МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

Донецький ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. М. горького

Мохаммед м.М. Алустаз

УДК 612.12.-008.1-085.456.1:615.835.3

Вплив оксигенації кровозамісного розчину на оксидантний гомеостаз і стан серця щурів

14.03.03 – нормальна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: Доктор медичних наук, професор

Філімонов Володимир Іванович,

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри нормальної фізіології.

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор Міщенко Віталій Петрович, Українська медична стоматологічна академія, завідувач кафедри нормальної фізіології.

Доктор медичних наук, професор Самохвалов Валерій Гаврилович, Харківський державний медичний університет, завідувач кафедри нормальної фізіології.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра нормальної фізіології, МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться “17”травня 2006 р. об 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.01 Донецького державного медичного університету ім. М. Горького за адресою:

83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького державного медичного університету ім. М. Горького за адресою: 83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16.

Автореферат розісланий “13”квітня 2006 року.

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук професор Солдак І.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні десятиріччя активно вивчаються процеси вільнорадикального окислення. При цьому більшість дослідників вказує на те, що надлишок супероксид-радикалів, дефіцит ендогенних антиоксидантів, генетично детермінована недостатність ферментів антирадикального захисту (супероксиддисмутаза, каталаза) та інші порушення в системі оксидантного гомеостазу призводять до окислювальної модифікації макромолекул в клітині. Це призвело до появи терміну “оксидантний стрес”. У серці ці процеси супроводжуються окислювальною модифікацією скоротливих структур - кардіоміоцитів, появою альдегідів і карбоксилів, фрагментації білків. Надлишок супероксид-радикалів призводить до пригноблення функцій ферментів, зокрема АТФаз, дегідрогеназ і ферментів енергетичного обміну кардіоміоцитів (Болдырев А.А., 1995; Henle E.S., 2000; Parker L., 1999; Patrono C., Fitz General G.A., 1999; Scott B., 1999). Природно, що все це в першу чергу порушує провідність і скоротливість кардіоміоцитів. Інтенсивність процесів вільнорадикального окислення в першу чергу залежить від вираженості гіпоксії.

З нестачею кисню людина зустрічається в повсякденному житті та трудовій діяльності досить часто. Розширення областей існування людини – освоєння високогірних районів у сільськогосподарських цілях, розвиток гірського туризму й альпінізму, збільшення кількості робіт в спеціальних умовах, різні форми внутрішньої патології, професійні захворювання складають далеко неповний реєстр умов, при яких виникає кисневе голодування. Вивченню гіпоксичних станів присвячено багато праць різних дослідників. Особливо великий внесок в дослідження цієї проблеми зроблено вітчизняною школою фізіологів, заснованою М.М. Сиротиніним.

Гіпербарична оксигенація є одним з найдієвіших способів підвищення надійності захисту організму від гіпоксії (Петровский Б.В., Ефуни С.Н., 1987; Зальцман Г.Л., 1980; Серяков В.В., 2001). Ефективність її застосування грунтується на різкому підвищенні рівня парціального тиску кисню (pО2) в артеріальній крові. Це, з одного боку, забезпечує високий градієнт кисню між кров’ю та тканинами, а з іншого – призводить до зростання кількості розчиненого в плазмі крові кисню (О2). Але застосування стандартної барокамери для гіпербаричної оксигенації вимагає дорогого устаткування. До того ж тривале перебування в умовах гіпербарії у деяких хворих може призвести до набряку легенів або токсичних уражень центральної нервової системи.

Зважаючи на це, пропонувалося (Парин В.В., Мєєрсон Ф.З.,1965; Баби-
чев С.И., Савченко З.И., Федоров В. П., Королев В. И., 1987) інфузійне введення оксигенованих розчинів. Воно має ряд переваг перед гіпербаричною оксигенацією: а) розчин можна подавати ізольовано до органу, що має в ньому потребу; б) при цьому можна запобігти небажаних побічних ефектів дії підвищеного тиску О2 на легені та головний мозок; в) немає необхідності в складній апаратурі.

У такий спосіб реалізується такий же механізм, який спрацьовує і при гіпербаричній оксигенації за рахунок підвищення рівня парціального тиску розчиненого в крові О2, що може частково ліквідувати навіть повну відсутність гемоглобіну.

Проте, гіпероксія, що супроводжує гіпербаричну оксигенацію, також призводить до активації вільнорадикального окислення (Петровській Б.В., Ефуні С.Н., Демуров Е.А., Родіонов В.В, 1987; Пасечник И.Н., 2001). Оскільки раніше вважалося, що підвищення вмісту продуктів вільнорадикального окислення є суто патогенетичним чинником, ідея застосування гіпероксигенованих розчинів, дотепер не знайшла належного клінічного застосування. На сьогоднішній час добре відомо і про участь активних форм О2 та їх продуктів в багатьох фізіологічних процесах вільнорадикального окислення (ВРО) є невід'ємною ланкою та внутрішньоклітинним месенжером таких важливих біологічних процесів, як транспорт електронів в дихальному ланцюзі, синтез простагландинів і лейкотриєнів, проліферація та дифференціювання клітин, згортання крові, метаболізм і синтез катехоламінів, фагоцитоз, метаболізм деяких ксенобіотиків (Чекнев С.Б., 1999; Мищенко В.П., 2001; Hancock J., Nei S., 2000; Kaur H., Halliwell B., 2000; Maher P., Schubert D., 2000; Smythies J., 2000).

Проте, позитивний антигіпоксичний вплив О2, що потрапляє в організм при високому рівні pО2, і поява останніми роками широкого арсеналу антиоксидантів стало для нас підставою для пошуку можливості “реабілітовувати” ідею застосування таких розчинів. Для цього на базі сучасного рівня науки необхідно поглиблено вивчити дію не одного лише оксигенованого розчину (після тотальної крововтрати) на міокард при його одномоментному введенні, а також використовувати як захист антиоксиданти. Застосована нами експериментальна модель дозволяє відслідкувати протягом перших хвилин гіпоксії зміни оксидантного гомеостазу в тканинах серця, відповісти на питання про те, чи є продукти перекисного окислення тим основним механізмом, який порушує функціональний стан серця при різко вираженій гіпоксії його тканини, або ж цим механізмом є недолік О2. Певний науковий інтерес представляє вивчення впливу на серцеву діяльність високого рівня pO2, який потрапляє не в лівий відділ серця, як це відбувається при перебуванні в барокамері, а в праве передсердя, де розташовуються структури провідної системи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана як фрагмент планової науково-дослідної роботи кафедри нормальної фізіології Запорізького державного медичного університету “Експериментально-клінічне дослідження механізмів системи детоксикації організму і шляхів підвищення її активації”(№ 0196V002256 шифр IH 14.02.03.96) і “Дослідження механізмів регуляції системи детоксикації організму та еритропоезу” (№ 0101V003300 шифр ІН 14.03.03.01). Автор брав безпосередню участь у вивченні впливу інфузійно введеного оксигенованого розчину Рінгера-Локка з антиоксидантами (АО) тіотриазоліном і румосолом, синтезованих у Запорізькому медичному університеті, на роботу серця в умовах повної заміни крові цим розчином.

Мета дослідження. Дати наукове обґрунтування на основі вивчення фізіологічних механізмів регуляції стану гомеостазу серця, використання оксигенованих розчинів з антиоксидантами як розчинів, що підтримують оксидантний гомеостаз тканин серця, так і його функціональний стан з метою наближення цих параметрів до фізіологічних в гострому експерименті.

Задачі дослідження.

1. Вивчити особливості динаміки вільнорадикального окислення в тканинах серця щурів при внутрішньовенному заміщенні гострої профузної крововтрати оксигенованим розчином Рінгера-Локка з антиоксидантами.

2. Вивчити особливості зміни антиоксидантної захисної системи в тканинах серця щурів при внутрішньовенному заміщенні гострої профузної крововтрати оксигенованим розчином Рінгера-Локка з антиоксидантами.

3. Дослідити функціональний стан серця щурів (за показниками варіабельності серцевого ритму) при внутрішньовенному заміщенні гострої профузної крововтрати оксигенованим розчином Рінгера-Локка з антиоксидантами.

4. Вивчити значимість одного з двох чинників – гіпоксії чи інтенсифікації процесів вільнорадикального окислення – в порушенні функціональних показників роботи серця в перші хвилини розвитку різко вираженої гіпоксії.

5. Провести порівняльне дослідження застосування двох антиоксидантів, синтезованих в Запорізькому державному медичному університеті, з яких тіотриазолін вже знайшов клінічне застосування, а румосол – знаходиться у стадії доклінічної апробації, як сполук, що впливають на оксидантний гомеостаз.

Об'єкт дослідження – оксидантний гомеостаз в тканинах серця щурів та функціональний стан серця при заміщенні профузної крововтрати оксигенованим розчином.

Предмет дослідження – особливості зміни оксидантного гомеостазу в тканинах серця та варіабельністі серцевого ритму щурів при внутрішньовенному заміщенні профузної крововтрати оксигенованим розчином.

Методи дослідження – біохімічними методами визначали рівень продуктів ВРО, активність ферментів антиоксидантної системи, активність креатинфосфокінази, функціональними – визначали показники варіабельності ритму серця, експериментальними – моделювали гіпоксичний стан в умовах профузної крововтрати.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше проведено комплексне вивчення кінетики оксидантного гомеостазу в тканинах серця, функціональних його параметрів у перші хвилини після профузної крововтрати та після заміщення крові оксигенованим розчином Рінгера-Локка з антиоксидантами. Уперше одержано дані про те, що в умовах гіпоксії, яка супроводжує заміщення гострої крововтрати звичайним розчином Рінгера-Локка, оксидантний гомеостаз різко порушується вже в перші хвилини: на фоні значного збільшення вмісту продуктів ВРО спостерігається зниження активності ферментів антиоксидантного захисту. У дослідах in vivo й in vitro показано, що застосовані нами антиоксиданти (тіотриазолін і румосол) при додаванні в оксигенований розчин забезпечують підтримку функціонального стану серця протягом всіх шести хвилин інфузії, проявляючи свій прямий вплив як блокатори продуктів пероксидації. Уперше показано, що в перші хвилини аноксії міокарду провідним фактором, порушення функціонального стану серця є не продукти пероксидації, а дефіцит О2.

Практичне значення одержаних результатів. Проведене дослідження показало, що внутрішньовенне заміщення профузної крововтрати оксигенованим розчином з антиоксидантами забезпечує збереження його функції, наближаючи основні біохімічні та функціональні показники до фізіологічних. Такий розчин може бути в деяких випадках рекомендований для використовування як кровозамінник.

Результати дослідження можуть використовуватися в науково-дослідній роботі та навчальному процесі, а також при розробці нових підходів до лікування гіпоксичних станів у практичній медицині.

Основні результати дисертації впроваджено в навчальний процес кафедр нормальної фізіології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Української медичної стоматологичної академії, Харківського державного медичного університету, Дніпропетровської державної медичноі академії, що підтверджується актами впровадження (16.09.04, 11.10.04, 03.11.04, 08.11.04).

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури з обраної теми, освоєно та виконано моделі. Самостійно здійснено всі біохімічні та функціональні дослідження серцевої діяльності. Проведено статистичну обробку та аналіз отриманих результатів, сформульовано висновки, опубліковано основні положення дисертації. Дисертантом не були використані результати та ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертації були викладені й обговорені на 16 з’їзді фізіологів України (Вінниця, 2002), науковій конференції студентів та молодих вчених (Вінниця, 2004), науково-практичній конференції молодих вчених Запорізького державного медичного університету (Запоріжжя, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю “І.М. Сєченов і Одеська школа фізіологів”, присвяченій 175-літтю з дня народження І.М. Сєченова (Одеса, 2004).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 3 статтях наукових журналів, 4 матеріалах і тезах конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, 7 розділів, висновків, списку використаних джерел, який містить 192 джерело на 21 сторінках, представлена на 134 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 15 рисунками на 15 сторінках, 25 таблицями на 27 сторінках.

ОСНОВНІЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Роботу виконано на 274 щурах-самцях лінії Вістар масою 180–200 г в осінньо-зимовий період. Під час проведення експерименту всі тварини знаходилися на стандартному раціоні живлення віварію згідно з “Санітарними правилами по устаткуванню, обладнанню та утриманню експериментально-біологічних клінік (віваріїв)” (Шафранов В.П., Рясина Т.В., 1974).

Експериментальні та інтактні групи щурів складалися з урахуванням віку, ваги та статі тварин. Однотипні втручання завжди виконувалися в один і той самий час доби. При проведенні кожної серії експериментів одночасно досліджувалася і інтактна група тварин.

Оксигенація розчину проводилася в апараті оригінальної конструкції, який дозволяє доводити рівень рО2 до 1500 - 2000 мм рт. ст. Аналіз газів проводився на апараті фірми Radiometr ABL 505.

Тваринам під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) проводилася лапаротомія з виділенням черевної аорти і нижньої порожнистої вени. Потім вена катетеризувалася для проведення подальшої інфузії розчинів, які досліджувалися, а аорта – для кровопускання (Степанов С.С., Гапоненко Г.Е., Семченко В.В., 1983). Через хвилину після початку кровопускання виконувалася інфузія розчину Рінгера-Локка з швидкістю відповідною хвилинному об’єму кровообігу (ХОК) щурів і складала 3,2 мл/хв·г маси тварини (Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., 1991; Верич Г.Е., 1972).

Тварини забивалися в кінці 3 і 6 хвилин інфузії для дослідження біохімічних показників тканин серця.

У ці ж проміжки (з 1 по 3 хвилини і з 4 по 6 хвилини) досліджувався функціональний стан серця шляхом аналізу варіабельності серцевого ритму (ВРС). Функціональний стан серця тварин оцінювався за допомогою електрокардіографічної діагностичної системи Cardiolab. Визначалися показники, які відображають стан нейрогенної і гуморальної контурів систем регуляції: високочастотний компонент (HF), низькочастотний компонент (LF) і індекс вагосимпатичної взаємодії (LF/HF) (табл. 2).

Активність перекисного окислення ліпідів у тканинах серця оцінювали за накопиченням його продуктів – подвійних зв’язків (ПЗ), дієнових кон’югатів (ДК) (Аношина М.Ю., Лановенко И.И., 1994). Із вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів визначали вміст малонового діальдегіду (МДА) за кольоровою реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Андреева А.И., 1988).

Стан антиоксидантної системи в тканинах серця оцінювався за активністю ферменту супероксиддисмутази (СОД) (Чевари С., Чаба И., Секей И., 1985) та глутатіонпероксидази (ГП) (Гаврилова А.Р., Хмара Н.Ф., 1986).

Методика визначення криатінфосфокінази (КФК) за допомогою набору реактивів для визначення каталітичної активності ізоферменту МВ–КФК в біологічному матеріалі (Камышников B.С., 2003).

Для визначення in vitro антиоксидантної активності використовували метод ферментативної ініціації ПОЛ (Губський Ю.И. и др., 2002).

Статистична обробка отриманих результатів проводилася на персональному комп'ютері з використанням програм з пакету “Biostat” (Гланц С., 1998). На етапі планування дослідження було проведено оцінку об’єму вибірок, достатнього для виявлення статистично значущих відмінностей. При порівнянні трьох і більше вибірок між собою були застосовані методи множинних порівнянь. У випадку нормального закону розподілу показників використовувалися параметричні критерії порівняння, у випадку відмінності закону розподілу від нормального – їх непараметричні аналоги.

Результати дослідження й їх обговорення. Дослідження стану серця і механізмів його регулювання в щурів в умовах заміщення крові оксигенованим розчином. В якості базового розчину при заміщенні гострої крововтрати використовувався розчин Рінгера-Локка. Оксигенація розчину здійснювалася в сконструйованому нами апараті, який доводив в розчині рівень pО2 до 1500 - 2000 мм рт. ст. через 20-25 хвилин. Саме цей режим оксигенування дотримувався нами в подальших дослідженнях.

Скориставшись формулою Генрі-Дальтона, ми визначили кількісний вміст О2 в такому розчині. Провівши відповідний розрахунок, можна побачити, що при pО2 1500 мм рт. ст. кожні 100 мл розчину містять 4,8 мл О2, а при 2000 мм рт. ст. – 6,3 мл. Нагадаємо, що в такій же кількості артеріальної крові знаходиться лише 0,3 мл розчиненого О2. Поза сумнівом, що в розчині, який використовувався нами, містилося набагато менше О2, ніж в артеріальній крові тварин (більше 20 мл/100 мл крові). Проте не слід забувати, що в звичайних умовах далеко не весь О2 артеріальної крові використовується і його велика частина залишається у венозній крові. Крім того, було встановлено, що в розчині, який відтікав з черевної аорти, рівень pО2 ще залишається в межах 400-650 мм рт. ст.

При вивченні динаміки дезоксигенації розчину у відкритому флаконі було знайдено, що протягом 10 хвилин рівень рО2 розчину залишався достатньо високим – вище 1500 мм рт. ст. Цей часовий проміжок і був використаний нами при проведенні експериментів.

Заміщення крові інфузією розчину Рінгера-Локка супроводжувалося зміною показників ВРС (табл. 1) в залежності від того, який був склад розчину. Так, якщо застосовувався лише розчин Рінгера-Локка, то частота серцевих скорочень (ЧСС) в перші 3 хвилини інфузії статистично значущо (р<0,01) знижувалася до 226,4±6,6 уд./хв в порівнянні з інтактними (360,4±13,1 уд./хв) щурами (р<0,05). При цьому такий показник як амплітуда моди (АMо), який характеризує збереження періодичності ритму серця, знижувався в такій же пропорції, як і ЧСС (p<0,05). Дещо повільніше, але так само збільшувався варіаційний розмах (ДХ), який відображає розкид інтервалів R-R, що свідчить про порушення пейсмекерної функції водія ритму (р<0,05).

В період між 4 і 6 хвилинами при інфузії стандартного розчину Рінгера-Локка вказана тенденція змін заглиблювалася, наприклад, ЧСС знижувалася до 187,4±28,1 уд./хв, тобто практично в двічі (р<0,05).

Інфузія оксигенованого розчину значно краще впливала на функціональні показники серця. Про це свідчить динаміка показників ВРС. Так, ЧСС залишалася достатньо високою, не тільки в перші 3 хвилини, але і в подальший трихвилинний проміжок (4-6 хвилини) після початку інфузії розчину (р<0,05). Аналогічно цьому при застосуванні оксигенованого розчину решта показників, що характеризують серцевий ритм, так само були більш близькими до рівня інтактних тварин. Так, якщо в перші 3 хвилини Мо у інтактних тварин дорівнювала 124,5±3,2 мс і при інфузії звичайного розчину зростала до 218,8±33,9 мс (р<0,05), то при використанні оксигенованого розчину знижувалася до 174,4±7,5 мс (р<0,05). Причому, якщо розкид цього показника у окремих тварин при інфузії звичайного розчину був дуже широким (про що свідчить велика помилка середньої m і високий показник ДХ), то оксигенація розчину різко знижувала розкид показників R-R (ДХ) інтервалів (р<0,01).

Таблиця 1

Зміна показників ВРС у щурів при замістній інфузії гострої крововтрати розчинами Рінгера-Локка (М±m)

Показники

ВРС | Час інфузії, хв | Група тварин

інтактна | з інфузєю

Рінгера-Локка | з інфузією Рінгера-Локка з румосолом | з інфузією оксигено-ваного

Рінгера-Локка | з інфузією оксигено-ваного

Рінгера-Локка з румослом

ЧСС, уд./хв | 1-3 | 360,4

±13,1 | 226,4

±6,61 | 249,4

±13,31 | 284,9

±10,01 | 309,6

±5,41

Мо, мс | 124,5

±3,2 | 218,3

±33,91 | 221,0

±15,51 | 174,4

±7,51 | 150,4

±6,6

АМо, % | 59,75

±6,64 | 31,5

±3,201 | 25,0

±4,571 | 45,13

±6,38 | 47,38

±2,63

ДХ, мс | 2,82

±0,14 | 4,47

±0,141 | 4,23

±0,131 | 3,23

±0,061 | 3,00

±0,08

ЧСС, уд./хв | 4-6 | - | 187,4

±28,11 | 225,8

±9,11 | 267,3

±13,81 | 297,9

±23,2

Мо, мс | - | 330,6

±15,61 | 323,1

±7,11 | 252,6

±10,01 | 206,9

±6,21

АМо, % | - | 25,75

±1,791 | 21,13

±1,061 | 34,63

±1,1 | 41,25

±1,371

ДХ, мс | - | 5,34

±0,291 | 4,8

±0,211 | 4,03

±0,081 | 3,43

±0,15

1 – різниця вірогідна порівняно з показниками інтактних тварин (р<0,05).

В проміжку між 4 і 6 хвилинами показники, що характеризують динаміку періодичності ритму серця, змінювалися у бік їх погіршення, але при використанні оксигенованих розчинів всі вони були значно ближчими до рівня інтактних тварин, ніж при інфузії стандартного розчину.

При застосуванні препаратів (обидва препарати впливали практично однаково, тому в табл. 1 для прикладу приведені результати дослідження румосолу) так само можна відзначити дещо краще збереження роботи серця, ніж при використанні лише одного розчину. Але поліпшення показників при цьому не було достовірним, так що можна говорити лише про тенденцію.

Застосування для інфузії оксигенованого розчину з препаратом краще всього зберігало функціональний стан серця. При цьому, принаймні, в перші 3 хвилини всі показники, що характеризують його, були найближчими до групи інтактних тварин.

Поза сумнівом, що внутрішньовенна інфузія розчину повністю не може замінити природного рівня доставки О2 для самого серця і особливо для головного мозку, в якому розташовані центри регуляції його функцій. Проте надходження в правий шлуночок розчину, рівень pО2 в якому зростає до 1500-2000 мм рт. ст., тобто вище звичайного рівня О2 в крові більше в 15-20 разів, не може не відобразитися як на стані структур провідної системи, розташованих тут, так і на рецепторах судин.

Виходячи з цього, особливий інтерес представляє визначення тих показників оцінки ВРС, які характеризують активність контурів системи регуляції серця. Зі всіх отриманих нами показників найбільший інтерес викликають ті, які відображають стан нейрогенного і гуморального контурів систем регуляції: HF, LF, LF/HF (табл. 2).

Таблиця 2

Зміна спектральних показників

ВРС щурів при замісній інфузії різними розчинами (М±м)

Спект-ральні показ-ники

ВРС | Час інфузії, хв | Група тварин

інтактна | з інфузією

Рінгера-Локка | з інфузією Рінгера-Локка з румосолом | з інфузією оксигено-ваного Рінгера-Локка | з інфузією оксигенованого Рінгера-Локка з румосолом

HF | 1-3 | 23,18

±1,42 | 67,64

±2,931 | 69,42

±3,371 | 45,46

±6,911 | 27,86

±3,84

LF | 18,37

±0,64 | 32,52

±2,921 | 41,48

±7,911 | 54,84

±6,941 | 63,64

±9,021

LF/HF | 1,39

±0,11 | 0,51

±0,071 | 0,6

±0,131 | 2,14

±0,0441 | 2,86

±0,551

HF | 4-6 | - | 63,75

±2,731 | 61,31

±1,281 | 41,91

±2,441 | 20,72

±1,3

LF | - | 41,54

±1,321 | 44,14

±2,01 | 60,82

±1,331 | 65,54

±1,231

LF/HF | - | 0,63

±0,011 | 0,72

±0,041 | 1,52

±0,081 | 2,12

±0,11

1 – різниця вірогідна порівняно з показниками інтактних тварин (р<0,05).

Ці показники у тварин при заміщенні крововтрати розчинами істотно відрізнялися від рівня інтактних тварин. Представлені дані показують, що при інфузії стандартного розчину показник HF, який характеризує вираженність автономного контуру регуляції (превалювання парасимпатичного впливу) різко (р<0,05) зростав. При цьому одночасно збільшувався (р<0,05) показник LF, який характеризує напруженість центрального (симпатичного) контуру регуляції. Переважне збільшення показника HF призводило до зниження відношення LF/HF.

Порівнюючи показники ВРС груп тварин, яким інфузувався звичайний розчин Рінгера-Локка, з групою тварин, яким інфузувався оксигенований розчин можна бачити істотну відмінність їх динаміки. Так, показник HF, що характеризує вираженність автономного контуру регуляції (превалювання парасимпатичного впливу) при використанні оксигенованого розчину нижче, як в перші 3 хвилини інфузії (67,64±2,93 і 45,46±6,91, р<0,05), так і в подальший трихвилинний проміжок (63,75±2,73 і 41,91±2,44, р<0,05). В той же час показник LF, який характеризує напруженість центрального (симпатичного) контуру регуляції при використанні оксигенованого розчину, навпаки, значно збільшувався. В результаті відношення LF/HF, в цих групах набагато вище (в перші три хвилини - 0,51±0,07 і 2,14±0,044, р<0,05 і наступні – 0,63±0,01 і 1,52±0,08, р<0,05), що свідчить про значне превалювання контуру пристосовування регуляції при використовуванні оксигенованого розчину.

З огляду на отримані дані, додавання препаратів в стандартний розчин не змінювало стан систем регуляції, а застосування оксигенованого розчину з румосолом зберігало показник HF на рівні інтактних тварин.

Таким чином оксигенування розчину під тиском в 3 атм, що дозволяє доводити рівень О2 до 5 мл в 100 мл розчину, значно краще зберігає всі параметри, що характеризують стан серця. Про це ж свідчать результати дослідження одного з ключових ферментів – КФК, який забезпечує ресинтез АТФ з креатинфосфату. Численними дослідженнями (Биленко М.В., 1989) було показано, що в умовах гіпоксії, що розвивається, в міокарді активність цього ферменту різко зростає.

В подальших дослідженнях встановлено, що через 3 хвилини інфузії розчину Рінгера-Локка рівень КФК статистично значущо (р<0,01) зростав. Проте застосування оксигенованого розчину з антиоксидантами забезпечувало протягом 3 перших хвилин збереження практично нормального рівня активності ферменту (р>0,05).

Лише до 6 хвилини інфузії у цих тварин в серці зростала активність даного ферменту, але збільшення активності було достовірно (р=0,04) нижчим, ніж при використанні неоксигенованого розчину.

В цілому, оцінюючи отримані в даному розділі результати, можна вважати, що відмінність впливу оксигенованого розчину обумовлена не тільки використанням О2 скоротливими структурами міокарду, провідною системою, а також системами рефлекторної регуляції.

Дослідження зміни антиоксидантної активності тканини під впливом препаратів в умовах in vitro. Експерименти по дослідженню in vitro ферментативної активності препаратів, що використовуються, показали, що обидва препарати, маючи антиоксидантну активність, призводять до стимуляції антиоксидантної активності гомогенату тканин серця при їх введенні. До того ж показано, що препарати легко проникають через клітинну мембрану. Свідченням цього є те, що, якщо гомогенат серця був узятий після трихвилинної інфузії розчину, що містить препарат, то антиоксидантна активність доданих в пробірку препаратів різко підвищувалася (р<0,05).

Визначення вмісту продуктів ВРО в міокарді при заміщенні гострої крововтрати розчинами. Моделювання гострої крововтрати з паралельною інфузією розчинів супроводжувалося порушенням оксидантного гомеостазу тканин серця. При цьому змінювався рівень проміжних продуктів ВРО – продуктів з подвійними зв'язками (ПЗ) та ДК, а також кінцевого продукту пероксидації – МДА (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст продуктів ВРО (мкмоль/г тканини) при трихвилинному заміщенні крововтрати різними розчинами (M±m)

Група тварин | Показник продуктів ВРО

ПЗ | р | ДК | р | МДА | p

Інтактна | 2,58

±0,18 | - | 0,88

±0,09 | - | 1,65

±0,16 | -

З інфузією Рінгера-Локка | 11,28

±2,05 | <0,01 | 8,59

±2,71 | <0,01 | 2,07

±0,04 | >0,05

З інфузією оксигенованого Рінгера-Локка | 19,71

±3,5 | <0,01 | 9,67

±2,17 | <0,01 | 2,33

±0,13 | >0,05

З інфузією

Рінгера-Локка

з тіотриазоліном | 6,37

±1,04 | >0,05 | 2,32

±0,46 | >0,05 | 1,59

±0,17 | >0,05

З інфузією

Рінгера-Локка

з румосолом | 6,6

±0,17 | >0,05 | 3,03

±0,1 | >0,05 | 1,59

±0,16 | >0,05

З інфузією оксигенованого Рінгера-Локка з тіотриазоліном | 3,75

±0,8 | >0,05 | 1,08

±0,2 | >0,05 | 1,14

±0,09 | >0,05

З інфузією оксигенованого Рінгера-Локка з румосолом | 4,01

±0,14 | >0,05 | 1,12

±0,09 | >0,05 | 1,14

±0,08 | >0,05

р – вірогідність різниці порівняно з показниками інтактних тварин.

Заміщення гострої крововтрати розчином Рінгера-Локка призводило до швидкого зростання кількості початкових і проміжних продуктів перекисного окислення ліпідів. Вже через 3 хвилини інфузії вміст ПЗ в серці таких тварин в порівнянні з інтактними тваринами статистично значущо (р<0,01) зростав рівень ПЗ з 2,58±0,18 мкм/г тканини до 11,28±2,05 мкм/г тканини, а ДК – від 0,88±0,09 мкм/г тканини до 8,59±2,71 мкм/г тканини (р<0,01), тобто, в 5–10 разів. При цьому статистично значущої зміни кінцевого продукту ВРО – МДА в порівнянні з інтактними тваринами не виявлено (р>0,05).

Оксигенація розчину супроводжувалася ще більш значним збільшенням концентрації продуктів пероксидації в тканинах серця. Так, на 3 хвилині вміст ПЗ підвищувався з 11,28±2,05 до 19,71±3,5 мкм/г тканини. Меншою мірою зростала концентрація ДК з 8,95±2,71 до 9,67±2,17 мкм/г тканини, МДА – з 2,07±0,04 до 2,33±0,13 мкм/г тканини.

Застосування обох антиоксидантів істотно знижувало утворення проміжних продуктів ВРО. Наприклад, при інфузії розчину Рінгера-Локка з тіотриазоліном на 3 хвилині вміст ПЗ був 6,37±1,04 мкмоль/г тканини, а без антиоксиданту – 11,28±2,05 мкмоль/г тканини (р>0,05). Ще більш яскравим був ефект відносно змін рівня ДК: при застосуванні тіотриазоліну його вміст знижувався до значення 2,32±0,46 мкм/г тканини, а без препарату – 8,59±2,71 мкм/г тканини (р<0,05). Прикметним є те, що через 3 хвилини інфузії розчину з антиоксидантами концентрація кінцевого продукту ВРО – МДА – була на рівні показника серця інтактних тварин.

Ще більш вираженним був ефект зниження рівня початкових продуктів пероксидації під впливом антиоксидантів при використанні оксигенованого розчину. Так, через 3 хвилини рівень ПЗ з 19,71±3,51 мкмоль/г тканини серця щурів, яким проводилася інфузія оксигенованого розчину, при застосуванні препарату, знижувався до 3,76±0,89 мкмоль/г тканини; ДК – з 9,67±2,17 мкмоль/г тканини до 1,09±0,21 мкмоль/г тканини, відповідно (в обох випадках р0,05). Порівнюючи ці показники з показниками інтактних тварин, можна бачити, що концентрація початкових продуктів статистично не відрізнялася від їх рівня, а вміст кінцевого продукту МДА при використанні обох препаратів був навіть нижчим, ніж в серці інтактних тварин. Проте, до 6 хвилини інфузії концентрація продуктів пероксидації зростала, але при використанні антиоксидантних препаратів вона залишалася, все ж таки, більш низькою, ніж без них.

Активність ферментів антиоксидантного захисту (АОЗ) в серці щурів, яким гостра крововтрата заміщувалася оксигенованими розчинами з антиоксидантами. Стан вільнорадикального окислення в тканинах залежить не тільки від чинників, що активують ці процеси, але і від активності механізмів антирадикального захисту. В табл. 4 наведені результати дослідження активності ферментів АОЗ у тварин з інфузією різного типу розчинів.

Вже через чотири хвилини гіпоксії (через три хвилини після початку інфузії неоксигенованого розчину Рінгара-Локка) спостерігається достовірне (р<0,01) зниження рівня активності ключового ферменту АОЗ – СОД від 185,82±6,71 до 127,9±4,75 у.о./(хв•мг) білка. Рівень ГП знижувався (р<0,01) ще більше – від 36,13±2,64 до 19,71±0,98 мкмоль/(хв•г) білка.

Використання оксигенованого розчину так само призводило до зниження активності даних ферментів антиоксидантної системи, причому ці зміни були дещо більш вираженними, ніж при використанні неоксигенованого розчину Рінгера-Локка.

Таблиця 4

Активність ферментів АОЗ в міокарді при трихвилинному заміщенні крововтрати різними розчинами (M±m)

Група тварин | Показник ферментів АОЗ

СОД,

у.о./(хв?мг) білка | p | ГП,

мкмоль/(хв?г) білка | p | ГР,

мкмоль/(хв?г) білка | p

Інтактна | 185,82

±6,71 | - | 36,13

±2,64 | - | 21,22

±1,04 | -

З інфузією Рінгера-Локка | 127,9

±4,75 | <0,01 | 19,71

±0,98 | <0,01 | 18,04

±0,80 | >0,05

З інфузією оксигенованого Рінгера-Локка | 150,68

±10,34 | <0,01 | 18,37

±0,84 | <0,01 | 13,86

±0,87 | <0,01

З інфузією Рінгера-Локка

з тіотриазоліном | 128,47

±5,82 | <0,01 | 25,83

±1,59 | <0,01 | 17,18

±1,57 | <0,05

З інфузією Рінгера-Локка

з румосолом | 110,18

±8,36 | <0,01 | 17,09

±0,73 | <0,01 | 14,42

±0,88 | <0,01

З інфузією оксигенованого Рінгера-Локка з тіотриазоліном | 114,61

±6,54 | <0,01 | 20,72

±1,53 | <0,01 | 15,88

±0,87 | <0,01

З інфузією оксигенованого Рінгера-Локка з румосолом | 90,83

±3,69 | <0,01 | 16,67

±0,99 | <0,01 | 17,92

±0,83 | >0,05

р – вірогідність різниці порівняно з показниками інтактних тварин.

Додавання в інфузований розчин антиоксидантів дещо змінювало стан АОЗ в серці щурів. При цьому значущі зміни у бік підвищення активності ферментів спостерігалися лише відносно ГП, активність якої зростала з 19,71±0,98 до 25,83±1,59 мкмоль/(хв?г) білка (р<0,05) при додаванні до стандартного розчину румосолу, та активність СОД підвищувалася при додаванні в розчин тіотриазоліну з 127,9±4,75 до 150,68±10,34 у.о./(хв?мг) білка (р<0,05).

В той же час, якщо використовувався оксигенований розчин, то препарати практично не змінювали активності ферментів АОЗ в серці щурів.

Активність всіх трьох ферментів в період інфузії з 4 до 6 хвилини знижувалася, але особливо істотно знижувалася активність ГР і ГП. Причому ця спрямованість відзначена у всіх проведених серіях. Наприклад, при використанні оксигенованого розчину з румосолом активність ГП з 25,83±1,59 знижувалася до 13,07±0,08 у.о./(хв?мг) білка (р<0,01), а ГР з 17,18±1,57 до 12,04±0,12 у.о./(хв?мг) білка (р<0,05).

Умови, проведеного нами експерименту, дозволяють освітити і деякі питання, пов'язані з оксидантним гомеостазом тканин (співвідношенням продуктів пероксидації та антиоксидантними механізмами самих клітин). Це в даний час актуально, оскільки велика кількість досліджень, присвячених процесам ВРО, формує уявлення лише про патогенетичну роль їх продуктів, зокрема при розвитоку інфаркту міокарду (Цебржинский О.И., 2001; Hess M., Mauson N. 1985; Sen C, Hanninen O., 1994).

Отримані нами результати дозволяють стверджувати, по–перше, що при гіпоксії відбувається одночасне зниження активності ферментів АОЗ і стимуляція утворення продуктів пероксидації, але при цьому зниження концентрації вказаних продуктів не призводить до швидкого повернення активності ферментів. По–друге, принаймні, в початковий період гіпоксії продукти пероксидації не мають вирішального значення в порушенні функцій міокарду, а ведучим є нестача О2.

ВИСНОВКИ

В даній роботі на основі експериментальних досліджень було показано, що внутрішньовенна замісна інфузія оксигенованого розчину Рінгера-Локка при профузній крововтраті призводить до підтримання функціональних та біохімічних показників серця.

1. Внутрішньовенна замісна інфузія розчину Рінгера-Локка призводить до зростання рівня продуктів ВРО на третій хвилині інфузії – ПЗ (від 2,58±0,18 до 11,28±2,05 мкмоль/г тканини, р<0,01), ДК (від 0,88±0,09 до 8,59±2,71 мкмоль/г тканини, р<0,01), МДА (від 1,65±0,16 до 2,07±0,04 мкмоль/г тканини); оксигенування розчину сприяє ще більш вираженому порушенню оксидантного гомеостазу тканин серця – зростанню ПЗ (від 2,58±0,18 до 19,71±3,5 мкмоль/г тканини, р<0,01), ДК (від 0,88±0,09 до 9,67±2,17 мкмоль/г тканини, р<0,01), МДА (від 1,65±0,16 до 2,33±0,13 мкмоль/г тканини). Аналогічні, але більш виражені зміни спостерігалися на шостій хвилині інфузії.

2. Внутрішньовенна замісна інфузія розчину Рінгера-Локка призводить до зниження активності ферментів антиоксидантної системи на третій хвилині інфузії – СОД (від 185,82±6,71 до 127,9±4,75 у.о./(хв?мг) білка, р<0,01), ГП (від 36,13±2,64 до 19,71±0,98 мкмоль/(хв?г) білка, р<0,01), ГР (від 21,22±1,04 до 18,04±0,80 мкмоль/(хв?г) білка); інфузія оксигенованого розчину Рінгера-Локка призводить до ще більш вираженого зниження рівня ферментів антиоксидантного захисту – СОД (від 185,82±6,71 до 110,18±8,36 у.о./(хв?мг) білка, р<0,01), ГП (від 36,13±2,64 до 17,09±0,73 мкмоль/(хв?г) білка, р<0,01), ГР (від 21,22±1,04 до 14,42±0,88 мкмоль/(хв?г) білка, р<0,01). Аналогічні, але більш виражені зміни спостерігалися на шостій хвилині інфузії.

3. Введення в неоксигенований розчин Рінгера-Локка, що інфузується антиоксидантів призводить до зменшення зростання рівня продуктів ВРО - ДС (від 11,28±2,05 до 6,37±1,04 мкмоль/г тканини, р<0,05), ДК (від 8,59±2,71 до 2,32±0,46 мкмоль/г тканини, р<0,05), МДА (від 2,07±0,04 до 1,59±0,17 мкмоль/г тканини), але при цьому спостерігалася відсутність ефекту на активність ферментів антиоксидантного захисту – їх активність залишалася як і раніше низькою; ці зміни були більш вираженими при додаванні антиоксидантів в оксигенований розчин.

4. Внутрішньовенна замісна інфузія стандартного розчину Рінгера-Локка призводить до зниження ЧСС на 3 і на 6 хвилині, зниження індексу LF/HF на 3 і на 6 хвилині, тоді як інфузія оксигенованого розчину Рінгера-Локка сприяє менш вираженим функціональним порушенням.

5. Внутрішньовенна замісна інфузія розчину Рінгера-Локка призводить до підвищення рівня КФК (від 28,41±1,35 до 59,25±1,46 Е/л) на 3 хвилині, на відміну від цього інфузія оксигенованого розчину Рінгера-Локка призводить до меншого зростання КФК - лише (від 28,41±1,35 до 39,65±1,34 Е/л) на 3 хвилині; а введення в розчин, що інфузується антиоксидантів забезпечує ще менш виражене збільшення активності КФК (від 59,25±1,46 до 49,04±2,28 Е/л) на 3 хвилині.

6. Обидва препарати тіотриазолін, які вже успішно застосовується в клініці, і румосол, що знаходиться на стадії доклінічного випробування, по своєму ефекту є близькими, а по механізму дії відносяться до АО прямої дії, що було підтверджено як в умовах in vitro, так і in vivo. При інфузії розчину Рінгера-Локка з цими препаратами в тканинах серця тварин з тотальною крововтратою значно знижуються концентрації продуктів ВРО, тоді як активність власних антиоксидантних ферментів залишається тією ж.

7. Отримані дані про те, що застосування антиоксидантів “прямої дії” з оксигенованим розчином Рінгера-Локка при заміщенні профузної крововтрати надає стабілізуючу дію на оксидантний гомеостаз серця, упроваджені в учбовий процес кафедр нормальної фізіології Харківського і Львівського медичних університетів, Української стоматологічної академії, Дніпропетровської медичної академії.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Алустаз Мохаммед М.М., Филимонов В.И. Исследование функционального состояния сердца крыс с помощью оценки вариабельности сердечного ритма в условиях замещения крови оксигенированными растворами с антиоксидантами // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: Зб. наук. праць. – Запоріжжя, 2004. – Вип. VIII. – 2004. – С. 193-199.

Автором вивчено функціональний стан серця за допомогою оцінювання варіабельності серцевого ритму в умовах заміщення крові оксигенованим розчином з антиоксидантами.

2. Мохаммед М.М. Алустаз. Влияние на сердце замещения кровопотери инфузией оксигенированных растворов с антиоксидантами // Запорожский медицинский журнал. – 2004. – № 4. – С. 77-79.

3. Мохаммед М.М. Алустаз. Стан вільнорадикального окислення в серці в умовах заміщення крововтрати оксигенованим розчином з антиоксидантами // Медичні перспективи. – 2004. – Т. IX, №2. – С. 14-18.

4. Филимонов В.И., Алустаз М.М. Физиологический подход к восстановлению сердечной деятельности // Фізіологічний журнал. – 2002. – Т. 48, № 2. – С. 79-80.

5. Мохаммед М.М. Алустаз. Использование оксигенированного раствора для массивной кровопотери // Матеріали до наукової конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю. – Вінниця, 2004. – С. 67.

6. Мохаммед М.М. Алустаз, Филимонов В.И., Беленичев И.Ф. Оксидантный гомеостаз тканей сердца в условиях замещения кровопотери гипероксигенированным раствором с антиоксидантами // І.М. Сєченов та Одеська школа фізіологів: Тези доповідей науково-практичної конференції з міжнародною участю, присвяченої 175-річчю з дня народження І.М. Сєченова. – Одеса: “Чорноморья”, 2004. – С. 145-148.

7. Филимонов В.И., Алустаз М.М., Филимонов Р.В. Перспективы использования гипероксигенированных растворов // Всеукраинская научно-практическая конференция с международным участием “Лекарства – человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств”: Материалы конференции (3 февраля 2005 г.). – Харьков, 2005. – С. 303-305.

Мохаммед М.М. Алустаз. Вплив оксигенації кровозамісного розчину на оксидантний гомеостаз і стан серця щурів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття нукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.03 – нормальна фізіологія. – Донецький державний медичний університет ім. М. Горького, Донецьк, 2006.

Дисертація присвячена одному з актуальних питань сучасної фізіології – визначенню пріоритетності двох чинників: інтенсіфікації вільнорадікального окислення чи нестачі кисню в порушенні функціонального стану серця та оксидантного гомеостазу його тканин, а також науковому обґрунтуванню використання оксигенованих під тиском в 3 атм розчинів з антиоксидантами як розчинів, що підтримують оксидантний гомеостаз тканин серця, так і його функціональний стан.

Показано, що інфузія як стандартного, так і оксигенованого розчинів, Рінгера-Локка супроводжувалася різким підвищенням концентрації продуктів вільнорадикального окислення на фоні зниження активності ферментів антиоксидантнго захисту.

Додавання в оксигенований розчин антиоксидантів прямої дії