МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. Богомольця

Запривода Лариса Петрівна

УДК 611.013.12:57.043 /.044

МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕРМАТОГЕНЕЗУ ПРИ ДІЇ ДЕЯКИХ ХІМІЧНИХ І ФІЗИЧНИХ ЧИННИКІВ

14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені
О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Яценко Валентин Порфирович,

Національний технічний університет

України “КПІ” МОН України,
завідуючий кафедрою медичної
кібернетики та телемедицини.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гордієнко Вадим Максимович, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка МОН України, професор кафедри цитології, гістології та біології розвитку;

кандидат біологічних наук Бідна Лариса Павлівна, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, доцент кафедри гістології, цитології та ембріології.

Провідна установа

Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевсь-кого, кафедра гістології, цитології та ембріології, МОЗ України, м. Тернопіль.

Захист відбудеться “ 17 ” лютого 2005 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 у Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, пр-т Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “ 14 ” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06

доктор медичних наук, професор Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У вік техногенної агресії в полі зору дослідни-ків знаходиться вивчення морфо-функціонального стану сперматогенезу як клітинної системи, постійно оновлюваної та дуже чутливої до дії екстремальних чинників хімічної та фізичної природи, що викликане по-гіршенням репродуктивного здоров’я чоловіків (Englert Y., 1998). Остан-нім часом саме андрогенний фактор в більшій половині випадків зумовлює появу безплідних шлюбів (Жиборев В.Н. и др., 1990; Гринчук В.А., 1990; Батыров Б.Б., 1990; Артюхин А.А., 1990; Паращук Ю.С., 1994; Іванюта Л.І., 1996).

Широке застосування в хімічній промисловості, в авто- та суднобудуванні находять нині епоксидні смоли та композиції на їх основі завдяки унікальному набору технологічних властивостей. Разом з тим при виробництві епоксидних смол та склопластиків, де концентрація епіхлоргідрину в 1,5 рази перевищувала гранично допустиму, у 40,5% чоловіків зі стажем роботи від 1 до 10 років відмічені сексологічні скарги (Нешков Н.С. и др., 1976; Высоцкий И.Ю., 2002).

Актуальність вивчення модельованих факторів космічного польоту визначається загальною стратегією України щодо проведення наукових біомедичних досліджень в космічному просторі та суперечливістю відомих даних про вплив цих факторів на одну з найбільш ушкоджуваних систем організму – генеративну (Плахута-Плакутина и др., 1976; Денисова Л.А. и др., 1988; Федорова Н.Л., 1967; Philpott D.E. et al., 1985).

Використання у багатьох галузях народного господарства джерел електромагнітного надвисокочастотного випромінювання приводить до розвитку різноманітних патологічних процесів у обслуго-вуючого персоналу та населення найближчих районів. З іншого боку, цей фізичний фактор при певних параметрах може благотворно впливати на живі організми, наприклад, у вигляді мікрохвильової резонансної терапії (МРТ). В літературі є відомості про вплив електромагнітного випромінювання промислової частоти на статеву систему, зокрема, на сперматогенез (Дедловская В.И. и др., 1987). При цьому встановлено, що тривала дія електромагнітного випромінювання (6 місяців) викликала пригнічення процесу поділу сперматогоній, а також приводила до деструкції зрілих статевих клітин.

В період зростаючої екологічної свідомості проблема збереження репродуктивного здоров’я є досить актуальною. Передумовою для проведення нинішнього дослідження є відсутність даних про вплив на генеративну функцію чоловіків епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф. У зв’язку з суперечливістю даних про вплив факторів космічного польоту на чоловічу репродуктивну систему та відсутністю інформації щодо дії гравітаційних навантажень у краніо-каудальному напрямку, що мають місце в практиці авіакосмічних польотів, постає необхідність подальшого вивчення цих питань. Не вивчені питання впливу електромагнітного поля надвисокої частоти низької інтенсивності на гонади та функцію відтворення при використанні його в умовах реальних режимів сеансного випромінювання, що застосовуються в лікувальній практиці.

Таким чином, є доцільним вивчення впливу вищеописаних чинників на стан чоловічої генеративної системи, яка реагує на значно нижчі рівні дії пошкоджуючих агентів, ніж інші органи і системи організму. Отримані результати будуть враховані при обгрунтуванні санітарних стандартів, а також профілактичних заходів, спрямованих на запобігання несприят-ливої дії зазначених чинників на репродуктивне здоров’я людей.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках комплексних науково-дослідних робіт Науково-дослідного лабораторного центру НМУ по темах: 1. “Физические принципы диагностики и лечения заболеваний человека с помощью низкоинтенсив-ных электромагнитных полей миллиметрового диапазона”, по заказу Госкомитета СССР по науке и технике и Президиума АН СССР от 1.07.86 №278/141, 1986-1989 гг. 2. “Моделювання (теоретичні та прикладні аспекти) захворювань людини та розробка математичних та інформаційних техно-логій супроводження медико-біологічних досліджень”, № держреєстрації 0198U003076, 1998-2000 рр. 3. “Дослідити особливості функції репродук-ції та пренатального розвитку білих щурів при впливі різноспрямованої гіпергравітації”, № держреєстрації 0198U001308, 2001-2003 рр.

Мета та задачі дослідження. Метою дослідження є експериментальне вивчення загальних закономірностей перебігу процесу сперматогенезу в умовах впливу чинників хімічної та фізичної природи. Досягнення цієї мети базувалось на вирішенні наступних задач:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об’єкти дослідження: сім’яники та клітини сперматогенного ряду, зрілі сперматозоїди, придатки сім’яників та сім’яні пухирці дорослих самців щурів, гіпофіз та наднирники потомків білих щурів, а також дорослі особини обох статей та їхнє потомство.

Предмет дослідження: загальні закономірності перебігу процесу сперматогенезу в умовах дії таких хімічних факторів, як ацетат свинцю та епоксиднодіанова смола, а також фізичних факторів – різноспрямована гіпергравітація та локальна дія ЕМП НВЧ.

Методи дослідження: морфологічні, морфометричні, фізіологічні, електронномікроскопічні, токсиколого-гігієнічні, математичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримані закономірності інгаляційної дії летючих компонентів епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф, різноспрямованої гіпергравітації та локального опромінення електромагнітного поля надвисокої частоти низької інтенсивності на стан репродуктивної функції самців білих щурів. Вперше розроблений новий метод, який дозволяє здійснити морфометричну оцінку завершального етапу сперматогенезу – періоду формування, і на цій основі дати кількісну характеристику кінцевих етапів утворення зрілих статевих клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про наявність гонадотоксичного ефекту епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф в концентрації на рівні існуючої гранично допустимої по епіхлоргідрину представлені науковцям гігієнічного профілю для розробки групового нормативу, придатного для всіх застосовуваних у промисловості епоксидно-діанових смол. Виявлений негативний вплив перевантаження на стан репродуктивної системи експериментальних тварин, особливо виражений в каудо-краніальному напрямку, що має місце в умовах реальних польотів, є основою для необхідності наукового обгрунтування профілактичних заходів для пілотів спеціалістами авіакосмічної медицини. Отримані дані щодо стану репродуктивного здоров’я білих щурів при дії ЕМП НВЧ, яке застосовується з лікувальною метою, були використані при впровадженні мікрохвильової резонансної терапії в клінічну практику. Створений метод оцінки стану сперматогенезу є теоретичною передумовою для наукового обгрунтування санітарних стандартів, а також для розробки профілактич-них заходів, спрямованих на запобігання можливої несприятливої дії чинників навколишнього середовища на репродуктивну функцію людини. Матеріали роботи при впровадженні в навчальний процес розширювати-муть уявлення студентів про вплив чинників хімічної та фізичної природи на стан чоловічої репродуктивної системи.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений пошук, збір і аналітичний огляд джерел наукової літератури за темою дисертації. Власноруч відтворена експериментальна модель пошкодження гонад при хронічній свинцевій інтоксикації та корекції її люпином. Експериментально-токсикологічне дослідження епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф проведене сумісно з співробітниками кафедри гігієни праці та професіональних захворювань НМУ (зав. кафедрою – професор
О.П. Яворовський). Самостійно вивчене автором репродуктивне здоров’я експериментальних тварин при дії фізичних факторів: різноспрямованої гіпергравітації та ЕМП НВЧ. Набраний необхідний ембріональний матеріал, отримане потомство та проведені фізіологічні дослідження його пре- та постанатального онтогенезу. Вивчений функціональний стан сперматогенезу у експериментальних тварин. Проведена гістологічна обробка та морфометричний аналіз матеріалу. Електронномікроскопічні дослідження здійснені в лабораторії електронної мікроскопії НДЛЦ при консультативній допомозі професора Л.О. Стеченко. Автором здійснене статистичне опрацювання, аналіз отриманих даних і написання роботи.

Планування досліджень, розробка морфометричного методу оцінки сперматогенезу, інтерпретація наукових положень, формулювання висновків та профілактичних рекомендацій проведені спільно з науковим керівником, а також при консультуванні І.Г. Анісімової, провідного наукового співробітника науково-дослідної групи токсикології НДЛЦ НМУ, де працює дисертант.

В наукових працях, опублікованих у співавторстві, автору нале-жить фактичний матеріал, отриманий нею при проведенні дослідження.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на: I Міжнародному симпозіумі “Гигиена физических факторов окружающей и производственной среды” (Київ, 1993); науково-практичних конференціях Науково-дослідного лабораторного центру Національного медичного університету “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (Київ, 1994, 1997, 1998, 1999, 2002, 2003); II Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів (Луганськ, 1998); симпозіумі з проблем космічної біомедицини (Київ, 2000); XII конференції з космічної біології та авіакосмічної медицини (Москва, 2002); II науковому симпозіумі “Космічна біомедицина. Телемедицина” (Київ, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт, які повністю відображають зміст проведеного дослідження, з них 3 – журнальні статті в профільних фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 11 – в збірниках робіт симпозіумів і наукових конференцій. Отриманий патент від 17.03.2000 р. на “Спосіб оцінки порушень сперматогенезу”.

Структура і об’єм дисертації. Дисертація виконана на 202 сторінках машинописного тексту (обсяг тексту основної частини становить 127 сторінок). Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу “Програма, об’єм та методи дослідження”, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел, який включає 283 бібліографічні описи, серед яких 235 робіт авторів України та країн СНД, 48 робіт іноземних авторів. Робота проілюстрована 27 таблицями, 57 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експерименти по вивченню впливу чинників хімічної та фізичної природи на репродуктивну функцію самців білих щурів сплановані у відповідності до існуючих методичних рекомендацій та методичних вказівок (1978, 1988, 2000). При цьому проводили макроскопічне дослідження сім’яників, яке включало зовнішній огляд з метою виявлення патологічних відхилень, вимірювання розміру та маси обох сім’яників, відношення маси сім’яників до маси тіла; а також визначали масу та масові коефіцієнти придатків сім’яників та сім’яних пухирців.

Функціональний стан сперматозоїдів оцінювали за тривалістю збереження їх рухливості (Егорова Г.М. и др., 1966), осмотичною резистентністю (Милованов В.К., 1962), відносною кількістю нерухомих та патологічних форм (Саноцкий И.В. и др., 1970).

Для мікроскопічного дослідження сім’яники фіксували в рідині Карнуа, занурювали в парафін, готували тонкі зрізи (6-7 ), забарвлювали гематоксиліном і еозином. Препарати тонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу “Олімпус”. На гістологічних препаратах підраховували ряд морфометричних показників: індекс сперматогенезу за чотирибальною системою Fogg (1951), кількість нормальних сперматогоній (Щербаков Г.Г., 1974), відносне число канальців зі злущеними клітинами сперматогенного ряду та 12-ю стадією мейозу (Саноцкий И.В. и др., 1979).

Для морфометричної оцінки завершального етапу сперматогенезу – періоду формування, нами був розроблений новий метод, за допомогою якого не тільки констатується факт наявності певної кількості спермато-генних клітин, але також характеризується процес сперматогенезу в розвитку шляхом визначення показника ступеня диференціації сперматид (ПСДС) – співвідношення середньої кількості сперматид в одиниці площі зрізу звивистих сім’яних канальців на VIа і IXа стадіях сперматогенезу за класифікацією C.P. Leblond et al. (1952). Практичну реалізацію запропонованого підходу здійснюють наступним чином. На поперечних зрізах сім’яників досліджують по 5 канальців на стадіях VIа і IXа сперматогенезу. Проводять виміри зовнішнього діаметра канальця (Д) і діаметра просвіту (d). Потім в стандартній площі поля зору, яке включає всю товщу сперматогенних клітин, підраховують кількість сперматид (Р). Для кожного досліджуваного канальця такий підрахунок здійснюють у чотирьох полях зору. Таким чином в кожному препараті, що вивчається, проводять підрахунок числа сперматид в 20 полях зору. Визначення ПСДС здійснюють за розробленою комп’ютерною програмою.

Розроблений нами метод для оцінки стану сперматогенезу був апробований на моделі пошкодження гонад при свинцевій інтоксикації (Чарыев О.Г. и др., 1977; Красовский Г.Н. и др., 1984) та при корекції її люпином – трав’янистою рослиною родини бобових, зокрема, білого люпину (Lupinus albus) сорту “Олешко”, наданого нам Українською асоціацією “Люпин і біб”. Для цього самцям білих щурів на протязі всього процесу сперматогенезу (56 днів) внутрішньошлунково вводили ацетат свинцю в токсичній (0,05 мг/кг маси тіла) та недіючій за загальнотоксичними показниками (0,0015 мг/кг) дозах. По закінченні експерименту частині щурів, які одержували ацетат свинцю в токсичній дозі, з метою корекції пошкоджених гонад протягом 1 місяця щоденно добавляли до добового раціону 5 г люпинового борошна, яке вміщувало 0,21 мг Zn. B експерименті використано 40 самців щурів, розподілених на 4 групи: I група – контроль, II і III група включали самців, які піддавалися внутрішньошлунковому введенню ацетату свинцю в дозі 0,05 мг/кг, IV група – в дозі 0,0015 мг/кг. Десять самців III групи з моделлю пошкодження гонад піддавали люпиновій корекції.

Експерименти по вивченню гонадотоксичної дії епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф проведені на 24 статевозрілих щурах-самцях, яких на протязі 4-х місяців 5 раз в тиждень по 4 години в день піддавали дії летючого комплексу в концентрації 0,92±0,07 мг/м3 – на рівні існуючої гранично допустимої концентрації по епіхлоргідрину. Контроль за концентрацією летючого комплексу в затравочній камері проводили за провідним компонентом – епіхлоргідрином (Перегуд Е.П. и др., 1973).

Модель гіпергравітації здійснювали на центрифузі типу К26Д з радіусом ротора 23 см. Щурів розміщували в пластмасових камерах у двох напрямках – голова-таз та таз-голова. Гравітаційному навантаженню величиною 4g щури піддавалися на протязі 7 днів по 3 години щоденно. B експерименті використано 24 самці щурів, розподілених на 3 групи:
I група – контроль, II група – дослідні самці щурів, які піддавалися гравітаційним навантаженням у краніо-каудальному напрямку, III група – дослідні самці щурів, які піддавалися гравітаційним навантаженням у каудо-краніальному напрямку. В експериментальних тварин проводили дослідження макрометричних показників репродуктивних органів та морфо-функціонального стану сперматогенезу. З метою інтегральної оцінки функції відтворення потомства самців білих щурів контрольної та дослідних груп парували з 65 інтактними самицями. Було отримано 48 запліднених самиць, з яких вагітними виявилися 38. При цьому обчислювали показники функції репродукції самців – індекси плодючості та вагітності.

Локальну дію електромагнітного поля надвисокої частоти (ЕМП НВЧ) здійснювали генератором ГЧ-142 через біологічно активну точку (БАТ) цзу-сань-лі (Плахотин М.В., 1966). Частота випромінювання складала 59 ГГц, вид випромінювання – неперервний синусоїдальний сигнал, густина потоку енергії на виході хвилевода 1 мВт/см2, експозиція 15 хвилин.

В першій серії цього експерименту вивчали вплив випромінювання на репродуктивну функцію дорослих самців білих щурів, для чого їх піддавали дії ЕМП НВЧ на протязі 56 днів. Потім самців парували з інтактними самицями для отримання ембріонального матеріалу та потомства. Відразу після парування тварин виводили з експерименту, вивчаючи при цьому морфо-функціональний стан сім’яників.

В другій серії експерименту визначали показники пре- і постнатального розвитку та морфо-функціонального стану спермато-генезу потомства самиць, які піддавалися дії ЕМП НВЧ в різні періоди життя (до парування та під час вагітності). Частину самиць опромінювали на протязі 3-х естральних циклів (15 днів), після чого їх парували з інтактними самцями. Іншу частину самиць опромінювали в різні строки вагітності: 1-6 та 6-16 дні.

Від вагітних самиць отримували ембріональний матеріал з метою вивчення рівня пренатальної загибелі зародків та загального розвитку плодів.

Частину вагітних щурів доводили до пологів, реєструючи у потомства показники фізичного розвитку, швидкість дозрівання сенсорно-рухових рефлексів, емоційно-рухову поведінку та здатність до координації рухів. По досягненні статевої зрілості у потомків чоловічої статі дослідної та контрольних груп вивчали морфо-функціональний стан сперматогенезу.

Ультраструктурне дослідження сім’яників гіпофізу та наднирників було проведене у 20 щуренят від 20-ти самиць, опромінених у 1-6 та 6-16 дні вагітності.

Всього при вивченні репродуктивного здоров’я білих щурів, опро-мінених ЕМП НВЧ, було задіяно 120 дорослих самців щурів, досліджено естральний цикл з метою відбору правильно циклюючих самиць у 587 тва-рин, отримано 218 вагітних самиць, обстежено 1570 плодів та 588 щуренят.

Матеріалом для електронномікроскопічного дослідження служили шматочки сім’яників, аденогіпофізу та наднирників тварин. Шматочки подрібненого матеріалу фіксували 2% розчином OsO4 за Caulfild (1957) на протязі 2 год. при +4oС. Шматочки аденогіпофізу попередньо фіксували на протязі 1 год. глютаровим альдегідом на фосфатному буфері з наступною 2-х годинною дофіксацією в 2% OsO4 за Millonig. Після фіксації зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, в ацетоні і заливали в суміш аралдиту та епону за загальноприйнятою схемою (Бирюзова В.П. и др., 1963; Карупу В.Я., 1984). Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі LKB-III, контраcтували 2%-ним розчином оцтово-кислого уранілацетату в 70є етанолі (Reynolds G., 1963) і цитратом свинцю (Watson M.L., 1958) по 10 хвилин та переглядали в електронних мікроскопах ЕМВ-100БР та ЕМ-125К.

Отриманий цифровий матеріал опрацьовували методами варіацій-ної статистики з використанням критерію достовірності Ст’юдента (Беленький М.Л., 1963) та у відповідності до рекомендацій, викладених у посібниках (Урбах В.Ю., 1964; Лакин Г.Ф., 1973; Мерков А.М. и др., 1974; Минцер О.П. и др., 1991).

Результати дослідження та їх обговорення. Розроблений нами метод для оцінки стану сперматогенезу апробований на моделі пошкодження гонад білих щурів при свинцевій інтоксикації, а також при корекції її люпином.

Нам вдалося відтворити модель пошкодження гонад, встановивши при цьому грубе порушення процесу цитодиференціації і передчасну зміну міжклітинних взаємодій між сустентоцитами і сперма-тидами, які викликають різке зниження запропонованого нами ПСДС з 0,91±0,02 до 0,64±0,02. Слід зазначити, що за допомогою ПСДС відмічали погіршення стану сперматогенезу з таким же високим ступенем достовір-ності (p<0,001), як і при традиційних методах оцінки (індекс спермато-ге-незу – p<0,002; число нормальних сперматогоній – p<0,001; число каналь-ців зі злущеними сперматогенними клітинами – p<0,001) – див. табл. 1.

При зниженні дози ацетату свинцю з токсичної – 0,05 мг/кг до недіючої за загальнотоксичними показниками – 0,0015 мг/кг не відмічали достовірних змін морфо-функціональних показників сперматогенезу у білих щурів згідно з традиційними методами оцінки. Тільки за допомогою розробленого нами методу встановлене пригнічення процесу диференці-ації сперматид, на що вказувало зниження ПСДС на 6,59% (p<0,05).

Корекція люпином пошкоджених при свинцевій інтоксикації гонад приводила до відновлення їхньої гістологічної структури та морфо-функціонального стану сперматогенезу, на що з високим ступенем достовірності вказували як традиційні методи оцінки (індекс сперматогенезу – p<0,001; число нормальних сперматогоній – p<0,001; число канальців зі злущеними сперматогенними клітинами – p<0,001), так і розроблений нами (ПСДС – p<0,001).

Таким чином, на моделі пошкодження гонад при свинцевій інтоксикації та при корекції її люпином відмічена здатність розробленого нами методу реагувати на різні зміни стану сперматогенезу значною амплітудою коливання ПСДС. Також розроблений нами метод дозволив об’єктивно оцінювати початкові порушення сперматогенезу, здатні виникати при мінімальних (порогових) рівнях дії хімічних факторів навколишнього середовища, і дозволив судити про механізми порушень сперматогенезу, зокрема, процесу диференціації сперматогенних клітин.

Отже, розроблений нами метод може сприяти подальшому удосконаленню оцінки стану процесів сперматогенезу у білих щурів при дії пошкоджуючих факторів навколишнього середовища.

Як показали результати інгаляційної дії епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф, що відноситься до малонебезпечних речовин (IV клас небезпечності) (ГОСТ. Вредные вещества, 1977), в концентрації на рівні існуючої гранично допустимої (ГДК) по епіхлоргідрину (0,92±0,07 мг/м3) протягом 4-х місяців на самців білих щурів, функціональні показники сперматозоїдів після 2-х та 4-х місячної інгаляційної затравки не відрізнялись від таких у контрольній групі тварин. В обидва строки дослідження не відмічене пошкодження гістологічної структури сім’яників та погіршення морфометричних показників стану сперматогенезу (згідно з традиційними методами оцінки) – табл. 1.

Таблиця 1

Морфометричні показники клітин сперматогенного ряду білих щурів після інгаляційної дії летучих компонентів епоксиднодіанової
смоли ЕД-22ф

Показники | Статистичний показник | Групи тварин

контроль | 2 міс | 4 міс

Індекс сперматогенезу | M±m | 3,66±0,01 | 3,65±0,01 | 3,69±0,02

p | >0,05 | >0,05

Число нормальних сперматогоній | M±m | 43,92±2,03 | 44,23±3,11 | 48,89±2,24

p | >0,05 | >0,05

Число канальців з 12-ю стадією мейозу | M±m | 1,75±0,52 | 1,13±0,37 | 2,13±0,51

p | >0,05 | >0,05

Число канальців зі злущеними спермато-генними клітинами | M±m | 1,88±0,43 | 2,13±0,43 | 2,25±0,48

p | >0,05 | >0,05

ПСДС | M±m | 0,94±0,02 | 0,88±0,02 | 0,86±0,02

p | >0,05 | <0,02

Морфометрична оцінка стану сперматогенезу за розробленим нами методом вказує на виражену тенденцію до зниження ПСДС після 2-х місячної (t=2,12; p>0,05) і на достовірне зниження показника після 4-х місячної інгаляційної дії смоли (t=2,83; p<0,02). Виявлений в умовах дії епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф своєрідний дефіцит завершального етапу сперматогенезу – періоду формування після двомісячної інгаляції складав 6%, після чотиримісячної – 9%. Слід гадати, що такий дефіцит, ймовірно, не відбивався на функціональних властивостях дозрілих сперматогенних клітин, про що свідчить збереження терміну їхньої рухливості і осмотична резистентність. Очевидно, такий рівень дефіциту сперматогенних клітин не займає загальний процес диференціації їхньої популяції в цілому (Запривода Л.П., 2001).

Таким чином, інгаляційна дія епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф протягом чотирьох місяців на рівні існуючої гранично допустимої концентрації по епіхлоргідрину (0,92±0,07 мг/м3) не викликала змін функціональних і морфометричних показників клітин сперматогенного ряду (згідно з традиційними методами оцінки стану сперматогенезу), проте пригнічувала процес диференціації сперматид, що свідчило про вибірковість дії зазначеної смоли на процеси сперматогенезу. Виявлене за допомогою розробленого нами методу порушення сперматогенезу, а саме, пригнічення диференціації сперматид, є провідною ознакою, яка повинна враховуватись при розробці заходів профілактики захворювань у працюючих з епоксидними сполуками, зокрема, при нормуванні цих хімічних речовин у повітрі робочої зони виробничих приміщень.

При дії різноспрямованих гравітаційних навантажень величиною 4g на самців білих щурів спостерігалось пригнічення сперматогенезу, морфологічними проявами якого було зниження числа нормальних сперматогоній на 25% у групі тварин з краніо-каудальним (p<0,05) і на 27% – з каудо-краніальним навантаженням (p<0,02); зниження індексу сперматогенезу на 4% у групі тварин з краніо-каудальним (p<0,02) і на 3% – з каудо-краніальним навантаженням (p<0,002); зменшення ПСДС на 12% у групі тварин з краніо-каудальним (p<0,01) та на 11% – з каудо-краніальним навантаженням (p<0,02).

Відмічені морфологічні зміни в клітинах сперматогенного ряду не супроводжувались порушенням функціонального стану сперматозоїдів.

Слід відмітити досить помітні зміни макрометричних показників репродуктивних органів щурів. Дія гіпергравітації в каудо-краніальному напрямку супроводжувалась зниженням маси та масових коефіцієнтів придатків сім’яників відповідно на 29% та на 18% (табл. 2). Маси сім’яних пухирців у цих тварин зменшилися в 2,6 разів та в 2,3 рази знижувались їхні масові коефіцієнти. У щурів з краніо-каудальними навантаженнями спостерігалися зміни макрометричних показників репродуктивних органів тієї ж направленості, (що і в каудо-краніальному напрямку), але меншого ступеня вираженості (див. табл. 2).

Інтегральна оцінка репродуктивної функції шляхом відтворення потомства самцями білих щурів, які піддавалися дії різноспрямованої гіпергравітації, свідчила про збереження статевого потягу в тварин обох дослідних груп – індекс плодючості не мав статистично значущих розбіжностей у порівнянні з контролем. В той же час у самців в умовах дії гіпергравітації в каудо-краніальному напрямку виявлене зменшення запліднюючої здатності сперматозоїдів: зниження індексу вагітності на 41% (контроль – 89,72±5,17; дослід – 52,78±14,47; p<0,05).

Таблиця 2

Макрометричні показники репродуктивних органів самців білих щурів, які піддавалися дії різноспрямованої гіпергравітації величиною 4g

Показники | Статис-тичний показ-ник | Групи тварин

контроль | краніо-каудальні навантаження | каудо-краніальні навантаження

Маса придатка сім’яника, г | M±m | 0,24±0,01 | 0,19±0,01 | 0,17±0,02

p | <0,01 | <0,01

Масовий коефіцієнт придатка сім’яника | M±m | 1,09±0,04 | 0,96±0,04 | 0,89±0,06

p | <0,05 | <0,02

Маса сім’яних пухирців, г | M±m | 0,56±0,05 | 0,27±0,06 | 0,22±0,03

p | <0,01 | <0,001

Масовий коефіцієнт сім’яних пухирців | M±m | 2,53±0,25 | 1,36±0,3 | 1,12±0,14

p | <0,01 | <0,001

Таким чином, в результаті вивчення впливу різноспрямованих гравітаційних навантажень величиною 4g у краніо-каудальному та каудо-краніальному напрямках на репродуктивну систему самців білих щурів встановлені наступні закономірності. Пригнічення сперматогенезу в сім’яниках, погіршення умов для дозрівання сперматозоїдів у придатках сім’яників та ураження сім’яних пухирців у вигляді зменшення маси та масових коефіцієнтів, що свідчило про зниження їхньої секреторної функції, більш виражене при дії гіпергравітації в каудо-краніальному напрямку, вкупі привели в цій групі тварин до зменшення запліднюючої здатності сперматозоїдів і зниження фертильності білих щурів.

Нами вперше у вітчизняній науці встановлено, що локальна дія електромагнітного поля надвисокої частоти (ЕМП НВЧ) низької інтенсивності на БАТ цзу-сань-лі білих щурів в умовах реальних режимів сеансного випромінювання, застосовуваних у лікувальній практиці, не порушувала репродуктивну функцію дорослих самців щурів, зокрема, морфо-функціональний стан сперматогенезу та процес відтворення. Відмічений повноцінний розвиток потомства, отриманого від спарювання попередньо опромінених самців з інтактними самицями, як у пренатальному, так і в постнатальному онтогенезі.

Мікрохвильова дія на самиць щурів на протязі 3-х естральних циклів (15 днів) до парування їх з інтактними самцями не спричиняла антенатальної загибелі їхніх потомків та істотно не впливала на показники фізичного розвитку і швидкість дозрівання сенсорно-рухових рефлексів у їхнього потомства в період годування (до 1 місяця). Морфо-функціональний стан сперматогенезу в цих потомків по досягненні ними двомісячного віку не відрізнявся від такого в контрольних тварин.

Опромінення ЕМП НВЧ вагітних самиць як в до-, так і в постімплантаційний період розвитку зародка не викликало збільшення антенатальної загибелі та уповільнення загального розвитку плоду, проте приводило до появи в двомісячних потомків самиць, опромінених на етапах активного органогенезу, блокування сперматогенезу в періоді дозрівання.

Електронномікроскопічне дослідження сім’яників та ендокринних органів (наднирників і гіпофізу), застосоване для розкриття суті процесів, що розвивалися в гонадах, вказувало на напруження структурних компонентів зазначених органів.

В першу чергу це стосувалося клітин пучкової та сітчастої зон наднирників, де точкою прикладання дії ЕМП НВЧ був енергетичний апарат клітин, в якому відмічалось як посилення функціональної активності за рахунок гіпертрофії мітохондрій та збільшення в них числа везикулярних крист, так і порушення утилізації синтезу гормонів мітохондріями та наявність мієліноподібних структур.

Електронномікроскопічне дослідження гонадотропів аденогіпофізу вказувало на характерний стан активації цих клітин, про що свідчила гіперплазія апарату Гольджі з формуванням багаточисленних структурних гранул, розвиток елементів гранулярної ендоплазматичної сітки та наявність значного числа вакуолярних утворень агранулярної ендоплазматичної сітки, іноді сягаючих великих розширень, гіпертрофія енергетичного апарату.

Вищеописані ультраструктурні зміни в наднирниках та гіпофізі були більш виражені в тій групі двомісячних потомків, які опромінювалися в 6-16 дні пренатального онтогенезу.

Більш виражені зміни в ендокринних органах щуренят, які локально опромінювалися в 6-16 дні пренатального онтогенезу, позначались і на функціонуванні сім’яників, зокрема, їхньої ендокринної та підтримувальної функції, що, в свою чергу, впливало на процес сперматогенезу. Так, наявність у цитоплазмі сустентоцитів мієліно-подібних утворень могла свідчити про активацію внутрішньоклітинного травлення, під час якого проходила утилізація загиблих у ході сперматогенезу клітин.

Екстраполюючи дані, отримані на експериментальних тваринах, на людину, можна висловити припущення, що вагітність є протипоказанням для застосування в лікувальній практиці локальної дії ЕМП НВЧ низької інтенсивності через БАТ цзу-сань-лі.

Результати дослідження були використані при впровадженні мікрохвильової резонансної терапії в клінічну практику.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягає у з’ясуванні загальних закономірностей перебігу процесу сперматогенезу в умовах дії хімічних (летючих компонентів епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф) і фізичних (різно-спрямованої гіпергравітації і локального опромінення електромагнітним полем надвисокої частоти низької інтенсивності) пошкоджуючих чинників навколишнього середовища, та обгрунтуванні морфо-функціональних показників для його оцінки.

1. Розроблений новий методичний підхід до вивчення сперматоге-незу, який дає можливість оцінювати ступінь порушення диференціації сперматид в динаміці шляхом кількісного порівняння сперматид в одиниці площі зрізу звивистих сім’яних канальців на VIа та IXа стадіях сперматогенезу, на протязі яких відбуваються важливі процеси формуван-ня зрілих статевих клітин. Створені алгоритм і програма для автоматизації морфометричної оцінки сперматогенезу можуть бути застосованими у роботі наукових та практичних гігієнічних лабораторій. Отриманий патент від 17.03.2000 на “Спосіб оцінки порушень сперматогенезу”.

2. Апробація розробленого методу на моделі пошкодження гонад білих щурів ацетатом свинцю в токсичній дозі – 0,05 мг/кг показала, що запропонований нами показник ступеня диференціації сперматид (ПСДС) знижувався з таким же високим ступенем достовірності (p<0,001), як і традиційні методи оцінки (індекс сперматогенезу – p<0,002; число нормальних сперматогоній – p<0,001; число канальців зі злущеними сперматогенними клітинами – p<0,001).

При зниженні дози ацетату свинцю з токсичної до недіючої за загальнотоксичними показниками – 0,0015 мг/кг змін морфо-функціонального стану сперматогенезу згідно з традиційними методами оцінки виявлено не було, проте за допомогою запропонованого нами методичного підходу відмічене порушення диференціації сперматид з ймовірністю похибки p<0,05.

Корекція люпином (Lupinus albus) пошкоджених при свинцевій ін-токсикації гонад приводила до відновлення їхньої гістологічної структури та морфо-функціонального стану сперматогенезу, на що з високим ступенем достовірності вказували результати оцінки як традиційними методами (індекс сперматогенезу – p<0,001; число нормальних сперматогоній – p<0,001; число канальців зі злущеними сперматогенними клітинами – p<0,001), так і розробленим нами (ПСДС – p<0,001).

3. Інгаляційна дія епоксиднодіанової смоли ЕД-22ф протягом чотирьох місяців на рівні існуючої гранично допустимої концентрації по епіхлоргідрину (0,92±0,07 мг/м3) не змінювала функціональних і морфологічних показників клітин сперматогенного ряду (згідно з традиційними методами оцінки сперматогенезу). При застосуванні розробленого нами методу встановлена виражена тенденція до зниження ПСДС після 2-х міс. (t=2,12; p>0,05) і достовірне зниження показника після 4-х міс. інгаляції (t=2,83; p<0,02), що свідчить про вибірковість дії зазначеної смоли на процеси сперматогенезу. Виявлені нами порушення сперматогенезу, зокрема, пригнічення процесу диференціації сперматид, є провідною ознакою при розробці заходів профілактики захворювань у працюючих з епоксидними сполуками.

4. При дії різноспрямованих гравітаційних навантажень величиною 4g (в краніо-каудальному та каудо-краніальному напрямках) на самців білих щурів спостерігалося пригнічення сперматогенезу, морфологічними проявами якого було порушення постмейотичного розвитку сперматозоїдів, зниження індексу сперматогенезу та зменшення числа сперматогоній у сім’яних канальцях. Пригнічення сперматогенезу в сім’яниках, погіршення умов для дозрівання сперматозоїдів у придатках сім’яників і зниження секреторної функції сім’яних пухирців, більш виражене при дії гіпергравітації в каудо-краніальному напрямку, вкупі привели в цій групі тварин до зменшення запліднюючої здатності сперматозоїдів на 41% (p<0,05) та зниження фертильності білих щурів.

5. Локальна дія електромагнітного поля надвисокої частоти (ЕМП НВЧ) низької інтенсивності на біологічно активну точку (БАТ) цзу-сань-лі білих щурів в умовах реальних режимів сеансного випромінювання, застосовуваних в лікувальній практиці (частота випромінювання 59 ГГц, густина потоку енергії на виході хвилевода 1 мВт/см2, експозиція 15 хв.), не порушувала репродуктивну функцію самців білих щурів, зокрема, не знижувала ПСДС (p>0,05), та не заважала повноцінному розвитку потомства, отриманого від спарювання їх з інтактними самицями.

6. Локальне опромінення самиць щурів ЕМП НВЧ на протязі 3-х естральних циклів до спарювання їх з інтактними самцями не впливало на антенатальний і ранній постнатальний онтогенез їхнього потомства та не змінювало морфо-функціональний стан сперматогенезу в потомків чоловічої статі по досягненні ними статевої зрілості, який характеризували за допомогою традиційних методів оцінки та розробленого нами методичного підходу.

7. Опромінення ЕМП НВЧ вагітних самиць як в до-, так і в постімплантаційний період розвитку зародка не викликало збільшення антенатальної загибелі та уповільнення загального розвитку плоду, проте приводило до появи в двомісячних потомків самиць, опромінених в 6-16 дні вагітності, блокування сперматогенезу в періоді дозрівання, а також напруження функціональної активності гландулоцитів та сустентоцитів сім’яників.

У потомків білих щурів чоловічої статі, частина пренатального онтогенезу яких (1-6 та 6-16 дні) проходила в умовах дії ЕМП НВЧ, виявлені структурні перебудови в аденогіпофізі та наднирниках, котрі свідчили про підвищення функціональної активності цих ендокринних органів. Найбільш виражені ці явища в потомків самиць, опромінених в пізні строки вагітності. Отримані дані свідчать про те, що застосування в лікувальній практиці ЕМП НВЧ протипоказано при вагітності.

8. На основі вивчення гонадотропної дії чинників хімічної та фізичної природи встановлена висока чутливість розробленого методичного підходу в порівнянні з відомими методами оцінки сперматогенезу, що дає змогу виявляти мінімальні (порогові) рівні дії пошкоджуючих агентів, при яких традиційні методи не чутливі. Результати роботи є теоретичною основою для розробки профілактичних заходів, спрямованих на запобігання можливого несприятливого впливу хімічних та фізичних чинників на організм людини.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Яценко В.П., Анисимова И.Г., Запривода Л.П. Новый метод морфометрического исследования закономерностей сперматогенеза // Вісник морфології. - 1999. - №2. – С. 224-226. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, вибрані зручні для ідентифікації стадії сперматогенезу, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних і написання роботи).

2. Запривода Л.П. Сравнительная характеристика морфологических методов оценки гонадотоксического эффекта химических веществ // Вісник морфології. - 2001. - №1. – С. 53-56.

3. Яценко В.П., Анісімова І.Г., Запривода Л.П. Морфо-функціональний стан процесів сперматогенезу білих щурів в умовах дії гіпергравітації // Український медичний альманах. - 2002. - №4. – С. 168-171. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних і написання роботи).

4. Пат. №35451А UA, МПК 6 G01 №33/48. Спосіб оцінки порушень сперматогенезу / Яценко В.П., Анісімова І.Г., Запривода Л.П.; НМУ імені О.О. Богомольця. - №99105629; Заявл. 14.10.1999; Опубл. 15.03.2001 // Промислова власність. - 2001. - №2. – С. 1.105. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, вибрані зручні для ідентифікації стадії сперматогенезу, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання роботи).

5. Яценко В.П., Анисимова И.Г., Запривода Л.П., Блонская Л.Ф. Экспериментальные исследования влияния микроволн КВЧ диапазона на генеративную функцию // Тез. докл. 1 Междунар. симпоз. “Гигиена физических факторов окружающей и производственной среды”. - Киев, 1993. – С. 55. (Автором проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних).

6. Яценко В.П., Запривода Л.П., Анісімова І.Г., Андрієнко Т.В., Блонська Л.Ф. Морфологічні особливості сперматогенезу потомства білих щурів при дії на вагітних самок міліметрового електромагнітного випромінювання // Тез. доп. V конгр. патологоанатомів України “Екологічна та інфекційна патологія: Сучасні патологоанатомічні аспекти”. - Чернігів, 1993. - С. 159. (Автором проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз результатів).

7. Запривода Л.П. Особливості сперматогенезу щурів при дії епоксидної смоли ЕД-22ф // Наукові записки з питань медицини, біології, хімії, аграрії та сучасних технологій навчання. Щорічник. Вип. 1. - Київ, 1997. - Частина I. – С. 213-214.

8. Анисимова И.Г., Яценко В.П., Запривода Л.П. Влияние микроволн крайне высокой частоты на развитие внутриутробного плода и потомства // Мат. конф. та тез. доп. “Проблеми екології та медицини”. - 1998. - №3-4. – С. 93-94. (Автором проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних).

9. Анисимова И.Г., Яценко В.П., Запривода Л.П. Морфологические особенности сперматогенеза белых крыс при интоксикации свинцом и коррекции люпином // Фахове видання наук. пр. Національного конгресу анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України “Актуальні питання морфології”. - Луганськ, 1998. – С. 14. (Автором проведені експе-ри-мент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних).

10. Яценко В.П., Запривода Л.П., Рева С.М. Алгоритмічне та програмне забезпечення досліджень сперматогенезу в токсикологічному експерименті // Мат. доп. II наук.-практ. конф. “Актуальні проблеми експериментальної медицини”. - Київ, 1998. – С. 107-108. (Автором проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних).

11. Анисимова И.Г., Запривода Л.П. Морфо-функциональные исследования гонадотоксического действия эпоксидной смолы ЭД-22ф // Мат. доп. II наук.-практ. конф. “Актуальні проблеми експериментальної медицини”. - Київ, 1998. – С. 73-74. (Автором проведені