ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Ярмолюк Сергій Миколайович

УДК 577.366+57.08.088.5+542.95

ДИЗАЙН ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ ЗОНДІВ

НА ОСНОВІ ЦІАНІНОВИХ БАРВНИКІВ для нуклеїнових кислот та білків

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора хімічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі комбінаторної хімії біологічно активних речовин Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий консультант | академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Єльська Ганна Валентинівна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

директор

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

Броварець Володимир Сергійович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

провідний науковий співробітник відділу хімії біоактивних

азотовмісних гетероциклічних основ

доктор хімічних наук, старший науковий співробітник

Качковський Олексій Дмитрович,

Інститут органічної хімії НАН України,

провідний науковий співробітник відділу кольору

та будови органічних сполук

доктор біологічних наук

Карпов Олександр Вікторович,

Національний університет харчових технологій,

доцент кафедри мікробного синтезу

Провідна установа | Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України

м. Одеса, відділ медичної хімії

Захист дисертації відбудеться 10 червня 2005 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України за адресою: 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий 6 травня 2005 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Д. М. Федоряк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Стрімкий розвиток біотехнологій потребує швидких і зручних засобів детекції та візуалізації нуклеїнових кислот (НК) і білків. Радіоізотопи, які традиційно використовуються з цією метою, мають ряд суттєвих недоліків, серед яких висока вартість, нестабільність, небезпечні умови праці. Тому на заміну радіоактивним міткам приходять більш зручні й дешеві імунохімічні та спектрально-люмінесцентні методи.

Більшість ультрачутливих методів кількісного та якісного визначення НК ґрунтується на застосуванні ціанінових барвників. Так, зокрема, їх використовують для визначення НК у розчинах, електрофоретичних гелях, на твердих носіях (блоти та мікрочіпи), у капілярно-електрофоретичних процедурах, флуоресцентній мікроскопії, Real-time PCR (полімеразно-ланцюгова реакція з постійним визначенням вмісту НК). Визначення НК у розчинах з допомогою SYBR Green забезпечує чутливість у 10000 разів вищу, ніж при спектроскопії поглинання, та в 400 разів вищу, ніж при використанні бромистого етидію.

Ціанінові барвники застосовуються також для ковалентного або нековалентного мічення білків. Так, в імунохімічних діагностиках використовують індоленінтриметинові (Cy3) та індоленінпентаметинові (Cy5) барвники. Індоленінові й скварилеві барвники застосовують для нековалентного мічення імуноглобулінів та у FISH (флуоресцентна гібридизація in-situ).

На відміну від радіоізотопів, флуоресцентні зонди безпечні у використанні та стабільні при зберіганні. Застосування сучасного спектрального обладнання, зокрема лазерів, дає змогу досягати чутливості детекції, сумірної з радіоізотопними методами. Так, наприклад, флуоресцентна технологія SMD (single molecule detection) дозволяє зафіксувати в розчині навіть окремі молекули.

Нині ціанінові барвники посідають чільне місце серед найперспективніших флуоресцентних зондів для біополімерів. Проте спектрально-люмінесцентні властивості поліметинових барвників у присутності біополімерів були практично не досліджені, запропоновані моделі їхньої взаємодії з НК не завжди давали змогу пояснити одержані експериментальні дані. Не вивчався також вплив агрегації на флуоресцентні властивості ціанінів у присутності біополімерів, не існувало практичних рекомендацій, розроблених технологій для дизайну нових флуоресцентних зондів.

Вирішенню зазначених актуальних проблем і присвячена дисертаційна робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною планових наукових досліджень, що виконувались у рамках держбюджетних тем “Синтез та вивчення механізму взаємодії ціанінових флуоресцентних зондів з нуклеїновими кислотами” № .2.4.16 (1997–1999 рр.) (№ державної реєстрації 0197U004292), “Синтез флуоресцентних гомо-n-мерних ціанінових барвників та вивчення механізму їх взаємодії з нуклеїновими кислотами” № .2.4.16 (2000–2002 рр.) (№ державної реєстрації 0100U000792), “Синтез мезо-заміщених в поліметиновому ланцюгу триметинціанів та вивчення механізму їхньої взаємодії з нуклеїновими кислотами та білками” № 2.2.4.16 (2003–2007 рр.) (№ державної реєстрації 0103U000070) та в рамках міжнародного проекту ІРР Міністерства енергетики США (№ В507077) (2000–2001 рр.). У 2004 році робота була підтримана міжнародним науковим фондом УНТЦ.

Мета дослідження полягала в спрямованому конструюванні (дизайні) флуоресцентних зондів на основі ціанінових барвників та вивченні їх взаємодії з нуклеїновими кислотами та білками.

Для досягнення цієї мети необхідно було розв’язати такі завдання:

· провести спектрально-люмінесцентне дослідження великого масиву поліметинових барвників різної природи для з’ясування загальних закономірностей їхніх властивостей у присутності НК і білків;

· розробити нові методи синтезу гомо-n-мерних монометинціанінів та триметинціанінів із замісниками в поліметиновому ланцюзі і дослідити спектрально-люмінесцентні властивості їхніх комплексів з нуклеїновими кислотами;

· вивчити агрегацію гомо-n-мерних монометинціанінів у вільному стані й у присутності біополімерів;

· розробити новий метод ковалентної кон’югації флуоресцентних ціанінових барвників до біомолекул на основі реакції пірилоціанінів з аліфатичними амінами;

· розробити технологію спрямованого конструювання флуоресцентних зондів для гомогенних систем детекції біополімерів.

Об’єкт дослідження – ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для біополімерів.

Предмет дослідження – дизайн флуоресцентних зондів на основі ціанінових барвників для НК та білків.

Методи дослідження: органічний синтез, електронна спектроскопія поглинання та випромінювання, квантово-хімічні розрахунки, гель-електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано нові методи синтезу гомо-n-мерних монометинціанінових барвників. Уперше синтезовано гомотримерний ціаніновий барвник. Вивчено спектрально-люмінесцентні властивості барвників у вільному стані та в присутності НК і білків.

Триметинціаніни з модифікованим поліметиновим ланцюгом уперше запропоновано для детекції НК у гомогенному аналізі. Показано, що основним способом їх взаємодії з ДНК є інтеркаляція. Розроблено новий зручний метод С-ацилювання активних метиленових груп імідазолідами карбонових кислот з використанням активуючого агента N,N’-карбонілдіімідазолу (КДІ).

Запропоновано й експериментально реалізовано принцип ефекторних груп, що дає змогу регулювати специфічність зв’язування флуоресцентних зондів з біополімерами. Розроблено зручні методи синтезу монометинціанінів з ефекторними групами різної природи та вивчено вплив цих груп на спектральні властивості утворених комплексів барвників з біополімерами.

На основі проведених спектрально-люмінесцентних досліджень і комп’ютерних розрахунків запропоновано модель “напівінтеркаляції” монометинціанінових барвників у дволанцюгову ДНК, згідно з якою один гетероцикл молекули інтеркалює між сусідніми парами основ, тоді як інший просторово фіксується в маленькій борозенці НК.

За допомогою спектрально-люмінесцентних методів досліджено агрегаційні процеси гомо-n-мерних барвників і барвників з ефекторними групами у вільному стані та в присутності біополімерів. Показано, що висока чутливість детекції НК гомодимерними барвниками зумовлена процесами агрегації ціанінів.

Уперше застосовано реакцію пірилоціанінів з аліфатичними амінами для ковалентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів і білків.

Розроблено основні принципи дизайну флуоресцентних зондів для гомогенної детекції біополімерів, що лежать в основі технології “провідного барвника”.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена технологія провідного барвника вперше була використана в контрактах між Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України та фірмою „Fluka GmbH” (Швейцарія). У результаті спільного дворічного дослідження (2002–2003 рр.) розроблено декілька нових комерційних флуоресцентних зондів для детекції білків. У 2003 р. зазначені установи уклали нову угоду про дизайн флуоресцентних зондів для візуалізації нуклеїнових кислот у гелях.

У 2002 р. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України та фірма “Fluorescent BioProbes GmbH” (Німеччина) уклали контракт та взяли патент на спільне комерційне використання реакції пірилоціанінів з амінами для кон’югації флуорофорів з аміногрупою біомолекул.

Особистий внесок здобувача є визначальним на всіх етапах дослідження і полягає в загальній постановці завдання, у виборі об’єктів дослідження, аналізі, інтерпретації та узагальненні експериментальних даних, одержаних як самостійно, так і у співпраці з іншими дослідниками. Під керівництвом автора виконані й захищені кандидатські дисертації аспірантів і пошукувачів В.Б. Ковальської (2000 р.), Д.В. Криворотенка (2001 р.), І.О. Кочешева (2001 р.), С.С. Лукашова (2003 р.) та О.М. Костенка (2003 р.). Автор висловлює щиру подяку О.І. Толмачову, Ю.Л. Сломінському, В.М. Ящуку, О.І. Корнелюку та Д.М. Говоруну за постійну підтримку і взаємокорисне обговорення отриманих результатів; І.В. Алексєєвій та Г.Х. Мацуці – першим учителям і науковим керівникам, Г.В. Єльській – науковому консультанту.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на ХVІІІ, ХІХ, ХХ Українських конференціях з органічної хімії (Дніпропетровськ, 1998; Львів, 2001; Одеса, 2004), Міжнародній конференції “Фізика і хімія органічних люмінофорів – 95” (Харків, 1995); ХІІ International Round Table “Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications” (La Jolla, USA, 1996); Vth International Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy (Berlin, Germany, 1997); 8th European Conference of Spectroscopy Biological Molecules (Enschede, Netherlands, 1999); Міжнародній конференції “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2000); Scientific conference “Biotechnology and Environment 2001” (Zagreb, Croatia, 2001); 7th Conference on Methods and Application of Fluorescence (Amsterdam, The Netherland, 2001); Fifth International Simposium on Functional р-Electron Systems (Ulm/Neu-Ulm, Germany, 2002); 4-й Міжнародній конференції по електронних процесах в органічних матеріалах (Львів, 2002); The Inaugural Austral-Asian Biospectroscopy Conference (Nakhon Ratchasima, Thailand, 2003); Meeting of the Discussion Group of the Royal Society of Chemistry “Fris 2003 – Fast Reactions in Solution” (Halle, 2003); Міжнародному форумі “Україна і Польща – разом у наукових програмах Європейського Союзу” (Львів, 2004).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 50 статтях у наукових фахових виданнях, 45 тезах доповідей на наукових конференціях, одному міжнародному патенті.

Cтруктура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, семи розділів, висновків і списку використаних джерел, що налічує 290 найменувань.

Робота містить 14 схем, 50 таблиць і 117 рисунків. Повний обсяг роботи – 342 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У результаті аналізу хімічних структур усіх комерційно доступних ціанінових барвників, що застосовуються для візуалізації НК у гелях, нами виявлено досить принципові спільні для всіх барвників структурні закономірності (рис. 1).

Рис. 1. Хімічна структура “оптимального” барвника для визначення НК у гомогенному аналізі

Як правило, для визначення НК у гелях і розчинах використовуються несиметричні монометинціанінові барвники, причому їх менш основне гетероциклічне ядро (А, бензазольне) містить мінімум замісників, а більш основне (Б, піридинове або хінолінове) – досить об’ємні замісники.

Слід зазначити, що майже в усіх опублікованих роботах взаємодія поліметинових барвників з НК досліджена на двох-трьох барвниках (YO, TO та їх похідних). У повному обсязі залежність спектрально-люмінесцентних властивостей утворених комплексів від хімічної структури барвника не вивчалася.

Загалом нами досліджено спектрально-люмінесцентні властивості близько 300 різних за хімічною природою ціанінових барвників у присутності НК і білків з метою з’ясування загальних закономірностей їхньої взаємодії з цими біополімерами.

Для зменшення агрегації ціанінів і покращення їх розчинності у воді молекула барвника модифікується сульфогрупами або залишками фосфорної кислоти. Присутність у складі молекули барвників Cyan 1, Cyan 5, Cyan 12 (табл. 1) аніонних груп призводить до різкого погіршення флуоресцентних властивостей барвників як зондів для детекції НК.

Таблиця 1

Інтенсивність флуоресценції комплексів деяких бензтіазольних барвників з ДНК

Барвник | IDNA, y.o. | QDNA, нм | Барвник | IDNA, y.o. | QDNA, нм

32,3 | 160 | 0,66 | 1,2

0,40 | 5,0 | 0,30 | 3,0

24,0 | 130 | 1,69 | 28,1

Примітка. IDNA – інтенсивність флуоресценції барвника в присутності ДНК, QDNA – приріст інтенсивності флуоресценції при зв’язуванні з ДНК.

Оскільки барвник Cyan 3 показав найбільше зростання інтенсивності флуоресценції при взаємодії з ДНК, ми синтезували низку монометинціанінів з 5,6-(метилендіокси)бензтіазольним фрагментом та іншими алкоксильними залишками. Спектральні характеристики барвників групи Cyan МО у присутності ДНК наведено в табл. 2.

Таблиця 2

Характеристики спектрів поглинання та флуоресценції барвників групи Cyan МО у присутності ДНК

Барвник | , нм | , нм | IDNA, y.o. | QDNA, нм

407, 427 | 472 | 16,5 | 41,2

423, 441 | 492 | 49,9 | 104

423, 442 | 486 | 22,9 | 45,8

397 | 484 | 16,5 | 21,4

400, 416, 458 | 487 | 22,9 | 29,7

Примітка. , – довжина хвилі максимуму спектра поглинання та випромінювання барвника в присутності ДНК.

Усі барвники досить суттєво збільшують інтенсивність флуоресценції у присутності ДНК (QDNA = 21,4–104). Нами досліджено вплив довжини N-алкільного замісника бензтіазольного ядра (Cyan 3, Cyan 13 та Cyan 23) на спектральні властивості барвників у комплексах з ДНК. Збільшення довжини замісника погіршує властивості барвника як флуоресцентного зонда. Зокрема, у випадку Cyan 23 (R = C4H9) IDNA = 22,9 у.о., тоді як для Cyan 13 (R = CH3) IDNA = 49,9 у.о. (табл. 1, 2). Інтенсивність флуоресценції Cyan 15 з об’ємним залишком 15-краун-5 також зростає при додаванні ДНК і перевищує інтенсивність випромінювання незаміщеного Cyan 45 (табл. 2). Цей факт складно пояснити з допомогою класичної моделі інтеркаляції, яка передбачає вбудовування всієї молекули барвника в міжосновний простір ДНК.

Вивчення механізму взаємодії монометинціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. Загальновизнано, що інтеркаляція є основним механізмом взаємодії монометинціанінів з НК. При великих співвідношеннях барвник/ДНК можливе також зв’язування з маленькою борозенкою. Проведені нами дослідження комплексів поліметинціанінів з НК свідчать про те, що характер такої взаємодії досить складний і визначається співвідношенням барвник/кількість пар основ НК, природою барвника і типом НК.

У ході дослідження нами вивчено низку монометинціанінів з гетероциклічним ядром 5,6-(метилендіокси)бензтіазолу (M42, Cyan 13, M44, M45, M47) з метою з’ясування впливу замісників на їхню взаємодію з ДНК. Спектрально-люмінесцентні властивості барвників у вільному стані та в присутності НК порівняно з характеристиками відповідних барвників з незаміщеним залишком бензтіазолу (M41, Cyan 45, BO, TO, Cyan 40) подано у табл. 3.

Уведення замісників до гетероциклічних ядер з різною електронодонорною здатністю по-різному впливає на флуоресцентні властивості ДНК-комплексів несиметричних монометинціанінів (табл. 3). Замісники в менш електронозбагаченому гетерозалишку значно знижують рівень інтенсивності флуоресценції барвника в ДНК-комплексі (IDNA у BO < M44, M47 < Cyan 40, M45 < TO), тоді як заміщення в більш електроно-збагаченому, навпаки, збільшує інтенсивність флуоресценції (IDNA у M42 > M41, Cyan 13 > Cyan 45, Cyan 40 > BO, M47 > M 44). Ця закономірність може свідчити про те, що в міжосновний простір ДНК повністю інтеркалює лише один з гетерозалишків. Електронна густина в молекулі несиметричного монометинціаніну дещо зсунута до більш електронозбагаченого залишку, піридинового, хінолінового чи метилендіоксибензтіазольного. Очевидно, при утворенні комплексу з ДНК барвник орієнтується так, що більш основний гетерозалишок розташовується ближче до негативно зарядженої фосфатної групи, а в електронейтральний міжосновний простір занурюється менш електронозбагачений залишок.

Для дослідження електронної асиметрії молекули барвника при утворенні комплексів монометинціанінів з ДНК синтезовано ряд пірилієвих та відповідних ізоструктурних піридинових барвників.

У присутності ДНК інтенсивність випромінювання всіх барвників IDNA зростає (табл. 4), проте величина QDNA значно більша для піридинових барвників (61,4–182), ніж для пірилієвих (5,6–17,9). Барвники М51 і М53 з великими об’ємними фенільними радикалами мають досить велике значення QDNA = 71,6 та 25,3 відповідно.

Таблиця 3

Інтенсивність флуоресценції ДНК-комплексів

метилендіоксибензтіазольних барвників та їх незаміщених аналогів |

IDNA, у.о. | QDNA | IDNA, у.о. | QDNA

39,8 | 54 | 101,1 | 34

16,5 | 41,2 | 49,9 | 104

12,2 | 260 | 4,3 | 96

51,1 | 182 | 6,14 | 61,4

19,2 | 960 | 3,16 | 150

Таблиця 4

Спектрально-люмінесцентні властивості барвників М46–М53

у вільному стані та в присутності ДНК |

, нм | , нм | , нм | , нм | S0, нм | SDNA, нм | І0,

у.о. | IDNA, у.о. | QDNA

435

457 | 433

457 | 500 | 490 | 43 | 33 | 0,03 | 0,3 | 10

435 | 440 | 480 | 490 | 45 | 50 | 0,28 | 51,1 | 182

457 | 461 | 545 | 530 | 88 | 69 | 0,026 | 0,345 | 13,3

456 | 461 | 511 | 514 | 55 | 53 | 0,1 | 6,14 | 61,4

Продовж. табл. 4

М48 | 412

430 | 412

430 | 472 | 465 | 42 | 35 | 0,08 | 0,452 | 5,65

М49 | 408 | 410 | 447 | 451 | 39 | 41 | 0,74 | 59,3 | 80,1

М50 | 458

483 | 467

495 | 540 | 523

553 | 57 | 28 | 0,028 | 0,5 | 17,9

М51 | 446 | 448 | 500 | 508 | 54 | 60 | 0,19 | 13,6 | 71,6

М52 | 469

508 | 487

521 | 615 | 547

580 | 107 | 26 | 0,044 | 0,247

0,24 | 5,6

М53 | 459 | 459 | 520 | 532 | 61 | 73 | 0,17 | 4,3 | 25,3

Примітка. S0 – стоксів зсув вільного барвника у буфері.

Якщо молекула барвника зв’язується з борозенкою НК, то заряджені фосфатні групи та гідратна оболонка рівномірно розташовані уздовж молекули барвника. При неповній інтеркаляції молекула барвника опиняється в електрично неоднорідному мікросередовищі, оскільки один гетерозалишок барвника розташовано в гідрофобному міжосновному просторі, а інший – біля негативного заряду фосфатів (рис. 2).

Рис. 2. Молекула Cyan 40 (світло-сіра), вкладена між парами основ

динуклеотиду dСdT/dAdG. Бензтіазольне ядро перекрите парами основ

(гідрофобний простір), а піридинове видається в малу борозенку (полярне середовище)

Унаслідок такого розташування при напівінтеркаляції зарядова густина барвника повинна зсуватися на гетероциклічне ядро, яке видається з гідрофобної кишені. При збільшенні електронної асиметрії в молекулі монометинціаніну стоксів зсув ?S у нього буде зростати.

Величини стоксових зсувів при утворенні комплексу з ДНК зростають у піридинових барвників Cyan 40, М48, М49, М51 і М53, у яких, очевидно, саме піридинове ядро знаходиться назовні. У пірилієвих барвників Cyan 39, М46, М50 і М53 стоксів зсув зменшується при взаємодії з ДНК. На нашу думку, ці барвники розташовуються в НК-комплексах подібно до піридинових, оскільки напрямок розподілення електронної асиметрії для пірилієвих і піридинових барвників протилежний.

Для з’ясування механізму взаємодії монометинціанінів з ДНК ми дослідили також вплив полярності середовища на флуоресцентні властивості комплексів барвників з ДНК. У робочі розчини додавали 15 %-у домішку органічного розчинника, який добре змішується з водою. Для порівняння використовували відомий класичний неціаніновий інтеркалятор бромистий етидій EtBr (табл. 5).

Таблиця 5

Інтенсивність випромінювання Cyan 13 та EtBr у вільному стані

та в комплексі з ДНК в присутності 15 %-ї домішки органічного розчинника

Розчинник

I0 ,

у.о. | IDNA,

у.о | I0 ,

у.о. | IDNA,

у.о

Вода | 0,41 | 2,60 | 0,23 | 28,20

Метанол | 0,53 | 1,92 | 0,19 | 11,00

Етанол | 0,60 | 1,84 | 0,27 | 15,35

Ізопропанол | 0,72 | 1,88 | 0,31 | 17,94

Гліцерин | 0,58 | 1,95 | 0,29 | 23,80

Ацетон | 0,83 | 1,93 | 0,38 | 7,06

Діоксан | 0,80 | 1,88 | 0,60 | 6,45

Для бромистого етидію зменшення інтенсивності флуоресценції комплексів барвник–ДНК при додаванні органічних розчинників є незначним (22–29 %) і майже не залежить від природи домішки. Цього й можна було очікувати, зважаючи на інтеркаляційний механізм взаємодії бромистого етидію з ДНК.

Для монометинціаніну зменшення інтенсивності флуоресценції комплексів барвник–ДНК при додаванні органічних розчинників проявляється яскравіше і становить 16–77 %. На наш погляд, інтеркаляційна модель взаємодії ціанінових барвників з ДНК не може цього пояснити. Можливим поясненням цього ефекту може бути запропонований механізм часткової інтеркаляції барвника в ДНК, при якому молекула барвника стає більш “відкритою” для взаємодії з середовищем.

Інтеркаляційний характер фіксації молекул бензтіазольного монометинціаніну Cyan 40 (табл. 3) на длДНК підтверджено за допомогою спектрів лінійного дихроїзму (рис. ). Про це свідчать від’ємні величини LD та LDr.

Проведене нами математичне моделювання механізму взаємодії монометинціаніну Cyan 40 з дволанцюговою ДНК з допомогою програми Hyperchem 5.0 показало, що найбільш енергетично вигідним є механізм повної інтеркаляції. Отримані дані не суперечать експериментальним результатам напівінтеркаляційної взаємодії Cyan 40 з ДНК.

У випадку існування ряду додаткових факторів – утворення агрегату між вільною та інтеркальованою молекулами Cyan 40 (коли вільна молекула, розташовуючись у борозенці ДНК, взаємодіє з інтеркальованою) чи введення до молекули барвника об’ємних замісників – енергетична вигідність різних механізмів зв’язування може змінитись на користь напівінтеркаляції (рис. 4).

Рис. 4. Структура комплексу барвника Cyan 40 з ДНК. Бензтіазольне ядро інтеркалює

між парами основ, а піридинове знаходиться в малій борозенці

Процеси агрегації, що супроводжують взаємодію поліметинціанінів з біополімерами, здебільшого ігнорувались і практично не вивчались до наших досліджень.

У спектрі поглинання Cyan13 спостерігається мономерна смуга (max = 440 нм), агрегатні смуги І (max = 417 нм) та ІІ (max = 395 нм). Остання смуга з’являється лише при наявності ДНК у розчині (рис. 5). На наш погляд, утворення агрегатів ІІ за участю молекул ДНК може свідчити на користь напівінтеркаляційної моделі взаємодії. Можливо, частина молекули зв’язаного барвника, що видається з міжосновного простору, є матрицею, на якій утворюється агрегат ІІ.

На основі отриманих експериментальних даних нами запропоновано напівінтеркаляційну модель взаємодії ціанінових барвників з дволанцюговою ДНК: при утворенні комплексу з длДНК монометинціанін розташовується так, що один з його гетероциклічних залишків занурюється в електронейтральний міжосновний простір, а інший – електростатично взаємодіє з фосфатною групою вуглеводневого каркасу.

Ціанінові барвники з ефекторними групами як флуоресцентні зонди для нуклеїнових кислот та білків. Для збільшення стійкості комплексу барвник–біополімер чи надання барвникові специфічності зв’язування до певного біополімеру ми запропонували уводити до молекул барвників “ефекторні групи” – ковалентно приєднані до хромофора функціональні замісники, які взаємодіють з біополімером, не впливаючи на спектральні властивості хромофора.

Для вивчення залежності афінних і спектральних властивостей модифікованих барвників від природи ефекторної групи нами було запропоновано ряд простих методів продукування множини ціанінових барвників з різноманітними функціональними замісниками. Як модельний хромофор використовувався високофлуоресцентний барвник Cyan 40, для модифікації якого ефекторними групами застосовано реакцію пірилоціаніну Cyan  з амінами (схема 1), досліджено її перебіг з різними функціонально заміщеними амінами та діамінами.

Для синтезу барвників з ефекторними групами ми вперше застосували поширений у пептидній хімії реагент – карбонілдіімідазол (КДІ). У цьому разі індольний азот і спиртові групи амінокомпонент не потребують використання захисних груп (сполуки D-16, D-19, схема 2).

Схема 1. Синтез похідних Cyan 40 реакцією пірилоціаніну Cyan 39 з первинними амінами

Схема 2. Синтез похідних Cyan 40 з ефекторними групами

активацією карбоксильної групи із застосуванням КДІ

Для кислот, хлорангідриди яких важкодоступні, ацилювання барвника D-23 проведено з допомогою КДІ. Барвники Р-2, Р-4, Р-5, Р-6, Р-7, Р-8 отримано саме у такий спосіб. Р-1, Р-3, Р-10, Р-11 синтезовано ацилюванням D-23 хлорангідридами карбонових кислот у піридині (схема 3).

Схема 3. Синтез похідних Cyan 40 з ефекторними групами

ацилюванням аміногрупи ціанінового барвника D_

Слід зазначити, що спектрально-люмінесцентні властивості вільних барвників з ефекторними групами майже не відрізняються від властивостей базового немодифікованого барвника Cyan 40.

Нами вперше показано, що присутність гідроксильної групи в молекулі ціанінів D-6, D-9, D-19 значно підвищує інтенсивність випромінювання їх комплексів з ДНК. Амінні ефекторні групи практично не впливають на флуоресцентні властивості барвників як у вільному стані, так і в присутності ДНК, РНК і білків (D-3, D-5, D-11, D-6, D-12, D-13, D-6, D-9, D-18, D-24, D-27) (табл. 6).

Таблиця 6

Характеристики спектрів флуоресценції барвників

з ефекторними групами D-1–D-27 у розчині та в присутності ДНК і РНК

Барвник | Ефекторна група | I0, у.о. | IDNA, у.о. | IRNA, у.о

D-3 | діетиламіно-етил- | Аліфатична

амінна | 0,36 | 39,5 | 81,4

D-5 | диметиламіно-етил- | 0,38 | 31,6 | 123,6

D-11 | N-піперазино-етил- | 0,26 | 51,1 | 87,2

D-12 | аміно-етил- | 0,30 | 16,4 | 63,5

D-13 | аміно-пропіл- | 0,30 | 25,4 | 75,9

D-18 | діетиламіноетил- капроіламідо- | 0,42 | 36,4 | 99

D-21 | диметиламіноетил- капроіламідо- | 0,33 | 49 | 39

D-24 | диметиламіно-пропіл- | 0,47 | 33,5 | 89,2

D-27 | діетиламіно-пропіл- | 0,46 | 30,3 | 98,4

D-14 | феніл-аміно- | Ароматична

амінна | 0,35 | 8,76 | 14,4

D-23 | 4-аніліно-капроіламідо- | 0,35 | 65 | 57

D-17 | 9-аміноакридил- капроіламідо- | 0,07 | 13,3 | 9,7

D-1 | 2-бензімідо-етил- | 0,39 | 42,6 | 47,5

D-4 | 5-аміно-5-карбокси-аміл- | Амінокислотна | 0,32 | 69,4 | 64,2

D-7 | карбокси-гексил- | Карбоксильна | 0,40 | 41,4 | 60,2

D-6 | гідрокси-пропіл- | Спиртова | 0,34 | 61,1 | 53,3

D-9 | гідрокси-етил- | 0,21 | 54,5 | 50,8

D-19 | тригідроксиметил-капроіламідо- | 0,45 | 89 | 61

D-20 | гідрокси-гексил- | 0,28 | 45,3 | 42,4

D-2 | диметоксифеніл-етил- | Ароматична | 0,43 | 38,8 | 63,4

D-8 | 3-індоліл-етил- | 0,41 | 57 | 177

D-10 | феніл-етил- | 0,37 | 32,6 | 47.2

D-16 | 3-індоліл-етил-капроіламідо- | 0,59 | 48,2 | 46,l

D-25 | метокси-етил- | Аліфатична | 0,48 | 34,2 | 37,7

D-26 | метокси-пропіл- | 0,53 | 34,1 | 45,9

Cyan 40 | метил- | 0,28 | 51,1 | 80,8

Примітка. I0, IDNA, IRNA – інтенсивність флуоресценції барвника у вільному стані та в присутності ДНК і РНК.

Принцип ефекторних груп також реалізовано для конструювання флуоресцентних зондів для детекції білків. Барвники Р-4 та Р-5 при зв’язуванні з BSA підвищують інтенсивність флуоресценції на два порядки (табл. 7). Можливо, цей ефект пов’язаний з фрагментом аніліду арилоцтової кислоти – ефектора, який надає барвнику здатності специфічно локалізуватись в одному з центрів зв’язування BSA.

Таблиця 7

Флуоресцентні властивості барвників Р-1–Р-8, Р-10–Р-11 у присутності 0,1 мг/мл BSA

Барвник | Ефектор | IBSA, у.о | QBSA

P-1 |

*-CO-CH2-O-Ar | 1,2 | 1,66

P-2 | *-CO-CH2-CHR-Ar | 1,57 | 3,2

P-3 | *-CO-Ar | 0,083 | 3,4

P-4 | *-CO-CH2-Ar | 11,7 | 29,25

P-5 | *-CO-CH2-Ar | 18,4 | 63,4

P-6 | *-CO-CH2CH2-(CH2)3-Ar | 1,18 | 2,8

P-7 | *-CO-CH2-O-Ar | 0,6 | 1

P-8 | *-CO-Ar | 0,8 | 6,7

P-10 | *-CO-Ar | 1,55 | 8,8

P-11 | *-CO-CHAr-Ar | 8,5 | 22,3

Примітка. IBSA – інтенсивність флуоресценції барвника в присутності БСА, QBSA  – приріст флуоресценції при зв’язуванні.

Отже, запропонований нами принцип ефекторних груп відкриває широкі можливості для створення нових флуоресцентних зондів на основі вже відомих ціанінових барвників. Завдяки модифікації одного й того ж ціаніну з допомогою різних ефекторів можна створювати флуоресцентні зонди зі специфічністю до ДНК, РНК чи білка, надавати барвнику здатності проникати через біологічні мембрани, синтезувати більш складні зонди з переносом енергії.

Гомо-n-мерні монометинові ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції нуклеїнових кислот. Основна увага при вивченні властивостей комплексів гомодимер–ДНК приділялась особливостям будови та природи інтеркалятора. До наших досліджень в літературі не існувало цілісного уявлення про вплив жорсткості, хімічного складу лінкера на властивості комплексу. Отже, пошук нових хімічних підходів для отримання гомодимерних монометинціанінів, лінкери яких суттєво б відрізнялися за хімічним складом та будовою, стало одним з предметів нашого дослідження. Ми використали три нових підходи, які дали змогу отримати ряд гомо-n-мерних тіапіридоціанів з лінкерами, різними за складом і довжиною.

Перший підхід полягав у застосуванні реакції пірилієвих солей з первинними діамінами (схема 4).

Схема 4. Синтез гомодимерних тіапіридоціанінів реакцією

пірилієвих солей з первинними діамінами

Другий підхід полягав у застосуванні реакції ацилювання поліамінів барвником D-7, карбоксильним похідним ціанінового барвника Cyan 39. Як конденсуючі реагенти використано ДЦГК або КДІ. З їх допомогою вперше синтезовано гомотримерні ціанінові барвники К-Т та К-СТ з виходами 59 та 65 % відповідно (схема 5).

Схема 5. Синтез гомо-n-мерних тіапіридоціанінів реакцією ацилювання амінів

активованим ефіром чи імідазолідом карбоксильного похідного ціанінового барвника

Третій підхід передбачав використання реакції діізоціанатів з амінопохідними барвників. З його допомогою синтезовано гомодимерний барвник К-10 з конфігураційно утрудненим лінкером (схема 6).

Схема 6. Синтез гомодимерних тіапіридоціанінів реакцією амінопохідного барвника з біс-ізоціанатом

Спектрально-люмінесцентні властивості синтезованих гомо-n-мерних монометинціанінів та їхніх комплексів з ДНК і РНК подано в табл. 8. Слід зазначити, що для гомодимерів з коротким лінкером (К-1–К-5) у комплексах з ДНК інтенсивність флуоресценції набагато нижча, ніж для мономерного ціанінового барвника Cyan 40. Короткі лінкери барвників К-1–К-5 не дають змоги утворювати бісінтеркаляційні комплекси з длДНК, що узгоджується з інтеркаляційним механізмом взаємодії барвників з ДНК. На відміну від длДНК, значне підвищення інтенсивності флуоресценції для РНК спостерігається при довжині лінкера у 5–6 атомів, що відповідає моделі “взаємодії, подібної до часткової інтеркаляції” ТОТО в односпіральну ДНК, запропонованої A. Глейзером.

Таблиця 8

Спектрально-люмінесцентні характеристики гомо-n-мерних монометинціанінових барвників та їхніх комплексів з НК у буфері 50 мM Tріс-HCl, pH 7,5

Барвник | Довжина

лінкера в атомах | , нм | , нм | IDNA,

y.o. | , нм | , нм | IRNA,

y.o.

К-1 | 5, аліфатичний | 401

424

447–– |

485–– |

6,0 | 410

431

450–– |

485–– |

11,7

К-2 | 6, аліфатичний | 402

420

448–– |

482–– |

4,7 | 402

419

450–– |

484–– |

17,6

К-3 | 5, аліфатичний | 424

451– |

496– |

6,1 | 423

451– |

498– |

3,1

К-4 | 7, аліфатичний | 403

430

455–– |

495–– |

32,1 | 400

433

451–– |

489–– |

12,2

К-5 | 8, аліфатичний– |

428

455–– |

493–– |

12,2 | 402

438

452–– |

493–– |

49,3

К-6 | 16, аліфатичний

з циклом | 401

429

450–– |

484–– |

108 | 411

429

445–– |

485–– |

40,3

К-7 | 12, аліфатичний | 427

449– |

484– |

60,1 | 415

445– |

486– |

18,3

К-8 | 20, аліфатичний | 404

432

454–– |

483–– |

83,6– |

427

452–– |

483–– |

50,3

К-СТ | 19, аліфатичний | 403

431

447–– |

484–– |

64,5– |

428

444–– |

486–– |

23,1

К-Т | 21, аліфатичний | 404

434

447–– |

485–– |

50,8 | 411

425

448–– |

487–– |

24,4

К-9 | 20, аліфатичний + ароматичний | 409

434

447–– |

483–– |

43,8– |

433

440–– |

484–– |

16,5

К-10 | 37, аліфатичний + ароматичний | 409

434

448–– |

484–– |

20,5 | 409

433

449–– |

485–– |

11,0

Cyan 40– | 440 | 490 | 51,1 | 436 | 494 | 80,8

Примітка. , – відповідно довжина хвилі максимуму спектра поглинання та флуоресценції барвника в присутності РНК.

На відміну від димерів з менш “жорсткими” ланцюгами (К-6, К-9) і барвників з довгим аліфатичним лінкером К-7, К-8, гомодимерний барвник К-10 з жорстким лінкером має досить низьку інтенсивність флуоресценції в комплексах з НК. Це може пояснюватись утрудненням інтеркаляції за рахунок жорсткості лінкера, або підвищеною здатністю димерів до агрегації за рахунок його ароматичності.

Спектри лінійного дихроїзму гомотримерного барвника та гомодимерного барвника К-6 (рис. 6), як і у відповідного мономера Cyan 40 (рис. 3), указують на інтеркаляційний механізм фіксації барвника в ДНК-комплексі.

Під час флуоресцентного титрування ДНК барвниками К-6, К-Т насичення інтенсивності флуоресценції відбувається майже при однаковому співвідношенні: одна молекула барвника К-Т на 20 пар основ, для барвника К-8 – на 16 пар основ. У зв’язку з цим можна припустити, що гомотримерний барвник К-Т зв’язується з НК тільки двома хромофорами.

Відомо, що інтеркалятори виявляють більшу специфічність до GC-збагачених ділянок, а речовини, що взаємодіють за борозенковим механізмом, – до АТ-збагачених. Спектрально-люмінесцентні властивості гомодимеру К-6 і гомотримеру К-СT у комплексах з полінуклеотидами poly(dA/dT) і poly(dGC/dGC) практично тотожні. Димери та тримери барвників характеризуються значно більшою здатністю до агрегації, ніж відповідні мономери. Для визначення структури агрегатів барвника зроблено квантово-хімічні розрахунки електронних переходів для агрегатів, що складаються з двох і трьох молекул ціаніну Cyan 40. Одержані величини відповідають експериментально отриманим спектрам (рис. 7).

На рис. 8 наведено спектри випромінювання мономерного ціаніну Cyan 40 та гомотримерного K-T.

Здатність до агрегації у мономера набагато нижча, ніж у тримера. У вільному стані у тримерного барвника спостерігається досить інтенсивне випромінювання агрегаційних структур, при взаємодії з НК у спектрах випромінювання обох барвників – інтенсивний молекулярний пік. Чутливість визначення ДНК визначається співвідношенням інтенсивностей випромінювання зв’язаного з нею зонда до незв’язаного. Процеси агрегації знижують флуоресценцію вільного ціаніну, унаслідок чого співвідношення сигнал/шум різко зростає (табл. ).

Таблиця 9

Флуоресцентні характеристики мономерного (Cyan 40), димерногоК-6) і тримерного (К-Т) барвників

Назва | Формула барвника | I0*, у.о. | IDNA, у.о. | QDNA*

К-Т | 0,04 | 50 | 1245

К-6 | 0,12 | 93 | 775

Cyan 40 | 0,28 | 51 | 182

Примітка. I0* – інтенсивність флуоресценції вільного барвника, виміряна на 482 нм, QDNA* – відношення IDNA до I0*.

Отже, з метою створення нових зондів для визначення ДНК у гомогенних системах аналізу можна застосовувати поліметинціанінові барвники з високою інтенсивністю випромінювання у вільному стані, збільшивши їх здатність до утворення агрегатів.

Триметинціанінові барвники з модифікованим поліметиновим ланцюгом як флуоресцентні зонди для гомогенного аналізу нуклеїнових кислот. У гомогенному аналізі ДНК, як правило, використовують монометинціаніни, які підвищують інтенсивність флуоресценції на порядки при зв’язуванні з НК. Таким чином, триметинціанінові барвники через високий рівень фонового випромінювання незв’язаного зонда для цієї мети малопридатні.

Нами запропоновано підхід, який дає змогу суттєво знизити рівень власного випромінювання триметинціанінів. Уведення до поліметинового ланцюга алкільних замісників виводить молекулу з планарної конформації і, як наслідок, інтенсивність флуоресценції незв’язаного барвника падає, при зв’язуванні з НК планарна конформація відновлюється й інтенсивність флуоресценції зростає. Оптимізована в рамках наближення молекулярної механіки за допомогою методу ММ+ геометрія молекули барвника Cyan 2 (рис. 9) суттєво відрізняється від плоскої геометрії немодифікованого барвника J01.

Рис. 9. Просторова будова триметинціаніну Cyan 2

в наближенні молекулярної механіки ММ+

Для з’ясування впливу заміщення в поліметиновому ланцюзі на спектрально-люмінесцентні властивості барвників у вільному стані та в присутності НК нами досліджено ряд заміщених і незаміщених барвників. Їх синтезували згідно з описаними в літературі методами. Симетричні карбоціаніни J01, Cyan 2, J23, J25–J32 з атомом водню й метильною групою у ?-положенні поліметинового ланцюга отримано ортоестерним методом відповідно до cхеми 7:

Схема 7. Синтез барвників J01, Cyan 2, J25–J32

Триметинціаніни J03–J22 одержано через ацилметиленові основи (схема 8), синтезовані шляхом ацилювання метилметосульфату 2-метилбензтіазолу (6.1) хлорангідридами кислот у піридині при пониженій температурі. Ми запропонували використовувати для ацилювання активуючий агент N,N’-карбонілдіімідазол (КДІ), що дало змогу отримати ацилметиленові основи з кислот, хлорангідриди яких нестійкі, (метоксиоцтова, слизева, 3-індолілоцтова та 1-нафтилоцтова кислоти).

Ацилметиленові основи (6.2) далі за допомогою хлоридоксиду фосфору в хлороформі були перетворені у ?-хлорвінілпохідні (6.3), з яких дією водного гідросульфіду натрію одержали ацилтіометиленові основи (6.4). Останні алкілували іодетаном з отриманням ?-етилтіовініл-похідних (6.5), які в реакції з (6.1) давали барвники J03–J22 (схема 8).

Схема 8. Синтез барвників J03–J22

Вплив модифікації поліметинового ланцюга на спектрально-люмінесцентні властивості триметинціанінів у комплексах з ДНК було вивчено на прикладі барвника J01. Замісник у мезо-положенні поліметинового ланцюга триметинціаніну значно понижує інтенсивність власної флуоресценції барвника I0. При зв’язуванні з ДНК інтенсивність модифікованих триметинціанінів зростає. Інтенсивність ДНК-комплексів J11, J12 та J14 з об’ємними вторинними і третинними амінами залишається низькою.

Найбільш оптимальними замісниками є первинні нерозгалужені радикали або ж об’ємні групи, але зі спейсером завдовжки у дві та більше метиленові ланки (Cyan 2, J3–J10) (табл. 10).

Таблиця 10

Спектрально-люмінесцентні властивості ДНК-комплексів

низки мезо-заміщених триметинтіаціанінових барвників

Примітка. ?DNA – молярний коефіцієнт екстинкції на довжині хвилі максимуму спектра поглинання барвника в присутності ДНК.

У спектрах поглинання й випромінювання барвників J03, J05, J11, J17 у присутності ДНК спостерігаються чіткі J-агрегатні смуги, які, очевидно, з’являються за рахунок утворення надмолекулярних барвникових структур у малій борозенці ДНК. Поява цих смуг досить специфічна, оскільки у вільному стані та в присутності РНК вони не утворюються (рис. 10). Зазначені барвники можуть використовуватися для конструювання специфічних флуоресцентних зондів, які можуть визначати ДНК у присутності РНК та інших біополімерів.

Рис. 10. Спектри поглинання (справа) та випромінювання (зліва) мезо-2-тієнілтриметинтіаціаніну J16 у водному розчині у вільному стані та у присутності ДНК і РНК

Барвник Cyan 2 виявив перспективні спектральні властивості для застосування в гомогенному аналізі ДНК. З метою вивчення можливого механізму взаємодiї триметинцiаніну Cyan 2 з ДНК проведено ряд експериментів: 1) флуоресцентне титрування барвником нативної ДНК i синтетичних полiнуклеотидiв; 2) гасiння флуоресценцiї ДНК-комплексiв Cyan 2 при збільшенні iонної сили розчину та додаванні анiонного гасника – йодид iону; 3) отримання спектра лiнiйного дихроїзму ДНК-комплексу барвника; 4) визначення константи зв’язування барвника з ДНК за результатами флуоресцентного титрування та вивчення міжфазного розподілу в системі етилацетат/вода.

Константа зв’язування Cyan 2 з нативною ДНК еритроцитів курчат Кзв визначалася флуоресцентним титруванням і дорівнювала 3,6104 М-1. Її також обчислювали за методом двох фаз для трьох різних концентрацій ДНК (210-5 М, 410-5 М та 810-5 М), вона становила 1,5104 М-1. Одержані значення Кзв можуть свідчити про утворення досить стійких комплексів барвника з ДНК.

Cпектр лінійного дихроїзму ДНК-комплексу з Cyan 2 вказує на інтеркаляційний характер взаємодії цього барвника з ДНК (рис. ), оскільки зведений лінійний дихроїзм (LDr)