ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Ямборко Надія Анатоліївна

УДК 575.22.46:631.51.01:632.952

СТІЙКІСТЬ МІКРОБНИХ УГРУПОВАНЬ ҐРУНТУ ДО ГЕНОТОКСИЧНОГО ВПЛИВУ ДЕЯКИХ ПЕСТИЦИДІВ

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі загальної і грунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Національної Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Іутинська Галина Олександрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу загальної і грунтової мікробіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних бактерій.

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Надкернична Олена Володимирівна, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН України, завідувач відділу біологічного азоту

Провідна організація: Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, кафедра мікробіології і загальної імунології.

Захист відбудеться “16” березня 2005 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “ “ лютого 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В умовах сучасної господарської діяльності людини кількість чинників, стресових для довкілля, у тому числі і для ґрунту, невпинно зростає. До найбільш поширених факторів антропогенного впливу, що мають важливе значення для формування і функціонування мікробних угруповань земель сільскогосподарського призначення, відносять засоби захисту рослин.

Світове використання пестицидів складає біля 3 млн тон на рік, з них частка фунгіцидів становить 18%. Тривалий досвід використання засобів хімічного захисту рослин показав їхній негативний вплив на довкілля і ґрунтову мікробіоту.

Переважна більшість дослідників [Круглов, 1991; Благодатская, 1996; Матаруева, 1998] визнають, що пестициди проявляють токсичну дію, яка веде до зменшення чисельності мікроорганізмів у ґрунті і пригнічення їхньої біохімічної активності. Лише в небагатьох роботах відмічається, що хімічно синтезовані пестициди мають не тільки токсичну, а й мутагенну дію на мікроорганізми ґрунту [Усатая, Катрук, 1990; Емнова, 1991].

Мікробний ценоз ґрунту першим контактує з полютантами. Пристосовуючись до нових агресивних умов існування, мікроорганізми проявляють стійкість до них або необоротно змінюють свої функціональні властивості, що може негативно позначитись на родючості ґрунту.

Стійкість мікробного ценозу ґрунту – це властивість зберігати структуру і характер функціонування за дії несприятливих факторів природного або антропогенного походження (резистентна стійкість) та здатність повертатись у вихідний стан після відхилень (пружна стійкість) [Одум, 1986; Хитров, 2003].

Незважаючи на те, що питання впливу пестицидів на мікробіоту ґрунту вивчається досить інтенсивно, залишаються мало дослідженими закономірності формування стійкості мікробного угруповання до токсичної і генотоксичної дії засобів захисту рослин. Вирішення цього питання є актуальним, оскільки дає можливість визначити вплив пестицидного навантаження на мікроорганізми ґрунту, виявити найбільш небезпечні пестициди, які можуть негативно впливати на їх генетичний апарат.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямом науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України в межах бюджетної тематики відділу загальної і ґрунтової мікробіології № 0101U003050/2.28.99, “Еколого-функціональні особливості мікробних угруповань ґрунту в умовах сучасного розвитку агроекосистем”, а також проектів фонду фундаментальних досліджень №06.-7/00020 “Дослідити закономірності функціонування ризосферних та епіфітних мікробних ценозів бобових під впливом нових композицій фунгіцидної дії”.

Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи було вивчення резистентної стійкості окремих культур і мікробного угруповання ґрунту вцілому до токсичної та мутагенної дії біологічних і хімічно синтезованих пестицидів, дослідження пружної стійкості мікробних угруповань за здатністю відновлювати свої функції після контакту з пестицидами.

Виходячи з мети досліджень, вирішувались такі завдання :

· визначити стійкість мікробних угруповань ґрунту, які сформувались за різних агротехнологій вирощування озимої пшениці, до токсичної і мутагенної дії пестицидів;

· дослідити з використанням тесту Еймса мутагенну дію пестицидів на культури Salmonella typhimurium ТА100, Salmonella typhimurium ТА98 і Escherichia coli WP2;

· виявити, спричинені пестицидами, зміни у ферментних спектрах типових представників ґрунтової мікробіоти;

· дослідити здатність мікробного ценозу ґрунту відновлювати чисельність і фізіологічну активність після контакту з пестицидами.

Об’єктами дослідження були мікробний ценоз чорнозему звичайного, відібраного в польових дослідах Національного аграрного університету; культури ауксотрофних мікроорганізмів E. coli WP2, S. thyphimurium TA100 і S. thyphimurium ТА98; культури ґрунтових мікроорганізмів Micrococcus luteus CCM 248 і Stenotrophomonas maltophilia УКМ В-257, фунгіциди мікробного походження мікосан і мікосан новий, хімічно синтезовані фунгіциди фундазол і вітавакс, гербіциди раундап і діален.

Предметом дослідження були резистентна і пружна стійкість мікроорганізмів ґрунту до генотоксичної дії деяких пестицидів.

Методи дослідження. Для реалізації завдань дослідження використовували класичні методи ґрунтової мікробіології у поєднанні з методами генетичних і біохімічних досліджень, а також розроблену автором методику визначення стійкості мікроорганізмів ґрунтового ценозу до токсичної і мутагенної дії пестицидів.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено новий метод визначення токсичного і мутагенного впливу пестицидів на мікробні угруповання ґрунту. Результати, одержані розробленим методом, корелюють з даними тесту на ауксотрофному штамі E. coli WP2.

Вперше показано, що біологічні агротехнології вирощування сільськогосподарських культур сприяють підвищенню стійкості мікробних угруповань ґрунту до пестицидів; за умов застосування хімічної агротехнології підвищується вразливість мікроорганізмів до мутагенної дії пестицидів.

Вперше виявлено, що під впливом пестицидів у спектрах ферментів ґрунтових мікроорганізмів можуть виникати такі зміни: перерозподіл активності між окремими фракціями ферменту; зникнення існуючих чи поява нових молекулярних форм ферменту; повна репресія його синтезу. Досліджені пестициди мають властивості слабких мутагенів та індукують зміни у спектрах глюкозо-фосфатізомерази, ізоцитратлегідрогенази, естерази, фосфоглюкомутази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, діафорази, алкогольдегідрогенази, глутаматдегідрогенази, супероксид-дисмутази, 6-фосфоглюконатдегідрогенази і сорбітолдегідрогенази ґрунтових мікроорганізмів.

Одержані нові характеристики пружної стійкості мікробного ценозу ґрунту за умов дії пестицидів. Показано, що дія пестицидів проявляється у гальмуванні швидкості метаболічних процесів у мікроорганізмів, що в свою чергу призводить до зниження більшості показників біологічної активності ґрунту.

Практичне значення одержаних результатів. Для еколого-генетичного моніторингу ґрунтів запропонований новий метод тестування безпечності нових пестицидів для ґрунтової мікробіоти з використанням в якості тест-об’єкту всієї сукупності мікроорганізмів, що входять до складу ґрунтового ценозу.

Для виявлення генетичних подій в геномі мікроорганізмів рекомендовано вивчення спектрів ферментів метаболізму у типових штамів ґрунтових мікроорганізмів.

На основі розроблених індикаційних систем і проведеної порівняльної характеристики генотоксичних властивостей біофунгіцидів, фунгіцидів хімічного походження, а також препаратів гербіцидної дії встановлено, що фунгіциди мікробного походження мікосан і мікосан новий не пригнічують функціональної активності мікробного ценозу ґрунту і можуть бути рекомендовані для використання як альтернатива хімічно синтезованим фунгіцидам.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено дослідження токсичної і мутагенної дії пестицидів на мікробні угруповання ґрунту, а також вивчена індукція ними мутацій у тест-культур мікроорганізмів E. coli WP2, S. typhimurium TA100 і ТА98. Здобувач самостійно проводила роботу по вивченню параметрів росту окремих мікроорганізмів за присутності пестицидів і виявляла зміни у ферментних спектрах ґрунтових мікроорганізмів, спричинені цими препаратами, досліджувала вплив генотоксичних пестицидів на пружну стійкість мікробних угруповань ґрунту. Аналіз результатів, їхнє узагальнення і статистичну обробку, інтерпретацію даних та формулювання основних положень і висновків дисертації, підготовку до друку наукових статей здобувачем проведено особисто за консультації наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н. Г.О. Іутинської.

Штам E. coli WP2, використаний для визначення мутагенності пестицидів, був наданий с.н.с. Інституту мікробіології АН Молдови, д.б.н. К. Є. Ємновою. Культури S. typhimurium TA100 і ТА98 були одержані від д.б.н., проф. Р. І. Гвоздяка. Культури M. luteus CCM 248 і S. maltophilia УКМ В-257 були надані для роботи д.б.н. О. А. Кіпріановою.

Дослідження спектрів ферментів проводили в Інституті агроекології і біотехнології УААН за консультативної підтримки д.с.-г.н., проф. В. І. Глазка.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на: X та XІ Міжнародних конференціях студентів і аспірантів по фундаментальним наукам “ЛОМОНОСОВ – 2003”; “ЛОМОНОСОВ – 2004” (Москва, Росія, квітень 2003, 2004 рр.); Міжнародній конференції “Біологічні науки і проблеми рослинництва” (Умань, червень 2003 р.); Міжнародній конференції “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, Білорусь, травень 2004 р); Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, вересень 2004 р.); Міжнародній науково-виробничій конференції, присвяченій 80-річчю з дня народження і 50-річчю наукової діяльності доктора с.-г. наук, проф. М. К. Шикули (Київ, січень 2005 р.). Матеріали доповідалися на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАН України (Київ, грудень 2002р).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових праць (7 статей, з них 6 – у фахових журналах, 5 – в тезах доповідей, один патент).

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 147 сторінки машинописного тексту і складається зі Вступу і розділів “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, п’яти розділів власних експериментальних досліджень, розділу “Обговорення результатів досліджень”, “Висновків”, Списку використаних джерел, який включає 207 посилань (з них 81 – іноземні). Робота ілюстрована 31 рисунком і 13 таблицями.

Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури подана характеристика пестицидів як факторів впливу на ґрунтову мікробіоту, наведені дані щодо генетичних пошкоджень і механізмів мутаційного процесу у мікробній клітині, висвітлюється взаємодія мутагенів з ДНК на молекулярному рівні. Проведений аналіз даних по використанню мікробних тестів для індикації мутагенної дії забруднень, подана характеристка генотоксичних властивостей засобів захисту рослин, розлядаються механізми стійкості мікроорганізмів до дії мутагенних факторів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об’єктами досліджень були: 1) мікробний ценоз чорнозему звичайного, зразки ґрунту були відібрані в польових дослідах Національного аграрного університету на базі корпорації “Агро-Союз”, селище Майське, Дніпропетровської області; 2) ауксотрофні мікроорганізми, які використовуються в тесті Еймса: Escherichia coli WP2, Salmonella thyphimurium TA100 і Salmonella thyphimurium ТА98; 3) ґрунтові мікроорганізми Micrococcus luteus CCM 248 і Stenotrophomonas maltophilia УКМ В-257 (штами із Української колекції непатогенних мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології).

Досліджували стійкість мікроорганізмів до нових фунгіцидів біологічного походження – мікосану і мікосану нового, розроблених в Національному Аграрному університеті [Кирик и др., 1989]. Фунгіцид мікосан є лужною витяжкою із міцелію грибів роду Fomes, а мікосан новий – роду Aspergillus. В дослід були взяті концентрації відповідно 0,325 і 0,188 мкг/мл, що еквівалентні дозам використання їх у сільськогосподарському виробництві.

Для порівняльного вивчення були взяті хімічно синтезовані фунгіциди фундазол 50 ЗП (беноміл 50%) і вітавакс 200 ФФ (карбоксид 17% + тирам 17%). Виробничі дози препаратів складали: для фундазолу 0,6 мкг/мл, для вітаваксу – 0,06 мкг/мл діючої речовини. Досліджували також дію препаратів гербіцидної дії – раундапу (48%-ний водний розчин солі гліфосату) і діалену (36,1%-ний водний розчин 2,4-Д і 3,6%-ний розчин дикамбу). Для раундапу виробнича доза була 0,307, для діалену – 0,223 мкг/мл [Перелік пестицидів, 1999]. Вивчали дію препаратів у концентраціях, рекомендованих виробництву, а також збільшених у 10 разів. Позитивними контролями були стандартні мутагени: K2Cr2O7 в концентрації 100 мкг/мл в рідкій культурі та 100 мкг/чашку [Емнова и др., 1991, Кузнецова и др., 2003] і N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідин (МННГ) в концентраціях 1, 10 і 100 мкг/чашку [Миллер, 1976].

Досліджували ґрунт під озимою пшеницею, яка вирощувалась за різними агротехнологіями: біологічною (обробіток ґрунту – 4-5 см, без пестицидів), традиційною (оранка – 25-30 см, гербіцид діален – 2,5 л/га), хімічною (раундап – 4 л/га, діален – 2,5 л/га, без обробітку ґрунту) і мінімальною (обробіток ґрунту – 4-5 см, діалену – 2,5 л/га). На всіх ділянках досліду були внесені мінеральні добрива у дозі N60P40K40.

Зразки ґрунту для аналізу відбирали на глибині 5 – 20 см двічі за вегетаційний період. Чисельність мікроорганізмів основних таксономічних і еколого-трофічних груп визначали загальноприйнятим методом посіву ґрунтової суспензії на агаризовані поживні середовища і виражали кількістю КУО в 1 г сухого ґрунту [Теппер, 1972; Герхардт, 1983; Добровольская и др, 2001].

Для визначення токсичного і мутагенного впливу фунгіцидів на ґрунтову мікробіоту суспензію ґрунту засівали на рідке мінеральне середовище з фунгіцидом і інкубували 2 доби на качалках при 28 0С і 240 об/хв. Контролями були варіант без фунгіцидів і варіант без фунгіцидів із стандартним мутагеном К2Сr2O7. Після інкубації суспензію клітин висівали на ґрунтовий агар і ґрунтовий агар із стрептоміцином (500 мкг/л), інкубували 5 діб при 28 0С.

На середовищі без стрептоміцину оцінювали токсичну дію фунгіцидів. На середовищі із стрептоміцином враховували кількість Str+-колоній. Мутагенний ефект оцінювали за частотою мутацій стійкості до стрептоміцину, яку визначали як відношення кількості колоній на чашках із антибіотиком до кількості колоній на чашках без антибіотику.

Оцінку мутагенної дії пестицидів на тест-штами E.coli WP2 і S. typhimurium проводили за методикою Еймса у модифікації Л. М. Фонштейна із співавторами [Фонштейн и др., 1977].

Параметри росту M.luteus CCM 248 за присутності пестицидів визначали загальноприйнятими методами [Перт, 1978]. Культуру вирощували у м’ясопептонному бульйоні до настання стаціонарної фази росту, накопичення біомаси визначали через кожну годину і будували калібрувальний графік залежності логарифму мікробної біомаси від тривалості культивування.

Методом гель-електрофорезу вивчали зміни у спектрах ферментів культур M.luteus CCM 248 і S. maltophilia УКМ В-257, спричинені пестицидами . Для одержання безклітинного екстракту у флакони з 50 мл МПБ із додаванням пестициду або стандартного мутагену (K2Cr2O7) засівали по 5 мл інокуляту 18-годинної культури і інкубували 30 год на качалках при 28 0С і 240 об/хв до настання експоненційної фази росту.

Після інкубації культуру центрифугуванням при 4000 об/хв 30 хв і двічі відмивали 0,05 М К+-фосфатним буфером рН 7,0. Осад клітин ресуспендували в 10 мл 2%-ного розчину Triton-X100. Дезінтеграцію клітин проводили ультразвуком на установці УЗДН-2Т: частота 22 кГц, тривалість 10с+20с+30с; інтервал між обробками 2 хвилини [Рачинская и др., 2004], дезінтеграти центрифугували при 12000 об/хв 30 хв при 4 0С, одержаний супернатант використовували як безклітинний екстракт, який зберігали при –20 0С.

Електрофорез проводили в 14%-ному крохмальному гелі, при 2 0С в буферній системі: гелевий буфер ТЕБ 0,05 М, електродний буфер Na-боратний. Джерелом струму були блоки живлення Б-5-50, режим електрофорезу при напрузі 100 mV: перші 20 хв – 10 mA, наступні 20 хв – 15 mA, основний час розгонки – при 20 mA, за 20 хв до закінчення 30 mA. Для індикації поведінки системи на лінії старту наносили барвник бромфеноловий синій. Тривалість процесу – 6 год, потім гелевий блок розрізали горизонтально на пластини по 5 – 7 мм, які заливали 20-ма мл фарбуючого розчину. Розчини містили ферментний субстрат, NADH або NADРН, феназинметасульфат або нітросиній тетразолію для функціонування ферменту і утворенням забарвленої сполуки з продуктом ферментативної реакції. [Глазко, 1985].

Вивчали ферменти: глюкозофосфатізомеразу (GPI) КФ 5.3.1.9., фосфоглюкомутазу (PGM) КФ 2.7.5.1., 6-фосфоглюконатдегідрогеназу (6-PGD) КФ 1.1.1.43., глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу (G-6-PD) КФ 1.1.1.49., ізоцитратдегідрогеназу (ICD) КФ 1.1.1.42., глутаматдегідрогеназу (GlDH) КФ 1.4.1.3., алкогольдегідрогеназу (ADH) КФ 1.1.1.1., сорбітолдегідрогеназу (SorDH) КФ 1.1.1.14., супероксиддисмутазу (SOD) КФ 1.15.1.1., діафоразу (DР) КФ 1.6.4.3., естерази (EST) КФ 3.1.1.1.

Для вивчення пружної стійкості мікроорганізмів до дії пестицидів був проведений дослід в яком у природні асоціації ґрунтових мікроорганізмів вирощували на рідкому поживному середовищі з пестицидом 48 год на качалках при 240 об/хв і температурі 28 0С. Потім клітини відмивали від пестициду і ресуспендували в 10 мл фізіологічного розчину. Визначали концентрацію клітин в 1 мл і однаковою кількістю біомаси (800 мг в об’ємі 10 мл) інокулювали стерильні зразки ґрунту. Чорноземний повітряно сухий ґрунт стерилізували в Інституті ядерних досліджень НАН України у полі відпрацьованого ядерного палива з енергією г-випромінювання 662 кілоелектронвольт, доза опромінення становила 3 млн. рад. [Хотянович и др.,1982]. Розмноження і стабілізація мікробних угруповань у ґрунті тривали 30 діб при 28 0С. Після цього вивчали біологічну активність ґрунту: інтенсивність дихання визначали адсорбційним методом, накопичення біомаси – кінетичним методом з урахуванням динаміки субстрат індукованого дихання [Anderson, Domsch, 1978; Благодатская, Ананьева, 1996], потенційну азотфіксуючу активність ґрунту – ацетиленовим методом [Умаров и др., 1981]; накопичення вільних амінокислот у ґрунті – аплікаційним методом [Методы.., 1991]; нітрифікаційну здатність ґрунту – за Арінушкіною з визначенням вмісту нітратів дисульфофеноловим методом [Аринушкина, 1961]; целюлозолітичну здатність ґрунту – ваговим методом [Теппер и др.., 1972].

Статистичну обробку даних було зроблено за допомогою пакету програм Microsoft Exel_97. Коефіцієнти кореляції даних були визначені непараметричним методом рангової кореляції. Характеристика спектрів ферментів була проведена за допомогою комп’ютерної програми TotalLab.

Розділ 3. Токсична і мутагенна дія пестицидів на мікробні угруповання ґрунту

Проведені дослідження мікробних оценозів чорноземного ґрунту, які сформувалися за умов застосування різних агротехнологій вирощування озимої пшениці (біологічної, традиційної, хімічної і мінімальної) показали, що у середньому за вегетаційний період найбільша кількість грибів, стрептоміцетів, амоніфікуючих, амілолітичних, оліготрофних, гуматрозкладаючих бактерій була виявлена у ґрунті за умов біологічної агротехнології і перевищувала їх кількість за умов традиційної агротехнології в 1,7 – 3,3 рази. При хімічній агротехнології порівняно з біологічною, кількість ґрунтових стрептоміцетів, амоніфікаторів, амілолітиків була меншою в 3,0 – 3,6 рази, а грибів, педотрофних, оліготрофних, гуматрозкладаючих бактерій – в 1,6 – 2,2 рази (табл.1). За умов біологічної і традиційної агротехнологій чисельність

Таблиця 1

Чисельність мікроорганізмів у чорноземному ґрунті (КУО у 1 г сухого ґрунту) при різних агротехнологіях вирощування озимої пшениці

Чисельність мікроорганізмів

(КУО в 1г ґрунту) | Агротехнології вирощування

Біологічна | Традиційна | Хімічна | Мінімальна

Гриби (тис. ) | 15,5±1,31 | 7,73±0,92 | 8,3±0,96 | 13,2±1,21 | Стрептоміцети (млн. ) | 1,6±0,36 | 0,48±0,22 | 0,45±0,23 | 3,0±0,57

Педотрофні (млн. ) | 29,6±1,81 | 30,1±1,82 | 13,5±1,22 | 17,9±1,41

Амоніфікуючі (млн. ) | 21,5±1,54 | 11,6±1,13 | 6,96±0,87 | 9,71±1,03

Амілолітичні (млн ) | 6,6±0,85 | 3,9±0,65 | 2,22±0,49 | 4,3±0,69

Оліготрофні(млн. ) | 33,8±1,93 | 24,9±1,66 | 17,6±1,39 | 16,5±1,35

Гуматрозкладаючі (млн.) | 13,3±1,21 | 6,4±0,84 | 7,9±0,93 | 9,5±1,02

педотрофних і оліготрофних бактерій відрізнялась несуттєво і була в 1,5 – 2 рази вищою, ніж за хімічної і мінімальної. Чисельність мікроорганізмів при хімічній агротехнології була найнижчою.

Стійкість природних мікробних асоціацій ґрунту до дії фунгіцидів характеризували їх виживанням та частотою індукції резистентності до стрептоміцину. Встановлено, що всі досліджувані фунгіциди характеризувалися більшою чи меншою токсичною дією на мікроорганізми (рис 1.). Найменший токсичний вплив мав мікосан новий, за дії його виробничої дози виживання було 65 – 86% від контролю. Хімічні фунгіциди діяли більш токсично: фундазол зменшував виживання до 24,1 – 40,3 %; вітавакс – до 6,5 – 27,9%. При збільшенні дози препаратів виживання мікроорганізмів не перевищувало – 3,4-10,7% від контролю. Стійкість мікробного ценозу до токсичної дії фунгіцидів суттєво залежала від агротехнології вирощування: найбільш стійкими виявилися мікробні асоціації за умов біологічної агротехнології, при хімічній агротехнології виживання мікроорганізмів було найнижчим.

Мутагенну активність фунгіцидів визначали розробленим нами методом реєстрації появи стрептоміцинстійких мутантів. У складі природних мікробних асоціацій ґрунту при різних агротехнологіях були виявлені мікроорганізми стійкі до стрептоміцину (Str+), чисельність яких становила – 5-8 % культивованих форм. Біологічні фунгіциди проявляли меншу мутагенність порівняно з біхроматом калію, тоді, як хімічні – у 1,5 – 3 рази вищу. Мікосан і мікосан новий у виробничих дозах індукували однакову частоту Str+-мутацій. Хімічний фунгіцид фундазол проявляв м’якшу дію порівняно з вітаваксом. Підвищення виробничої дози для кожного з фунгіцидів в 10 разів, викликало збільшення частоти мутацій у 2 – 3 рази (рис.2).

Найбільш стійкими до мутагенної дії фунгіцидів були мікробні угруповання за умов біологічної агротехнології: мікосан новий у виробничій дозі не викликав мутагенного ефекту взагалі, а мікосан, фундазол і вітавакс спричиняли меншу частоту появи мутацій у порівнянні з іншими агротехнологіями. Мінімальну стійкість виявляв мікробний ценоз, сформований за умов традиційної агротехнології.

Отже, фунгіциди біологічного походження (мікосан і мікосан новий) у виробничих дозах проявляють у 1,5 рази нижчу мутагенність порівняно із стандартним мутагеном, тоді як хімічно синтезовані (фундазол і вітавакс) – у 1,5 – 3 рази вищу. За токсичним і мутагенним впливом на ґрунтову мікробіоту досліджені фунгіциди можна розташувати у такій послідовності: мікосан новий < мікосан < фундазол < вітавакс. Розроблений метод індикації генотоксичних властивостей пестицидів дає можливість виявляти рівень їх генетичної безпечності і токсичності для грунтових мікроорганізмів.

Розділ 4. Генні мутації у тест-культур мікроорганізмів, індуковані пестицидами

Точкові мутації типу заміни пар азотитих основ виявляли на тест-об’єктах E.coli WP2 і S. typhimurium TA100. Генотип E.coli WP2 несе мутацію, яка визначає ауксотрофність по триптофану, генотип S. typhimurium TA100 – мутацію, яка визначає ауксотрофність по гістидину.

При дії виробничих доз мікосану і мікосану нового на тест-культуру E. coli WP2 частота мутацій становила 250 – 235 % від контролю, а при підвищенні дози у 10 разів – зростала до 410 і 360 %, вітавакс і фундазол викликали вищу частоту мутацій: 269 і 380% – у виробничих, 452 і 474% – у дозах збільшених в 10 разів. Підвищені дози усіх препаратів викликали у E. coli WP2 таку ж частоту мутацій, як K2Cr2O7 і високі дози МННГ (табл.2).

У S. typhimurium ТА100 фунгіциди індукували нижчу частоту мутацій ніж у культури E. coli WP2. Збільшення доз препаратів у 10 разів не мало суттєвого впливу на частоту мутацій.

Частоту появи мутацій типу мутацію зсуву рамки зчитування виявляли з використанням штаму S. typhimurium ТА98. Під дією мікосану частота мутацій була – 130%, мікосану нового – 114%, фундазолу – 161%, вітаваксу – 223% від контролю. У дозі, збільшеній у 10 разів максимальний мутагенний ефект спричиняв вітавакс – 334% від контролю.

Виробничі дози фунгіцидів викликали у тест-штамів таку частоту мутацій як і низькі дози нітрозогуанідину.

Найбільш чутливим до дії пестицидів виявився штам E. coli WP2. Результати статистичної обробки даних показали, що коефіцієнт кореляції між тестом із використанням штаму E. coli WP2 і розробленим нами методом індикації генотоксичних властивостей пестицидів становить 0,758, що є суттєвим на рівні достовірності 99%. Кореляції між результатами, одержаними на культурах S. typhimurium TA100, ТА98 і на мікробному ценозі ґрунту не виявлено.

Таблиця 2

Індукція мутацій у тест-штамів мікроорганізмів фунгіцидами біологічного і хімічного походження.

Мутагени | Частота мутацій, % від контролю | Escherichia coli WP2 | Salmonella typhimurium TA100 | Salmonella typhimurium TA98

Мікосан* | 250 | 181 | 130 | Мікосан10** | 410 | 192 | 160 | Мікосан новий* | 235 | 169 | 114 | Мікосан новий10** | 360 | 182 | 132 | Фундазол* | 380 | 102 | 161 | Фундазол10** | 474 | 167 | 196 | Вітавакс* | 269 | 153 | 223 | Вітавакс10** | 452 | 218 | 334 | K2Cr2O7, 100 мкг/чаш400 | 347 | 1121 | МННГ, 100 мкг/чаш | 295 | 679 | 542 | МННГ, 10 мкг/чаш | 193,5 | 360 | 226 | МННГ, 1 мкг/чаш | 139,5 | 242 | 154 | Контроль без мутагенів | 100 | 100 | 100 |

Примітка: * - дія фунгіцидів у дозах рекомендованих виробництву;

** - дія збільшених у 10 разів виробничих доз фунгіцидів.

Розділ 5. Параметри росту Micrococcus luteus CCM 248 за присутності пестицидів

Параметри росту характеризують фізіологічний стан мікробної культури.

На основі дослідження динаміки накопичення біомаси M. luteus CCM 248 нами були розраховані основні параметри росту, які наведені у таблиці 3.

В середовищі без пестицидів питома швидкість росту M. luteus CCM 248 становила 0,32 год-1, при рості за присутності мікосану або мікосану нового вона зменшувалася у 1,7 – 1,9 рази. Сильніший інгібуючий ефект спостерігали під дією синтетичних фунгіцидів: за присутності фундазолу питома швидкість росту знижувалася в 2,1 рази, вітаваксу – в 1,9 рази.

Гербіциди знижували питому швидкість росту M. luteus CCM 248 в 1,6 – 1,9 рази у порівнянні з контролем. Максимальне пригнічення росту культури спричиняв стандартний мутаген K2Cr2O7 – питома швидкість росту зменшувалась у 4,6 рази.

Під дією пестицидів змінювалися і інші параметри росту. Так, тривалість подвоєння чисельності клітин M. luteus CCM 248 за присутності K2Cr2O7 становила 10,58 год, тоді як у контролі – 2,15 год, за присутності мікосану і раундапу – 3,32 і 3,70 год, за присутності мікосану нового і фундазолу – 4,0 і 4,52 год, вітаваксу і діалену – 4,15 і 4,47 год відповідно.

Таблиця 3

Параметри росту Micrococcus luteus CCM 248 за присутності пестицидів

Варіанти | Питома швидкість росту, год-1 | Тривалість подвоєння чисельності, год | Число поколінь за годину Контроль без обробки | 0,32 | 2,15 | 0,47 | Мікосан | 0,19 | 3,70 | 0,27 | Мікосан новий | 0,17 | 4,00 | 0,25 | Фундазол | 0,15 | 4,52 | 0,22 | Вітавакс | 0,17 | 4,15 | 0,24 | Раундап | 0,20 | 3,32 | 0,30 | Діален | 0,15 | 4,47 | 0,23 | K2Cr2O70,07 | 10,58 | 0,09

Швидкість поділу клітин M. luteus CCM 248 у контролі становила 0,47 поколінь за годину, а на середовищах з біофунгіцидами вона зменшувалась в 1,7 – 1,9 рази, за присутності фундазолу і вітаваксу – в 2,0 – 2,1 рази; раундапу і діалену – в 1,6 і 2,0 рази; K2Cr2O7 – у 5,2 рази.

Розділ 6. Зміни у ферментних спектрах ґрунтових мікроорганізмів під впливом пестицидів

Ферменти є маркерами конкретних структурних генів і їх спектри відображають генетичні перебудови, які відбуваються під дією пестицидів. Швидкість руху молекулярної форми (МФ) ферменту в електричному полі залежить від величини заряду молекули. До зміни заряду молекули білку ведуть заміни амінокислот і вони є важливими для функціонування ферменту. Для оцінки функціональних наслідків генетичних пошкоджень, спричинених, пестицидами було досліжено спектри 11 ферментів різних груп у штамів M. luteus CCM 248 і S. maltophilia УКМ В-257.

Аналіз фореграм проводили за допомогою комп’ютерної програми TotalLab. Була визначена відносна активність кожної зони спектру, її розраховували у % від сумарної активності спектру в межах однієї доріжки. Нами було виявлено три типи змін, спричинених пестицидами у спектрах ферментів: 1) кількісні зміни – перерозподіл активності окремих МФ ферменту від сумарної активності спектру; 2) якісні зміни спектрів – поява або зникнення МФ ферментів; 3) повна інактивація ферменту.

Кількісні зміни були виявлені у спектрах таких ферментів, як глюкозофосфатізомераза, ізоцитратлегідрогеназа, естераза штаму M. luteus CCM 248; ізоцитратлегідрогеназа, фосфоглюкомутаза, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, діафораза, естераза, алкогольдегідрогеназа штаму S. maltophilia УКМ В-257. Естеразний спектр штаму M. luteus CCM 248 був представлений чотирма зонами активності (рис.3а).

У контролі і варіантах з пестицидами за відносною активністю переважала зона С, максимальною вона була у варіанті з біофунгіцидом мікосаном – до 62,1 %. Одночасно, у присутності пестицидів, порівнянно з контролем знижувалась відносна активність зони В: у варіантах з фундазолом і вітаваксом – до 13,1 і 12,6 %, у варіантах з діаленом і мікосаном новим – 14,3 і 16,6 %, а у варіанті з мікосаном – 1,5 % (табл. 4).

Якісні зміни спектрів були виявлені у таких ферментів, як глюкозофосфатізомераза, глутаматдегідрогеназа, супероксид-дисмутаза штаму S. maltophilia УКМ В-257; діафораза штаму M. luteus CCM 248. GPI штаму S. maltophilia УКМ В-257 у контролі був представлений двома зонами активності – В і С (рис. 3б). Під дією мікосану нового, вітаваксу і діалену відбулися якісні зміни – з’являлася нова швидка зона А. У спектрі за присутності віта ваксу і ділену переважала відносна активність зон В і С, тоді, як для мікосану нового – відносна

Таблиця 4

Характеристика спектрів естерази і глюкозофосфатізомерази

Пестициди | Естераза

M. luteus CCM 248 | Глюкозофосфатізомераза

S. maltophilia

УКМ В-257

Зони активності | Відносна активність, % від сумарної | Зони

активності | Відносна активність, % від сумарної | Мікосан | А

В

С

D2,8

1,5

62,1

20,6 | В

С | 34,4

65,6 | Мікосан новий | А

В

С

D | 11,6

16,6

47,6

24,7 | А

В

С | 31,9

2,3

65,7 | Фундазол | А

В

С

D | 11,8

13,1

58,1

17,1 | В

С | 43,9

56,1 | Вітавакс | А

В

С

D | 14,8

12,6

45,1

27,5 | А

В

С | 14,3

41,9

43,8 | Раундап | А

В

С

D | 15,3

23,7

42,6

18,4 | В

С | 26,1

73,9 | Діален | А

В

С

D | 11,3

14,3

52,9

21,5 | А

В

С | 18,7

34,9

46,4 | Контроль | А

В

С

D | 10,8

30,2

37,1

21,9 | В

С | 42,4

57,6

K2Cr2O7 | _ | Не досліджували | В

С | 46,7

53,3

активність зон А і С (табл. 4). Це може свідчити про відмінності у механізмах дії пестицидів біологічного походження і хімічно синтезованих. Кількісні зміни під впливом мікосану нового і раундапу полягали у підвищенні порівняно з контролем відносної активності зони С відповідно до 65,7 і 73,9 %.

Суттєві якісні зміни відбувалися у спектрі супероксиддисмутази (SOD), зони її активності представлені світлими плямами (рис.4а)

Таблиця 5

Характеристика спектру 6-фосфоглюконатдегідрогенази

Stenotrophomonas maltophilia УКМ В-257

Пестициди | Зони

активності | Відносна активність, % від сумарної

Мікосан | А

В | 0,2

99,8

Мікосан новий | А

В | 2,9

97,1

Фундазол | А

В | 31,9

68,1

Вітавакс | А

В | 19,1

80,9

Раундап | А

В | 2,00

98,0

Діален | Не виявлено

Контроль | А

В | 1,5

98,5

K2Cr2O7 | А

В | 78,1

21,9

У контролі присутня тільки зона D. На фоні дії різних пестицидів формується складний спектр із варіаціями зон від А до Е. При дії усіх досліджуваних препаратів замість зони D з’являлась повільна зона Е. У варіантах з K2Cr2O7, мікосаном і раундапом була виявлена також зона С, а з мікосаном новим – зони А і В. Максимальні зміни у спектрі SOD спричиняв мікосан новий (три нових зони замість однієї).

Крім цього, під впливом пестицидів може відбуватися повна інактивація ферменту. Так, нами було виявлено, що в присутності гербіциду ділену не виявлялись ферменти

6-фосфоглюконатдегідрогеназа і сорбітолдегідрогеназа штаму S. maltophilia УКМ В-257. Спектр 6-PGD у S. maltophilia УКМ В-257 був представлений малоактивною зоною А і дифузною зоною В, а у варіантах з K2Cr2O7, мікосаном новим, фундазолом і вітаваксом – складався з чіткої А- і дифузної В-зон (рис.4б). У варіантах з біофунгіцидами і раундапом значних відмінностей від контролю відмічено не було, у всіх варіантах за відносною активністю переважала зона В (табл. 5). Хімічні фунгіциди і K2Cr2O7 вирівнювали розподіл відносної активності між зонами в сторону зони А: фундазол – до 68,1 % і вітавакс – 80,9 %; K2Cr2O7 – 78,1 %.

Розділ 7. Пружна стійкість мікробних угруповань ґрунту

Виявлені зміни ферментів ґрунтових мікроорганізмів мають відображатися на інтенсивності і напрямках перетворення мікроорганізмами речовин у ґрунті. Тому, доцільними є дослідження функціональної активності мікробних угруповань, що зазнали впливу пестицидів після чого дія стресового фактора була знята. За таких умов досліду була визначена пружна стійкість мікробних угруповань ґрунту.

Узагальненим тестом, що характеризує трансформацію вуглецю та біологічну активність ґрунту є продукція ним СО2.

Таблиця 6

Вплив післядії пестицидів на фізіологічну

активність мікробного ценозу

Обробка препаратом | Швидкість базального дихання, VБД,

мг СО2/г•год | Швидкість СІД, VСІД,

мг СО2/г•год | Контроль | 12,5 | 114,3 | K2Cr2O7, | 4,8 | 60,0 | Мікосан | 8,6 | 100,7 | Мікосан новий | 10,0 | 113,4 | Фундазол | 7,5 | 109,3 | Вітавакс | 7,5 | 85,6 | Раундап | 8,8 | 115,6 | Діален | 6,2 | 110,3 |

варіантах з K2Cr2O7 і хімічним фунгіцидом вітаваксом була на 48 % і 25 % нижче, ніж у контролі (табл.6).

Зміни, що відбулися в мікробному угрупованні ґрунту після контакту з пестицидами, негативно позначилися на його азот фіксуючій активності (рис.5). Максимальне зниження нітрогеназної активності ґрунту (на 62%) спостерігали у варіанті з діаленом. Після дії вітаваксу, раундапу, стандартного мутагену азотфіксуюча здатність мікробного угруповання була на 36, 42 і 64% відповідно нижчою за контроль. Післядія мікосану і мікосану нового була незначною: нітроігеназна активність становила 18,0 і 18,2 мкМ С2Н4 у 100 г ґрунту за год, що на 20 % нижче контролю.

Таблиця 7

Нітрифікаційна активність ґрунту

Варіант досліду | Нітрифікаційна активність, мг N-NO3 / 100г ґрунту

Актуальна (без субстрату) | Потенційна (із субстратом)

Контроль | 0,210 | 0,92

K2Cr2O7 | 0,234 | 0,98

Мікосан | 0,192 | 0,59

Мікосан новий | 0,270 | 0,64

Фундазол | 0,260 | 0,52

Вітавакс | 0,091 | 0,58

Раундап | 0,112 | 0,34

Діален | 0,118 | 0,50

контакт з біофунгіцидами стимулював процес розкладання целюлози, з фундазолом – не змінював інтенсивності процесу, з вітаваксом, раундапом, діаленом і К2Cr2O7 –знижував швидкість деструкції у 2,5-3,4 рази (рис 8). не тільки для мікроорганізмів, а й для істот вищого рівня організації, в тому числі і для людини.

Проведені дослідження показали, що навіть нетривалий контакт пестицидів з ґрунтовими мікроорганізмами з наступним відновленням природного середовища їх існування, істотно впливає на їхні життєво важливі функції. Генотоксична дія пестицидів на мікробний ценоз ґрунту знаходить своє відображення у інтенсивності перебігу процесів трансформації вуглецевих і азотовмісних сполук у ґрунті і здатності ґрунтової мікробіоти до самовідтворення.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що агротехнології вирощування сільськогосподарських культур відіграють важливу роль у формуванні стійкості мікроорганізмів ґрунту до токсичної і мутагенної дії пестицидів. Хімічна агротехнологія підвищує чутливість, а біологічна – формує резистентність мікробних угруповань до засобів захисту рослин.

2. Розроблений новий спосіб визначення токсичної і мутагенної дії пестицидів на мікробні угруповання ґрунту. За статистичними обрахунками результати, одержані запропонованим способом, корелюють на рівні достовірності 99 % з даними тесту на ауксотрофних мутантах E.coli WP2. Запропонований спосіб можна використовувати у еколого-токсикологічних дослідженнях нових препаратів.

3. Встановлено, що фунгіциди біологічного походження (мікосан і мікосан новий) у виробничих дозах проявляють у 1,5 рази нижчу генетичну активність порівняно із стандартним мутагеном, тоді як хімічно синтезовані (фундазол і вітавакс) – у 1,5 – 3 рази вищу. За токсичним і мутагенним впливом на ґрунтову мікробіоту досліджені фунгіциди можна розташувати у такій послідовності: мікосан новий < мікосан < фундазол < вітавакс.

4. Фунгіцидні біологічні препарати мікосан, мікосан новий, а також хімічно синтезовані вітавакс і фундазол у дозах, рекомендованих виробництву, діють на тест-культури мікроорганізмів Escherichia coli WP2 і Salmonella typhimurium TA100, TA 98 як слабкі мутагени.

5. Генетична регуляція мікробних ферментних систем є нестійкою до дії пестицидів. На прикладі M. luteus CCM 248 і S. maltophilia УКМ В-257 виявлено три типи змін, які виникають під впливом пестицидів у спектрах ферментів мікроорганізмів: 1) перерозподіл активності між молекулярними формами окремих ферментів (глюкозо-фосфатізомераза, ізоцитратлегідрогеназа, естераза штаму M. luteus CCM 248; ізоцитратлегідрогеназа, фосфоглюкомутаза, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, діафораза, естераза, алкогольдегідрогеназа штаму S. maltophilia УКМ В-257); 2) поява нових або зникнення наявних множинних молекулярних форм ферментів (глюкозофосфатізомераза, глутаматдегідрогеназа, супероксид-дисмутаза штаму S. maltophilia УКМ В-257; діафораза штаму M. luteus CCM 248); 3) повне пригнічення синтезу ферменту (6-фосфоглюконатдегідрогеназа і сорбітолдегідрогеназа штаму S. maltophilia УКМ В-257).

6. Хімічно синтезовані пестициди знижують пружну стійкість мікробного угруповання ґрунту – його здатність відновлювати структуру і функціональний стан після дії стресового фактору. Накопичення мікробної біомаси зменшується на 33%, чисельність – на 23 – 71%, швидкість продукції СО2 – на 30,6 – 50 %, нітрогеназна активність ґрунту – на 20 – 62%, нітрифікаційна здатність – у 2 – 3 рази, активність деструкції целюлози – у 2,5 – 3,4 рази.

7. Біофунгіциди мікосан і мікосан новий не пригнічують відтворення чисельності мікроорганізмів ґрунту, не впливають на його нітрифікаційну і целюлозолітичну здатність, стимулюють накопичення вільних амінокислот, але знижують швидкість продукції СО2 на 20 – 31% і нітрогеназну активність на 21