність визначали за методикою Болдырева АА. (1985), Са2+,Мg2+–АТФазну активність за методикою Зварича Е.І. (1991). Концентрацію Са2+ у спермальній плазмі та сперматозоїдах розраховували за методикою Звєрєвої Г.В. (1992). Вміст білка визначали методом Lowry O. et al. (1951). Контроль за структурою і формою сперматозоїдів проводили за допомогою електронного мікроскопа (Johnsen S.G., 1970).

Одержані результати досліджень обробляли за допомогою методів математичної статистики (Эйзен С., 1982) з використанням пакета програм Star Office 7 для персонального комп’ютера типу Intel Pentium.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При обстеженні чоловіків з екскреторно-токсичною формою неплідності встановлено, що 60,4% із них відповідали найбільш активному репродуктивному віку від 20 до 30 років, що вказує на велике суспільне значення проблеми демографії сім’ї та збереження генофонду населення України. У більшості випадків (87,5%) захворювання виявлено при самостійному зверненні хворих; хронічні запальні процеси статевих органів при цьому мали характер багатовогнищевих уражень у 66,2% пацієнтів; значна роль належала комбінованій інфекції, коли присутні асоціації специфічних патогенів (у 36,8%), у 47,1% захворювання протікало по типу моно інфекції; серед обстежених у 16,2% пацієнтів інфекційний агент при комплексному обстеженні виявити все ж не вдалось, проте виявляли лейкоцити у секреті простати, порції сечі після масажу простати, чи спермі, їм встановлено діагноз хронічний запальний тазовий больовий синдром, що відповідає сучасній класифікації простатитів (Schaeffer A.J., 2003). Тривалість захворювання від 1 до 5 років у чоловіків вікової групи 20-30 років становила 12,1%, у віковій групі 31-40 років – 48,1%. Саме на фоні тривалого перебігу запального процесу, в умовах неефективної терапії розвиваються олігозооспермія, глибокі порушення з боку морфофункціональних та біохімічних показників сперми, зрушення в системі антиоксидантного захисту.

При екскреторно-токсичній неплідності спостерігалось зниження практично всіх показників функціональної активності сперматозоїдів, особливо концентрації та загальної кількості рухливих сперматозоїдів з нормальною будовою, тобто тих, які здатні приймати участь в спермо-ооцитарній реакції (табл. 1).

Таблиця 1

Морфо-функціональні характеристики еякуляту при різних формах неплідності (Mm)

Показники спермограми | Група 2

Екскреторно-токсична неплідність

(n=68) | Група 3

Секреторна неплідність | Група 1

Контроль

(n=20)

Лівобічне варикоцелє (n=17) | Односторонній паховий крипторхізм (n=11)

Концентрація сперматозоїдів, млн/мл | 281,8* | 182,5** | 92,1*** | 633,5

Загальна кількість сперматозоїдів в еякуляті, млн | 503,8* | 383,5** | 162,4*** | 1457,6

Відносна кількість рухливих сперматозоїдів, % | 372,7* | 372,6** | 522,6*** | 622,4

Кількість патологічних форм, % | 462,5* | 262,9** | 393,4*** | 282,0

Концентрація лейкоцитів в еякуляті, х 109/л | 1,820,414* | 0,670,320 | 0,720,120 | 0,730,134

рН | 7,50,25 | 7,40,2 | 7,20,2 | 7,40,25

*, **, *** різниця з контрольною групою вірогідна, Р<0,001

При односторонньому паховому крипторхізмі спостерігались більш виражені патологічні відхилення характеристик еякуляту в порівнянні з групою варикоцелє: спостерігалась виражена оліготератозооспермія; зрушення рН у кислу сторону, що відбиває порушення функції гонадостату та його регуляторного впливу на простату та сім’яні міхурці. Проте відносна концентрація рухливих сперматозоїдів була вищою у групі хворих з одностороннім крипторхізмом.

Враховуючи те, що Са2+ регулює рухливість сперматозоїдів, процеси гіперактивації та капацитації, акросомну реакцію (Aitken R.J., 1997), а також опосередковано впливає на стан ПОЛ (Савов В.М., 1986), досліджувалась залежність ПОЛ від концентрації Са2+. Згідно з результатами досліджень, вміст малонового диальдегіду зростав від 113,4 нмоль/мг білка в контрольних пробах до 182,64,2 нмоль/мг білка за наявності 0,5 мМ Са2+. При олігозооспермії він був значно вищим і складав 235,66,1 нмоль/мг білка. Глутатіонпероксидазна активність лінійно зростала зі збільшенням концентрації Са2+ до 0,01 мМ і сягала 6,80,7 мкмоль GSH/мг білка за 1 хв. Більші концентрації Са2+ (0,5 мМ) зумовлювали зниження глутатіонпероксидазної активності до 2,20,2 мкмоль GSH/мг білка за 1 хв. Додавання Са2+ у середовище інкубації в концентраціях 0,1-2 мМ пригнічувало глутатіонтрансферазну активність. Цей показник був найбільшим за відсутності Са2+, тобто у контрольних зразках – він становив 0,560,04 мкмоль GSH/мг білка за 1 хв. Із збільшенням концентрації Са2+ до 0,1 мМ спостерігалось зростання глутатіонредуктазної активності до 0,550,04 мкмоль NADPH/мг білка за 1 хв, подальше збільшення вмісту Са2+ призводило до зниження активності ферменту. Таким чином, встановлений чіткий взаємозв’язок між концентрацією Са2+ і пероксидацією ліпідів, а також активністю глутатіонзалежних ферментів.

При патоспермії спостерігається зниження активностей всіх ферментів антиоксидантної системи на фоні зростання ПОЛ та продукції АФК. Це, очевидно, є однією з причин зниження функціональної активності сперматозоїдів. Базисна терапія супроводжувалась лише незначним зниженням процесів пероксидації, ймовірно внаслідок ерадикації інфекції, як основного фактора ушкодження. Лікування хворих з призначенням антиоксидантної терапії призводило до зменшення вмісту МДА практично до контрольного рівня.

Лікування хворих при екскреторно-токсичній неплідності з призначенням комплексної – базисної та антиоксидантної терапії, призводило до зростання глутатіонпероксидазної активності з 3,80,6 до 5,60,7 мкмоль GSH/мг білка за 1 хв; глутатіонредуктазної при з 0,320,03 до 0,460,04 мкмоль NADPH/мг білка за 1 хв, а значить, і до активації антиоксидантного захисту (рис. 1). Встановлено, що зростання глутатіонпероксидазної активності, прямо корелює із збільшенням кількості рухливих сперматозоїдів та зворотньо з кількістю їх патологічних форм.

Рис. 1. Вплив різних методів лікування на активність

глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази (Mm).

Коефіцієнт кореляції (r) становив відповідно 0,764 і -0,621 (P<0,01; n=68).

В процесі консервативного антиоксидантного лікування хворих з варикоцелє глутатіонпероксидазна активність мала тенденцію до зростання від 2,400,31 до 2,620,32 мкмоль GSH на 1 мг білка за 1 хв; активність глутатіонредуктази при цьому зросла із 2,650,30 до 3,050,32 нмоль NADPH на 1 мг білка за 1 хв; активність глутатіонтрансферази складала 0,400,03 мкмоль GSH на 1 мг білка за 1 хв і практично не змінювалась у процесі лікування. Можна спостерігати тенденцію до деякого підвищення активності ферментів антиоксидантного захисту по закінченні 3-місячного лікування, проте достовірної різниці (Р<0,05) у показниках не виявлено. Активність глутатіонпероксидази в результаті лікування одностороннього пахового крипторхізму дещо зменшується – з 2,30,18 до 2,10,16 мкмоль GSH на 1 мг білка за 1 хв. Активність глутатіонредуктази теж зменшується – з 1,700,14 до 1,450,15 нмоль NADPH на 1 мг білка за 1 хв, а активність глутатіонтрансферази залишається практично незмінною. Враховуючи стандартні відхилення по виборці наведених даних, можна зробити висновок про відсутність достовірного впливу антиоксидантної терапії на ферменти глутатіонової системи та неефективність цього методу лікування в якості монотерапії при секреторній неплідності.

У проаналізованих еякулятах групи 4 концентрація Са2+ у сперматозоїдах і плазмі та їх сумарний вміст у спермі були найвищими при олігозооспермії ІІ-ІІІ ступеню, найнижчими при нормозооспермії, крім того, у плазмі оцінених еякулятів концентрація іонів була значно вищою, ніж у сперматозоїдах. Середня концентрація Са2+ у сперматозоїдах становила 1,05-1,73, у плазмі 3,58-8,75 мМ. Незважаючи на високі значення коефіцієнта варіації (Сv), який для Са2+ коливається у межах 24-45%, достовірність змін вмісту Са2+ була дуже високою (Р0,001). Таким чином встановлено, що зі зростанням ступеня олігозооспермії збільшується концентрація кальцію як в цілому в спермі, так і в сперматозоїдах і спермальній плазмі, тобто ці процеси тісно взаємопов’язані. Для отримання більш чіткої картини щодо ролі Са2+ в підтриманні біологічної повноцінності сперматозоїдів, в подальшому порівняльний аналіз проводили між нормозооспермією та олігозооспермією ІІ-ІІІ ст.

Аналіз показників вмісту іонів свідчить, що в еякулятах кожної дослідної групи, при наявності різної кількості сперматозоїдів, міститься майже однакова концентрація Са2+. Тобто при високих значеннях коефіцієнта варіації кількості статевих клітин в еякулятах (Сv=76%) середній вміст іонів Са2+ у сперматозоїдах і плазмі практично не змінюється (Р>0,1-0,5). Крива змін вмісту у кожній дослідній групі еякулятів є майже прямою.

Оскільки на даний час ще остаточно не вивчено вплив іонів на функціональний стан сперматозоїдів в еякулятах різної якості, нами було встановлено зв’язки між вмістом Са2+ у плазмі і сперматозоїдах та їх рухливістю. Аналіз результатів досліджень свідчить про те, що криві змін вмісту Са2+ у плазмі та сперматозоїдах при нормозооспермії спрямовані від вищої концентрації при низькій рухливості до нижчої при високій (рис. 2), при патоспермії залежність між рухливістю сперматозоїдів і концентрацією Са2+ в них і плазмі виражена менш чітко. Таким чином, як для норми, так і для патоспермії при рухливості сперматозоїдів >30% існує зворотня кореляція між рухливістю і концентрацією Са2+ у сперматозоїдах. Коефіцієнт кореляції (r) становив -0,534 при нормозооспермії (P<0,01; n=25) і -0,621 при олігоастенозооспермії (P<0,01; n=123).

Рис. 2. Залежність вмісту Са2+ у сперматозоїдах та спермальній

плазмі від рухливості сперматозоїдів (Mm).

Зміни концентрації Са2+ у плазмі і сперматозоїдах залежно від кількості патологічних форм статевих клітин мають свої особливості. Так, накопичення Са2+ у сперматозоїдах еякулятів групи нормозооспермії складає 1,0-1,5 мМ. Накопичення іонів Са2+ у сперматозоїдах еякулятів групи оліготератозооспермії дорівнює 1,6-1,9 мМ. Аналогічні зміни, але на значно вищому рівні – 3-5 і 8-9 мМ – отримано у плазмі (рис. 3).

Рис. 3. Залежність вмісту Са2+ у сперматозоїдах та спермальній

плазмі від кількості патологічних форм сперматозоїдів (Mm).

Амплітуда змін концентрації іонів Са2+ в еякулятах групи оліготератозооспермії виражена чіткіше, ніж у групі нормозооспермії. При великій кількості патологічних форм (>40%) спостерігається зворотня кореляція – зростання кількості патологічних форм сперматозоїдів відбувається одночасно зі зменшенням концентрації Са2+. Коефіцієнт кореляції (r) у спермальній плазмі та сперматозоїдах відповідно становив -0,914 та –0,759 (P<0,01; n=92).

Підтримання оптимальних високої внутрішньоклітинної концентрації К+ та низької внутрішньоклітинної концентрації Na+ та Са2+ є основним для виживання сперматозоїдів і їх захисту від передчасної акросомної реакції. Ці процеси тісно пов’язані з функціонуванням Na+,K+-АТФази та Са2+,Mg2+-АТФази. Для запобігання зростання концентрації Са2+ в сперматозоїдах необхідна більш висока активність Са2+,Mg2+-АТФази, яка забезпечує вихід Са2+ із клітин. Можна припустити, що різниця в активності ферментів при нормо- та олігозооспермії може бути пов’язана з виникненням конформаційних змін у будові плазматичної мембрани сперматозоїдів через зростання кількості гідропероксидів ліпідів. Лікування хворих з екскреторно-токсичною формою неплідності за допомогою базисної та антиоксидантної терапії, в окремій серії досліджень (n=20), призводило до стабілізації активностей обох досліджуваних АТФаз, їх наближення до норми. Так, проведені дослідження активностей Са2+,Mg2+-АТФази та Na+,K+-АТФази сперматозоїдів при олігозооспермії відобразили зниження їх активності по закінченню лікування відповідно у 1,4 та 1,6 разів (рис. 4).

Рис. 4. АТФазна активність при нормо- та олігозооспермії до та після лікування (Mm).

Вивчення активності АТФаз дає змогу зрозуміти одну з причин інтенсифікації виведення Са2+ зі сперматозоїдів із-за його високої концентрації в них при олігозооспермії, яка призводить до зниження функціональної активності сперматозоїдів та розвитку неплідності.

Критеріями вилікування при екскреторно-токсичній неплідності вважались зникнення клінічних симптомів захворювання і елімінація збудника (табл. 2). Відмічена більш позитивна динаміка клінічних показників у хворих, які отримували базисну та антиоксидантну терапію, в порівнянні з хворими, які отримували лише базисну (табл. 3).

Таблиця 2 Таблиця 3

Ефективність терапії урогенітальних Показники клінічної ефективності

інфекцій у групі 2 лікування

Етіологічний фактор | Покращення, %

хламідіоз | 86,7

хламідіоз+уреаплазмоз | 81,8

трихомоніаз+хламідіоз | 77,8

уреаплазмоз | 85,7

гонорея | 100

трихомоніаз+гонорея | 80,0

трихомоніаз | 83,3

хронічний абактеріальний простатит | 63,6

Також враховувались наявність змін у спермограмі та динаміка змін в системі пероксидне окиснення ліпідів глутатіонова антиоксидантна система. Морфо-функціональні характеристики еякулятів пацієнтів з екскреторно-токсичною неплідністю після проведеного лікування відображені у табл. 4.

Таблиця 4

Морфо-функціональні характеристики еякуляту чоловіків груп 2.1 та 2.2 через

3 місяці від початку лікування

Показники спермограми | група 2 (до проведення лікування) | група 2.1 (після проведеного базисного лікування) | група 2.2 (після базисної та антиоксидантної терапії)

Концентрація сперматозоїдів, млн/мл | 281,8 | 402,5 | 392,7

Загальна кількість сперматозоїдів в еякуляті, млн | 503,8 | 643,5 | 663,4

Відносна кількість рухливих сперматозоїдів, % | 372,7 | 412,3 | 582,1*

Кількість патологічних форм, % | 462,5 | 402,0 | 341,7*

Концентрація лейкоцитів в еякуляті, х 109/л | 1,820,414 | 0,680,074 | 0,660,086

* різниця між групою 2 та 2.1 вірогідна, Р<0,05

За результатами таблиці можна зробити висновок, що застосування препаратів з антиоксидантними властивостями переважно впливає на покращення рухливості та морфології сперматозоїдів. Ці дані узгоджуються в цілому з такими, що отримані іншими авторами, де показано, що активація глутатіонової антиоксидантної системи призводить до покращення морфології сперматозоїдів, і що втрата сперматозоїдами рухливості пов’язана з підвищеним рівнем пероксидації ліпідів (Balercia G., 2004; Garrido N., 2004). Антиоксидантна терапія за участю вітаміна Е забезпечує зростання рухливості сперматозоїдів (Long J.A., Kramer M., 2003), призначення вітамінів Е та С призводить до збільшення кількості рухливих та морфологічно повноцінних сперматозоїдів (Suzuki M., Kurabayashi T., 2003), а додавання вітаміну Е до сперматозоїдів у системі in vitro спричинює дозозалежне зростання як рухливості, так і кількості живих форм (Verma A., Kanwar K.C. 1999).

Отримані дані зміни морфо-функціональних характеристик еякулятів пацієнтів з секреторними формами неплідності після 3-місячного консервативного лікування препаратами з антиоксидантними властивостями свідчать про відсутність у більшості випадків достовірного покращення (за винятком рухливості сперматозоїдів при лівобічному варикоцелє (Р<0,05)), однак, у всіх випадках спостерігається тенденція до їх покращення. Відсутність значного ефекту від консервативного лікування варикоцелє можна пояснити відсутністю усунення дії факторів розвитку секреторної неплідності – продовженням патогенного впливу на яєчко температурного фактору, гіпоксемії, гормонів наднирників, продуктів метаболізму, аутоімунного процесу, пошкоджень мікроциркуляторного русла. У випадку секреторно-ендокринної неплідності при односторонньому крипторхізмі відсутність ефективності антиоксидантної терапії очевидно можна пояснити ранньою атрофією гермінативного епітелію, як у затриманому, так і в контрлатеральному яєчку, порушенням функції інтерстиційних клітин, дисбалансом гонадостату.

Таким чином, у дисертації подано нове вирішення наукового завдання, що полягає у розробці методу діагностики та лікування чоловічої неплідності на основі вивчення процесів пероксидації ліпідів, активності ферментів глутатіонової антиоксидантної системи, транспортувальних АТФаз та кальцієвого гомеостазу, а також відповідного застосування антиоксидантної терапії при екскреторно-токсичній формі неплідності.

ВИСНОВКИ

1. Одним з факторів патогенезу хронічних специфічних запальних процесів чоловічих статевих органів, викликаних хламідіями, уреаплазмами, трихомонадами, гонореєю та їх поєднаннями, як основної причини розвитку екскреторно-токсичної неплідності, є підвищення активності пероксидації ліпідів мембран сперматозоїдів (у 1,2 раза) та декомпенсація активності ферментів глутатіонової антиоксидантної системи – зниження концентрації глутатіонпероксидази (у 3 раза), глутатіонредуктази (в 1,7 раза), глутатіонтрансферази (в 1,9 раза).

2. У хворих з екскреторно-токсично формою неплідності підвищення інтенсивності вільнорадикального окиснення ліпідів мембран сперматозоїдів корелює зі зниженням їх концентрації та рухливості (r=0,779), збільшенням кількості патологічних форм (r=0,657) і порушенням структури (r=0,538).

3. У спермі суб- та інфертильних пацієнтів показники концентрації Са2+ є одними з тих, які визначають якість сперми і корелюють з рухливістю (r=-0,621) і кількістю патологічних форм (r=-0,759) сперматозоїдів.

4. У суб- та інфертильних чоловіків катіони Са2+ здатні регулювати процес пероксидації ліпідів сперматозоїдів та функціонування системи знешкодження наслідків його дії, здійснюючи не тільки стимулюючий вплив на глутатіонову антиоксидантну систему при низьких концентраціях (від 0,01 мМ до 0,1 мМ), а й інгібуючий вплив при вищих концентраціях Са2+ (більше 0,5 мМ).

5. При патоспермії збільшення активності транспортувальних АТФаз статевих клітин (Nа+,K+-АТФази в 2,4 раза та Са2+,Mg2+-АТФази в 1,5 раз) скеровано на зниження концентрації Са2+ у сперматозоїдах, які ним перевантажені, що спричиняло зменшення їх рухливості і збільшення кількості патологічних форм в еякулятах.

6. Трьохмісячний курс прийому препаратів з антиоксидантними властивостями (вітамін Е 600 мг/день, вітамін С 500 мг/день), а також цинку сульфат 250 мг/день, які модулюють активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи та транспортувальних АТФаз, призводить до зниження кількості пероксидних сполук (в 1,2 раза) та зростання активності глутатіонової антиоксидантної системи сперматозоїдів (в 1,4-1,9 раза) при екскреторно-токсичній формі неплідності, що достовірно призводить до покращення морфо-функціональних характеристик сперматозоїдів – збільшення рухливості та зменшення кількості патологічних форм.

7. Прийом препаратів з антиоксидантними властивостями при секреторній формі неплідності достовірно не впливає на якість сперми.

8. Розроблено метод діагностики чоловічої неплідності шляхом визначення активності ПОЛ, ферментів глутатіонової антиоксидантної системи, транспортувальних АТФаз, концентрації Са2+ в спермі та сперматозоїдах, які можуть бути додатковими показниками при встановленні фертильності .

9. Запропонований діагностично-лікувальний метод в порівнянні з базовим підвищив ефективність лікування на 41% у хворих на екскреторно-токсичну неплідність та дозволив досягти вагітності у 9 з 32 дружин пацієнтів (28,1%).

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Воробець Д.З. Регуляція функціональної активності сперматозоїдів у чоловіків при олігозооспермії за участі глутатіонової антиоксидантної системи // Буковинський медичний вісник. – 2003. – Т. 7, № 1-2. – С. 19-21.

2. Воробець Д.З., Борис Ю.Б. Особливості глутатіонової антиоксидантної системи сперматозоїдів чоловіків при олігозооспермії // Acta Medica Leopolensia. – 2003. – Т.9, № 1. – С.79-81.

3. Максим’юк Г.В., Воробець Д.З., Борис Ю.Б., Бойко М.І. Зв’язок концентрації іонів Са2+, К+, Na+ з біологічною повноцінністю сперматозоїдів // Медична хімія. – 2003. – Т.5, №3. – С.85-89.

4. Максим’юк Г.В., Бойко М.І., Воробець Д.З. Особливості транспорту іонів Са2+, К+, Na+ у чоловічій спермі високої і низької якості // Практична медицина. – 2003. – Т.9, № 4. – С. 86-89.

5. Borzhievsky С.K. Vorobets D.Z. Infertile and Fertile Human Sperm: Ca2+, Mg2+-ATPase Properties // Advances in Clinical and Experimental Medicine. Urology. Wroclaw Medical University. – 2003. – V.12, №. 4. – Р. 119-122.

6. Воробець Д.З. Кореляція між станом антиоксидантної системи та рухливістю сперматозоїдів при екскреторно-токсичній формі чоловічої неплідності // Медична хімія. – 2004. – № 3. – С. 58-61.

7. Vorobets D.Z. Effect of vitamin E and ascorbic acid supplementation on human semen quality and lipid peroxidation in oligoasthenozoospermic men // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. Lublin. – 2004. – V.17, № 2. – P. 315-318.

8. Воробець Д.З. Са2+, Mg2+-АТФазна активність сперматозоїдів при нормо- та олігозооспермії у чоловіків // 5-й Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих учених. – Тернопіль, 2001. – С. 34-35.

9. Воробець Д.З. Вміст Na+, K+, Ca2+ та активність АТФаз, що підтримують їх внутрішньоклітинний гомеостаз у сперматозоїдах чоловіків при нормо- та олігозооспермії // Тези доповідей 61-ої загальноуніверситетської студентської наукової конференції. – Львів, 2001. – С. 71-72.

10. Vorobets D.Z. ATP-ases Activities of Infertile and Fertile Human Sperm // International Congress of Medical Students and Young Physicians. Abstdracts’ Book. – Poznan, 2001. – Р. 101-102.

11. Воробець Д.З. Активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи у сперматозоїдах за олігозооспермії // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т.74, № 4а. – С. 31.

12. Vorobets D.Z. The Glutathione System of Spermatozoa in Patients With Oligozoospermia // 4th Parnas Conference. Wroclaw: 2002. – Р. 92.

13. Vorobets’ D.Z. Infertility and glutathione antioxidant system function in human spermatozoa // 4th Congress of the Central European Association of Urology. – Јуdџ, 2002. – ?. 92.

14. Vorobets’ D.Z., Borys Yu.B., Sheremeta R.Z., Shuliak O.V. Oligozoospermia and Gluthatione Antiperoxidative System of Human Spermatozoa // Advances in Clinical and Experimental Medicine. Urology. – Wroclaw, 2003. – V.12, №.4. – Р. 106-107.

15. Воробець Д.З., Максим’юк Г.В. Концентрація іонів Са2+, K+ і Na+ в сперматозоїдах: зв’язок з біологічною повноцінністю // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології. Тези доповідей. – Львів, 2004. – С. 239.

АНОТАЦІЯ

Воробець Д.З. Порушення антиоксидантної та іон-транспортувальних систем сперматозоїдів при чоловічій неплідності та їх корекція. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.06 – урологія. – Інститут урології АМН України. – Київ, 2005.

Дисертація присвячена підвищенню ефективності діагностики та лікування чоловічої неплідності шляхом встановлення критеріїв якості сперми за участю глутатіонової антиоксидантної системи та іонного гомеостазу, і корекції репродуктивної функції за допомогою препаратів з антиоксидантними властивостями. Обстежено 253 чоловіків, серед яких 223 – з різними формами неплідності. Проведено порівняльний аналіз консервативного антиоксидантного лікування 96 пацієнтів з екскреторно-токсичною та секреторними формами неплідності.

Вперше комплексно вивчено роль пероксидації ліпідів, ферментів глутатіонової антиоксидантної системи, а також транспортувальних АТФаз та іонів кальцію в причинах зниження якості сперми. Встановлено, що катіони Са2+ здатні регулювати процес пероксидації ліпідів, здійснюють стимулюючий вплив на глутатіонову антиоксидантну систему при низьких концентраціях, та інгібуючий при високих. Виявлено, що збільшення активності транспортувальних АТФаз статевих клітин при патоспермії скеровано на зниження концентрації Са2+ у сперматозоїдах, які ним перевантажені, що спричиняло зменшення їх рухливості і збільшення кількості патологічних форм в еякулятах. Доведено, що застосування препаратів з антиоксидантними властивостями, які модулюють активність глутатіонової антиоксидантної системи та транспортувальних АТФаз, достовірно призводить до покращення морфо-функціональних характеристик еякулятів.

Розроблено метод діагностики чоловічої неплідності шляхом визначення активності ПОЛ, ферментів глутатіонової антиоксидантної системи, транспортувальних АТФаз, концентрації Са2+ в сперматозоїдах і спермальній плазмі.

Ключові слова: чоловіча неплідність, екскреторно-токсична неплідність, секреторна неплідність, патоспермія, антиоксидантна терапія, Са2+,Mg2+-, Na+-,K+- АТФази.

АННОТАЦИЯ

Воробец Д.З. Нарушение антиоксидантной и ион-транспортирующих систем сперматозоидов при мужском бесплодии и их коррекция. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.06 – урология. – Институт урологии АМН Украины. – Киев, 2005.

Диссертация посвящена повышению эффективности диагностики и лечения мужского бесплодия путем определения критериев качества спермы при участии глутатионовой антиоксидантной системы, а также ионного гомеостаза, и коррекции репродуктивной функции с помощью антиоксидантной терапии. Обследовано 253 мужчин, в том числе 223 с различными формами бесплодия. Проведено сравнительный анализ консервативного антиоксидантного лечения 96 пациентов с экскреторно-токсической и секреторными формами бесплодия.

Впервые комплексно изучено роль пероксидации липидов, ферментов глутатионовой антиоксидантной системы, а также транспортных АТФаз и ионов кальция в механизмах снижения качества спермы.

Установлено, что одним с факторов патогенеза хронических специфических воспалительных процессов мужских половых органов, как основной причины развития экскреторно-токсического бесплодия, является повышение активности пероксидации липидов мембран сперматозоидов (в 1,23 раза), а также декомпенсация активности ферментов глутатионовой антиоксидантной системы – снижение концентрации глутатионпероксидазы (в 3,09 раза), глутатионредуктазы (в 1,72 раза), глутатионтрансферазы (в 1,86 раза). Повышение активности свободнорадикального окисления мембран сперматозоидов коррелирует со снижением их концентрации, подвижности, увеличением количества патологических форм и нарушением структуры.

Установлено, что катионы Са2+ могут регулировать процесс пероксидации липидов, стимулировать глутатионовую антиоксидантную систему при низких концентрациях (от 0,01 мМ до 0,1 мМ), а при высоких концентрациях (больше 0,5 мМ) – ингибировать. Отмечено, что повышение активности транспортных Na+,K+- и Ca2+,Mg2+-АТФаз половых клеток при патоспермии направлено на снижение концентрации Са2+ в сперматозоидах, которые им перенасыщены, что приводило к снижению подвижности и увеличению количества патологических форм сперматозоидов. Доказано, что применение препаратов с антиоксидантными свойствами при экскреторно-токсическом бесплодии на протяжении 3 месяцев (витамина Е 600 мг/день, витамина С 500 мг/день) и сульфата цинка 250 мг/день, которые модулируют активность глутатионовой антиоксидантной системы и транспортных АТФаз, достоверно приводит к улучшению морфо-функциональных характеристик эякулятов. Ингибирование процессов пероксидации вследствие антиоксидантной терапии прямо коррелирует с улучшением подвижности (r = 0,779), и со снижением количества патологических форм (r = 0,657) сперматозоидов (Р<0,01; n=68).

Разработано метод диагностики мужского бесплодия путём исследования активности пероксидации липидов, ферментов глутатионовой антиоксидантной системы глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы, Na+,K+-, Са2+,Mg2+ - транспортных АТФаз, концентрации Са2+ в сперматозоидах и спермальной плазме.

Ключевые слова: мужское бесплодие, экскреторно-токсическое бесплодие, секреторное бесплодие, патоспермия, антиоксидантная терапия, Са2+,Mg2+-, Na+,K+- АТФазы.

ABSTRACT

Vorobets’ D.Z. Sperm antioxidant and ion-transporting systems disorders at male infertility and their correction. – Manuscript.

The given thesis is presented for obtaining scientific degree of the Candidate of Medical Science on the specialty 14.01.06 – Urology. – Institute of Urology of the AMS of Ukraine. – Kyiv, 2005.

The present study is dedicated to the efficiency