БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Боровков Сергій Борисович

УДК 619:616.36 – 004:612.751.3

КЛІНІКО-БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ стану сполучної тканини в ДІАГНОСТИЦІ та лікуванні ОСТЕОДИСТРОФІЇ КОРІВ

16.00.01 – діагностика і терапія тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Біла Церква – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії

Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник – кандидат біологічних наук, професор,

член-кореспондент УААН

Карташов Микола Іванович,

Харківська державна зооветеринарна академія,

завідувач кафедри клінічної діагностики

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор,

член-кореспондент УААН

Влізло Василь Васильович,

Інститут біології тварин УААН,

директор;

кандидат біологічних наук, професор

Стадник Андрій Максимович,

Львівська національна академія ветеринарної медицини

ім. С.З. Гжицького, завідувач кафедри терапії

Провідна установа – Національний центр “Інститут експериментальної і

клінічної ветеринарної медицини УААН”,

відділ біотехнології та лабораторія

фармакології і токсикології, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “14” вересня 2006 р. о 11 00 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.821.02 при Білоцерківському

державному аграрному університеті за адресою: 09111, м. Біла Церква,

вул. Ставищанська, 126; навчальний корпус № 8, ауд. № 1.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Білоцерківського державного аграрного університету за адресою: 09110, м. Біла Церква, Соборна площа, 8/1.

Автореферат розісланий “3” серпня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доцент ____________Чорнозуб М. П.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблеми, пов’язані з розвитком внутрішніх хвороб великої рогатої худоби, завжди були в центрі уваги ветеринарних фахівців. Особливо широко розповсюджені хвороби, спричинені порушенням обміну речовин. У корів молочних порід часто діагностують остеодистрофію (Кондрахін І.П., 1980, 1989, 2000; Борисевич Б.В., 1992, 1997, 1999; Павлов М.Є., 1998; Левченко В.І. зі співавт., 2000). Серед основних причин остеодистрофії дослідники відзначають незбалансоване мінерально-вітамінне живлення, наявність супутніх патологій, зокрема кетозу, утримання на забруднених радіонуклідами територіях та порушення технологічних режимів утримання корів. Вплив останнього фактора на розвиток остеодистрофії у великої рогатої худоби не викликає сумніву, але його механізми висвітлені в літературі недостатньо (Волторністий В.М., 1983, 1987; Плященко С.И., Сидоров В.Т., 1987; Борисевич В.Б. зі співавт., 1992; Порфирьев И.А., 2001).

Для діагностики остеодистрофії корів розроблені і впроваджені в практику клінічні, фізичні, біохімічні та гістологічні методи, кожен з яких не тільки використовується для вирішення наукових і практичних завдань, але й має певні обмеження. Тому багато питань щодо діагностики остеодистрофії, особливо її ранньої стадії, залишаються ще маловідомими (Кондрахин И.П., 1989; Самотаев А.А., Розанов В.И., 1997; Борисевич В.Б., Борисевич Б.В, 2002). Це стосується деяких біохімічних тестів, що характеризують стан мінерального гомеостазу, який змінюється лише при істотних порушеннях системи ендокринної регуляції та значному ступені ушкоджень структури кісткової тканини. Відомості про стан органічної складової кісткової тканини у корів у нормі та при остеодистрофії досить обмежені (Зусмановский А.Г., Самотаев А.А., 1981; Зухрабов М.Г., 1989; Стадник А.М., 2001, 2002). У роботах зарубіжних дослідників описані нові для ветеринарії методи діагностики остеодистрофії: визначення в крові і сечі вмісту остеокальцину, гідроксипроліну, карбокситермінального телопептиду І типу колагену, гідроксипіридиноліну та інші (Palmer J., 1995; Philipov Z.P., 1998; Liesegang А., 1998).

Тому встановлення фізіологічних параметрів біохімічних показників стану сполучної тканини у сироватці крові та сечі корів у нормі і за остеодистрофії та виявлення інформативних тестів для її ранньої діагностики, а також пошук ефективних заходів корекції метаболічних порушень є актуальними напрямами і потребують подальшого вивчення.

Зв’язок дисертаційної роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота є фрагментом наукової теми кафедри клінічної діагностики Харківської державної зооветеринарної академії “Розробка і впровадження нових та вдосконалення існуючих методів лабораторної діагностики для оцінки стану здоров’я тварин”, номер державної реєстрації 0102U003546.

Мета роботи – встановити інформативність біохімічних показників стану сполучної тканини в сироватці крові та сечі корів для діагностики остеодистрофії, особливо на ранніх стадіях, та здійснення контролю ефективності корекції метаболічних порушень при цій патології.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:–

експериментально обґрунтувати та визначити інформативність біохімічних показників стану кісткової системи за даними досліджень сироватки крові й сечі білих щурів та високопродуктивних корів, що знаходяться в умовах обмеженої рухової активності (ОРА);–

обґрунтувати доцільність використання біохімічних показників, що характеризують стан сполучної тканини: концентрація глікопротеїнів (ГП), хондроїтинсульфатів (ХСТ), рівень глікозаміногліканів (ГАГ) і їх фракцій у сироватці крові, вміст оксипроліну (ОП), уронових кислот (УК) і фракцій глікозаміногліканів, а також кальцію (Са) і фосфору (Р) в сечі при обстеженні корів з метою виявлення різних, у тому числі ранніх, стадій остеодистрофії;–

встановити взаємозв’язок між рівнем біохімічних показників у сироватці крові та рівнем молочної продуктивності корів, що може служити фактором, який сприятиме розвитку остеодистрофії; –

обгрунтувати ефективність використання препарату вітаміну D3 та еконіки “Люкон” для лікування корів, хворих на остеодистрофію;–

розробити практичні рекомендації щодо використання біохімічних показників сироватки крові та сечі для діагностики остеодистрофії у корів.

Об’єкт дослідження – порушення обміну речовин у корів.

Предмет дослідження біохімічні показники сироватки крові і сечі, що характеризують стан сполучної тканини, для діагностики остеодистрофії у корів та контролю за ефективністю корекції порушень метаболізму при лікуванні, обгрунтування ефективності застосування препарату вітаміну D3 та еконіки “Люкон” в лікуванні хворих на остеодистрофію корів.

Методи досліджень – клінічні; експериментальне моделювання остеодистрофії у корів та щурів гіпокінезією та внутрішньом’язовим введенням дексаметазону у щурів; біохімічні (визначення у сироватці крові глікопротеїнів, за-гальних хондроїтинсульфатів, фракцій глікозаміногліканів, загального білка та його фракцій, сечовини, креатиніну, глюкози, молочної та піровиноградної кислот, холестеролу, загального кальцію, неорганічного фосфору, активності аланін- і аспартатамінотрансфераз, лужної фосфатази; в сечі – кальцію, фосфору, оксипроліну, уронових кислот, фракцій глікозаміногліканів); гістологічні (гістопрепарати губчастих кісток щурів, зафарбовані гематоксиліном і еозином); методи статистичного аналізу.

Наукова новизна роботи. В експерименті на білих щурах та коровах доведено, що довготривале обмеження рухової активності є фактором, який спричинює деструктивні зміни в кістковій тканині, котрі супроводжуються деполімеризацією макромолекул органічного матриксу кісткової тканини і підвищенням рівня біохімічних показників у сироватці крові (глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, фракцій ГАГ) і сечі (оксипроліну, уронових кислот) на ранніх стадіях патологічного процесу. У дослідах на коровах, хворих на остеодистрофію, запропоновані діагностичні критерії різних, у тому числі ранніх, стадій остеодистрофії з використанням біохімічних показників, що характеризують стан органічного матриксу кісткової тканини. Доведена інформативність цих показників при контролі за лікуванням корів.

Практичне значення одержаних результатів. Установлені ліміти концентрації біохімічних показників сироватки крові (вміст глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, фракцій ГАГ) та сечі (уронових кислот і оксипроліну) для корів, що дає змогу проводити діагностику ранніх стадій остеодистрофії у високопродуктивних корів. Доведена ефективність використання комплексу вітаміну D3 та еконіки “Люкон” для лікування корів, хворих на остеодистрофію. Одержані результати використовуються в науково-дослідній роботі та при викладанні предметів “Ветеринарна клінічна біохімія” і “Внутрішні хвороби тварин” у Білоцерківському державному аграрному університеті, Харківській державній зооветеринарній та Полтавській державній аграрній академіях.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно виконав, проаналізував та узагальнив увесь обсяг експериментальних досліджень. Гістологічні дослідження кісткової тканини виконувалися за консультативної допомоги кандидата біологічних наук, старшого наукового співробітника лабораторії морфології сполучної тканини ХНДІПХС ім. проф. М.І. Ситенка Л.М. Бенгус.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювалися на Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня заснування Харківського зооветеринарного інституту (Харків, 2001 р.), 4-й (Біла Церква, 2003 р.) і 5-й (Біла Церква, 2005 р.) міжнародних науково-практичних конференціях "Проблеми неінфекційної патології тварин", науковій конференції за підсумками науково-дослідної роботи за 2001–2002 рік

(Харків, 2002 р.), науково-практичній конференції хірургів “Сучасні проблеми ветеринарної хірургії” (Харків, 2004 р.).

Публікації за темою дисертації. Результати експериментальних досліджень опубліковані у 7 статтях, що вийшли у фахових виданнях: “Збірник наукових праць Харківського зооветеринарного інституту” (1), “Збірник наукових праць Харківської державної зооветеринарної академії” (1), “Вісник Білоцерківського державного аграрного університету” (2), “Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького” (1), “Наукові праці Полтавської державної аграрної академії” (1), “Вісник Полтавської державної аграрної академії” (1).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 6 розділів результатів власних досліджень, їх узагальнення та аналізу, висновків і пропозицій, списку використаної літератури, що містить 212 джерел, у тому числі 86 – із далекого зарубіжжя. Робота викладена на 125 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 25 таблицями та 18 рисунками. У додатку наведено 7 документів.

Вибір напрямів досліджень, матеріал та методи виконання роботи.

Незважаючи на значну кількість публікацій з патології опорно-рухового апарату у великої рогатої худоби і, зокрема кісткової тканини, біохімічні критерії, які характеризують стан її органічного компонента, у ветеринарній медицині практично не вивчалися. Водночас відомо, що при захворюваннях пов’язаних з порушеннями метаболізму в кістковій тканині, її клітини і білки беруть активну участь у розвитку патологічного процесу. Окрім мінеральної частини, кісткова тканина у своєму складі містить багато органічних компонентів (колагенові і неколагенові білки, глікозаміноглікани тощо) та ферментів, визначення яких може бути доцільним в діагностиці остеодистрофії. Очевидно, що за остеодистрофії у сироватці крові та сечі відбуваються зміни показників, що характеризують стан сполучної тканини, тому їх дослідження мають істотне значення в діагностиці хвороби, особливо на ранній стадії. Проте такі відомості щодо сільськогосподарських тварин у вітчизняній літературі обмежені (Стадник А.М., 2001, 2002). Це й зумовило вибір напряму наших досліджень.

Робота виконувалася протягом 2000–2006 рр. на кафедрі клінічної діагностики та в науково-навчальному центрі тваринництва і рослинництва Харківської державної зооветеринарної академії, у відділі проблем лабораторної діагностики та імунології Інституту патології хребта та суглобів ім. М.І. Ситенка, на базі господарства АТОВ “Харківплемсервіс” Харківського району Харківської області. Проведено клінічне обстеження і лабораторний аналіз крові та сечі 40 щурів і 72 корів. Експерименти проведено відповідно до концепції 3R згідно з загальними принципами експериментів на тваринах, які ухвалені на Першому національному конгресі з біоетики (Київ, 2001) та узгоджені з положеннями Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).

Дослідження проводили за чотири етапи. На першому етапі інформативність біохімічних показників сполучної тканини при діагностиці остеодистрофії вивчали після експериментального відтворення патології на білих щурах лінії Wistar (40 особин). Остеодистрофію моделювали внутрішньом’язовим введенням 2%-ного водного розчину дексаметазону в дозі 9 мг/кг маси тіла, один раз на тиждень протягом місяця (10 особин), а також утриманням тварин у спеціальних клітках для гіпокінезії протягом 28 діб. Щурів, яким вводили дексаметазон, виводили з досліду на 28-у добу, а щурів після ОРА – відповідно на 7-, 14-, 21- та 28-у добу. Шість інтактних щурів були контрольними. Для взяття матеріалу застосовували метод декапітації під гексеналовим наркозом, після чого негайно відбирали проби крові і зразки кісткової тканини для гістологічних досліджень.

Стан кісткової тканини вивчали за наступними показниками: а) в сироватці крові визначали вміст хондроїтинсульфатів (ХСТ) та глікопротеїнів (ГП), фракцій ГАГ, загального кальцію та неорганічного фосфору, активність лужної фосфатази; б) у сечі – вміст оксипроліну, уронових кислот, фракцій ГАГ, кальцію і фосфору. Для гістологічних досліджень використовували грудні та поперекові сегменти хребта білих щурів. Гістологічні препарати фарбували гематоксиліном і еозином.

На другому етапі інформативність біохімічних показників стану кісткової тканини вивчали на коровах АТОВ “Харківплемсервіс” червоно-рябої породи віком 5–7 років, на 5–6-му місяцях лактації, з середньорічною продуктивністю по останній лактації 6000–7000 кг, усього 27 тварин, з яких 9 були клінічно здорові і користувалися щоденним моціоном (контрольна група), 9 – хворі на остеодистрофію (третя стадія) та 9 клінічно здорові, що були переведені на стійлове утримання без моціону протягом 2-х місяців (ОРА). У корів останньої групи кров відбирали на 15-, 30- та 60-ту добу. Після клінічного обстеження корів визначали біохімічні показники крові і сечі, що характеризують стан кісткової тканини.

На третьому етапі вивчали клініко-біохімічні характеристики корів при лікуванні спонтанної остеодистрофії. Дослідження проводили у науково-навчальному центрі тваринництва і рослинництва Харківської державної зооветеринарної академії на 25 коровах чорно- та червоно-рябої порід, віком 5–7 років, продуктивністю 3–4 тис. л молока за лактацію. 7 корів були клінічно здоровими, 18 – з ознаками остеодистрофії, вони увійшли в першу та другу дослідні групи. Тваринам першої дослідної групи внутрішньом’язово ін’єктували препарат “Продевіт-тетра” (1 см3 препарату містить вітаміни: А – 50000 МО; D3 – 25000 МО; Е – 20 мг; F – 5 мг) в середньому по 6 мл кожні 5 днів (усього 10 ін’єкцій). Тваринам другої групи внутрішньом’язово ін’єктували препарат “Продевіт-тетра” за тією ж схемою в поєднанні з препаратом “Люкон” у дозі 8 мг/кг маси тіла протягом 51 дня по 7 днів поспіль з 7-денною перервою після кожного курсу. Всіх корів досліджували клінічно і проводили біохімічний аналіз крові на початку досліду та на 30- і 60-у добу лікування.

На четвертому етапі в АТОВ “Харківплемсервіс” на 30 коровах вивчали вплив високого рівня молочної продуктивності на розвиток остеодистрофії. При виконанні роботи у сироватці крові корів визначали такі показники: загальний білок – біуретовим методом; білкові фракції – електрофорезом на папері в мединал-вероналовому буфері; сечовину – за колірною реакцією з діацетилмонооксимом; креатинін – за колірною реакцією Яффе (метод Поппера); холестерол – за методом Ілька; глікопротеїни – за Штейнбергом–Доценком; фракції ГАГ методом Штерна зі співавт., хондроїтинсульфати – за методом Nеmeth – Csoka у модифікації Л.І. Слуцького; загальний кальцій – комплексонометричним методом з індикатором мурексидом (за Луцьким Д.Я.); неорганічний фосфор – за реакцією з аскорбіновою кислотою (метод Фіске-Субароу); активність АлАТ та АсАТ – уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом за Райтманом і Френкель; лужної фосфатази – за методом Боданські. Вміст оксипроліну у сечі визначали за методом А.А Крель і Л.М. Фурцевої, сумарних уронових кислот – за N. Di Ferrante та C. Rich, фосфору і кальцію – за методикою, описаною в посібнику під редакцією А.А. Покровського (1969), фракційний склад ГАГ – за методом, розробленим у лабораторії ХМДІПХС. У щурів і частини корів визначали також вміст глюкози, лактату і пірувату уніфікованими методами. Математична обробка проводилася статистичними методами з використанням Т-критерію Фішера–Стьюдента та стандартного пакету “Статистика” в програмі ЕХЕL 2000.

Результати досліджень та їх аналіз

Експериментальне відтворення остеодистрофії у білих щурів

Поглиблене вивчення методів діагностики різних стадій остеодистрофії у корів з використанням біохімічних досліджень є актуальною, але досить складною проблемою. Тому дослідженням цього захворювання у корів передували експерименти на білих щурах, які знаходилися в умовах гіпокінезії протягом 28 діб, щурам п’ятої групи внутрішньом’язово вводили дексаметазон (табл.1).

Уже на початкових стадіях гіпокінезії встановлено збільшення вмісту глюкози, пірувату і лактату в сироватці крові (як наслідок стресорної реакції), тенденцію до збільшення концентрації деяких компонентів, але більш істотні та вірогідні зміни значень біохімічних показників спостерігали на 21- і 28-й дні експерименту. До них можна віднести вірогідне збільшення на 21-й день вмісту загальних хондроїтинсульфатів (р0,001), 28-й – глікопротеїнів (р0,05), а на 14-й (р0,01) і 28-й (р0,001) дні – активності лужної фосфатази у порівнянні з контрольною групою, гіперекскрецію кінцевих метаболітів обміну органічних компонентів кісткової тканини. Такі зміни свідчать про посилення катаболічної спрямованості метаболізму хрящової і кісткової тканин внаслідок як реактивного (динаміка глікопротеїнів і сіалових кислот), так і деструктивного характеру (динаміка загальних хондроїтинсульфатів). Про це також свідчить більш виражене зростання концентрації глікопротеїнів на 28-й день досліду синхронно з підвищенням вмісту хондроїтинсульфатів, рівень яких продовжував зростати саме в цей період.

У сироватці крові тварин, яким протягом місяця ін’єктували дексаметазон, спостерігалося значне зростання (р0,001) рівня всіх вищезгаданих показників, порівняно з контрольною групою. Це свідчить про розвиток більш значних деструктивних ушкоджень у тканинах кістково-суглобового апарату, порівняно з щурами, у яких патологію моделювали гіпокінезією. Перші зміни концентрації продуктів метаболізму органічного матриксу кісткової тканини в сечі виявлялися у щурів уже на 7-й день експерименту: вміст оксипроліну підвищився на 45,6 % (р0,001), уронових кислот – 24,7 % (р0,001), що на фоні значних змін фракційного складу ГАГ свідчить про значні порушення у кістковій тканині. На 14-й день досліду вміст оксипроліну в сечі тварин підвищився майже удвічі, порівняно з контролем, а на 28-й – у 2,6 рази (табл.1).

Уміст першої та другої сироваткових фракцій ГАГ, як показників обміну тканинних протеогліканів, що переважно містяться в хрящовій та кістковій тканинах, почав вірогідно змінюватися вже на 7-у добу експерименту. Так, рівень першої фракції ГАГ, в якій кількісно переважає хондроїтин-6-сульфат, знизився на 22,8 % (р0,001), другої і третьої підвищився на 9,8 (р0,05) і 31,6 % (р0,001) відповідно, проте загальна кількість ГАГ зменшилася на 10,7 % (р0,05), що свідчить про порушення синтезу цих компонентів клітинами сполучної тканини внаслідок обмеження рухової активності.

При тривалому терміні (28 днів) обмеження рухової активності у білих щурів спостерігалися більш суттєві зміни складу всіх фракцій ГАГ у порівнянні з контрольною групою. Так, вміст другої і третьої фракцій був підвищеним, порівняно з контролем, на 129,0 і 110,5 % (р<0,001). У цей час відбувається посилення деструктивних змін, про що свідчить не тільки порушення співвідношення окремих фракцій ГАГ, але й збільшення активності лужної фосфатази, концентрації глікопротеїнів і сіалових кислот, що притаманно реактивному процесу.

Введення дексаметазону спричинило ще більш істотні зміни кісткової тканини у вигляді остеомаляції та остеопорозу, що підтверджується даними гістологічних досліджень. У сироватці крові значно підвищилися рівні ХСТ, ГП, сироваткових фракцій ГАГ та активність лужної фосфатази. Вміст оксипроліну в сечі зріс до 49,8±2,0, уронових кислот – до 75,3 ±3,4 мг на добу, порівняно з 6,8±0,4 і 7,7±0,3 в контролі.

Результати дослідів свідчать, що на 7-й день експерименту в сироватці крові виявилася тенденція до зменшення концентрації загального кальцію, що супроводжувалося збільшенням його екскреції з добовою сечею (р0,05) на 22,4 % (рис.1). Останнє, можливо, пов’язано з тим, що у тварин внаслідок стресової реакції на різку зміну умов утримання посилювалося утворення антидіуретичного гормону, що зменшило добовий діурез і сприяло відносному збільшенню екскреції кальцію і фосфору. На 28-й день експерименту рівень кальцію в сироватці крові був зниженим, порівняно з контролем, на 23,7 % (р0,001). Екскреція кальцію в цей термін була вищою на 83,5 % (р<0,001).

Рис.1. Динаміка загального кальцію в сироватці крові та сечі у щурів

протягом гіпокінезії (у відсотках порівняно з контрольною групою)

Але найбільшими змінами біохімічних показників сироватки крові і сечі характеризувалася група щурів, яким уводили дексаметазон. У них відзначали різке (р0,001) зниження вмісту в сироватці крові кальцію і фосфору на 30,2 і 18,0 %, відповідно, при вірогідному зростанні показників добової екскреції цих елементів із сечею (р0,001), у 3,0 та 2,3 рази, що вказує на значну втрату цих елементів організмом.

Підсумовуючи дані розділу, можна твердити, що вже на початкових стадіях остеодистрофії, яка виникає при різкому обмеженні рухової активності, у щурів підвищується вміст окремих фракцій ГАГ у сироватці крові та екскреція оксипроліну, уронових кислот і кальцію з сечею. На більш пізніх термінах до цих змін додається збільшення концентрації глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів та підвищення активності лужної фосфатази. Результати біохімічних досліджень були підтверджені гістологічно змінами губчастої кісткової тканини щурів.

Визначення інформативності показників стану сполучної тканини

в сироватці крові та сечі при діагностиці остеодистрофії у корів

Відомо, що режим гіпокінезії призводить до виникнення і розвитку у великої рогатої худоби багатьох патологій неінфекційного характеру, зокрема остеодистрофії. Виникнення цієї патології у корів у зимово-стійловий період утримання пов’язують як з обмеженням рухової активності, так із невідповідною структурою раціону, недостатністю мінерально-вітамінного живлення, захворюваннями нирок, печінки та дисфункцією залоз внутрішньої секреції, що негативно впливає на метаболізм кісткової тканини.

Тому на другому етапі наших досліджень вивчалася можливість використання комплексу біохімічних показників сироватки крові та сечі для ранньої діагностики остеодистрофії у великої рогатої худоби, яка виникає внаслідок впливу ОРА в зимово-стійловий період утримання.

Утримання тварин в умовах повного виключення моціону протягом двох місяців на фоні незбалансованого мінерально-вітамінного живлення негативно вплинуло на їх клінічний статус. У дослідних тварин, починаючи з 30-го дня такого режиму, знижувалася молочна продуктивність; у трьох корів спостерігалася блідість слизових оболонок, у двох – гіпотонія рубця. Реакція сечі з реактивом Розера у двох тварин дала позитивний результат, що свідчить про розвиток кетозу. У групі контролю за цей період також знизилася молочна продуктивність, але загальний стан і клінічні показники не змінилися. На 60-й день експерименту у тварин дослідної групи спостерігали спотворення смаку та подальше зниження молочної продуктивності. Гіпотонію рубця відмічали у п’яти корів (55,6 %), блідість слизових оболонок – у чотирьох (44,4 %), горбкуватість останньої пари ребер – у двох тварин (22,2 %), чого не спостерігалося на початку досліду. Контрольні тварини мали задовільні клінічний статус та вгодованість протягом усього експерименту.

У тварин з вираженими клінічними ознаками остеодистрофії, які увійшли до п’ятої групи, був спотворений смак; вони неохоче піднімалися та приймали корм, гіпотонія рубця спостерігалася у трьох тварин, а в чотирьох діагностували потовщення зап’ясткових суглобів та асептичний пододерматит. У всіх корів виявили лізис останніх хвостових хребців, виражену горбкуватість та часткове розсмоктування останньої пари ребер (до 1/2 ребра у п’яти тварин). Кон’юнктива анемічна, температура тіла в межах норми, у трьох тварин спостерігали тахіпное. Гіпокінезія спричиняла негативний вплив на функціональний стан і структуру печінки: поступово зменшувався вміст альбумінів (на 30-у добу; р0,01) та збільшувалася активність АсАТ і АлАТ (на 60-у добу; р0,05 і р0,01).

На 15-у добу відмічали тенденцію до зменшення вмісту загального кальцію та вірогідне (р0,01) зниження рівня неорганічного фосфору (на 12,1 %), а на 30-у в корів спостерігали вірогідне (р0,001) зменшення вмісту загального кальцію, неорганічного фосфору (р<0,01) та збільшення активності лужної фосфатази в 1,6 раза (р<0,001; табл. 2).

Таблиця 2 – Біохімічні показники сироватки крові корів в умовах обмеження

рухової активності та хворих на остеодистрофію

Група

Показник | Контроль | Гіпокінезія, днів | При

остеодистрофії | 30 | 60 | Са, ммоль/л | 2,46±0,04 | 2,21±0,03*** | 2,30±0,04** | 1,95±0,03*** | Р, ммоль/л | 2,06±0,06 | 1,79±0,04** | 1,97±0,04 | 1,67±0,05*** | ЛФ, од. Боданські | 8,6±0,7 | 13,8±1,1*** | 13,0±0,5*** | 20,1±1,5*** | ГП, од | 0,49±0,02 | 0,63±0,03*** | 0,53±0,02 | 0,69±0,02*** | ХСТ, г/л | 0,08±0,003 | 0,12±0,003*** | 0,14±0,005*** | 0,248±0,04*** | Фракції ГАГ | І, од. | 6,3±0,20 | 7,7±0,10*** | 8,2±0,20*** | 8,9±0,20*** | ІІ, од. | 3,2±0,20 | 4,6±0,10*** | 5,2±0,20*** | 7,1±0,30*** | ІІІ, од. | 1,4±0,10 | 2,0±0,04*** | 1,6±0,40** | 2,4±0,30*** | Сума ГАГ, од. | 10,9±0,30 | 14,7±0,20*** | 15,1±0,30*** | 18,4±0,30*** | Примітка. Різниця з контролем*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001

У корів з вираженими клінічними ознаками спонтанної остеодистрофії рівень загального кальцію та неорганічного фосфору був значно нижчим (р0,001), ніж у корів групи контролю: 1,950,03 і 1,670,05 ммоль/л проти 2,460,04 та 2,060,06 ммоль/л, відповідно.

У тварин на 30-й день досліду відбувалося вірогідне (р0,001) збільшення, порівняно з контрольною групою, показників, які свідчать про активну елімінацію в кров органічних компонентів кісткової тканини і є інформативними щодо розвитку в ній дистрофічного процесу: ГП, ХСТ, ГАГ та їх фракцій.

Після 60-добової гіпокінезії у корів дослідної групи продовжувала збільшуватися концентрація хондроїтинсульфатів (0,140,005 г/л, порівняно з 0,080,003 у контролі; р0,001). Це свідчить про деполімеризацію протеогліканів, внаслідок чого в загальний кровообіг потрапляють глікозаміноглікани. Тварини з клінічними ознаками остеодистрофії мали максимальні показники вмісту сироваткових ГП – 0,690,02 од. та ХСТ – 0,2480,04 г/л (р0,001, порівняно з контролем), що дає підставу вважати їх інформативними тестами для діагностики остеодистрофії у корів.

Відбулися зміни і у фракційному складі ГАГ. Вже на 15-ту добу досліду вірогідно (р0,01) збільшився сумарний вміст ГАГ (12,320,25 од.) внаслідок зростання першої (13,4 %) і другої (17 %) фракцій, а після 30-денної гіпокінезії на фоні підвищення вмісту кожної з фракцій ГАГ на 22,6 %, 41,5 і 41,7 % (р0,001), відповідно, збільшилася загальна їх сума на 30,6 % (р0,001).

У корів на 60-й день гіпокінезії, порівнянно з попереднім терміном, підвищився вміст загальних ГАГ до 15,10,30 од. внаслідок зростання рівня всіх фракцій, порівняно з контролем, а саме – І фракції на 31,1 % (р0,001), ІІ – на 62,3 (р0,001), ІІІ – на 16,5 % (р0,01). Змінюється співвідношення між окремими фракціями: відносна кількість другої збільшується на 5,1 % (р0,01), першої, що переважно містить хондроїтин-6-сульфат, та третьої – зменшується.

У корів, хворих на остеодистрофію, були значно підвищені як загальна кількість ГАГ (на 68,0 %; р0,001), так і вміст усіх трьох фракцій, відповідно, на 41,5 %, 118,9 та 69,8 %; р0,001). У цих тварин спостерігався також перерозподіл фракцій ГАГ: відбувалося переважне збільшення ІІ (р0,001), більш специфічної для кісткової тканини фракції, оскільки у корів у ній кількісно переважає хондроїтин-4-сульфат.

Для визначення ступеня катаболізму кісткової тканини були проведені біохімічні дослідження складу сечі. Уже на 15-у добу гіпокінезії збільшилася екскреція фосфору на 49,3 % (р0,001), а в перерахунку на креатинін – на 50 % (р0,001). У корів на 30-й день гіпокінезії (табл.3), порівняно з групою контролю, вірогідно збільшувалося виділення кальцію на 24,1 % (р0,001) та фосфору на 88,7 % (р0,001), екскреція оксипроліну та уронових кислот зросла на 24,5 і 25,3 % (р0,001).

На 60-й день експерименту, порівняно з попереднім періодом, екскреція мінеральних компонентів з сечею зменшилася і тому різниця в показниках з контролем невірогідна. Високою, порівняно з контролем, залишалася екскреція оксипроліну та уронових кислот (р0,001).

Таблиця 3 – Біохімічні показники в сечі корів в умовах обмеження рухової активності та хворих на остеодистрофію

Показник | Контроль | Гіпокінезія, днів | При остеодистрофії

30 днів | 60 днів

Са, мг/л | 136,83,0 | 169,72,2*** | 143,72,3 | 179,42,5***

Р, мг/л | 27,41,3 | 51,71,7*** | 28,41,8 | 49,02,9***

Са/Р | 5,00,17 | 3,30,12*** | 5,20,33 | 3,80,23***

УК, мг/л | 8,30,44 | 10,40,21*** | 11,90,25*** | 12,40,55***

Оксипролін, мг/л | 31,41,4 | 39,11,1*** | 38,01,0*** | 47,32,1***

Примітка. Вірогідна різниця з контролем ***-р<0,001

У корів, хворих на остеодистрофію, метаболічні порушення були більш виражені, ніж після 60-денної гіпокінезії: у цій групі були максимальними показники екскреції кальцію, оксипроліну та уронових кислот (р0,001). Це вказує на високу діагностичну цінність показників стану мінеральної та органічної складових кісткової тканини при діагностиці остеодистрофії у корів.

Визначення інформативності показників стану сполучної тканини

в сироватці крові та сечі при лікуванні остеодистрофії корів

У цьому розділі дисертаційної роботи була визначена ефективність застосування комплекного препарату вітамінів А, D3, Е, F “Продевіт-тетра”

(1 см3 препарату містить вітаміну А – 50000 МО; D3 – 25000 МО; Е – 20 мг; F – 5 мг) у поєднанні з гепатопротекторним препаратом з рослинної сировини “Люкон”, який належить до класу біомосів. Для корів препарат був застосований вперше. Контроль за якістю лікування здійснювали за допомогою клінічних методів обстеження корів і визначенням змін біохімічних показників сироватки крові та сечі (табл.4). Вміст показників, які характеризують стан органічного матриксу, а також активність лужної фосфатази зазнали значних змін протягом досліду як у тварин контрольної, так і дослідної груп. Так, у контрольній групі корів на 60-й день досліду вірогідно (р<0,01) підвищився рівень глікопротеїнів та хондроїтинсульфатів на 27,8 та 50,0 % відповідно. Водночас у групі 1 і 2 вірогідно зменшувалася концентрація глікопротеїнів – на 9,6 (р<0,05) і 26,6 % (р<0,01), хондроїтинсульфатів – на 23,1 (р<0,01) і 52,9 % (р<0,001) відповідно, що свідчить про зниження ступеня деструктивних процесів у кістковій та хрящовій тканинах. Окрім цього, у другій дослідній групі протягом досліду зменшувалася активність лужної фосфатази порівняно з початком досліду: на 30-й день – на 19,1 (р<0,01), на 60-й – 46,6 % (р<0,001).

Таблиця 4 – Показники стану сполучної тканини в сироватці крові корів з ознаками остеодистрофії та у корів, хворих на остеодистрофію, протягом лікування

Термін досліду, діб | Контроль | 1 група | 2 група

клінічно здорові | “Продевіт-тетра” | “Продевіт-тетра+”Люкон”

Глікопротеїни,

од. | На початку | 0,540,05 | 0,640,04 | 0,790,06***

30 | 0,590,06 | 0,610,04 | 0,700,04

60 | 0,690,03°° | 0,580,04*,° | 0,580,04*,°°

ХСТ, г/л | На початку | 0,120,02 | 0,130,01 | 0,170,02***

30 | 0,140,01 | 0,110,01 | 0,140,01

60 | 0,180,01°° | 0,100,01***, °° | 0,080,01***, °°°

ЛФ, од.Боданські | На початку | 10,21,1 | 13,00,4* | 13,10,8*

30 | 10,40,7 | 13,60,6** | 10,60,7°°

60 | 11,10,8 | 12,70,5 | 7,00,3***, °°°

Примітки:* р0,05;**р0,01; ***р0,001 порівняно з контролем;

° р0,05; °°р0,01; °°°р0,001 порівняно з початковим показником

Вірогідні відмінності на початку досліду були між показниками контрольної і дослідних груп. У дослідних тварин групи 1, порівняно з контрольною, була вірогідно підвищена активність лужної фосфатази – на 28,4 % (р<0,05), групи 2 – підвищеними були вміст глікопротеїнів – на 34,7 % (р<0,001), хондроїтинсульфатів – на 41,7 % (р<0,001) та активність лужної фосфатази – на 28,4 % (р<0,05).

На 30-й день експерименту у тварин обох дослідних груп намітилася тенденція до зменшення, порівняно з вихідними даними, вмісту глікопротеїнів, рівень яких вірогідно не відрізнявся від такого у групі контролю. Подібна динаміка спостерігалася і відносно концентрації ХСТ. Активність лужної фосфатази у першій групі була вищою за контроль на 30,8 % (р<0,01), а в другій – практично зрівнялася з ним.

На 60-й день досліду у корів обох дослідних груп, порівняно з контролем, вірогідно знизився вміст глікопротеїнів: у першій – на 15,9 % (р<0,05), у другій – на 18,0 % (р<0,01). Зниження рівня глікопротеїнів у першій групі супроводжувалося вірогідним (р<0,001) зменшенням вмісту хондроїтинсульфатів на 44,4 %. У тварин першої групи залишалася високою, порівняно з контролем, активність лужної фосфатази, а в другій вона була нижчою, ніж у контрольній, на 36,8 % (р<0,001).

Наведена динаміка показників вмісту глікопротеїнів та хондроїтинсульфатів свідчить про нормалізацію обміну вуглеводно-білкових біополімерів сполучної тканини у тварин дослідних груп, що, на нашу думку, відбувається за рахунок зменшення деструкції органічних компонентів кісткової тканини на фоні застосування препаратів, що позитивно впливають на їх метаболізм.

Вірогідну інформацію про метаболізм органічного матриксу кісткової тканини при лікуванні корів хворих на остеодистрофію дає визначення специфічних показників – глікозаміногліканів сироватки крові (табл 5).

Вміст першої фракції ГАГ сироватки крові, у якій переважає хондроїтин-6-сульфат, на початку досліду у корів, хворих на остеодистрофію, в обох групах був вищим (р<0,001) на 26,9 і 44,2 %, ніж у тварин контрольної групи, що свідчить про деструктивні зміни в сполучній тканині.

Через 30 діб рівень ГАГ, що входять в І фракцію, в сироватці крові хворих корів залишався підвищеним, хоча і не було вірогідної різниці з групою контролю, а у групі 2 вірогідно (р<0,05) зменшився на 14,7%, порівняно з початком досліду. Через 60 діб утримувалася тенденція до зниження вмісту цієї фракції ГАГ в обох дослідних групах, порівняно з початком дослідження. У групах 1 і 2 різниця становила 15,2 (р<0,01) і 34,7 % (р<0,001) відповідно, причому, якщо показник у першій групі знизився до рівня контрольної групи, то в другій він став на 14,0 % нижчим за контроль (р<0,05).

Рівень другої фракції ГАГ, в якій переважає хондроїтин-4-сульфат, також був підвищеним, порівняно з контролем, при первинному обстеженні у першій дослідній групі на 40,9, другій – 77,3 %. Оскільки ця фракція ГАГ в найбільшій кількості міститься в кістковій тканині, то це свідчить про переважання деструктивних змін саме у кістках корів дослідних груп на початку експерименту.

Через 30 днів в обох дослідних групах ситуація істотно не змінилася і вміст хондроїтин-4-сульфату залишався вірогідно вищим за контроль і незмінним порівняно з початковими показниками. Через 60 днів у тварин контрольної групи рівень фракції – підвищився на 68,2 % (р<0,001). У дослідних групах, навпаки, було відмічено зниження, порівняно з контролем, вмісту хондроїтин-4-сульфату в сироватці крові корів на 13,5 % (р<0,05) та 18,9 % (р<0,01). Окрім цього, у тварин другої групи рівень ІІ фракції ГАГ був вірогідно (р<0,01) меншим порівняно з початком досліду на 23,1 %, що доводить позитивний ефект лікування корів вітамінним комплексом у поєднанні з препаратом “Люкон”.

Таблиця 5 – Вміст ГАГ у сироватці крові у корів, хворих на остеодистрофію, протягом лікування

Термін досліду, діб | Контроль | 1 група | 2 група

клінічно здорові | “Продевіт-тетра” | “Продевіт-тетра+”Люкон”

І фракція | На початку | 5,20,5 | 6,60,2*** | 7,50,3***

30 | 5,80,6 | 5,90,3 | 6,40,4°

60 | 5,70,4 | 5,60,2,°° | 4,90,6*,°°°

ІІ фракція | На початку | 2,20,1 | 3,10,3* | 3,90,3***

30 | 2,70,2 | 3,40,2* | 3,60,2**

60 | 3,70,2°°° | 3,20,1* | 3,00,1**,°°

ІІІ фракція | На початку | 2,10,1 | 2,10,2 | 1,90,1

30 | 2,30,1 | 2,20,2 | 1,80,1***

60 | 2,50,1°°° | 1,80,1*** | 1,60,1***

Всього | На початку | 9,50,5 | 11,70,6** | 13,40,4***

30 | 10,80,6 | 11,40,5 | 11,80,3

60 | 11,90,4 | 10,60,2**,° | 9,50,6**

Примітки:* р0,05;**р0,01; ***р0,001 порівняно з контролем;

° р0,05; °°р0,01; °°°р0,001 порівняно з початковим показником

До складу ІІІ фракції сироваткових ГАГ входять такі компоненти, як гепарин, гепаран- та кератансульфати. Останній кількісно переважає інші. Кількість його збільшується у тканинах суглобів при старінні і дистрофічних захворюваннях. Він заміщує частку хондроїтинсульфатів кісткової тканини, яка відповідно зменшується. Як свідчать дані, наведені в таблиці 5, на початку досліду вміст компонентів, що входять у ІІІ фракцію ГАГ, однаковий у всіх групах. Через 30 діб від початку експерименту у корів другої групи спостерігається високовірогідне (р<0,001) зниження вмісту цієї фракції на 21,7 %, порівняно з контрольною. Це збігається з наведеними вище даними щодо змін вмісту хондроїтинсульфатів у цій групі.

Через 60 діб у першій і другій дослідних групах корів відбувалося вірогідне зменшення рівня ІІІ фракції сироваткових ГАГ – на 28,0 і 36,0 % відповідно. Це свідчить про зниження катаболічних процесів у тканинах кісток та суглобів. У корів контрольної групи цей показник вірогідно підвищився, порівняно з початком досліду, на 19,1 %.

Зміна суми фракцій ГАГ відображає загальну тенденцію перетворень обміну протеогліканів сполучної тканини у корів. Виявилося, що до початку досліду вміст ГАГ у корів обох дослідних груп був підвищений на 23,2 та 41,1 % відповідно, що підтверджує розвиток остеодистрофії. Через 30 діб з початку застосування препаратів сумарна кількість ГАГ істотно не змінилася, а через 60 днів вірогідно зменшилася при введенні вітамінного препарату на 10,9 %, а в комплексі з препаратом “Люкон” – на 20,2 %.

Екскреція оксипроліну та уронових кислот з сечею у тварин дослідних груп була вірогідно вищою, порівняно з контролем, на 46,8 та 58,2 % відповідно (табл.6). Протягом досліду вміст оксипроліну в дослідних групах знижувався: на 60-й день у другій групі, порівняно з контролем, на 25,9 % та на 42,2 % у порівнянні з показником на початку досліду (р<0,001). У контрольній групі екскреція оксипроліну з сечею, навпаки, зросла на 23,4 % (р<0,05).

Таблиця 6 – Екскреція оксипроліну та уронових кислот у корів, хворих на остеодистрофію, протягом лікування

Термін досліду, діб | Контроль | 1 група | 2 група

клінічно здорові | “Продевіт-тетра” | “Продевіт-тетра+”Люкон”

Оксипро-

лін,

мг/л | На початку | 14,11,2 | 20,72,3* | 22,31,2***

30 | 16,10,5 | 19,81,4* | 18,40,7*

60 | 17,40,6° | 17,60,9 | 12,90,7***°°°

Уронові кислоти, мг/л | На початку | 3,80,2 | 8,50,3*** | 8,20,2***

30 | 4,40,2 |