НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології і генетики

Говорун Дмитро Миколайович

УДК 577.323
577.324

ФІЗИКО-ХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ
БІОМОЛЕКУЛЯРНОГО ВПІЗНАВАННЯ

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної біофізики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Мацука Геннадій Харлампійович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, директор, завідувач відділу структури і функцій нуклеїнових кислот.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Єльська Ганна Валентинівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувачка відділу механізмів трансляції генетичної інформації,

доктор біологічних наук, професор Зима Валентин Леонідович, Київський університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біофізики біологічного факультету,

доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, м. Київ, завідувач відділу фізики біологічних систем.

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 23 листопада 1999 року о 10 годині
на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01
в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України
за адресою: 252143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (252143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 21 жовтня 1999 року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук,
ст. науковий співробітник | Лукаш Л.Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біомолекулярне впізнавання є одним із найхарактерніших атрибутів живого – воно опосередковує переважну більшість біологічно важливих процесів на молекулярному рівні (Енгельгардт, 1976). Тому пошук найбільш загальних, в ідеалі – універсальних, фізико-хімічних закономірностей, котрі лежать в його основі, є одним із фундаментальних напрямків молекулярної і структурної біології. Актуальність цього дуже непростого і вельми розлогого завдання визначається також перспективами цілеспрямованого впливу на перебіг як пара-, так і метаболічних процесів у клітинах організму шляхом синтезу сполук, вибірковість зв’язування яких близька до селективності природних молекул, та створення на їхній основі різноманітних лікарських і діагностичних молекулярних систем. Окрім того, формалізована інформація щодо природи механізмів біомолекулярного впізнавання вкрай необхідна для створення методами супрамолекулярної фізико-хімії новітніх технологій, зокрема біомолекулярної електроніки (Lehn, 1995).

Нині в царині проблеми біомолекулярного впізнавання продовжується інтенсивне накопичення експериментальних даних (в основному рентгеноструктурних і ЯМР) високої роздільної здатності та їхня систематизація. Проте цілісна картина фізико-хімічної природи специфічності до цього часу так і не викристалізувалася. Встановлено лише, що критичними параметрами останньої є площа поверхні обопільного контакту молекул-партнерів та їхня афінність. Якщо перший із них визначається, в основному, силами Ван-дер-Ваальса, то відповідальними за другий є водневі зв’язки (Н-зв’язки), так звані точкові контакти. Вважається, що внесок точкових контактів у специфічність білково-нуклеїнового впізнавання зменшується в ряду нуклеотидна основа – цукровий залишок – фосфатна група. Доведено, що білок розпізнає не середні, а локальні варіації структури ДНК. Визначальну роль у перебігу процесів білково-нуклеїнового впізнавання відіграє великоамплітудна, нелінійна динаміка молекул-партнерів, в першу чергу ДНК. Відома лише одна загальнобіологічна модель, яка концентрує в собі перелічені закономірності, - феноменологічна модель структурно-динамічної відповідності місць впізнавання (Koshland, 1958-1971). Проте внутрішня “молекулярна логіка” процесів впізнавання біополімерами один одного, як доцільно влаштованих систем, продовжує залишатися “поза кадром”.

Аналіз літератури засвідчує, що одним із “вузьких місць” проблеми білково-нуклеїнового впізнавання є обмеженість знань про ті структурно-динамічні особливості ДНК, які відповідають за її специфічну взаємодію з білком. Ось їх далеко не повний перелік: низькочастотна нелінійно-динамічна поведінка, пов’язана з передплавленням та, так званими напіврозкритими станами; здатність лінійної ДНК до низькоенергетичних локальних і інтегральних вигинів, величина яких істотньо залежить від послідовності основ; далекодія в ДНК; варіації конформації цукрово-фосфатного кістяка та відстані між сусідніми комплементарними парами основ ДНК в залежності від послідовності тощо. Так, парадоксальний з точки зору усталених поглядів на структурно-динамічну організацію ДНК висновок, зроблений на основі серії експериментів (Diekmann et al., 1986-1992), про те, що викривленість лінійної ДНК пов’язана із стекінгом, наштовхує на думку, що сучасні уявлення про його природу потребують якщо не перегляду, то принаймні якісного вдосконалення. Те ж саме стосується структурно-динамічних властивостей компонентів НК – основ, нуклеозидів, їхніх Уотсон-Криківських пар тощо. Як випливає з аналізу літератури, вже накопичилося чимало аргументів на підтвердження такої точки зору.

З іншого боку, із принципових причин проблему біомолекулярного впізнавання не можна вирішити, залишаючись в її рамках. Необхідно проаналізувати її з більш загальних позицій, а саме – як влаштовані біополімери, чим вони відрізняються від органічних полімерів-представників неживого світу і в чому полягають глибинні фізико-хімічні засади (“молекулярна логіка”) їхнього функціонування. Іншими словами, проблема біомолекулярного впізнавання не може бути подолана раніше, аніж буде створена чи, принаймні, окреслена цілісна фізико-хімічна концепція функціонування біополімерів. На превеликий жаль, здобутки у цьому напрямку більш, ніж скромні: маємо, по суті, лише одну феноменологічну модель “білок-машина” (Чернавский, 1987 -1999) і феноменологічний принцип молекулярної регуляції (Monod et al., 1963).

Отже, проблема біомолекулярного впізнавання залишається вкрай актуальною як з огляду на її непересічну теоретичну і практичну значущість, так і з урахуванням стану її недостатньої вивченості. Для свого вирішення вона потребує якісно нових підходів, які виходять за усталені рамки, що склалися в цій галузі знань.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота цілковито відповідає основному планові фундаментальних досліджень відділу молекулярної біофізики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (завідувач відділу до 1995 року – кандидат біологічних наук, ст. науковий співробітник, доцент Желтовський М.В.). Її виконано в рамках бюджетних тем “Вивчення специфічності білково-нуклеїнових взаємодій в модельних системах різного рівня складності” (№ держ. реєстрації 01.91.0002584, 1991-1995 р.р.) і “Вивчення фізико-хімічної природи перебігу елементарних процесів білково-нуклеїнового впізнавання в модельних системах типу “мономер-мономер” та “мономер-полімер” (№ держ. реєстрації 0198U005247, 1996-2000 р.р.).

Частково робота виконувалася в рамках отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів “Вплив метилювання нуклеотидних основ на їх впізнавання амінокислотними радикалами, що містять карбоксильну групу” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5/410, 1992-1993 р.р.), “Розробити методи одержання нових антиретровірусних препаратів в ряду заміщених по цукру синтетичних нуклеозидів і їх аналогів” (програма “Біотехнологія” ДКНТ України, шифр 01.11.01/027-92, № держ. реєстрації 0195U019371, 1992-1995 р.р.), “Вплив протонування та депротонування нуклеотидних основ та амінокислот на процеси точкового білково-нуклеїнового впізнавання” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.2/97, 1993-1994 р.р.), “Пошук речовин з імуномодулюючими та протипухлинними властивостями серед нуклеозидів азапіримідинового ряду” (програма “Захист генофонду населення України” ДКНТ України, шифр 1.01.01/064-92, № держ. реєстрації 0195U011006, 1994 р.), “Вивчення структурно-динамічних особливостей компонентів біополімерів та їх впливу на специфічність точкових білково-нуклеїнових та нуклеїново-нуклеїнових контактів” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.3/184, 1994-1997 р.р.), “Вивчення структури та фізико-хімічних властивостей низькомолекулярних водневозв’язаних комплексів, що моделюють специфічні білково-нуклеїнові контакти” (грант міжнародного наукового фонду “Україна”, шифр K1F100, 1994-1995 р.р.), “Вплив протонування та депротонування нуклеотидних основ та амінокислот на процеси точкового білково-нуклеїнового впізнавання, визначального для регулятивних механізмів клітини” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.2/97, 1995 р.), “Прототропна таутомерія нуклеотидних основ: нові підходи до старої проблеми” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.4/77, 1996 – т.час ) та деяких інших.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – встановити найбільш загальні фізико-хімічні закономір-ності нуклеїново-нуклеїнового і білково-нуклеїнового впізнавання на мікро-структур-ному рівні, спрямувавши основні зусилля на виявлення нових, функціонально важливих структурно-динамічних властивостей компонентів НК і модельних комплексів типу “мономер-мономер”, з’ясування їхньої квантовохімічної природи і створення на цій основі макромолекулярних моделей впізнавання.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі комплексні завдання:

1. Вивчити основні фізико-хімічні форми структурної мінливості нуклеотидних основ: в першу чергу – стереохімічну нежорсткість, структурну ізомерію та прототропну таутомерію, а також нові аспекти спонтанного дезамінування та пошкодження кисневими радикалами і дати їм належну квантовохімічну інтерпретацію.

1. Дослідити протонодонорні, включаючи СН-кислотність, та протоноакцепторні властивості азотистих основ, що визначають їхню комплексотвірну здатність. Встановити, як змінюється структурна нежорсткість основ при їхньому протонуванні і депротонуванні та при втягуванні у міжмолекулярні Н-зв’язки.

1. Дослідити конформаційну гнучкість Уотсон-Криківських пар основ ДНК, встановити основні стереоелектронні чинники, що лежать в її основі, та проаналізувати її можливу біологічну значущість у царині біомолекулярного впізнавання.

1. Вивчити вплив стереохімічної нежорсткості основ ДНК на оптико-фізичні властивості їхніх кристалів і розвинути на цій основі нові уявлення про стекінг нуклеотидних основ та їхніх Уотсон-Криківських пар.

1. Визначити енергетику і кооперативні властивості міжмолекулярних Н-зв’язків у модельних системах нуклеїново-нуклеїнового впізнавання – кристалах і співкристалізатах основ ДНК – та її внесок у стабілізацію останніх.

1. Створити експериментальну установку для прецизійної реєстрації Раманівських спектрів біополі-мерів та їхніх складових частин. Отримати низькочастотні (<200 см-1) Раманівські спектри компонентів НК, що послідовно ускладнюються, низькомолеку-лярних комплексів, що моделюють точкові нуклеїново-нуклеїнові та білково-нуклеїнові контакти, та їхніх компонентів у твердій фазі. Встановити природу низькочастотних коливань ДНК, важливих для її розпізнавання білком.

1. Вивчити основні структурно-динамічні та енергетичні властивості повної множини точкових контактів типу “нуклеотидна основа – бічний радикал амінокислоти”, що стабілізуються двома міжмолекулярними Н-зв’язками.

1. Розробити нові модельні уявлення про структурно-динамічні особливості ДНК, які контролюють розпізнавання її білком, а саме: спонтанні напіврозкриті стани, викривленість, далекодію, передплавлення, генотоксичну дію УФ-опромінення, кооперативність.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що азотисті основи з аміногрупою є структурно-нежорсткими, дипольно-нестійкими молекулами; інтерконверсія яких відбувається трьома топологічно і енергетично нееквівалентними шляхами, супроводжується істотньою деформацією амінного фрагмента і залежить від розташування аміногрупи в кільці та від її оточення. Вперше встановлено квантово-хімічні засади цієї біологічно важливої властивості і зроблено висновок про квантову геометрію нуклеотидних основ, які мають у своєму складі аміно- чи метильну (Ме) групу. Вперше показано, що структурна нежорсткість нуклеотидних основ з аміногрупою залежить від її таутомерного та ізомерного стану, а також від зміни їхнього зарядового стану та втягування у міжмолекулярні Н-зв’язки.

Вперше вивчено структурну ізомерію канонічних нуклеотидних основ, встановлено, що лише дві з них – Ade і Thy є енергетично найвигіднішими структурними ізомерами (глобальними мінімумами) в своїх сімействах та обгрунтовано висновок про те, що з-поміж усіх основ ДНК саме Ade є найкращим структурним елементом для створення генетичної кодової матриці в процесі еволюції. Зроблено висновок про те, що характерною відмінною рисою НК від органічних полімерів – представників неживого світу є унікальне поєднання ними різноманітних форм структурної мінливості.

Вперше у максимально можливому форматі, обмеженому лише уявленнями про природу хімічного зв’язку, досліджено прототропну таутомерію канонічних основ, їхніх дезамінованих аналогів, а також молекул – складових частин цих сполук. Вперше встановлено, що прототропна таутомерія азотистих основ має молекулярно-цвітеріонний характер, причому в ній беруть участь усі без винятку протони з карбопротонами включно. Вперше з’ясовано, що для пуринових основ основним таутомером-цвітеріоном з-поміж тих, що формуються шляхом міграції карбопротонів, є ілідна форма, котра утворюється в результаті переходу карбопротона при атомі С8 на сусідній з ним атом азоту, з’єднаний з атомом С8 подвійним зв’язком, та відіграє важливу роль у процесах воднево-тритієвого обміну групи С8Н.

Запропоновано нові уявлення про стекінг Уотсон-Криківських пар основ ДНК: головна їхня відмінність від існуючих полягає у наявності специфічних кулонівських контактів вільної електронної пари (ВЕП) амінних атомів азоту з атомами водню сусідніх (верхніх чи нижніх) основ, які можна розцінювати як вертикальні Н-зв’язки.

У контексті молекулярного управління запропоновано розглядати аміногрупу основ НК як “молекулярний суглоб”, нелінійно-динамічна рухомість якого регулюється втягуванням у міжмолекулярні Н-зв’язки як амінних атомів водню, так і ВЕП амінного атома азоту. Вперше встановлено, що саме ця властивість аміногрупи забезпечує високу конформаційну гнучкість Уотсон-Криківських пар основ відносно кутів "пропелер-твіст" і "злам" та окреслено біологічну значущість цього ефекту для структурно-динамічної організації НК, їхнього синтезу, кодоно-антикодонових взаємодій, а також білково-нуклеїнового впізнавання.

Вперше представлено мікроструктурні моделі, що грунтуються на нових уявленнях про структурну нежорсткість нуклеотидних основ та їхній стекінг і мають послідовне квантовохімічне обгрунтування: вони стосуються тих структурно-динамічних особливостей ДНК, які детермінують впізнавання її білком, – спонтаних напіврозкритих станів, викривленості, далекодії, передплавлення, генотоксичної дії УФ_опромінення та кооперативності.

Вперше вивчено основні структурно-динамічні та енергетичні властивості повної множини точкових контактів типу “нуклеотидна основа-бічний радикал амінокислоти”, що стабілізуються двома міжмолекулярними Н-зв’язками. Вперше зафіксовано перехід основи із основної у рідкісну таутомерну форму під впливом міжмолекулярних взаємодій та перенесення протону від амінокислоти на основу. Вперше встановлено, що вже на найнижчому структурному рівні впізнавання відбувається за “сценарієм” взаємної адаптивності молекул-партнерів за участі суттєво взаємозалежних внутрішньо- та міжмолекулярних Н-зв’язків, здатних не лише розпадатися і відновлюватися, але й біфуркативно перемикатися. Вперше зроблено висновок про обмеженість відомої точки зору, яка ототожнює розповсюдженість, а отже – і біологічну значимість точкових білково-нуклеїнових контактів з їхньою енергетикою. Запропоновано доповнити “статичні” схеми точкової взаємодії основ з бічними радикалами амінокислот динамічними, що включають як перехідні стани інтерконверсії основ ДНК, так і бічних радикалів деяких амінокислот.

Методами низькочастотної Раманівської спектроскопії та спектральної калориметрії отримано нові дані про фізико-хімічні властивості твердофазних модельних об’єктів – кристалів і співкристалізатів нуклеотидних основ, співкристалізатів типу “основа – похідна амінокислоти”, а також компонентів НК, що послідовно ускладнюються.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Загальнотеоретичне значення одержаних результатів полягає у тому, що вони якісно розширюють існуючі уявлення про структурно-динамічну гетерогенність ДНК і її основні квантовохімічні чинники та про перебіг елементарних актів білково-нуклеїнового та нуклеїново-нуклеїнового впізнавання, підіймаючи їх до рівня мікроструктурних моделей, що мають послідовне квантовохімічне обгрунтування. Важливим з теоретичної точки зору є подолання при цьому цілої низки існуючих у цій царині стереотипів: так вдалося, зокрема, довести, що канонічні нуклеотидні основи належать до класу структурно-нежорстких молекул, а стекінг Уотсон-Криківських пар не може бути зведений лише до нелокалізованих взаємодій статичних плоскопаралельних структур. Такі уявлення виявилися досить продуктивними – з’ясувалося, що вони лежать в основі широкого кола ефектів загальнобіологічної значущості, а саме – напіврозкритих станів ДНК, її викривленості, далекодії в ДНК, її передплавлення, кооперативності тощо, що контролюють перебіг елементарних актів білково-нуклеїнового впізнавання і які описувалися раніше феноменологічно.

Запропоновані моделі, а також висновок щодо характерної фізико-хімічної відмінності НК від органічних полімерів – представників неживого світу будуть стимулювати подальші теоретичні пошуки у напрямку створення цілісної фізико-хімічної концепції функціювання НК та наповнення новим змістом фізико-хімічних критеріїв живого.

Якісно нова концепція стереохімічної нежорсткості основ ДНК та їхнього стекінгу може бути використана як базова для теоретичного пояснення непересічних експериментальних фактів, які не мають до цього часу задовільного мікроструктурного тлумачення і стосуються, зокрема, унікальної механічної еластичності ДНК та її здатності передавати електричні сигнали, зокрема фотоіндуковані, на велику відстань без затухання. Вона також буде сприяти теоретичному обгрунтуванню необхідності вдосконалення існуючої структурної номенклатури НК, розвитку поняття про структурно-динамічну відповідність Уотсон-Криківських пар основ ДНК і розширення традиційних рамок конформаційного аналізу НК. Окрім того, вона дає імпульс для подальшого теоретичного розвитку класичної ідеї про роль ефектів електронного спряження у перебігу біологічних процесів на молекулярному рівні за участю НК: центральним моментом тут може виявитися поглиблення на теоретичному рівні взаємозв’язку між такими властивостями, притаманними як НК, так і нуклеопротеїдним комплексам, як кооперативність, гетерогенність, нелінійність і нерівноважність із структурною нежорсткістю їхніх складових частин. Дані щодо впливу зарядового стану фосфатів на вертикальні взаємодії в ДНК можуть виявитися вельми корисними при розробці синенергетичних нелінійно-динамічних моделей біомолекулярного управління і регуляції, а також моделей термодинамічної стабільності ДНК і її компактизації білками. Принципово важливий висновок про квантову геометрію основ ДНК дозволить чіткіше окреслити рамки придатності класичних механічних підходів у теоретично-розрахункових дослідженнях структурно-динамічних властивостей як НК, так і нуклеопротеїдних комплексів. Висновок про можливу біологічну значущість "прихованих" від безпосереднього експериментального спостереження рідкісних таутомерів, елементарних білково-нуклеїнових контактів в перехідних станах інтерконверсії їхніх складових частин тощо актуалізує роль теоретичних методів досліджень, зокрема квантовохімічних. Особливий теоретичний інтерес становлять також результати вивчення різноманітних форм структурної мінливості азотистих основ. Не виключається, що вони відіграють неабияку роль у перебігу параметаболічних процесів, які нині розцінюються як молекулярне підгрунтя старіння і все більше привертають увагу дослідників.

Отримані в роботі результати можуть бути використані в науково-дослідній практиці для розробки кількісних моделей, що описують процеси біомолекулярного впізнавання на макромолекулярному рівні. Встановлені структурно-динамічні властивості точкових нуклеїново-нуклеїнових та білково-нуклеїнових контактів можуть бути корисними для зменшення неоднозначності в інтерпретації рентгеноструктурних і ЯМР-даних щодо просторової організації НК та нуклеопротеїдних комплексів. Результатами дисертації можна також скористатися в супрамолекулярній хімії при виробленні стратегії синтезу високомолекулярних сполук з прогнозованими властивостями. Розроблений автором оригінальний Раманівський спектрометр може знайти застосування всюди, де мають справу з реєстрацією малоінтенсивних спектрів. Окрім того, зроблені в роботі висновки дають поштовх для постановки нових, як реальних, так і комп’ютерних експериментів, спрямованих на поглиблення інформації щодо перебігу елементарних процесів біомолекулярного впізнавання.

Матеріали дисертації лягли в основу спецкурсу, прочитаного дисертантом студентам спеціалізації "фізика біологічних систем" факультету природничих наук Національного університету "Києво-Могилянська академія" у 1998-1999 навчальному році.

Переважна більшість числових даних, викладених в дисертації, об’єднана в комп’ютерну базу даних, доступну для споживачів.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта є визначальним на всих етапах дослідження і полягає, перш за все, у постановці проблеми та обгрунтуванні завдань, у виборі об’єктів досліджень і розробці їхніх методик, аналізі, інтерпретації та узагальненні експериментальних і розрахункових даних. Йому належать всі теоретичні ідеї та експериментальні підходи, реалізовані в дисертації. Основні експериментальні дослідження і теоретичні розрахунки виконані автором одноосібно. Частину їх отримано у співпраці з співробітниками відділу молекулярної біофізики ІМБіГ НАН України – М. В. Желтовським, Я. Р. Міщук, І. В. Кондратюком та С. П. Самійленко.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на IX, X, XI, XII і XIV Школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів” (м. Тернопіль, 1989; м. Суми, 1991; м. Харків, 1993; м. Ніжин, 1995; м. Одеса, 1999), ІІІ, IV і VIII Європейських конференціях з спектроскопії біологічних молекул (м. Болонья, 1989; м. Йорк, 1991; м. Еншед, 1999), VIII Всесоюзній конференції “Використання обчислювальних машин в спектроскопії молекул і хімічних дослідженнях” (м. Новосибірськ, 1989), XII Всесоюзній нараді "Застосування коливальних спектрів для дослідження неорганічних і координаційних сполук" (м. Мінськ, 1989), ІV Всесоюзній конференції з спектроскопії комбінаційного розсіяння світла (м. Ужгород, 1989), VІ Всесоюзній координаційній нараді з спектроскопії полімерів (м. Мінськ, 1989), Всесоюзній школі “Молекулярно-клітинні механізми імунної регуляції гомеостазу та проблеми математичного моделювання” (м. Красноярськ, 1990), Науково-практичних семінарах “Оптика і спектроскопія та їхнє застосування в народному господарстві і екології” (м. Мелітополь, 1990; м. Кам’янець-Подільський, 1992), ІІІ Міжнародній конференції з лазерної спектроскопії розсіяного світла та діагностиці біологічних об’єктів (м. Москва, 1990), ІІ Міжнародному конгресі теоретиків у галузі органічної хімії (м. Торонто, 1990), Всесоюзній школі із застосування комп’ютерів у хімії (м. Звенигород, 1990), Школах-семінарах з фізики нуклеїнових кислот (м. Харків, 1990; м. Харків, 1993), VI Польсько-радянському симпозиумі з спектроскопії водневого зв’язку (м. Познань, 1990), XX Європейському конгресі з молекулярної спектроскопії (м. Загреб, 1991), VІІ і VIII Конференціях з спектроскопії біополімерів (м. Харків, 1991; м. Харків, 1993), Міжнародному симпозиумі з останніх досягнень у дослідженні хімії та молекулярної біології раку (м. Пекін, 1991), ІX Всесоюзній конференції з хімічної інформатики (м. Чорноголовка, 1992), І Українсько-польському симпозиумі з водневого зв’язку (м. Одеса, 1992), Конференції (за участю міжнародних вчених) з коливальної спектроскопії, присвяченій 80-річчю від дня народження Б. І. Степанова (м. Мінськ, 1993), XII Міжнародному семінарі з міжмолекулярної взаємодії та конформацій молекул (м. Харків, 1994), Міжнародній науковій конференції “Фізика і хімія органічних люмінофорів – 95” (м. Харків, 1995), І і ІІ З’їздах Українського біофізичного товариства (м. Київ, 1996; м. Харків, 1998), Міжнародній конференції “Нелінійні явища в біології” (м. Пущино, 1998), Ювілейній конференції Федерації європейських біохімічних товариств (м. Копенгаген, 1998), Конференції (за участю міжнародних учасників) з фізики біологічних систем (м. Київ, 1998), VІІ Конференції з сучасних тенденцій у обчислювальній хімії (м. Віксбург, 1998), XXVII Конференції південно-східної асоціації хіміків-теоретиків США (м. Талахас, 1998), Міжнародній конференції “Водневий зв’язок” (м. Київ, 1998), ІІ З’їзді біофізиків Росії (м. Москва, 1999), XIII Конференції “Горизонти досліджень водневого зв’язку” (м. Швєрадув Здруй, 1999) та Наукових семінарах Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ, 1990-1999), Інституту фізики НАН України (м. Київ, 1996), Національного університету “Києво-Могилянська академія” (м. Київ, 1997), НДЦ квантової медицини "Відгук" МОЗ України (м. Київ, 1999).

Публікації. На тему дисертації надруковано 47 статей (з них 8 - одноосібних) у вітчизняних та зарубіжних фахових журналах, що реферуються, та 33 тези доповідей на наукових конференціях. Вони у повному об’ємі висвітлюють зміст, результати, висновки і рекомендації дисертації.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, чотирьох оригінальних розділів, кожен з яких закінчується висновками, де викладено результати дослідження і проведено їхнє обговорення, підсумкових висновків і переліку використаних літературних джерел (300 найменувань). Повний обсяг дисертації - 300 сторінок, вона містить 37 таблиць і 31 рисунок.

Методологія, методи і об’єкти досліджень. “Від простого до складного” – це основний методологічний принцип, який використано у роботі. Простими і водночас репрезентативними частинами цілого – ДНК і нуклеопротеїдних комплексів – слугували ізольовані нуклеотидні основи, нуклеозиди, прості молекули, що моделювали бічні радикали амінокислот, Уотсон-Криківські пари і Н-зв’язані комплекси типу “нуклеотидна основа – бічний радикал амінокислоти”; використовува-лися також твердофазні низькомолекулярні моделі білково-нуклеїнового і нуклеїново-нуклеїнового впізнавання – кристали компонентів НК, що послідовно ускладнювалися, співкристалізати нуклеотидних основ, а також співкристалізати типу “нуклеотидна основа –похідна амінокислоти”. Використовувалися як експериментальні (Раманівська спектроскопія, спектральна калориметрія, в окремих випадках ЯМР і ІЧ- спектроскопія), так і теоретично-розрахункові методи (напівемпіричні квантовохімічні методи АМ1, MNDO/3 і MNDO/Н). Основна мотивація вибору експериментальних методів – це висока інформативність, теоретично-розрахункових – доступність реалізації при прийнятній швидкості отримання інформації і її якості. В комп’ютерному експерименті велика увага приділялася його плануванню, а також оцінці надійності отриманих результатів. На етапі планування на основі аналізу літератури створювалася якісна модель очікуваного в класі сполук, що вивчалися, ефекту. Для оцінки достовірності його числової версії використовувалися "тестові" молекули, ретельно вивчені експериментально або ж розрахунковими методами високого рівня складності. У переважній більшості випадків комп’ютерний експеримент був спрямований не на поліпшення існуючих числових даних, а на пошук нових ефектів що мають непересічне біологічне значення. При цьому нас цікавили не стільки самі числові дані, як їхні тенденції.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Структурна мінливість нуклеотидних основ: результати квантовохімічних досліджень

Стереохімічна нежорсткість. Вперше встановлено, що азотисті основи, які мають у своєму складі аміногрупу, належать до класу структурно-нежорстких молекул. Інтерконверсія їхніх несиметричних енантіомерів відбувається трьома енергетично і топологічно нееквівалентними шляхами: через площинну інверсію амінного фрагмента ?CNH2 , через планарний перехідний стан і суттєво анізотропне повертання аміногрупи навколо екзоциклічного зв’язку CN через два різних плоскосиметричних перехідних стани. Характер інтерконверсії аззотистих основ з аміногрупою суттєво залежить від положення останньої в кільці та від її оточення. Для піримідинових основ незалежно від положення аміногрупи і пуринових основ з аміногрупою у будь-якому положенні піримідинового кільця найбільш низькоенергетичним шляхом інтерконверсії є площинна інверсія. Проте у випадку, коли аміногрупа знаходиться у 8 положенні імідазольного кільця пуринових основ, найбільш низькоенергетичним шляхом інтерконверсії є внутрішнє повертання аміногрупи навколо екзоциклічного зв’язку CN через плоскосиметричний перехідний стан з цис-орієнтацією амінопротонів відносно сусіднього з амінним фрагментом подвійного зв’язку C=N. Вперше встановлено, що така поведінка азотистих основ пуринового ряду з аміногрупою у 8 положенні тісно пов’язана з аналогічною поведінкою 2-аміноімідазолу: його анелювання з піримідинами не змінює характеру інтерконверсії, збурюючи лише її енергетичні параметри. Вперше вдалося пов’язати характер інтерконверсії азотистих основ з аміногрупою із характером пірамідальності амінного фрагмента у мінімумі гіперповерхні потенціальної енергії (ГППЕ): коли амінопротони розташовані по один бік від площини кільця, енергетично найвигіднішим шляхом інтерконверсії є площинна інверсія амінного фрагмента (така ситуація має місце, зокрема, у канонічних нуклеотидних основах - Ade, Gua, Cyt); коли ж амінопротони розміщені асиметрично по обидва боки від площини кільця, енергетично найвигіднішим шляхом інтерконверсії є внутрішнє повертання аміногрупи навколо екзоциклічного зв’язку CN. Інтерконверсія азотистих основ з аміногрупою супроводжується істотньою зміною дипольного момента (це пов’язано, в основному, із зміною просторової орієнтації ВЕП амінного атома азоту), а також суттєвою деформацією амінного фрагмента (так, зокрема, в перехідних станах внутрішнього повертання аміногрупи значно зростає (до 55° - 57°) кут нахилу її площини H'NH'' до екзоциклічного зв’язку CN). Встановлено, що бар’єр площинної інверсії канонічних нуклеотидних основ з аміногрупою спадає в ряду Gua > Cyt > Ade, причому для Gua він близький до kT при фізіологічній температурі. Згодом цей висновок було підтверджено квантовохімічними розрахунками високого рівня складності (Leszczyсski, Љponer et al., 1996). Вперше шляхом зіставлення величини бар’єру площинної інверсії з експериментальною частотою віялового (інверсного) коливання амінного фрагмента зафіксовано надбар’єрний характер площинної інверсії в Ade, Cyt і Gua у вигляді суттєво ангармонійного коливання великої амплітуди, котра сягає десятків градусів. Вперше зроблено принципово важливий висновок про квантову геометрію цих біологічно важливих молекул. Це означає, що врахування нульової коливальної енергії суттєво змінює геометрію молекули, яка відповідає глобальному мінімуму. Навіть при Т > 0 К Ade, Cyt і Gua є ефективно планарними молекулами (ефективна симетрія СS), при цьому величину відхилення від площинності амінного фрагмента у глобальному мінімумі ГППЕ можна розглядати як оцінку знизу амплітуди його віялового коливання. Таким чином, вдалося подолати існуючу дилему "планарність-непланарність" щодо будови нуклеотидних основ з аміногрупою. Нині експериментальні дані щодо структурної нежорсткості азотистих основ з аміногрупою відсутні, проте, на наш погляд, найкращим її доказом є непридатність гармонійного наближення для інтерпретації частот деформаційних коливань амінного фрагмента.

Зроблено узагальнення щодо анізотропії повертання аміногрупи – найбільша її величина спостерігається у тих випадках, коли аміногрупа оточена з одного боку ендоциклічним атомом азоту, а з іншого – екзоциклічним зв’язком NH чи CH, як це має місце в Cyt (5 ккал/моль) і Gua (4,4 ккал/моль за даними АМ1). За цих умов аміногрупі значно вигідніше повертатися амінопротонами у бік сусіднього подвійного зв’язку C=N, бо перехідний стан повертання у цьому випадку стабілізується кулонівською взаємодією амінних атомів водню з ендоциклічним атомом азоту і ВЕП амінного атома азоту з атомом водню сусідньої групи NH чи CH. Цю взаємодію можна розглядати як внутрішньомолекулярні Н-зв’язки, що взаємопосилюються. Повертання аміногрупи у зворотній бік значно ускладнене дестабілізацією перехідного стану кулонівським відштовхуванням ВЕП амінного і сусіднього ендоциклічного атома азоту, а також амінних і атома водню групи NH чи CH. Таким чином, вперше встановлено, що аміногрупа в канонічних нуклеотидних основах не обертається ізотропно на 360° без деформацій, як це традиційно вважалося раніше, а переважно повертається в обмеженому секторі (180°) двогранних кутів, істотньо при цьому деформуючись. Зроблено висновок, що основними стереохімічними чинниками структурної нежорсткості азотистих основ з аміногрупою є р?-спряження ВЕП амінного атома азоту з ?-електронною системою кільця, Фермі- відштовхування між амінним зв’язком NН і сусіднім зв’язком NН чи CН, кулонівська взаємодія ВЕП амінного атома азоту як з ВЕП сусідніх атомів, так і з атомом водню сусіднього зв’язку NН чи CН. Вперше встановлено взаємозалежність структурної нежорсткості азотистих основ з аміногрупою від таутомерії і геометричної ізомерії.

Наявність низьких ( 200 см-1) частот в коливальних спектрах азотистих основ, що відповідають непланарним деформаціям кільця, вказує на його квазіжорсткість: розрахунок за формулою гармонійного осцилятора з використанням літературних даних для силових постійних непланарних коливань кільця (10 - 20 ккал/моль) дає для нульової амплітуди величину, що перевищує 10°. Ця елементарна оцінка цілковито узгоджується з дослідженнями конформаційної гнучкості гетероциклів нуклеотидних основ квантовохімічними методами високого рівня складності (Шишкін, 1999).

Вперше показано, що при переході від основи до нуклеозиду спостерігається слабка тенденція до підвищення бар’єру площинної інверсії амінного фрагмента і відповідно зниження бар’єрів поворотної рухомості аміногрупи. На відміну від основ та їхніх метильованих по глікозидному азоту аналогів, де площинна інверсія амінного фрагмента відбувається у дзеркально-симетричному адіабатичному потенціалі, в нуклеозиді цей потенціал стає асиметричним, причому величина асиметрії помітно менша за бар’єр інверсії. Це означає, що для нуклеотидних основ з аміногрупою у складі нуклеозидів появляється, нехай і у динамічному сенсі, виділений напрямок "верх-низ".

Використовуючи метод MNDO/Н, вперше вдалося показати, що канонічні нуклеотидні основи охоплені просторовою сіткою взаємозалежних внутрішньомолекулярних Н-зв’язків типу NН…О і NН…N з енергією 0,7-3 ккал/моль (яку треба розглядати як оцінку зверху). Такі уявлення підкріплюються експериментальними даними: так, зокрема, найслабший (0,7 ккал/моль) внутрішньомолекулярний Н-зв’язок N6Н’’…N7 в Ade зафіксовано рентгено-структурними методом у кристалічному стані (Jeffrey, Saenger, 1994), а найсильніший (3 ккал/моль) N4Н’…N3 в Cyt зареєстровано нами методом ЯМР-спектроскопії у безводному диметилсульфоксиді. Для внутрішньомолекулярних Н-зв’язкві за участю аміногрупи характерно те, що при її анізотропному повертанні вони істотньо змінюють не лише свою енергетику, перемикаючись з одних атомних груп на інші, а й кількість: їхня енергія, кооперативні властивості, тип і навіть кількість не є стаціонарними характеристиками.

Прототропна таутомерія. Вперше в практиці квантовохімічного дослідження явища прототропної таутомерії азотистих основ "з прицілом" на її біологічну значимість ця задача розв’язана у максимально можливому форматі, обмеженому лише уявленнями про природу хімічного зв’язку, для досить великої кількості молекул, що послідовно ускладнюються: канонічних основ ДНК, їхніх дезамінованих аналогів та складових частин - пурину, піримідину і імідазолу (Im). Такий підхід, дозволив зафіксувати низку нових фізико-хімчних закономірностей прототропної таутомерії азотистих основ.

Так, вперше встановлено, що це явище має молекулярно-цвітеріонний характер – в ньому беруть участь усі без винятку протони, включаючи карбопротони. Показано, що пуринові основи та Im мають значно більшу схильність до цвітеріонної таутомерії, аніж піримідинові. Виявлено спільну структурну рису молекулярно-цвітеріонних таутомерів основ, що мають у своєму складі атоми кисню, – переважну цис-орієнтацію гідроксильних груп відносно сусіднього ендоциклічного атома азоту. Доведено, що планарна будова основного таутомера не є наскрізною властивістю всієї множини таутомерів.

Вперше з’ясовано, що для кожної азотистої основи пуринового ряду та Im основним таутомером-цвітеріоном з-поміж тих, що формуються шляхом міграції карбопротонів, є ілідна форма, що утворюється в результаті переходу протона при атомі вуглецю С8 (С2 в Im) на сусідній атом азоту (N7 - у пуринах, N2 - в Im). Біологічна значущість її, зокрема, полягає в тому, що вона є перехідним станом реакції Н > T(D) - обміну групи С8Н пуринових основ і групи С2Н Im у воді при сприятливих pH: молекулярно-кінетичний механізм її формування - це естафетне протонування (атома N7 пуринів і атома N3 Im) – депротонування (зв’язку С8Н пуринів і С2Н Im) за участю протонів з водного середовища. Встановлено, що у випадку пуринових основ, які мають у своєму складі аміногрупу, навіть на низькомолекулярному рівні процес обміну є конформаційно-чутливим, оскільки перехід з основної таутомерної форми в ілідну супроводжується істотним збуренням структурно-динамічних властивостей амінного фрагмента. Це означає, що швидкість обміну в групі С8Н Ade і Gua визначається не лише конформацією НК, але й її збуренням при переході в ілідну форму. Зроблено припущення про участь ілідних таутомерів пуринових основ в процесах їхнього пошкодження кисневими радикалами.

Обгрунтовано точку зору про значно більшу біологічну значущість прототропної таутомерії азотистих основ, аніж це прийнято нині. Це стосується, насамперед, високоенергетичних таутомерів, зокрема цвітеріонних, які безпосередньо не фіксуються фізико-хімічними методами, в першу чергу - спектроскопічними, в умовах термодинамічної рівноваги і гомогенності оточення (вакуум, низькотемпературна інертна матриця, розчин тощо), - так званих "прихованих структур". Стверджується, що в умовах суттєвої гетерогенності локального оточення, як це має місце у високомолекулярних білково-нуклеїнових комплексах, більшість, якщо не всі таутомери тієї чи іншої нуклеотидної основи, можуть бути зафіксовані Н-зв’язками у відповідних місцях впізнавання. Принципових фізико-хімічних перешкод для цього не існує, оскільки характерний для них діапазон енергетичної стабільності ( 30 ккал/моль) з надлишком може бути перекритий втягуванням рідкісних таутомерів у Н-зв’язки із кількома бічними радикалами амінокислот (особливо зарядженими), що утворюють місце впізнавання. Характерним тут є приклад біосинтезу пуринових нуклеотидів - необхідною його передумовою, як відомо, є переведення основи із основної у рідкісну таутомерну форму N7Н з відкритим для приєднання цукрового залишку атомом азоту N9 імідазольного циклу, яке реалізується ферментом. Окрім того, в кристалі isoCyt співіснують дві таутомерні форми - основна, з локалізацією імінопротона при атомі N3, і рідкісна, з локалізацією імінопротона при атомі N1, енергії яких істотньо відрізняються – на 12,2 ккал/моль (за даними АМ1). Це показовий приклад того, як навіть у гомогенних умовах за рахунок залежності комплексотвірної здатності основи від її таутомерного стану міжмолекулярні Н-зв’язки стабілізують рідкісну таутомерну форму з досить високою енергією. Отже, неправомірно ставити у пряму залежність, як це традиційно робиться, біологічну значущість тієї чи іншої таутомерної форми від її енергетичної стабільності.

Вперше постульовано можливість взаємоперетворення деяких таутомерів азотистих основ за рахунок перенесення протону вздовж внутрішньомолекулярного Н-зв’язку. Пізніші розрахунки високого рівня складності координати реакції внутрішньомолекулярного перенесення протону в Gua (від атома N1 на атом кисню), Cyt (з аміногрупи на атом N3) і деяких інших основах ДНК (Leszczynski, Gorb, 1998-1999) повністю це підтвердили. Більше того, ці розрахунки є чи не найкращим додатковим свідченням наявності в нуклеотидних основах внутрішньомолекулярних Н-зв’язків.

Здатність приєднувати або відщеплювати протон. Оригінальність запропонованого підходу для вирішення цієї задачі полягає у використанні широкого (такого ж, як і у випадку вивчення прототропної таутомерії) набору об’єктів дослідження. Це дозволило встановити спільні і відмінні риси як протонодонорних-протоноакцепторних властивостей азотистих основ, так і їхньої здатності деформуватися при зміні зарядового стану, а також прослідкувати, як вони змінюються з ускладненням структури молекули.

Так, детальний аналіз величини та характеру структурних збурень, що мають місце при протонуванні та депротонуванні основи, засвідчує, що максимальні зміни величини геометричних параметрів (валентних зв’язків, валентних та двогранних кутів) спостерігаються поблизу місць приєднання чи відщеплення протона, зменшуючись на периферії, при цьому збурення геометричних параметрів супроводжується істотним перерозподілом зарядів на атомах. Азотисті основи, які не мають у своєму складі аміногрупи, не змінюють площинного характеру своєї будови при протонуванні чи депротонуванні незалежно від його місця. Вперше встановлено, що азотисті основи з аміногрупою поводять себе інакше: найістотніших збурень, які сягають десятків градусів при зміні їхнього зарядового стану шляхом протонування чи депротонування, зазнають "найм’якші" геометричні параметри – двогранні кути, що характеризують пірамідність амінного фрагмента CNН2. Протонування основ з аміногрупою, незалежно від його місця (виняток складає лише амінний атом азоту), призводить до повного їхнього сплощення – їхня інтерконверсія відбувається лише шляхом анізотропного повертання аміногрупи навколо екзоциклічного зв’язку CN, причому величини бар’єрів повертання зростають у порівнянні з електронейтральною основою. Депротонування основ з аміногрупою навпаки – значно посилює неплощинність їхнього амінного фрагмента і дещо зморщує кільце. При цьому величина ефекту та його характер залежить від місця депротонування основи. Їхня інтерконверсія відбувається, як і у електронейтральних аналогів, трьома топологічно і енергетично нееквівалентними шляхами, але на відміну від останніх, зростає бар’єр площинної інверсії і відповідно зменшуються бар’єри внутрішнього повертання аміногрупи. У аніонів Ade, наприклад, бар’єр площинної інверсії зростає більше, ніж