МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

КРИМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. С.І. ГЕОРГІЄВСЬКОГО

БЕССАЛОВА ЄВГЕНІЯ ЮРІЇВНА

УДК 611- 08 + 611.821+ 611.631: 591.4 + 59.082

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ ЯЄЧНИКІВ ССАВЦІВ

ПРИ ПАРЕНТЕРАЛЬНОМУ ВВЕДЕННІ

КСЕНОГЕННОЇ СПИННОМОЗКОВОЇ РІДИНИ

14.03.01 – нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Сімферополь – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Кримському державному медичному університеті

ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, м. Сімферополь.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Ткач Владислав Вікторович, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, професор кафедри нормальної анатомії людини.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Бобін Володимир Вікторович, Харківський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри нормальної анатомії;

доктор медичних наук, професор Фоміних Тетяна Аркадіївна, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, професор кафедри загальної хірургії з курсом оперативної хірургії та топографічної анатомії.

Провідна установа: Івано-Франківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра анатомії людини.

Захист відбудеться “04” жовтня 2006 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 52.600.02 при Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського (95006, Україна, АР Крим, м. Сімферополь, бул. Леніна, /7).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (95006, Україна, АР Крим, м. Сімферополь, бул. Леніна, /7).

Автореферат розісланий “ 28” серпня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.О. Мороз

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Спинномозкова рідина – це гуморальне середовище центральної нервової системи, яке забезпечує стан гомеостазу. Оптимальний фізико-хімічний склад спинномозкової рідини (СМР) є необхідною умовою для нормального функціонування мозку та організму в цілому (Л.С. Штерн, 1960). Фізіологічна активність зазначеного компоненту центральної нервової системи визначається наявністю широкого спектра біологічно активних речовин різноманітного походження (В.А. Отеллин, 1998). У складі СМР виявлені гіпоталамічні рилізинг-фактори (G. Nikisch, 2005), тропні гормони гіпофіза (S.2001), вазопресин, окситоцин (A.1998), гормони епіфіза (V. Rizzo, 2002; Jiang-Ning Zhou, 2003; M.P.den Berg, 2004), гормони периферичних ендокринних залоз та їх аналоги, які синтезуються клітинами мозку (K. Мurakami, 1999), а також нейропептиди, нейромедіатори, гормони тимуса, фактори росту (P. Koehne, 2002), простагландини, амінокислоти, вітаміни, лізоцим тощо. Вміст білка в СМР низький, її парентеральне введення не викликає імунопатологічних реакцій, міжвидової та індивідуальної імунологічної несумісності, тератогенної та ембріотоксичної дії (В.В. Ткач, 1998). Низкою авторів встановлені різноманітні ефекти спинномозкової рідини при парентеральному введенні, вказана можлива перспектива використання її як основи лікарських засобів (А.П. Фрідман, 1971; Г.А. Вартанян, 1992; В.В. Ткач (мол.), 2000; В.В. Ткач, 2005). Нині активно вивчаються ефекти впливу ксеногенної спинномозкової рідини (КСМР) при парентеральному введенні на різні системи організму (А.Ю. Родін, 1990; В.В. Ткач 2005, 2006). Враховуючи складність нейрогуморальних механізмів регуляції функцій жіночої репродуктивної системи (О.В. Волкова, 1999), особливе зацікавлення виявляють механізми та результати впливу КСМР на статеву систему самок поліестричних ссавців та людини. Проте цьому питанню в сучасній літературі приділяється мало уваги.

Препарати біогенного походження широко використовуються в різних галузях медицини. Перспектива розробки препаратів цієї групи визначається їх здатністю здійснювати поліфункціональну дію на всіх рівнях нейрогуморальної регуляції, а також підсилювати захисні та адаптаційні можливості організму (В.Г. Морозов, 2000; В.В. Ткач 2001; Г.В. Долгов, 2004).

Питання репродукції людини та ссавців мають велике практичне значення для медико-біологічних, сільськогосподарських та соціально-демографічних наук. Використання препаратів біогенного походження в акушерсько-гінекологічній практиці є обґрунтованим, зважаючи на їх багаторівневу дію на багатоступеневу систему регуляції репродуктивної функції жінок. Тому вивчення репродуктивних показників та морфофункціональних змін у яєчниках поліестричних ссавців при парентеральному введенні КСМР є актуальним питанням медичної науки.

Багаторічні дослідження вчених-морфологів Кримського державного медичного університету дозволили виявити широкий спектр біологічних ефектів КСМР. Зокрема, проаналізовані морфофункціональні зміни сім’яників при парентеральному введенні КСМР (В.И. Бондаренко, 1989). Водночас, репродуктивні показники та морфофункціональні зміни яєчників ссавців при парентеральному введенні КСМР не були предметом дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках плану наукових досліджень Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського і є фрагментом комплексної наукової роботи “Розробка нового імунобіологічного препарату із спинномозкової рідини великої рогатої худоби (корів)”, державна реєстрація № 01.93U041176.

Мета дослідження. Визначити зміни морфофункціонального стану яєчників і пов’язаних з ними показників фертильності ссавців при парентеральному введенні ксеногенної спинномозкової рідини.

Задачі дослідження.

1. Визначити анатомічні та гістологічні критерії оцінки стану яєчників ссавців при парентеральному введенні КСМР з аналізом можливих змін фізіологічних процесів.

2. Вивчити вплив КСМР на динаміку морфологічних змін у яєчниках ссавців на етапах становлення їх репродуктивної системи в різні періоди постнатального розвитку.

3. З’ясувати вікову динаміку настання статевої зрілості щурів при парентеральному введенні КСМР.

4. Вивчити стан естральних циклів як провідних показників фертильності при парентеральному введенні КСМР в різні періоди постнатального розвитку.

5. Оцінити здатність до розмноження і стан приплоду білих щурів та свиней при введенні їм КСМР в різні періоди постнатального розвитку.

Об’єкт дослідження. Закономірності репродуктивної функції та морфологічних змін внутрішніх жіночих статевих органів під впливом ксеногенної спинномозкової рідини.

Предмет дослідження. Морфофункціональні зміни яєчників і показники фертильності білих щурів лінії “Вістар” та свиней великої білої породи при парентеральному введенні спинномозкової рідини лактуючих корів.

Методи дослідження. 1. Фізіологічні методи - для прижиттєвого дослідження репродуктивної функції. 2. Морфологічні методи: а) макроскопічні - для визначення структури яєчників на органному рівні; б) гістоморфологічні - для визначення структури яєчників на тканинному рівні; в) гістохімічні – для встановлення активності метаболічних процесів та змісту ліпідів як непрямих показників стероїдогенезу в тканинах яєчників; г) гістометричні - для визначення особливостей фолікулогенезу та активності атретичного процесу, аналізу співвідношення строма-паренхіма в яєчниках. 3. Статистичні методи – для аналізу та встановлення вірогідності кількісних показників даних прижиттєвих і морфологічних досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на великому експериментальному матеріалі вивчені морфофункціональні зміни яєчників, а також показники фертильності білих щурів та свиней при парентеральному введенні прижиттєво взятої КСМР на різних етапах постнатального розвитку за допомогою фізіологічних, морфологічних, морфометричних, гістохімічних і статистичних методів дослідження. Вивчено вплив КСМР на структуру та функцію яєчників після введення її в періодах новонародженості, статевого дозрівання та зрілому віці. Вивчена можливість застосування КСМР як натурального біологічного агента з метою регулювання фертильності самок ссавців. З’ясовано, що СМР лактуючих корів пригнічує функції репродуктивної системи самок поліестричних ссавців. Виявлені затримка приросту маси і термінів настання статевої зрілості, зміни естральних циклів (збільшення тривалості циклу, скорочення фази проеструсу, подовження еструсу і діеструсу), зниження показників фертильності, зміни органометричних показників гонад, а також співвідношення генеративних елементів і строми, показників фолікулогенезу, зміни гістотопографії ліпідів у гормоносинтезувальних структурах яєчника. При введенні КСМР самкам свиней виявлені відсутність (припинення) естральних циклів та безплідність, морфологічною основою якої є ановуляція та активація атрезії в яєчниках.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень мають важливе теоретичне значення: виявлені нові біологічні властивості КСМР; з’ясована роль лікворної ланки в регуляції функцій репродуктивної системи самок ссавців; встановлена можливість моделювання стану донора у реципієнта при парентеральному введенні КСМР завдяки біологічно активним речовинам, які містяться у ній.

Практичне значення одержаних результатів полягає в можливості використання препарату на основі КСМР у тваринництві (ветеринарії) і медицині з метою корекції гормонального статусу. При подальших розробках в цьому напрямку можливе створення препарату з перспективою використання з ціллю регуляції ендокринної функції в акушерстві та гінекології: у гінекології подібні препарати могли б застосовуватися при таких захворюваннях – передчасне статеве дозрівання, ювенільні маткові кровотечі, дисфункціональні маткові кровотечі в зрілому віці, патологія репродуктивної системи в літньому і старечому віці (клімактеричний синдром, поєднаний з остеопорозом) як засіб замісної гормональної терапії, а також для регулювання народжуваності (контрацепція). В акушерстві є перспектива використання подібних препаратів з метою лікування передчасного переривання вагітності, особливо в ранні терміни, для нормалізації перебігу гестаційного процесу при недостатності функції жовтого тіла. В перспективі також можлива розробка препаратів на основі спинномозкової рідини для використання при гормонально залежних пухлинах та передпухлинних станах яєчників, матки, грудної залози. Одержані результати можуть бути основою для розробки недорогих і безпечних ліків на основі біологічного субстрату.

Матеріали дисертації впроваджені в навчально-педагогічний процес і наукову роботу кафедр нормальної анатомії людини, гістології, цитології і ембріології, патологічної анатомії, акушерства і гінекології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського, кафедр технології виробництва, зберігання і переробки продукції тваринництва та охорони праці і безпеки життєдіяльності з курсом гістології Південної філії “Кримський агротехнологічний університет” Національного аграрного університету, кафедр анатомії людини Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м. Київ), Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава), Сумського державного університету, Івано-Франківського державного медичного університету, Дніпропетровської державної медичної академії, Донецького державного медичного університету ім. М. Горького, Запорізького державного медичного університету. Матеріали дисертації впроваджені в практику свинарства ВАТ “Широке” Сімферопольського району автономної республіки Крим.

Особистий внесок здобувача. Дисертація виконана автором самостійно: проаналізовані актуальність і ступінь вивчення проблеми, розроблені мета і задачі дослідження, визначений методологічний підхід, згідно з яким проведено експеримент, зроблений забір КСМР, виконані прижиттєві і морфологічні дослідження, проведені аналіз, систематизація і статистична обробка одержаних результатів, розроблені головні положення дисертації, на основі яких обґрунтовані наукові висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Дисертаційна робота апробована на засіданні Кримського відділення Наукового товариства анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України, засіданні кафедри патологічної анатомії Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського. Матеріали дисертації оприлюднені на таких наукових форумах: 72-й та 73-й студентських науково-практичних конференціях Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (Сімферополь, 2000; 2001), IX Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Луганськ, 2002), симпозіумі “Біологія опорно-рухового апарату” (Сімферополь, 2004), II відкритій науково-практичній конференції “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Сімферополь, 2005), науково-практичній конференції “Сучасні методи в дослідженні структурної організації органів та тканин” (Судак, 2006), Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії” (Чернівці, 2006), IX Міжнародній науково-практичній конференції “Наука та освіта – 2006” (Дніпропетровськ, 2006), I Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні наукові досягнення – 2006” (Дніпропетровськ, 2006), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Проблеми сучасної морфології” (Полтава, 2006), Міжнародній науково-практичній конференції “Європейська наука ХХI сторіччя: стратегія і перспективи розвитку – 2006” (Дніпропетровськ, 2006), XI Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств, (Полтава, 2006), Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми сучасних наук: теорія і практика – 2006” (Дніпропетровськ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, у яких відображено основні результаті дослідження. Серед них 5 статей опубліковано у фахових наукових виданнях України (з них 3 одноосібні).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 224 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалу і методів, трьох розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Бібліографічний перелік містить 301 найменування, з них 182 авторів країн СНД і 119 – іноземних, викладений на 33 сторінках. Текст ілюстрований 16 таблицями та 120 рисунками, що складає 41 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. СМР отримували від лактуючих корів червоної степної породи 4-6-річного віку через 2-3 тижні після першого отелення (фізіологічна ановуляція). Забір ліквору здійснювали без анестезії методом субокципітальної пункції за допомогою голки Біра. СМР брали у напівзакриту систему для прижиттєвого отримання ліквору великої рогатої худоби (В.В. Ткач (мол), 2000). Ліквор збирали у стерильні пластикові системи ПК-11-01 для консервування крові. СМР в рідкому азоті доставляли до Кримської республіканської станції переливання крові, де її зберігали в холодильниках типу НС 12/50 при температурі від –40 до –70 оС. Мета даного способу отримання та консервації – збереження максимальної кількості біологічно активних речовин. Для цього СМР в замороженому стані направляли на Білгород-Дністровський завод медичних виробів (Одеська область) для гамма-стерилізації на промисловій установці “Стерилізатор-3” протягом 5 годин при експозиції 1,5 Мрад. СМР зберігали на станції переливання крові в замороженому стані. Одержаний таким способом біологічний препарат являє собою суцільну, прижиттєво взяту, кріоконсервовану, гамма-стерилізовану спинномозкову рідину лактуючих корів, який використовували для подальших експериментальних досліджень.

Дослідження проведено на самках поліестричних ссавців: 160 самок білих щурів лінії “Вістар” і 120 самок свиней великої білої породи.

Білі щури розділені на такі групи: 1 - новонароджені (1 доба життя), 2 - нестатевозрілі (30 доба життя), 3 - статевозрілі (90-110 діб життя). Ліквор вводили одноразово в порожнину очеревини з розрахунку 2 мл/кг. Залежно від віку в кожній групі разова доза становила 0,015, 0,1 і 0,5 мл відповідно. Для точнішого дозування, перед введенням КСМР тваринам 1 і 2 груп, її розводили стерильним 0,9% розчином NaCl у співвідношенні 1:1 і ретельно перемішували. Третя група розділена на дві підгрупи в залежності від кратності введення КСМР (3А – одноразове введення, 3Б – багаторазове введення через день протягом 30 діб у тій же дозі, курсова доза становила в середньому 8 мл). Для вивчення динаміки морфологічних змін у яєчниках тварин 1 і 2 груп забивали поетапно: через 30 діб після введення КСМР, у віці 90, 180 діб, щурів 3А групи забивали у віці 180 діб, 3Б групи – 270 діб. У всіх щурів у віці 80-150 діб щоденно брали піхвові мазки з метою визначення динаміки естральних циклів.

Свині розділені на 3 групи, вікова періодизація яких відповідає віковим групам щурів: 1 - новонароджені (14 доба життя), 2 - нестатевозрілі (60 доба життя), 3 - рання статева зрілість (180 доба життя). Ліквор свиням вводили одноразово внутрішньом’язово з розрахунку 2 мл/кг. Свиней 1 групи забивали у віці 14 місяців, коли вони досягають зрілості. Свині 2 групи розділені на 3 підгрупи, в кожній з яких тваринам диференційовано вводили суцільний ліквор, ліквор, проведений крізь бактеріальні фільтри, чи надфільтрат ліквору. Надфільтрат одержували методом вимивання залишку на фільтрі дистильованою апірогенною водою в кількості 250 мл після проводки 600 мл суцільного ліквору. Тобто, надфільтрат був змитий водою і розведений до кількості 250 мл. Свиней 2 групи забивали поетапно з метою вивчення динаміки морфологічних змін. Свиней 3 групи забивали у віці 9 місяців.

Усім контрольним тваринам вводили 0,9 % розчин NaCl за тією ж схемою. Кількість тварин, задіяних в експерименті, розраховували так, щоб при виведенні їх з експерименту на кожному етапі було по 10 щурів та свиней.

Дослідження проведено такими методами:

1. Фізіологічні методи: прижиттєвий контроль динаміки приросту маси тіла, спостереження за статевим циклом і статевою поведінкою щурів та свиней, визначення термінів відкриття піхви і появи першої тічки, аналіз піхвових мазків, оцінка придатності до розмноження, визначення тривалості вагітності, чисельності потомства і динаміки приросту маси приплоду у щурів; взяття піхвових мазків з наступною цитологічною характеристикою, яка дає можливість встановити стадію естрального циклу; встановлення середньої тривалості циклів за період 30 діб; вираховування коефіцієнта кожної стадії естрального циклу за формулою:

K = a / b x 100%

де: К – коефіцієнт стадії циклу, a – кількість діб, які належать до даної стадії циклу за період спостереження, b – загальна тривалість дослідження (у наших дослідженнях – 30 діб).

Відповідно до цього встановлювали коефіцієнти проеструсу (п), еструсу (э), метеструсу (м), діеструсу (д), визначаючи їх Кп, Ке, Км, Кд.

2. Макроскопічні методи: А) макроскопічний опис яєчників; Б) морфометричні та кількісні методи згідно з рекомендаціями О.В. Волкової: вимірювання абсолютної маси яєчників (мг, г); визначення відносної маси яєчників за формулою:

Мвідн = Мабс / Мтвар х 100%

де: Мвідн – відносна маса яєчника (%), Mабс – абсолютна маса яєчника (г), Мтвар – маса тварини (г);

- обчислювання індексу впливу лікворного препарату (I) за формулою:

І = Мд / Мк

де: Мд – середня величина маси правого яєчника в досліді (мг, г), Мк – середня величина маси правого яєчника в контролі (мг, г),

- органометричні дослідження: встановлення довжини, ширини і товщини яєчника, діаметра жовтих і атретичних тіл, діаметра великих фолікулів (мм);

- обчислювання об’єму яєчників за формулою:

V = ?ABC / 6

де: V – об’єм яєчника (мм3, см3), A – довжина, В – ширина яєчника, С – товщина яєчника (мм, см);

- обчислювання питомої ваги яєчника за формулою:

Pnum = Mabc / V

де: Pпит – питома вага яєчника (мг/мм3, г/см3), Mабс – абсолютна маса яєчникамг, г), V – об’єм яєчника (мм3, см3);

- обчислювання абсолютного числа фолікулів різного діаметра, атретичних і жовтих тіл у яєчниках свиней на серійних сагітальних зрізах товщиною 1 мм;

- аналіз співвідношення строма – паренхіма методом зіставлення площі стромальних і генеративних елементів у яєчниках;

- обчислювання площі судин яєчників.

3. Мікроскопічні методи: А) Гістоморфологічні методи: оглядові методи забарвлення гематоксиліном і еозином, за методом ван Гізон; забарвлення колагенових волокон за методами Mаллорі, Гейденгайна, Массона.

Б) Гістохімічні методи: встановлення активності оксидоредуктаз (СДГ – за методом Нахласа, ЛДГ – за методом Пірса, Гесса, Скарпеллі); виявлення загальних ліпідів суданом чорним В і нейтральних ліпідів суданом III і IV.

В) Гістоморфометричні методи згідно з рекомендаціями О.В. Волкової: встановлення активності ферментів та інтенсивності забарвлення продуктів гістохімічної реакції напівкількісним методом; вимірювання лінійних розмірів компонентів яєчників (товщина оболонок фолікулів і овоцитів, діаметра фолікулів, овоцитів, ядер овоцитів) диференційовано в фолікулах різних генерацій; вимірювання площі різних структур гонад (площа фолікулів, овоцитів і їх ядер) диференційовано в фолікулах різних генерацій.

4. Статистичні методи. Результати зведені в структуровану базу даних і оброблені програмним засобом MS Office – Excel. Вивчення фолікулогенезу і морфометричне дослідження яєчників виконане за допомогою системи комп’ютерного аналізу мікроскопічних зображень (світловий мікроскоп OLIMPUS СХ-31, цифрова камера OLIMPUS С5050Z) при збільшенні 100, 400, 1000 з використанням прикладної ліцензійної програми “Видеотест-Морфология” (Свідоцтво про офіційну реєстрацію програми для ЭВМ № 990 537 від 27 липня 1997 р.) відповідно до основних принципів стереології в морфометрії. Мікрофотографії друкували на принтері STYLUS-С84. Фолікули систематизували за класифікацією Pedersen, Peters, модифікувавши її в експериментах зі свинями.

Результати дослідження та їх аналіз. Підсумовуючи результати прижиттєвих методів досліджень впливу КСМР на репродуктивну систему самок білих щурів, необхідно виокремити такі закономірності:

1. Парентеральне введення КСМР самкам білих щурів у різні періоди онтогенезу викликає затримку термінів настання статевої зрілості: у 1 піддослідній групі термін відкриття піхви на 58,3% більше, ніж у контролі (Р<0,001), термін появи першої тічки - на 33,3% (Р<0,001); у 2 групі ці терміни більше на 20,8% (Р<0,001) і 20,7% (Р<0,001) відповідно.

2. При введенні КСМР збільшується тривалість естральних циклів (у контролі – 4,1 діб; у 1 піддослідній групі – 5,1; 2 – 5,2; 3А – 4,6; 3Б – 6,7; Р<0,01) завдяки збільшенню тривалості фаз еструсу і діеструсу, при цьому максимально подовжується еструс і скорочується проеструс (табл. 1).

3. У піддослідних тварин змінюються показники фертильності: збільшується тривалість вагітності (у 1 групі – на 9,7%, Р<0,01; у 2 – на 5,6%, Р<0,05; у 3А зміни не вірогідні, у 3Б – на 9,0%, Р<0,01), зменшується кількість щурят у приплоді (у 1 групі – на 48,0%, Р<0,001; 2 – на 35,4%, Р<0,001; 3А – на 31,2%, Р<0,01; 3Б – на 27,6%, Р<0,01), збільшується маса щурят (у 1 та 3А групах зміни не вірогідні; у 2 групі – на 24,8%, Р<0,001; у 3Б – на 4,1%, Р<0,01).

4. При одноразовому введенні КСМР зміни репродуктивних показників більше виражені при введенні в 1 добу життя, менше виражені при введенні на 30 добу і зворотні при введенні КСМР щурам на 90 добу життя. Багаторазове введення ліквору викликає максимальні зміни в динаміці естральних циклів.

5. Динаміка приросту маси приплоду, народженого піддослідними самками, вірогідно переважає над динамікою приросту маси контрольних

тварин у період від народження до статевого дозрівання і є максимальною при введенні КСМР самкам на 30 добу життя, менше виражені зміни динаміки приросту маси щурят в інших групах тварин.

Таблиця 1

Коефіцієнти фаз естральних циклів щурів

Гру-па | Коефіцієнти фаз циклів (%)

Кп/е | Кп | Ке | Км | Кд

1 Д | 9,33±1,46*** | 13,67±1,07*** | 27,33 ± 1,53 | 25,00±1,41 | 34,00±3,05*

2 Д | 9,33 ± 1,95** | 14,33±1,15*** | 26,33 ± 1,67 | 26,00±1,95 | 33,33±2,72*

3А Д | 8,33 ± 1,41** | 18,50 ± 1,45** | 31,17±0,91*** | 28,00±1,30 | 22,33±0,92*

3Б Д | 8,67 ± 1,50** | 7,67 ± 1,66*** | 45,00 ± 6,40* | 22,00±2.88 | 25,33±4,95

К | 1,67 ± 0,59 | 23,83 ± 0,64 | 25,50 ± 0,64 | 25,67±0,75 | 25,00±0,59

Примітка: Д – дослід, К – контроль, * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.

Кп/е коефіцієнт скороченого проеструсу, Кп, Ке, Км, Кд – коефіцієнти проеструсу, еструсу, метеструсу, діеструсу відповідно.

Отже, теоретичні припущення можливості впливу на естральні цикли і показники фертильності ссавців шляхом парентерального введення КСМР підтверджені у експерименті, що є підґрунтям для розробки біопрепаратів на основі КСМР, які впливають на регуляцію функцій гонад та репродуктивність.

Морфологічними дослідженнями яєчників виявлено такі закономірності.

У контрольній групі з ростом тварин відбувається прогресивний ріст яєчників, який супроводжується збільшенням їх маси та об’єму. Зменшення коефіцієнта маси відбувається в період 30-90 діб, пізніше цей показник збільшується. Ріст питомої ваги гонад продовжується до періоду ранньої статевої зрілості, питома вага яєчників щурів у віці 90 і 180 діб відрізняється незначно, відбувається синхронізація приросту маси і об’єму гонад. Питома вага досягає максимальної величини у віці 270 діб. В віці 30-60 діб відбувається інтенсивний ріст фолікулів з формуванням текальних оболонок, що супроводжується атрезією всіх великих фолікулів. У віці 90 діб одночасно з формуванням атретичних тіл відбувається овуляція, формуються жовті тіла, повністю оформлені строма і судинний апарат яєчника, які зазнають значних перебудов у процесі фолікулогенезу, що залежить від циклічної активності гіпоталамо-гіпофізарної системи. У віці 180 діб морфологія яєчників свідчить про розквіт репродуктивної функції, відбувається максимальний розвиток паренхіматозних елементів гонад, які включають гормоносинтезувальну інтерстиційну тканину (клітини внутрішньої теки, інтерстиціоцити, інтерстиційні клітини атретичних тіл) і жовті тіла. З ростом і дозріванням змінюється співвідношення паренхіма – строма з переважанням стромальних структур над генеративними у щурів старшої вікової групи.

У щурів 1 піддослідної групи зменшується маса гонад порівняно з контролем (табл. 2), що відображене негативним значеннями індексу I. При цьому більшою мірою зменшується об’єм яєчників порівняно з контролем, а, отже, відбувається ущільнення орган, яке проявляється збільшенням його питомої ваги. Морфологічні особливості фолікулярного апарату свідчать про запізніле настання статевої зрілості. Морфологічний статус яєчників піддослідних щурів 1 групи відповідає статусу яєчників контрольних щурів, які знаходяться на більш ранніх етапах розвитку.

У щурів 2 групи маса гонад більша від контролю до віку 90 діб, що відображене позитивним значенням показника I. Пізніше маса яєчників контрольних щурів, навпаки, перевищує масу яєчників піддослідних тварин (табл. 2). При цьому не відбувається змін щільності яєчників порівняно з контролем. На всіх етапах експерименту відносна площа генеративних елементів і судинного русла вища, ніж у контролі. У яєчниках щурів піддослідної групи відбувається активний ріст фолікулів у віці 60 діб, що супроводжується значним розвитком судинного русла органа і формуванням великої кількості атретичних тіл. У решті періодів постнатального онтогенезу відмінності в досліді та контролі несуттєві.

У щурів 3А групи помірно знижені маса та об’єм яєчників порівняно з контролем, що супроводжується збільшенням питомої ваги органів (табл. 2). Морфологічно яєчник практично не відрізняється від контролю. У 3Б групі маса та об’єм яєчників, навпаки, значно збільшені, що відображене високим показником I, при цьому максимально зменшена питома вага. В яєчниках щурів 3Б групи порушується фолікулогенез. Всі великі фолікули мають потовщені текальні оболонки, овоцит у них гине, овуляція не настає. Істотні морфологічні зміни яєчників пов’язані з активацією атрезії, відсутністю овуляції, наявністю великої кількості жовтих тіл, очевидно сформованих раніше. Персистенція фолікулів та атретичних тіл, слабкий розвиток строми та судинного русла пов’язані з великими розмірами та низькою питомою вагою яєчників.

Таблиця 2

Вікові органометричні показники яєчників щурів

Гру-

па | Маса щурів (г) | Абсолют-на маса (мг) | Відносна маса (%) | Об’єм (мм3) | Питома вага (мг/мм3) | I

1 група

Д 30 | 22,4±0,7

*** | 5,0 ± 0,4

** | 0,0222 ± 0,0009 | 12,2±1,4

** | 0,43±0,02

** | 0,7

К 30 | 34,9 ± 0,7 | 7,1 ± 0,3 | 0,0203 ± 0,0007 | 23,7±2,9 | 0,32±0,02

Д 90 | 104,4±2,7

*** | 18,3±0,6

*** | 0,0176 ±0,0005

* | 20,3±1,8

** | 0,94±0,05

* | 0,8

К 90 | 153,4 ± 1,7 | 23,9 ± 0,9 | 0,0156 ± 0,0005 | 36,3 ± 5,1 | 0,73±0,07

Д 180 | 188,5±4,1

*** | 39,0±1,5

** | 0,0207 ± 0,0006 | 34,8±2,7

*** | 1,15±0,06

*** | 0,9

К 180 | 216,2 ± 3,8 | 44,8 ± 0,8 | 0,0207 ± 0,0002 | 63,7 ± 2,4 | 0,71±0,02

2 група

Д 60 | 112,1 ± 1,1 | 25,7±0,6

*** | 0,0229±0,0005

*** | 41,2±2,1

** | 0,63±0,02 | 1,4

К 60 | 109,8 ± 2,7 | 18,2 ± 0,6 | 0,0166 ± 0,0005 | 31,2 ± 1,7 | 0,59±0,02

Д 90 | 146,0±1,5

** | 27,6 ± 0,7 | 0,0189±0,0005

** | 45,9 ± 3,5 | 0,62±0,04 | 1,1

К 90 | 153,4 ± 1,7 | 25,7 ± 1,3 | 0,0167 ± 0,0008 | 41,1 ± 5,4 | 0,67±0,05

Д 180 | 225,8 ± 5,4 | 35,2±1,9

** | 0,0155±0,0005

*** | 44,3±6,5

* | 0,89±0,09 | 0,8

К 180 | 218,8 ± 6,1 | 44,9 ± 0,9 | 0,0207 ± 0,0007 | 65,9 ± 3,3 | 0,69±0,02

3 група

Д 3А | 251,4±6,3

*** | 39,5±1,2

*** | 0,0158±0,0006

*** | 48,2±2,3

*** | 0,83±0,02

** | 0,8

К 3А | 210,4±2,3 | 47,5±0,5 | 0,0226 ± 0,0005 | 65,1 ± 1,9 | 0,73±0,02

Д 3Б | 267,2±3,2

* | 99,0 ± 7,7

* | 0,0369±0,0026

* | 153,8±14,3 * | 0,66±0,03

*** | 1,3

К 3Б | 257,6±2,7 | 73,8 ± 1,9 | 0,0286 ± 0,0006 | 67,1 ± 2,3 | 1,11±0,04

Примітка: Д – дослід, К – контроль, поруч цифрами вказані вікові підгрупи;

* Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001%.

В яєчниках інтактних свиней виявлені взаємопов’язані вікові загально-біологічні закономірності росту і диференціювання генеративних і стромальних елементів, які мають циклічний характер у статевозрілих свиней. Виявлена специфічна для свиней особливість фолікулогенезу: полярність росту фолікулів (особливо виражена до стадії передпорожнинних фолікулів), яка пов’язана з індукуючим впливом строми, підтвердженим при гістохімічних дослідженнях.

Результати прижиттєвого спостереження за динамікою приросту маси та статевою циклічністю свиней дозволяють стверджувати, що під впливом КСМР відбуваються такі зміни:

1. При введенні КСМР нестатевозрілим свиням (1, 2 групи) вірогідно знижується маса піддослідних самок порівняно з контрольними. При введенні КСМР статевозрілим свиням (3 група), навпаки, їх маса вірогідно збільшується.

2. Спостерігається ановуляція, відсутність естральних циклів, стійка безплідність у 1 та 2 групах свиней (при введенні КСМР до настання статевої зрілості). Зміни показників фертильності свиней при введенні КСМР до статевого дозрівання незворотні. При введенні КСМР статевозрілим самкам свиней (3 група) спостерігали зміни статевої поведінки, викликані порушенням естрального циклу. Після введення КСМР в період спокою (міжтічковий період) упродовж 30-40 діб тічки не було. Зміни показників фертильності свиней 3 групи зворотні.

Результати морфологічного дослідження яєчників свиней дозволяють стверджувати, що парентеральне введення КСМР викликає низку змін, пов’язаних із наведеними ефектами на показники фертильності.

При введенні новонародженим свиням (1 група) КСМР викликає стійкі морфологічні зміни репродуктивної системи у зрілому віці:

1. Збільшується маса (на 80,7%, Р<0,001), об’єм (на 76,5%, Р<0,01), коефіцієнт маси (на 108,9%, Р<0,001), відносна площа строми (на 37,2%, Р<0,001) і судинного русла (на 35,8%, Р<0,01) яєчників.

2. У яєчниках припиняється ріст більшості порожнинних фолікулів, які досягли діаметра 4-5 мм, лише 1/3-1/4 частка з них продовжує ріст, але, не досягаючи розмірів зрілих преовуляторних фолікулів, зазнає атрезії, перетворюючись на великі атретичні тіла.

3. Потовщується білкова оболонка яєчників.

4. Велика кількість атретичних тіл у яєчниках і велика насиченість їх ліпідними включеннями підтверджує єдиний механізм посилення функції похідних інтерстиційної залозистої тканини при введенні КСМР.

5. Морфометричні показники фолікулогенезу свідчать про наявність дегенеративних процесів у зростаючих фолікулах, загибель овоцитів у них.

При введенні КСМР та її фракцій свиням 2 групи, відбуваються деякі морфофункціональні зміни яєчників. Суцільний ліквор і його надфільтрат викликають пригнічення росту яєчника. У таких гонадах фолікулів, що розвиваються, мало, вони меншого розміру, ніж фолікули в яєчниках інтактних свиней. При введенні проведеного крізь фільтри ліквору спостерігаються протилежні зміни – посилюється ріст численних фолікулів, внаслідок чого яєчник набуває неправильної форми. В яєчниках свиней всіх підгруп у віці 3-9 місяців відбувається активація атретичного процесу, спостерігається відсутність овуляції. Гістохімічні дослідження довели, що при введенні суцільного ліквору відбувається функціональна перебудова строми, яка оточує зростаючі фолікули, що проявляється збільшенням активності ЛДГ порівняно з контролем.

При введенні КСМР свиням в період статевої зрілості (3 група) спостерігається атрезія всіх великих фолікулів, яка супроводжується формуванням великої кількості атретичних тіл та відсутністю овуляції, з послідовним відновленням репродуктивної функції. В яєчниках піддослідних свиней виявлені численні атретичні тіла.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішена актуальна наукова задача щодо вивчення морфофункціональних змін яєчників ссавців при парентеральному введенні ксеногенної спинномозкової рідини в різні періоди їх постнатального онтогенезу. Спинномозкова рідина лактуючих корів поза природним резервуаром істотно пригнічує показники фертильності і детермінує відповідні морфологічні зміни в яєчниках щурів та свиней. Виявлені невідомі раніше властивості спинномозкової рідини можуть бути основою для використання її як біологічного субстрату для виготовлення нових лікарських засобів.

1. Парентеральне введення ксеногенної спинномозкової рідини одноденним і 30-денним самкам білих щурів викликає затримку термінів настання їх статевої зрілості (термін появи першої тічки подовжується на 33,3% і 20,8% відповідно).

2. Парентеральне введення ксеногенної спинномозкової рідини подовжує тривалість естральних циклів (у контролі – 4,1 діб; у 1 піддослідній групі – 5,1 діб; 2 – 5,2; 3А – 4,6; 3Б – 6,7) як провідних репродуктивних складових завдяки збільшенню тривалості фаз еструсу і діеструсу зі значним скороченням фази проеструсу. При одноразовому введенні ксеногенної спинномозкової рідини до настання статевого дозрівання подовжується фаза діеструсу, а введення її статевозрілим самкам викликає виражене подовження фази еструсу; багаторазове введення викликає максимальне подовження естральних циклів за рахунок стадії еструсу.

3. При введенні ксеногенної спинномозкової рідини змінюються показники фертильності: збільшується тривалість вагітності (в 1, 2, 3Б групах – на 5,6-9,7%), зменшується кількість щурят у приплоді (в усіх групах на 27,6-48,0%), збільшується їх маса (в 2, 3Б групах – на 4,1-24,8%). Зміни репродуктивних показників більше виражені при одноразовому введенні ксеногенної спинномозкової рідини у першу добу життя, менше – на 30 добу і зворотні при введенні на 90 добу життя.

4. Приріст маси народжених від піддослідних самок щурят вірогідно переважає приріст маси контрольних тварин аж до статевого дозрівання і є максимальним при введенні спинномозкової рідини самкам на 30 добу їх життя.

5. Парентерально введена ксеногенна спинномозкова рідина викликає схожі морфологічні зміни в яєчниках щурів і свиней, які пов’язані з регресією паренхіматозних елементів, порушенням процесів фолікулогенезу та активацією стромальних компонентів. Ступінь вираженості і характер гістологічних перебудов яєчників під впливом ксеногенної спинномозкової рідини залежать від віку тварин. Максимальні зміни структури яєчників настають при введенні ксеноліквору на ранніх етапах постнатального розвитку.

6. При одноразовому введенні ксеногенної спинномозкової рідини нестатевозрілим щурам значно сповільнюються ріст яєчників і диференціювання їх тканин. Одноразове введення спинномозкової рідини статевозрілим щурам менш ефективне. При багаторазовому введенні статевозрілим щурам збільшується число зростаючих фолікулів з формуванням великих жовтих тіл, які надалі становлять основну масу паренхіми гонад, з наступною атрезією фолікулів та ановуляцією; репродуктивна функція при цьому відновлюється через 30-50 діб.

7. Одноразове введення ксеногенної спинномозкової рідини новонародженим і 2-місячним свиням викликає тривалу безплідність і перешкоджає циклічним змінам репродуктивної системи, що пов’язано з блокуванням фолікулогенезу на етапі селекції домінантних фолікулів; ановуляція зумовлена атрезією всіх порожнинних фолікулів. Аналогічне введення ксеногенної спинномозкової рідини після статевого дозрівання супроводжується зворотними змінами показників фертильності.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Спинномозкову рідину лактуючих корів можна використовувати як засіб біологічної кастрації і регулювання репродукції деяких ссавців в експериментально-морфологічних дослідженнях і тваринницькій практиці.

2. В медицині при подальших розробках в цьому напрямку можливе створення препаратів на основі ксеногенної чи аллогенної спинномозкової рідини з метою регулювання функції ендокринної та статевої систем.

3. У свинарстві можливе використання спинномозкової рідини лактуючих корів для збільшення приросту маси самок свиней віком 8-10 місяців.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Михеева Е.Ю. Цереброспинальная жидкость - ее биологические свойства и влияние на репродуктивную систему млекопитающих животных и человека // Таврический медико-биологический вестник. – 2004. – Т.7, № 4. – С. 89-94.

2. Бессалова Е.Ю., Барсуков Н.П., Ивахненко В.Н. Цитохимическое исследование активности некоторых дегидрогеназ в тканях яичников свиней после парентерального введения прижизненно взятой ксеногенной спинномозговой жидкости крупного рогатого скота // Клінічна та експериментальна патологія. – 2005. – Т.4., № 3. – С. 22-27. (Здобувачем проведено гістохімічне дослідження, опис та узагальнення результатів).

3. Бессалова Е.Ю. Оригинальная классификация фолликулов, адаптированная для экспериментального изучения яичников крупных млекопитающих // Тр. Крым. гос. мед. ун-та им. С.И. Георгиевского “Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения”. – Т. 142, Ч. I. – Симферополь, 2006. – С. 4-5.

4. Бессалова Е.Ю., Королев В.А. Показатели фертильности самок белых крыс при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости // Cвіт медицини та біології. – 2006. – № 1. – С. 5-10. (Здобувачем проведені фізіологічні методи дослідження репродуктивної функції, виконана статистична обробка отриманих результатів, сформульовані висновки).

5. Бессалова Е.Ю. Гистохимическое исследование липидов в тканях яичников млекопитающих при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости // Вісник проблем біології і медицини. – 2006. – Вип. . – С. 177-180.

6. Бессалова Е.Ю., Барсуков Н.П., Ивахненко В.Н. Изменения активности дегидрогеназ в тканях органов половой системы самок свиней при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости (цитохимическое исследование) // Морфология. – 2006. – Т. 129, № 1. – С. 80-84. (Здобувачем проведено гістохімічне дослідження, узагальнення результатів та порівняльний аналіз напівкількісним методом, обгрунтовані висновки).

7. Михеева Е.Ю., Киселев В.В., Кривенцов М.А. Морфофункциональные изменния в органах репродуктивной системы самок свиней при парантеральном введении ксеногенной цереброспинальной жидкости // Материалы 72-й студенческой научной конференции КГМУ. – Симферополь, 2000. – С. 31-32. (Здобувачем проведено гістологічне дослідження, опис та узагальнення результатів).

8. Михеева Е.Ю., Киселев В.В., Кривенцов М.А., Резниченко Ю.Ю. Связь нейроэндокринных и иммунных механизмов мозга как обоснование гетероликворотерапии // Материалы 73-й юбилейной студенческой научно-практической конференции КГМУ. – Симферополь, 2001. – С. 68-69. (Здобувачем проведео аналіз сучасної літератури).

9. Ткач В.В., Пикалюк В.С., Михєєва Є.Ю., Ткач В.В. (мол.), Кісельов В.В., Крівенцов М.А., Самсонова А.Г., Резніченко Ю.Ю. Морфофункціональні зміни в організмі реципієнтів після парентерального введення прижиттєво взятої ксеногенної цереброспинальної рідини лактуючих корів // Тези доп. ІХ конгресу Світової федерації українських лікарських товариств, присвяченому 25-річчю СФУЛТ. – Луганськ; Київ; Чикаго, 2002. – С. 37-38. (Здобувачем викладена частина тез, яка стосується перебудови репродуктивної системи).

10. Бессалова Е.Ю. Исследование содержания липидов в тканях яичников свиней при парентеральном введении прижизненно взятой спинномозговой жидкости крупного рогатого скота // Тез. докл. ІІ науч.-практ. конф. “Актуальные проблемы современной медицины” // Тр. КГМУ им. С.И. Георгиевского “Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения”. – Т. 141, Ч.VI. – Симферополь, 2005. – С. 122.

11. Бессалова Е.Ю. Особенности постановки морфологического эксперимента при изучении репродуктивной функции млекопитающих