Академія медичних наук України

Інститут гігієни та медичної екології імені О.М. Марзеєва

Акопян Гаяне Рубенівна

УДК: 576.312.35/381:616-056.7-053.2

ЦЕНТРОМЕРНА НЕСТАБІЛЬНІСТЬ ТА ПОЛІМОРФІЗМ ХРОМОСОМ

В НОРМІ І ПРИ ПАТОЛОГІЇ ЛЮДИНИ

03.00.15 – генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті спадкової патології АМН України (м.Львів)

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор

Гнатейко Олег Зіновійович,

Інститут спадкової патології АМН України, директор

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Пілінська Марія Андріївна,

Інститут експериментальної радіології

Наукового Центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії цитогенетики відділу медичної генетики

доктор медичних наук, професор

Гордієнко Ірина Юріївна,

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, завідувач відділення медицини плода

доктор медичних наук, професор Бажора Юрій Іванович,

Одеський державний медичний університет,

завідувач кафедри клінічної імунології,

генетики та медичної біології

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, кафедра медичної генетики

Захист дисертації відбудеться 17 травня 2006 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.02 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50

Автореферат розісланий 14 квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Омельченко Е.М.

Актуальність теми. Збереження стабільності геному є обов’язковою умовою повноцінного розвитку організму, а його дестабілізація асоціюється з формуванням патологічного фенотипу, високим ризиком апоптичної загибелі клітин або їх вступом на шлях онкогенної трансформації (J.H.J. Hoeijmakers, 2001). Локальна дезорганізація хроматину в центромерних і перицентромерних ділянках хромосом загрожує дисфункцією центромерного білкового комплексу і асоціюється з високим ризиком аномального перебігу мітозу. Ознаки центромерної хромосомної нестабільності (ламкість, міжхромосомні перебудови, передчасне розділення центромер) знаходять у пацієнтів із спадковою патологією та в пухлинних клітинах і розглядають як вірогідний ефект генотоксичних впливів (J. Major et al., 1999; L.H. Yih et al., 2003; J.B. Mailhes et al., 2003; K. Prabhakara, R. Ramadevi, 2004; K. Mehes et al., 2004).

Індукцію центромерної нестабільності пов’язують із структурно-функціональними особливостями конститутивного або С-гетерохроматину, який формує центромерні і прицентромерні ділянки хромосом. Саме завдяки специфічній структурній організації С-гетерохроматину та його здатності до епігеномних модифікацій забезпечується локальне формування комплексу центромерних білків, задіяних у процесах мітотичного поділу (N. Dillon, R. Festenstein, 2002; P. Bernard, R. Allshire, 2002; M.G. Mattei, J. Luciani, 2003). Вміст макросателітних ДНК у складі С-гетерохроматину відзначається суттєвою міжхромосомною та міжособовою варіабельністю і проявляється явищем С-поліморфізму хромосом 1, 9, 13—16, 21, 22 та Y (K.W. Jones, G.1971; A.P. Craig-Holmes, M.W. Shaw, 1971). В численних дослідженнях зроблено спроби пов’язати явище С-поліморфізму з формуванням патологічного фенотипу у людини, проте й надалі відсутні обґрунтовані рекомендації щодо його врахування в практиці медико-генетичного консультування. Відсутня концепція, яка могла б пояснити причини частого виявлення носіїв екстремальних С-поліморфних варіантів серед пацієнтів медико-генетичних консультацій та обґрунтувати зв’язок даного явища з аномальним розділенням хромосом і формуванням анеуплоїдних клітин, що складає важливу медико-соціальну проблему.

Найбільш вірогідним механізмом втрати хромосом та формування гіподиплоїдної анеуплодії вважається передчасне розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ) (P.H. Fitzgerald, 1975). Вагомі докази порушення плоїдності мітотичних клітин внаслідок центромерної дисфункції отримано в роботах останніх років, присвячених дослідженню цитологічних ефектів інактивації центромерних білків (V.L. Johnson et al., 2004; L. Michel et al., 2004; T.S. Kitajima et al., 2005; B.E. McGuinness et al., 2005). В переважній більшості згаданих робіт цитогенетичний аналіз не проводився, а його застосування для дослідження секурин-дефіцитних клітин дозволило виявити достовірну індукцію ПРЦ та анеуплоїдії в популяції мітотичних клітин (Z. Wang et al., 2001).

Поряд із значним поступом у розшифровці молекулярних основ аномального перебігу мітозу, цитогенетичні ознаки центромерної дисфункції вивчені недостатньо і не враховуються в практиці медико-генетичних досліджень. Виконані роботи характеризуються суперечливістю у визначенні феноменології ПРЦ, різнорідністю за методами його реєстрації, обмеженістю обсягу досліджених випадків. Відсутня інформація про рівень спонтанної індукції ПРЦ в різних тканинах та на різних етапах нормального онтогенезу людини, що не дозволяє об’єктивно охарактеризувати його параметри при патологічних станах. Немає концепції, яка б обґрунтувала закономірності виникнення ПРЦ та його функціональну роль в реалізації життєвого циклу клітини з урахуванням результатів сучасних досліджень центромерних білків та конститутивного гетерохроматину. Все вище викладене створило потребу проведення цілеспрямованого дослідження центромерної хромосомної нестабільності, яке б дозволило визначити закономірності індукції ПРЦ в нормі і при патології людини, охарактеризувати зв’язок даного явища з маніфестацією інших ознак хромосомної нестабільності і фенотипом конститутивного гетерохроматину та обгрунтувати доцільність його врахування в практиці медико-генетичних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в межах наукових комплексних тем Інституту спадкової патології АМН України: “Дослідження ендогенного впливу гормонів щитовидної залози, особливостей імунного та хромосомного статусу на виникнення анеуплоїдій в потомстві людини” (№ держреєстрації 0195U023204); “Проспективне визначення інформативних маркерів в геномі сімей з анеуплоїдним потомством для оптимізації підходів до пренатальної діагностики” (№ держреєстрації 0198U002189), “Проспективне спостереження за частотою та спектром поширеної спадкової патології серед дітей Західного регіону України в умовах масового та селективного скринінгу” (№ держреєстрації 0199U001345), “Дослідження інформативних генетичних маркерів людини в системі преконцепційної профілактики спадкової патології та соматичного мутагенезу” (№ держреєстрації 0101U001297, “Геногеографічні дослідження поширеної моногенної патології (фенілкетонурія, муковісцидоз, спільна м’язова атрофія, м’язова дистрофія Дюшена) у Західному регіоні України” (№ держреєстрації 0102U001773, “Дослідження ролі генетичних чинників в реалізації схильності до анеуплоїдної патології та захворювань хромосомної ламкості” (№ держреєстрації 0104U010088).

Мета роботи: Дослідити закономірності маніфестації явища центромерної нестабільності в мітотичних клітинах людини та визначити інформативність його використання в практиці медико-генетичних досліджень.

Задачі дослідження:

1. Розробити алгоритм оцінки та охарактеризувати прояви центромерної нестабільності в короткочасній культурі клітин в умовах нормального пренатального і постнатального розвитку людини.

2. Дослідити основні характеристики С-поліморфізму хромосом в умовах нормального пренатального і постнатального розвитку людини.

3. Визначити прояви центромерної нестабільності та С-поліморфізму хромосом при поширених патологічних станах у людини.

4. Охарактеризувати функціонально-асоціативні зв’язки між маніфестацією центромерної нестабільності та достовірних ознак хромосомної нестабільності в мітотичних клітинах людини.

5. Обгрунтувати доцільність та розробити конкретні практичні рекомендації щодо врахування ознак центромерної нестабільності в практиці медико-генетичних досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сформовано концепцію про передчасне розділення центромер (ПРЦ) сестринських хроматид як закономірний прояв індукованої нестабільності геному проліферуючих клітин. Вперше розроблено алгоритм об’єктивної оцінки ПРЦ та охарактеризовано фенотип і спонтанний рівень даного явища в різних тканинах та на різних етапах нормального онтогенезу людини. В серії порівняльних досліджень в нормі та при різноманітних патологічних станах у людини вперше доведено, що індукція ПРЦ — це закономірна реакція геному у відповідь на екзогенне або ендогенне пошкодження ДНК та вірогідний елемент генетичних програм, пов’язаних з процесами тканинної диференціації, онкогенної трансформації та клітинної загибелі. Вперше встановлено, що індукція часткового ПРЦ маніфестує послідовно з індукцією хромосомних аберацій і є вірогідним наслідком генотоксичного впливу, а його виникнення загрожує клітині втратою хромосом, формуванням анеуплоїдії та підвищеним ризиком онкогенної трансформації. Вперше розроблено та частково обґрунтовано концепцію, що індукція повного ПРЦ в культурі соматичних клітин є свідченням вродженого або набутого дефекту G2 checkpoint і загрожує клітині передчасною загибеллю або ендоредуплікацією за відсутності експресії p53 дикого типу.

Вперше сформовано концепцію про неконститутивну природу значної частки екстраваріантів С-поліморфізму, що реєструються в практиці медико-генетичних досліджень. У розвиток даної концепції вперше постульовано і доведено, що фенокопії макроваріантів і часткових перицентричних інверсій утворюються внаслідок перманентної деконденсації прицентромерного гетерохроматину у відповідь на зміни клітинного метаболізму та (або) гормональної регуляції, які супроводжують процеси клітинної диференціації, реалізацію адаптативно-стресових реакцій та розгортання патологічного процесу. Вперше запропоновано розцінювати факти реєстрації 2-х і більше макроваріантів С-поліморфізму та часткових перицентричних інверсій як вірогідні ознаки індукованої хромосомної нестабільності. Вперше висловлено гіпотезу, що потенційно негативний вплив носійства мікроваріантів та повних перицентричних інверсій 9-ої хромосоми реалізується через дисфункцію адаптативно-стресових реакцій в клітині внаслідок неспроможності невеликих ділянок С-гетерохроматину ефективно зв’язуватись з фактором термального шоку HSF1 (Heat Shock Factor I). Вперше постульовано роль конститутивного гетерохроматину хромосом 1-ої пари в нормальній реалізації програми spindle checkpoint та збереженні диплоїдного набору соматичних клітин. При цьому, індукція хромосомних перебудов 1-ої хромосоми із втратою балансу прицентромерного гетерохроматину розглядається як пусковий елемент анеуплоїдизації клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено алгоритм оцінки центромерної хромосомної нестабільності соматичних клітин, який відзначився високою інформативністю в діагностиці та прогнозуванні синдромів хромосомної нестабільності, поширених гемобластозів дітей і дорослих та екологічно детермінованому захворюванні, обумовленому впливом фтору і солей важких металів. Запропоновано враховувати рівень індукції центромерної хромосомної нестабільності в практиці цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів та для прогнозування онкогенетичної трансформації клітин.

В практику медико-генетичного консультування населення України вперше впроваджено алгоритм цитогенетичної та молекулярно-генетичної діагностики синдромів Ніймеген (NBS) та атаксії-телеангіектазії, що дозволило встановити значну поширеність NBS у Львівській області, виявити перші випадки в Івано-Франківської, Волинської, Тернопільської, Рівненській та Запорізькій областях та обґрунтувати доцільність впровадження його селективного скринінгу в усіх регіонах країни.

Сформовано реєстр сімей високого ризику щодо відтворення синдромів хромосомної нестабільності, який дозволяє ефективно спостерігати за репродуктивною функцією в родинах, своєчасно здійснювати заходи пренатальної діагностики, запобігати впливу іонізуючого випромінювання на гомозиготних і гетерозиготних носіїв мутацій, проводити лікувальну корекцію вродженого комбінованого імунодефіциту та профілактику онкологічної патології.

В практиці медико-генетичного консультування пропонується враховувати носійство повної перицентричної інверсії 9-ої хромосоми (9ph+) та високої делеції довгого плеча Y-хромосоми (Yq12-) як фактори ризику порушень статевої диференціації, фертильності та формування анеуплоїдних гамет в осіб чоловічої статі. Факти поєднання в каріотипі двох і більше великих гетерохроматинових районів та часткових перицентричних інверсій разом із ознаками хромосомної нестабільності вказують на високу ймовірність реєстрації фенокопій С-поліморфних варіантів, індукція яких відбулася внаслідок змін гомеостазу соматичних клітин.

Отримані результати склали основу нововведень та інформаційних листів: “Комплексна система заходів ефективного формування груп ризику сімей по народженню анеуплоїдного потомства” (МОЗ України, Реєстр галузевих нововведень, випуск 8—9, К., 1998, стор. ; №130/9/8), “Алгоритм ефективної профілактики природжених вад розвитку у дітей” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 15, К., 2002, стор. ; №271-2003), “Порядок селективного скринінгу синдрому хромосомної ламкості Ніймегена” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 15, К., 2002, стор. ; №274-2003), “Спосіб діагностики аномального розділення центромер метафазних хромосом” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 15, К., 2002, стор. 69; №275-2003), “Профілактика природженої та спадкової патології плоду у жінок з порушеним репродуктивним анамнезом” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 19, К., 2004, стор. 69; №77-2005), “Спосіб цитогенетичної діагностики синдрому Ніймеген та атаксії-телеангіектазії” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 20, К., 2005, стор. 126). Використані в роботі удосконалені методи пренатальної діагностики хромосомної патології оформлені та видані у вигляді деклараційного патенту на винахід “Спосіб отримання препаратів метафазних хромосом із культури амніоцитів” (Деклараційний патент на винахід UA58404А.— Бюл. №7, 2003). Результати роботи впроваджені у Львівському міжобласному медико-генетичному центрі, Харківському спеціалізованому медико-генетичному центрі, Донецькому спеціалізованому медико-генетичному центрі та міжобласному центрі медичної генетики і пренатальної діагностики м. Кривий Ріг.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто опрацювала новий підхід до вивчення явища центромерної нестабільності, розробила алгоритм його оцінки, особисто приймала участь у проведенні клінічних і цитогенетичних досліджень, здійснила узагальнення отриманих результатів. Автор особисто сформулювала власні наукові концепції і практичні рекомендації. Робота виконана в межах комплексних науково-дослідних робіт, керівником та відповідальним виконавцем яких був здобувач. Співучасть співробітників Інституту та інших установ у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на II з’їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), XVIII міжнародному конгресі з аналітичної цитології (Ріміні, Італія, 1996), XVI Європейському конгресі з гематології та імунології (Тессалоніки, Греція), II конференції Європейської цитогенетичної асоціації (Відень, Австрія, 1999), міжнародній конференції “Placentologic monitoring studies and ecotoxicologic aspects of genetic diseases” (Краків, Польща, 2000), NATO Advanced Research Workshop “Endocrine Disrupters and Carcinogenetic Risk Assessment” (Бялисток, Польща, 2001), III науково-практичної конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2002), ІІІ з’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), I конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові хвороби” (Харків, 2003), Всеросійській науково-практичній конференції “Современные достижения клинической генетики” (Москва, 2003), Республіканській науково-практичній конференції “Профілактика вроджених вад розвитку і спадкової патології” (Київ, 2004), Республіканській науково-практичній конференції “Сучасні лабораторні методи дослідження спадкової патології” (Київ, 2004), II конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові хвороби” (Харків, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 55 робіт, з них: у провідних фахових журналах і збірниках — 30, у матеріалах з’їздів, симпозіумів та конференцій — 25, отримано 1 деклараційний патент на винахід та видано 5 інформаційних листів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 278 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, шести глав власних досліджень, узагальнення, висновків, практичних рекомендацій та переліку використаних джерел. Текст дисертації ілюстрований 59 таблицями та 47 рисунками, містить 7 додатків. Перелік використаних джерел складає 762 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Обсяг досліджень. Основний контингент для досліджень склали пацієнти Львівського міжобласного медико-генетичного центру (ЛММГЦ) та Львівської дитячої спеціалізованої клінічної лікарні (ЛДСКЛ). Досліджено 874 особи та 163 зразки пренатального матеріалу. Зроблено 937 цитогенетичних, 99 молекулярно-генетичних та 131 досліджень апоптозу.

Цитогенетичні дослідження здійснено у 812 випадках дослідної та 125 — контрольної групи. До складу контрольної групи увійшли 30 дорослих волонтерів, 60 новонароджених дітей та 35 дітей віком 3—14 років, які проходили обстеження в ЛДСКЛ. Контингент постнатальних досліджень (681) склали 84 випадки синдромів хромосомних анеуплодій (трисомія-21, Х-моносомія, синдром Клайнфельтера), 32 — синдромів хромосомної нестабільності (СХН), 98 — гемобластозів у дітей, 24 — гемобластозів дорослих; 19 — хронічних захворювань інфекційно-токсичного генезу у дітей, 42 — дітей з регіону, забрудненого солями важких металів та фтору (м. Соснівка Львівської області); 10 — дітей із зони радіаційного контролю (м. Коростень Житомирської області); 91 – порушень менструальної функції з нормальним каріотипом; 33 — випадків первинної аменореї з ознаками чоловічого псевдогермафродитизму (каріотип 46,XY); 39 — порушень статевого розвитку та сперматогенезу у чоловіків в асоціації з нормальним каріотипом; 108 — членів подружніх пар з невиношуванням вагітності в анамнезі; 101 — батьків пацієнтів. Поряд з цим досліджено 131 зразок пренатального матеріалу: 62 — цитотрофобласту хоріону і гемопоетичних ембріональних печінкових клітин (ГЕПК) від артифіціальних абортусів (7—11 тижнів гестації) та 69 — цитотрофобласту плаценти і клітин амніотичної рідини в матеріалі інвазивної пренатальної діагностики стану плоду (18—24 тижні).

Рівень індукції апоптозу досліджено у 35 дорослих волонтерів (контрольна група), 13 хворих на гемобластози дитячого віку, 39 дітей з екологічно несприятливого регіону (м. Соснівка Львівської області), 10 пацієнтів з СХН, а також у 32 зразках ГЕПК людини. Імуногістохімічні дослідження експресії білків P53 та Bcl-2 проводили у 10 зразках ембріональної печінки та 11 — ворсин хоріону. Молекулярно-генетичні дослідження здійснено у 54 випадках NBS-подібного фенотипу, у 2 плодів з високим ризиком NBS, 9 випадках вірогідної атаксії-телеангіектазії, 14 батьків дітей з СХН, а також у 20 пацієнтів чоловічої і жіночої статі з порушеннями статевої диференціації.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводили на клітинах крові, кісткового мозку, ГЕПК, хоріону, плаценти та амніотичної рідини людини, культивованих ex vivo або in vitro.

Культивування лімфоцитів периферичної крові та отримання препаратів метафазних хромосом проводили за стандартним методом D.A.(1965). При виготовленні препаратів хромосом з культивованих клітин кісткового мозку та крові хворих на гемобластози враховували рекомендації B.та B.H.(1992). Препарати хромосом гемопоетичних ембріональних печінкових клітин отримували з матеріалу ембріональної печінки артифіціальних абортусів після 2-годинного культивування в присутності колхіцину (ex vivo) за методикою О.О. Созанського із співавторами (1989). Отримання препаратів метафазних хромосом з клітин плаценти та ворсин хоріону ex vivo проводили за методом G.(1983). Для культивування клітин амніотичної рідини використовували метод Д.В. Заставної (2003). Виготовлення препаратів хромосом з амніоцитів проводили за методом, розробленим Н.Л. Гулеюк і за нашої участі (2003), новизна якого засвідчена патентом на винахід.

Рівномірно забарвлені препарати хромосом з використанням 4% розчину барвника Гімза (“Merck”, Німеччина) застосовували для реєстрації хромосомних аберацій, передчасного розділення центромер (ПРЦ) та для аналізу плоїдності клітин. Дослідження структурної організації хромосом проводили з використанням G-забарвлення препаратів хромосом 2% розчином барвника Гімза за методом M.A.(1971) у власній модифікації. Структурно-функціональну організацію центромерних ділянок хромосом оцінювали на C-забарвлених препаратах хромосом (A.T. Sumner, 1972).

Візуальний хромосомний аналіз проводили при збільшенні х 1000 на мікроскопах “Axioplan” (Німеччина) та “Nikon” (Японія) з фотографуванням препаратів хромосом. При аналізі 100 метафазних пластинок (м.п.) реєстрували кількісні та структурні аномалії хромосом, факти анеуплоїдії, поліплоїдії та передчасного розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ). Для визначення структурних перебудов застосовували Міжнародну номенклатуру ISCN—1995. При аналізі хромосомних аберацій враховували всі аберації хромосомного та хроматидного типів, за винятком пробілів. Дослідження явища ПРЦ проводили на основі алгоритму, вперше запропонованого і впровадженого у даному дослідженні. Оцінку С-поліморфних варіантів хромосом 1, 9, 16, 13—15, 21, 22 та Y проводили за 5-бальною напівкількісною системою, розробленою в Інституті медичної генетики РАМН (1981), та із застосуванням методики кількісного аналізу, розробленої при виконанні кандидатської дисертаційної роботи (Г.Р. Акопян, 1988).

Молекулярно-генетичні дослідження проводили з використанням ДНК лейкоцитів периферичної крові, виділеної методом ферментативного розщеплення та подальшої фенольної екстракції (Т. Маниатис, 1988; G.D.1999). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на термоциклерах “АМП-4” (м. Новосибірськ, РФ), “Perkin Elmer” 4800 nf 2400 (“Cetus”, США), “AMPLY-4” (ф-ма “Биоком”, м. Москва, РФ). Реактиви виробництва “MBI Fermentas” (Литва), олігонуклеотидні праймери синтезовані в Інституті біоорганічної хімії РАН (м. Москва, РФ). Молекулярно-генетичний аналіз мутації 657del5 гена NBS1, асоційованого з синдромом Ніймеген (NBS), проводили за методом R.із співавторами (1998) на основі ПЛР з використанням олігонуклеотидних послідовностей, що фланкують сайт виникнення делеції. Фрагменти розділяли в 8% поліакриламідному гелі. Для верифікації мутації 657del5 гена NBS1 зразки було секвеновано на автоматичному секвенаторі ABI PRIZM 310 з використанням флюоресцентно мічених ddNTP3 згідно технології BigDyeTM (“Applied Biosystems”). За методом M. Telatar із співавторами (1998) проводили дослідження 7 типових мутацій гена ATM, асоційованих з атаксією-телеангіектазією (А-Т): IVS53-2AC (codon 2544del 159nt екзону 54), 6095GA (codon 2003 екзону 43), 7010 del GT (codon 2337 екзону 50), 5932GT (codon 1973del88nt екзону 42), 3214GT (codon 1026del207nt екзону 24), 3245 ATCTGAT (codon 1081 екзону 24), 7636del9nt (codon 2546 екзону 54). Ефективність ПЛР перевіряли шляхом гель електрофорезу в 3% агарозному гелі з наступною візуалізацією бромистим етидієм.

Проточноцитометричні дослідження апоптозу проводили у відділі клінічної імунології Інституту онкології АМН України та у клінічній лабораторії ЛДСКЛ з використанням приладів FACScan (“Becton Dickinson, USA), обладнаних аргоновим лазером з довжиною хвилі 488 нм та програмним забезпеченням CellQuest для комп’ютерів Мас. Клітини забарвлювали пропідієм йодидом, а для вимірювання його флюоресценції застосовували вузькосмуговий фільтр 585/42 нм. Реєстрацію клітин з апоптотичною втратою ДНК проводили шляхом кількісного аналізу гіподиплоїдної зони гістограми (“sub-G1-peak”) за методом I.із співавторами (1991). Показники питомого вмісту клітин з різною кількістю ДНК в основних фазах мітотичного циклу (G1/0, S, G2+М) обробляли з використанням програми Mod Fit LT 2.0 (BDIS, USA).

Дослідження апоптозу шляхом люмінесцентної мікроскопії препаратів клітин, прижиттєво забарвлених акридином оранжевим, проводили у відділенні регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України за методом Н.В. Крищишина та М.Д. Луцика (1978) у власній модифікації. Препарати клітин аналізували з використанням люмінесцентного мікроскопу ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, м. Санкт-Петербург, Росія) при збільшенні х 500 в області збудження 360—440 нм та емісії 480—700 нм. Аналізували по 300 клітин випадково знайдених під мікроскопом з фотографуванням препаратів на кольорову фотоплівку Fuji 100. Факт життєздатності або апоптичної загибелі клітин встановлювали в залежності від характеру люмінесценції з врахуванням рекомендацій K.із співавторами (2001).

Реєстрацію цитологічних ознак апоптозу проводили за методом B.C.та J. Keesey (1995) на стандартно зафіксованих мазках крові та препаратах метафазних хромосом, забарвлених 4% барвником Гімза при збільшенні х 1000. При аналізі 150—200 клітин у кожному зразку проводили вибіркову реєстрацію клітин з виразною фрагментацією ядра та відшаруванням апоптичних тілець. Інші ознаки апоптичної морфології клітин не враховували.

Імуногістохімічні дослідження проводили в інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького з використанням моноклональних антитіл (DAKO, Данія). По завершенні імуногістохімічної реакції, зрізи тканин фарбували гематоксиліном, укладали в бальзам та досліджували у світловому мікроскопі при збільшенні х 400. При аналізі 200 клітин проводили напівкількісну реєстрацію інтенсивності сигналу із визначенням особливостей його локалізації.

Статистична обробка результатів дослідження проводилась за допомогою пакету програм “Statistica 5” та Microsoft Excel — 2000. Достовірність різниці середніх значень показників в досліді і контролі, а також значимість коефіцієнтів лінійної регресії і кореляції оцінювали при 95%-й ймовірності і вище. Застосовували критерій Пірсона ч2 у випадках доведеного нормального характеру розподілу вибірок, а також метод непараметричної статистики (U-тест Mанна-Уітні) для порівняльного аналізу рядів з незалежним розподілом вибірок при 95%-й ймовірності і вище.

Результати досліджень та їх обговорення.

Фенотип та рівень спонтанної індукції центромерної хромосомної нестабільності в культивованих соматичних клітинах людини

Нами встановлено, що на препаратах хромосом, виготовлених із застосуванням колхіцину з короткочасних культур крові, кісткового мозку, цитотрофобласту, амніоцитів та ГЕПК, зустрічаються клітини з передчасним розділенням різної кількості хромосом із середньометафазним ступенем конденсації (рис. ). Фенотип часткового ПРЦ відзначається передчасним розділенням від 1 до 20 хромосом каріотипу і проявляється паралельним розташуванням сестринських хроматид, що у випадках невеликих хромосом створює фенокопію парного фрагменту (рис. а). Цитогенетичний фенотип повного ПРЦ представлений передчасним розділенням 23—46 хромосом каріотипу і характеризується непаралельним взаєморозташуванням сестринських хроматид, коли відстань між центромерами є меншою ніж між хромосомними плечами (рис. б). Фенотип повного ПРЦ не відзначається ознаками пуфінгу або “розщеплення” центромер.

В даному дослідженні охарактеризовано рівень спонтанної індукції повного і часткового ПРЦ в різних тканинах та на різних стадіях нормального і патологічного розвитку людини (табл. ). Встановлено низький рівень повного ПРЦ в культивованих лімфоцитах пуповинної і периферичної венозної крові та в клітинах кісткового мозку практично здорових дітей і дорослих (0,06—0,7 на 100 м.п. відповідно). Часткове ПРЦ виявилось більш поширеним явищем і реєструвалось практично в усіх досліджених культурах крові та кісткового мозку здорових осіб з індивідуальними коливаннями 1—4 на 100 м.п. Рівень спонтанної індукції часткового ПРЦ не відрізнявся в культурах крові і кісткового мозку осіб дитячого віку і був вищий в лімфоцитах in vitro жінок репродуктивного віку (1,6±0,2 та 3,0±0,6 на 100 м.п. відповідно). Характерною рисою часткового ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку здорових осіб було передчасне розділення не більше 2 хромосом каріотипу з вибірковим залученням хромосом групи C (6, Х, 11, 12) та групи Е (18).

В пренатальний період нормального розвитку людини зареєстровано достовірну індукцію повного ПРЦ в гемопоетичних ембріональних печінкових клітинах (ГЕПК), цитотрофобласті хоріону і амніоцитах порівняно з клітинами крові і кісткового мозку постнатально обстежених осіб: 2,1—14,9 та 0,04—0,7 на 100 м.п. відповідно (P<0,001) (табл. ). Найвищі показники індукції повного ПРЦ спостерігались в ГЕПК (14,9±2,2 на 100 м.п.), найнижчі — в амніоцитах (2,1±0,5 на 100 м.п.) і проміжні — в клітинах цитотрофобласту хоріону (7,4±1,7 на 100 м.п.). Отримані нами дані щодо значної індукції повного ПРЦ в ГЕПК ex vivo в 7—12 тижнів гестації людини узгоджуються з результатами попередніх досліджень (О.О. Созанський із співавт., 1987; О.М. Яворовська, 1992; М.Р. Лозинська, 1995). Рівень часткового ПРЦ виявився практично однаковий у зразках пренатального матеріалу і незначно перевищував параметри постнатальних тканин (3,1—4,4 та 1,4—1,6 на 100 м.п. відповідно) (табл. 1).

Таблиця 1

Частота реєстрації клітин з передчасним розділенням центромер (ПРЦ) в культурах соматичних клітин в нормі і при патології людини (на 100 м.п.)

Об’єкт дослідження | Культура клітин | К-сть культур/метафаз | ПРЦ повне | P1 | ПРЦ часткове | P2

Нормальний постнатальний розвиток

Новонароджені | пвк | 14/1400 | 0— | 1,4±0,4—

3—14 років | пк | 23/2300 | 0,04±0,04— | 1,4±0,3—

3—14 років | км | 9/900 | 0,1±0,1— | 1,7±0,6—

3—14 років | пк+км | 32/3200 | 0,06±0,04— | 1,6±0,2—

18—30 років | пк | 10/1000 | 0,7±0,2— | 3,0±0,6—

Нормальний пренатальний розвиток

Ембріон | ГЕПК | 35/3500 | 14,9±2,2 | <0,001 | 3,1±1,1 | >0,05

Ембріон | хоріон | 20/1580 | 7,4±1,7 | <0,001 | 4,4±1,3 | =0,01

Плід | амніоцити | 41/1687 | 2,1±0,5 | <0,01 | 3,1±0,6 | <0,05

Патологічні стани у дітей

ГЛЛ | пк+км | 33/2800 | 9,1±2,1 | <0,001 | 38,4±4,6 | <0,001

ГЛЛ (ремісія) | пк+км | 25/2180 | 1,2±0,6 | <0,05 | 5,8±1,5 | <0,01

ГЛЛ (ремісія повна) | пк+км | 13/1130 | 0,3±0,2 | >0,05 | 3,9±0,9 | <0,01

НЗЛ | пк+км | 8/800 | 53,9±4,8 | <0,001 | 6,3±2,3 | <0,001

ГМЛ | км | 5/500 | 36,8±15,6 | <0,01 | 28,8±4,1 | <0,001

Синдром Ніймеген | пк | 7/500 | 2,3±1,0 | <0,01 | 2,8±1,5 | >0,05

Атаксія-телеангіектазія | пк | 7/700 | 2,9±0,9 | <0,05 | 1,4±0,9 | >0,05

Екологічна патологія | пк | 42/4200 | 3,5±0,4 | <0,001 | 0,5±0,1 | >0,05

Інф.-токсичні стани | пк | 19/1900 | 2,2±0,3 | <0,01 | 0,3±0,1 | >0,05

Патологічні стани у дорослих

ГМЛ | км | 8/500 | 2,5±0,7 | <0,01 | 11,8±3,8 | <0,05

ХМЛ | км | 14/800 | 4,1±0,6 | <0,001 | 13,7±2,1 | <0,001

НЗЛ | км | 7/350 | 6,0±1,5 | <0,001 | 12,3±4,2 | <0,05

Репродуктивні втрати | пк | 48/4800 | 0,9±0,2 | <0,05 | 3,2±0,3 | <0,05

Примітки |

пвк — пуповинна венозна кров, пк — периферична кров, км — кістковий мозок

ГЕПК — гемопоетичні ембріональні печінкові клітини

ГЛЛ — гостра лімфобластна лейкемія

ГМЛ — гостра мієлоїдна лейкемія

НЗЛ — негоджкінська злоякісна лімфома

ХМЛ — хронічна мієлоїдна лейкемія

Підбір контролю для порівняння проводили в залежності від культури клітин

В якості контролю порівняльно-онтогенетичних досліджень використано пк+км

P1 — достовірне перевищення контрольних показників за рівнем повного ПРЦ

P2 — достовірне перевищення контрольних показників за рівнем часткового ПРЦ

З іншого боку, структура часткового ПРЦ в ГЕПК відзначилась появою суттєвої частки метафазних клітин з передчасним розділенням більше 3-х хромосом набору, приналежних до всіх хромосомних груп.

Отже, за нашими даними, явище центромерної нестабільності у проявах повного і часткового ПРЦ достовірно індукується в проліферуючих клітинах різного тканинного походження в пренатальний і постнатальний період нормального онтогенезу людини. Часткове ПРЦ відзначається стабільністю маніфестації в різних тканинах та на різних етапах онтогенезу. Індукція повного ПРЦ є нетиповим явищем для культивованих клітин крові і кісткового мозку в період постнатального розвитку і достовірно маніфестує в тканинах пренатального походження (гемопоетичні ембріональні клітини, цитотрофобласт хоріону, клітини амніотичної рідини), де відзначається суттєвою міжтканинною варіабельністю.

Фенотип та рівень індукованої центромерної хромосомної нестабільності в культивованих соматичних клітинах людини

Дотримуючись концепції про вірогідний зв’язок явища ПРЦ з індукцією хромосомної нестабільності, ми дослідили характер його маніфестації за умов підвищеної напруженості процесів ендогенного та екзогенного мутагенезу. Для цього проведено комплексний цитогенетичний аналіз клітин крові і кісткового мозку у пацієнтів із спадковими синдромами хромосомної нестабільності (СХН), у хворих на гемобластози, у випадках вторинних імунодефіцитних станів інфекційно-токсичного ґенезу у дітей, в осіб, що проживають на територіях, забруднених генотоксичними чинниками, у членів подружніх пар з репродуктивними втратами в анамнезі, а також у батьків пацієнтів з СХН та хворих на гемобластози. Всього обстежено 325 осіб (60 контрольної групи) та проаналізовано 26200 метафазних пластинок.

При тому, що в контролі клітини з повним ПРЦ практично не виявлялись, достовірну індукцію даного явища зареєстровано у 80—96% короткочасних культур крові і кісткового мозку хворих на гемобластози, інфекційно-токсичну та екологічно-детерміновану патологію. Поряд з цим, індукцію повного ПРЦ знайдено у двох третинах випадків синдромів хромосомної нестабільності, у кожного другого з батьків дітей з гострою лімфобластною лейкемією або СХН, а також у третини членів подружніх пар з репродуктивними втратами в анамнезі. Найвищі параметри індукції повного ПРЦ відмічено в культурах крові і кісткового мозку дітей, хворих на гемобластози, а саме, у випадках гострої лімфобластної лейкемії (ГЛЛ), гострої мієлоїдної лейкемії (ГМЛ), мієлодиспластичного синдрому (МДС) та негоджкінської злоякісної лімфоми (НЗЛ) (табл. ). Досліджені випадки ГЛЛ, ГМЛ та МДС у дітей відзначились значними міжособовими коливаннями рівня індукції повного ПРЦ (2—99 на 100 м.п.), тоді як у пацієнтів з НЗЛ дане явище стабільно відтворювалось в половині мітотичних клітин (коефіцієнт варіації v=10%). В єдиному дослідженому нами випадку NBS, ускладненому розвитком НЗЛ, відсоток повного ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку відповідав параметрам культур пацієнтів з НЗЛ (47,8±6,1 та 53,9±4,8 на 100 м.п. відповідно) і достовірно перевищував показники групи пацієнтів з NBS без онкологічних ускладнень (2,4±1,3 на 100 м.п., P<0,001). Це свідчить про високу специфічність індукції повного ПРЦ в гемопоетичних клітинах під час маніфестації НЗЛ у дітей. У дорослих пацієнтів з хронічною мієлоїдною лейкемією (ХМЛ), ГМЛ та НЗЛ рівень індукції повного ПРЦ в клітинах кісткового мозку також достовірно перевищував контрольні показники (табл. ), що вказує на закономірність індукції даного явища під час маніфестації гемобластозів незалежно від нозологічної форми та віку особи. В ремісії ГЛЛ у дітей зареєстровано достовірну регресію рівня індукції повного ПРЦ в клітинах крові і кісткового мозку з досягненням показників здорових осіб на стадії повної ремісії: 0,3±0,2 та 0,06±0,04 на 100 м.п. відповідно (P>0,05).

Поряд з дослідженими випадками гемобластозів, достовірну індукцію повного ПРЦ в межах 2,2—3,5 на 100 м.п. встановлено в переважній більшості культур лімфоцитів пацієнтів з СХН та вторинними імунодефіцитними станами інфекційно-токсичного генезу, а також у дітей з проявами екологічно детермінованого захворювання, викликаного впливом солей важких металів і фтору (табл. ). Рентгенівське опромінення культивованих лімфоцитів пацієнтів з атаксією-телеангіектазією (А-Т) в дозі 1 грей викликало значне зростання відсотка повного ПРЦ порівняно з параметрами неопромінених культур пацієнтів і контролю: 4,0±0,7, 2,9±0,9 та 0,04±0,04 на 100 м.п. відповідно. Зважаючи на доведену генетичну нездатність лімфоцитів пацієнтів з A-T та синдромом Ніймеген (NBS) здійснювати зупинку клітинного циклу у відповідь на радіаційне пошкодження ДНК (intra-S або G2 checkpoint) (H. Beamish et al., 1996; M.H.et al., 1998; A.et al., 1999), ми припускаємо зв’язок підвищеної індукції повного ПРЦ в опромінених мітотичних клітинах з вродженим або набутим дефіцитом G2 checkpoint.

Якщо спонтанний рівень часткового ПРЦ у здорових осіб не перевищував 4 на 100 м.п., то його достовірну індукцію зареєстровано в культурах крові і кісткового мозку в усіх досліджених випадках гемобластозів у дітей (6,3—38,4 на 100 м.п., P<0,001) та дорослих (11,8—13,7 на 100 м.п., P<0,05) (табл. ). Порівняно з контролем, де ПРЦ демонстрували 1—2 хромосоми каріотипу, в гострому періоді гемобластозів з’являвся репрезентативний пул мітотичних клітин з передчасним розділенням 3—20 хромосом, який, зокрема, становив більше половини випадків часткового ПРЦ в клітинах кісткового мозку пацієнтів з ГЛЛ. Якщо в контролі передчасно розділялися хромосоми груп С і E, то в гострому періоді гемобластозів дане явище поширювалось на представників всіх хромосомних груп. 80% всіх зареєстрованих ПРЦ-хромосом були представниками груп С і E, наступну позицію обіймали ПРЦ-хромосоми групи G, A, B і найменш часто зустрічалося передчасне розділення хромосом F і D. Передчасне розділення хромосом груп A, B, C і E переважно спостерігалось у пацієнтів дитячого віку, тоді як типовим явищем в культурах дорослих хворих на гемобластози виявилось ПРЦ-G. В ремісії ГЛЛ у дітей зареєстровано достовірну регресію рівня часткового ПРЦ (38,4±4,6 та 3,9±0,9 на 100 м.п. відповідно, P<0,001).

В літературі описано поодинокі випадки реєстрації явища ПРЦ з ознаками “розщеплення центромер” при гемобластозах дорослих (Y.et al., 1982; J.H.et al., 1984; L.G.et al., 1985), а також знахідки повного ПРЦ в окремих випадках ГМЛ у дітей (P.W.et al., 1993). В нашій роботі на репрезентативному матеріалі статистично доведено закономірність відтворення явища ПРЦ у двох альтернативних фенотипах (повне і часткове ПРЦ), достовірність його індукції в гострому періоді гемобластозів у дітей і дорослих та достовірну регресію в ремісії з практичним досягненням показників здорових осіб. Отже, індукція повного і часткового ПРЦ є закономірними проявами хромосомної нестабільності при гемобластозах, причому інформативними ознаками гострого періоду захворювання є поява в популяції мітотичних клітин крові та кісткового мозку більше 2% метафазних пластинок з повним ПРЦ та більше 10% клітин з частковим ПРЦ, які відзначаються передчасним розділенням 3—20 хромосом набору за участі представників груп G, A, B, D, F.

У пацієнтів з СХН, рівень часткового ПРЦ в культивованих лімфоцитах не відрізнявся від контрольних показників (табл. ), проте структура даного явища виявилася відмінною і відзначалася появою репрезентативного пулу клітин з ПРЦ 3—20 хромосом каріотипу та залученням у дане явище хромосом всіх відомих груп, подібно до того, як це спостерігалось в ГЕПК та клітинах хворих на гемобластози. Специфічним проявом часткового ПРЦ у випадках СХН виявилась вибіркова індукція передчасного розділення хромосом групи B при повній відсутності даного явища в контролі (0,9±0,3 на 100 м.п., P<0,001). Рентгенівське опромінення культур лімфоцитів пацієнтів з А-Т в дозі 1 грей також супроводжувалось достовірною індукцією ПРЦ-B порівняно з неопроміненими культурами (0,6±0,2 та 2,8±0,7 хромосом на 100 м.п., P<0,01). Поряд з цим, нами виявлено вибіркову достовірну індукцію передчасного розділення хромосом групи D (13—15) у випадках атаксії-телеангіектазії та хромосом групи A (2, 3) у пацієнтів з синдромом Ніймеген (NBS) порівняно з контролем. Отримані дані узгоджуються з повідомленням про знахідки ПРЦ-D у 2 пацієнтів з атаксією-телеангіектазією (K.E.M.ьhler, 1995), проте достовірну індукцію ПРЦ-B в досліджених випадках А-Т та NBS, а також ПРЦ-А у випадках NBS, виявлено нами вперше. Єдиний досліджений нами випадок NBS, ускладнений розвитком НЗЛ, характеризувався достовірним підвищенням індукції часткового ПРЦ порівняно з відповідними параметрами у випадках НЗЛ та NBS без онкологічних ускладнень: 26,0±5,7, 6,3±2,3 та 2,8±1,5 на 100 м.п. відповідно (P<0,001). Одночасно відмічено парадоксальне зростання частки клітин з ПРЦ більше 3 хромосом каріотипу: 11,5±4,9, 2,6±2,2 та 1,8±1,3 на 100 м.п. відповідно (P<0,001). Виявлені особливості індукції часткового ПРЦ у випадку NBS, ускладненого розвитком НЗЛ, можуть відображати цитогенетичний фенотип нестабільності геному NBS1-дефіцитних клітин на шляху їх онкогенної трансформації. Якщо ж узагальнити всі отримані нами дані, достовірна індукції повного ПРЦ в культурах клітин хворих на гемобластози, синдроми хромосомної нестабільності та екологічно детерміновану патологію вказує на високу вірогідність асоціації даного явища з напруженням процесів ендогенного і екзогенного мутагенезу.

Функціонально-асоціативні зв’язки між індукцією передчасного розділення центромер та відомих цитологічних ознак

Достовірна індукція ПРЦ у гострому періоді гемобластозів, регресія його параметрів на стадії ремісії та поширеність в культурах крові без мітогенної стимуляції бласттрансформації вказували на високу вірогідність бластної природи ПРЦ-клітин. Таке припущенням було зроблене Y.et al. (1982) та L.G.et al. (1985) за результатами поодиноких знахідок “розщеплення центромер” у дорослих хворих на ГМЛ. Нами встановлено існування достовірної позитивної лінійної залежності між рівнем бластів у крові та індукцією часткового ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку (коефіцієнт кореляції p=0,81, P<0,001). Це обґрунтовано доводить, що часткове ПРЦ є вірогідною ознакою цитогенетичного фенотипу бластних клітин.

Часткове ПРЦ вважається одним із провідних механізмів нерозходження хромосом, втрати клітин та утворення анеуплоїдії, в тому числі і при формуванні гіподиплоїдних клонів лейкемічних клітин (P.H.et al., 1975; K.78; J.H.et al., 1984). Основу для даної концепції створили випадкові знахідки одночасної індукції ПРЦ та анеуплоїдних клітин в практиці каріотипування пацієнтів та досліджень трансформованих культур клітин. Нами доведено існування позитивної лінійної залежності між рівнем індукції часткового ПРЦ та анеуплоїдії в культурах крові і кісткового мозку хворих на гемобластози (коефіцієнт кореляції p=0,84, P<0,001). Достовірний характер даної залежності відтворювався при диференційному врахуванні ПРЦ різної кількості хромосом, причому найбільш тісний зв’язок з продукцією