НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Броварський Валерій Дмитрович

УДК 638.145.5

обгрунтування технології репродукції бджолиних маток

06.02.04 - технологія виробництва продуктів тваринництва

а в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий консультант доктор сільськогосподарських наук, професор

Поліщук Віктор Петрович,

Національний аграрний університет, професор кафедри бджільництва ім. В.А. Нестерводського

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор, академік УААН Богданов Григорій Олександрович, Українська академія аграрних наук, заступник академіка-секретаря відділення зоотехнії

доктор сільськогосподарських наук, професор Лєбєдєв В’ячеслав Іванович, Державна наукова установа НДІ бджільництва Російської академії сільськогосподарських наук, заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу технології виробництва продуктів бджільництва

доктор сільськогосподарських наук, професор Кирилів Ярослав Іванович, Львівська національна академія ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького, проректор з наукової роботи

Провідна установа — Білоцерківський державний аграрний університет, кафедра крупного тваринництва, Міністерство аграрної політики України, м. Біла Церква

Захист відбудеться “22 вересня“ 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.05 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус №3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус №4, к. 41

Автореферат розісланий “21“ серпня м2006р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Чигрин А.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Виведення бджолиних маток є однією з найважливіших проблем розмноження бджіл, збільшення чисельності бджолиних сімей та підви-щення ефективності галузі бджільництва. Вивчення біології відтворення виду Apis mellifera сприяє розробці нових високоефективних технологій розмноження бджіл, способів штучного осіменіння бджолиних маток. Встановлене у медоносних бджіл явище поліандрії (Тряско В.В., ; WoykeRuttner ) дало можливість обґрунтувати ряд теоретичних положень з їх розмноження і розробити низку практичних заходів щодо виведення бджолиних маток відомого походження. Показано (Назин С.Н., 1987; 1988), що із диплоїдних яєць, відкладених бджолиною маткою, розвиваються жіночі особини різного батьківського походження, на основі чого висунуто гіпотезу про змішування сперми у статевих шляхах матки після спаровування з трутнями. Нині ще недостатньо вивченими залишаються особливості переміщення сперми різних трутнів у статевих шляхах бджолиної матки, її розміщення в спермоприймачі та використання, регулювання процесу відкладання гаплоїдних і диплоїдних яєць (Тряско В.В., 1989; Фоти Н. и др., 1980; Woyke1988). Особливого наукового і практичного значення також набувають питання репродукції бджолиних маток з відомим батьківським походженням, розробка та впровадження способів їх штучного осіменіння (Руттнер Ф., 1975; Черевко Ю.А., 1996; CobeySchley2002). Однак, через відсутність глибоких наукових досліджень з функціонування окремих органів статевої системи бджолиних маток, способів введення, міграції та використання сперми різних трутнів при обсіменінні яєць, впливу способів штучного осіменіння маток на розвиток яєчників і походження бджіл, виникла необхідність розробки нових ефективних технологій розмноження бджіл, збільшення чисельності чистопородних бджолиних маток відомого походження, підвищення обсягів виробництва товарної продукції та ефективності племінної роботи у бджільництві. Актуальним також є вдосконалення існуючих та розробка нових способів штучного осіменіння бджолиних маток і забезпечення цього процесу необхідним сучасним обладнанням.

Вирішення цих наукових проблем дасть можливість удосконалити способи одержання чистопородних маток, підвищити продуктивність бджолиних сімей вітчизняних порід бджіл.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисерта-ційна робота виконана впродовж 1992–2005 років відповідно до плану наукових досліджень кафедри бджільництва ім. В.А. Нестерводського Національного аграрного університету за темами “Розробити напрямки інтенсифікації бджіль-ництва в лісостеповій зоні України” (номер державної реєстрації 0198U007254) та “Створити шляхом селекції внутрішньопородний тип українських бджіл” (номер державної реєстрації 0199U002579).

Мета і задачі досліджень. Мета роботи – теоретично обґрунтувати та розробити потокову технологію відтворення бджолиних маток за штучного осіменіння.

Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

- дослідити оптимальний об’єм сперми трутнів, встановити кратність і тривалість її введення у статеві шляхи бджолиної матки;

- вивчити функцію піхвового клапану статевої системи матки та розробити спосіб припіхвового осіменіння;

- дослідити переміщення сперми трутнів в статевій системі бджолиної матки за різних варіантів її введення;

- з’ясувати вплив трутнів на походження робочих бджіл при репродуктив-ній діяльності маток за різних способів їх штучного осіменіння;

- дослідити вплив різних способів введення сперми трутнів в статеві шляхи матки на розвиток яєчників;

- вдосконалити основні елементи технології виведення неплідних бджолиних маток та провести оцінку їх якості;

- розробити потокову технологію штучного осіменіння бджолиних маток;

- провести виробничу перевірку розробленої потокової технології штучного осіменіння бджолиних маток;

- визначити економічну ефективність застосування потокової технології штучного осіменіння бджолиних маток;

- на основі експериментальних досліджень розробити нормативні документи: технічні умови (ТУ) та методичні рекомендації із застосування потокової технології штучного осіменіння бджолиних маток.

Об’єкт дослідження – бджолині матки, статева система бджолиної матки, трутні, робочі бджоли, сперма трутнів, обладнання для штучного осіменіння маток.

Предмет дослідження – потокова технологія штучного осіменіння бджолиних маток, функція піхвового клапана, розвиток яєчників матки, штучне осіменіння бджолиної матки, обладнання для відтворення бджолиних маток і трутнів, біологічно активні речовини сперми трутнів.

Методи дослідження – зоотехнічні (спосіб введення сперми, потокова технологія штучного осіменіння маток, виведення та оцінка якості маток і трутнів), морфологічні, гістологічні (будова статевих шляхів матки, розвиток яєчників, міграція сперми в статевих шляхах матки, функція піхвового клапана), біохімічні (біологічно активні сполуки сперми трутнів) та статистичні (біометрична обробка матеріалів досліджень).

Наукова новизна одержаних результатів. На основі проведених дослід-жень розширено та доповнено наукові положення щодо особливостей поліанд-рії у бджіл, які покладено в основу наукової концепції розробленої потокової технології відтворення плідних бджолиних маток за штучного осіменіння. Встановлена наявність двох гілок піхвового клапана у плідних бджолиних маток та досліджено його роль в регулюванні відкладання диплоїдних та гаплоїдних яєць, що дало можливість запропонувати новий спосіб штучного осіменіння бджолиних маток шляхом ін’єкції сперми трутнів у зону піхви матки. Вперше експериментально обґрунтовано оптимальні дози сперми трутнів, встановлено кратність і тривалість її введення в камеру жала бджолиної матки.

Отримано нові дані щодо обсіменіння яєць бджолиної матки в процесі її репродуктивної діяльності, досліджено розміщення та використання порцій сперми трутнів у статевих шляхах матки за різних способів її введення, з’ясовано вплив поліандрії на батьківські ознаки жіночих особин бджолиної сім’ї. Встановлено стимулюючий вплив міграції сперми трутнів та її біологічно активних сполук на розвиток яєчників і репродуктивну функцію бджолиної матки. Обґрунтовано доцільність застосування освітлення комірки при перенесенні личинок і з’ясовано вплив кута нахилу маточних мисочок, способів розміщення маточників у гніздах сімей-виховательок та поведінки бджолиних маток і робочих бджіл на вихід племінних маток, що дало можливість вдосконалити технологічні прийоми їх одержання.

Наукова новизна проведених досліджень підтверджена трьома патентами України на винахід.

Практичне значення одержаних результатів. На основі встановлених закономірностей прояву поліандрії у бджіл розроблено потокову технологію штучного осіменіння бджолиних маток, а також нове обладнання для їх анес-тезії, розкриття камери жала, введення інжектора та впорскування сперми трутнів у статеві шляхи бджолиної матки (патент України №50846, 2000), що дозволяє спростити ряд технологічних операцій за штучного осіменіння, уник-нути травмування статевих органів, отримати 96% ділових плідних маток за штучного осіменіння, підвищити продуктивність до 112-185 бджолиних маток за день. Розроблена потокова технологія штучного осіменіння дає можливість вдвічі прискорити початок відкладання яєць матками.

Запропоновані способи виведення неплідних маток (патент України №46910, 2000), вдосконалене обладнання для підготовки та вирощування їх шляхом підвищення ефективності використання потенціалу сімей-виховате-льок, а також методи збереження і оцінки якості неплідних бджолиних маток забезпечують збільшення виробництва і реалізацію племінної продукції відомого батьківського походження. Розроблено новий спосіб збереження та ефективного використання трутнів за штучного осіменіння бджолиних маток (деклараційний патент України №14389, 2005).

Матеріали досліджень розглянуто та схвалено на Науково-технічній раді Міністерства аграрної політики України (секції виробництва та переробки продукції тваринництва і птахівництва) та рекомендовано до впровадження (2004). Їх використано при підготовці ТУ “Технологія інструментального осіменіння бджолиних маток”, затверджених Міністерством сільського господарства і продовольства України (1993), методичних рекомендацій “Припіхвове осіменіння бджолиних маток”, затверджених Науково-технічною радою Міністерства аграрної політики України (2004), розробці потокової технології штучного осіменіння маток та обладнання, які впроваджено в Україні (відділ селекції і репродукції карпатських бджіл; державне підприємство ДГ „Нектар” – ННЦ „Інститут бджільництва ім. П.І. Прокоповича”; племінний бджолозавод „Мед Поділля”; плембджолорозплідник „Прибузькі Медобори”; дослідне господарство УААН „Агрофірма ім. Грушевського”; НДГ „Великоснітинське ім. О.В. Музиченка”), а також за кордоном: у Канаді (фірма “Van Kessel Farms”), Польщі (фірма “S№decki Bartnik”), Російській Федерації (Башкирський державний аграрний університет, м. Уфа), Ізраїлі (фірма Михверет Ф.Б.), що дозволило підвищити продуктивність праці у бджологосподарствах розплід-ницького напрямку при штучному осіменінні у 8 разів та збільшити вихід маток на 60%. Розроблені способи одержання плідних бджолиних маток при штуч-ному осіменінні використано в дослідженнях зі створення внутрішньопородного типу “Хмельницький” української породи бджіл (затверджено на секції виробницт-ва та переробки продукції тваринництва і птахівництва Науково-технічної ради Мінагрополітики України, протокол № 6 від 21 грудня 2005р.).

Одержаний експериментальний матеріал використано при підготовці нав-чального посібника “Розведення та утримання бджіл” (1995) і підручника “Тех-нологія виробництва продукції тваринництва” (2005) напряму “Зооінженерія” для вищих аграрних навчальних закладів освіти IІI-IV рівнів акредитації.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто обґрунтував наукову кон-цепцію з теми дисертаційної роботи, визначив мету і основні задачі досліджень, опрацював джерела літератури, розробив загальну методику і провів експери-ментальні дослідження, провів біометричну обробку, аналіз і узагальнення отриманих результатів, зробив висновки і пропозиції виробництву. Вибір нап-ряму і окремих методик досліджень проведено разом з науковим консультан-том. Під час проведення гістологічних досліджень було використано обладнан-ня й отримано консультаційну допомогу кандидата ветеринарних наук, доцента кафедри патанатомії НАУ М.К. Потоцького. При виготовленні розробленого обладнання брав участь кандидат технічних наук Ю.С. Павленко. Із спільних розробок з ними автор використав свою частку досліджень.

Апробація результатів дисертації. Потокова технологія штучного осіме-ніння та обладнання демонструвалися на Міжнародних сільськогосподарських виставках України “Агро–93” (Диплом другого ступеня), “Агро–2005” (відзначено дипломом), в Інституті інформації Пекінської академії аграрних і лісових наук (Пекін, 2003), на Міжнародному консорціумі GCTERA (Київ, 2003), V симпозіумі Україна – Австрія (Київ, 2004). Основні результати дос-ліджень з дисертаційної роботи оприлюднені в доповідях на Міжнародних конференціях: “International conference on the Asian honey bees and bee mites” (Thailand, 1992), “Сучасні проблеми зооінженерії та шляхи їх вирішення” (Львів, 1999), “Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини” (Харків, 2000), “Апитерапия сегодня – с биологической аптекой пчел в ХХІ век” (Уфа, 2000), “Интермед–2000” (Москва, 2000), “Новое в науке и практике пчело-водства” (Москва, 2002), 6-й Міжнародній конференції “Интермед–2005” (Москва, 2005), “Сучасний стан і перспективи розвитку генетики сільськогос-подарських тварин” (Київ, 2005), “Підвищення комплексної продуктивності бджолиних сімей районованих в Україні порід” (Київ, 2005), вченій раді Державного наукового закладу Науково-дослідний інститут бджільництва Россільгоспакадемії (Російська Федерація, Рибне, 2005), IV Міжнародній науково-виробничій конференції “Трансплантація ембріонів як інструмент селекції в новому тисячолітті” (Київ, 2004), ІХ Міжнародній науково-практич-ній конференції “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 2004), Міжнародній науковій конференції “Сучасний стан і перспективи розвитку генетики сільськогосподарських тварин” (Київ, 2004), наукових конференціях професорсько-викладацького складу факультету технології виробництва і переробки продукції тваринництва НАУ (Київ, 1992 – 2006 рр.), професорсько-викладацького складу факультету ветеринарної медицини НАУ (Київ, 2005), в Інституті бджільництва ім. П.І. Прокоповича на науково-практичній конференції “Стан та перспективи розвитку наукового забезпечення селекційно-племінної роботи в бджільництві” (Київ, 1997), Науково-технічній раді Мінагрополітики України (Київ, 2004), об’єднаному засіданні кафедр факультету технології виробництва і переробки продукції тваринництва Національного аграрного університету.

Публікації. Основні результати теоретичних та експериментальних дос-ліджень за темою дисертаційної роботи викладено в підручнику і навчальному посібнику, методичному посібнику (1), трьох монографіях, технічних умовах (1) та методичних рекомендаціях (1), трьох патентах на винаходи, 24 статтях у фахових виданнях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація містить 351 сторінку комп’ютерного тексту і складається зі вступу, розділів огляду літератури, загальної методики та основних методів досліджень, результатів досліджень (експериментальна частина), аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків і пропозицій, списку використаних джерел літератури та додатків.

Робота містить 35 таблиць, 83 рисунки та 61 додаток. Бібліографічний список включає 452 найменування, з них 201 – іноземними мовами.

загальна методика і основні методи досліджень

Дослідження за темою дисертаційної роботи виконані протягом 1992–2005 рр. на кафедрі бджільництва ім. В.А. Нестерводського Національного аграрного університету. Досліди з окремих питань проведені в НДІ екології і токсикології ім. Л.І. Медведя, а також провідних бджологосподарствах України. За вказаний період проведено 33 досліди, в т.ч. наукових – 12, науково-господарських – 10 і виробничих – 11. Для досліджень було використано 305 бджолиних сімей української породи, 2927 бджолиних маток, одержаних від природного та штучного осіменіння, виготовлено та проаналізовано 9850 гістохімічних зрізів і 52200 препаратів частин екзоскелету робочих бджіл.

Дослідження виконували в три етапи (рис. 1). На першому етапі вивчали ефективність використання загальноприйнятих способів штучного осіменіння бджолиних маток (Moritz1989) та розробляли новий спосіб ін’єкції сперми трутнів у статеві шляхи матки.

Для відпрацювання нового способу штучного осіменіння були виведені бджолині матки, яких за принципом аналогів розподілили на контрольну і дослідні групи. Маткам контрольної групи вводили сперму загальноприйнятим способом, а дослідної – новим, враховуючи об’єм, кратність та тривалість її введення. Ефективність способів штучного осіменіння бджолиних маток визначали за кількістю відкладених ними диплоїдних та гаплоїдних яєць (Билаш Г.Д., Кривцов Н.И., 1991), а також за чисельністю сперматозоїдів у спермоприймачах їх статевої системи (Войке Е. и др., 1975).

Дослідження другого етапу були спрямовані на розробку та апробацію по-токової технології штучного осіменіння, вивчення впливу різних факторів на відтворну здатність бджолиних маток, будову і функціонування окремих орга-нів статевої системи, створення нового обладнання для введення сперми трутнів.

За одержаними результатами були визначені технологічні вимоги та вдосконалювалось обладнання для розробки потокової технології штучного осі-меніння бджолиних маток. Для його апробації використали дві групи бджолиних маток: маток контрольної групи осіменяли спермою трутнів, яку вводили за загальноприйнятим способом, а дослідних – за новим. Визначали показники, які характеризують продуктивність роботи оператора та ефективність осіменіння бджолиних маток. Додатково було сформовано ще три групи бджолиних сімей для випробування плідних бджолиних маток від штучного осіменіння (контрольна – матки природного спаровування; перша дослідна – матки одержали від штучного осіменіння з використанням загальноприйнятого способу введення сперми; друга дослідна – за новим способом). У дослідах вивчали продуктивність бджолиних маток, інтенсивність розвитку та продуктивність бджолиних сімей (Боднарчук Л.І. та ін., 1996; 2001).

Рис. 1. Загальна схема досліджень

Для вдосконалення потокової технології штучного осіменіння вивчали функ-ціонування окремих органів статевої системи плідних бджолиних маток різного віку в процесі їх репродуктивної діяльності, використавши для цього гістологічні дослідження (Пирс Э., 1962; Потоцький Н.К., 1988). Бджолиних маток на різних стадіях переміщення яєць фіксували в рідкому азоті, а потім – у розчині Буена і за-ливали ущільнюючими середовищами. Гістохімічні зрізи отримували на санному мікротомі, одержані препарати вивчали під бінокулярним мікроскопом Лабовал фірми Karl Zeis (збільшення ок. 16 х об. 10), описували та фотографували.

Вплив трутнів на походження робочих бджіл при репродуктивній діяльності маток за різних способів їх штучного осіменіння вивчали шляхом морфологічних досліджень бджіл (Назин С.Н., 1987) та гістологічних зрізів органів статевої системи бджолиних маток (Броварський В.Д. 1987; 1991). У кожному варіанті досліджень було використано п’ять бджолиних маток. Фіксацію бджолиних маток, препарування їх статевої системи, заливку в ущільнюючі середовища та одержання гістологічних зрізів проводили за вдосконаленою нами методикою (Броварський В.Д., Потоцький М.К., 1999). Аналіз гістологічних зрізів, розміщення сперми в яйцепроводах і вивчення морфології яйцевих трубочок в яєчниках проводили за загальноприйнятою методикою (Пирс Э., 1962).

Крім того, бджолиних маток української породи штучно осіменяли, застосувавши різні варіанти введення сперми трутнів. Бджолиним маткам вводили 9 мкл сперми трутнів (по 3 мкл від українських, італійських і сірих гірських кав-казьких трутнів). У першому варіанті використали одноразове введення сперми трутнів, а у другому – триразове, з інтервалом в 24 год. Бджолиних маток підсаджували в нуклеуси, а з початком репродуктивної діяльності маркували послідовно відкладені ними 20 яєць з інтервалом 21 день. На 21-й день після проведеного обліку вилучали з комірок бджіл, яких фіксували, а потім за морфологічними ознаками встановлювали їх породну належність за батьківським походженням (Билаш Г.Д., Кривцов Н.И., 1991). Додатково проаналізували проби бджіл за батьківським походженням протягом всього періоду репродуктивної діяльності бджолиних маток, одержаних від штучного осіменіння. У дослідженнях використали 8 груп бджолиних маток української породи (по 4 особини у групі). Застосовуючи загальноприйняту та нову технології штучного осіменіння, бджолиним маткам за різного способу, кратності та об’ємів вводили сперму, відібрану від трутнів, що характеризуються контрастними породними ознаками (українська, італійська, сіра гірська кавказька). Бджолиних маток підсаджували в сім’ї, а з початком відкладання ними яєць протягом двох сезонів з інтервалом 12 днів відбирали молодих бджіл по 40-50 особин в одній пробі і за морфологічними показниками визначали їх батьківське походження.

Для з’ясування походження біологічно активних сполук сперми трутнів було розроблено методику їх виділення та проведено ідентифікацію окремих її складових методом обернено фазової хроматографії (фірма Waters (США), колонка Nova-Pak C18 (150 х 2,1 мм), рухома фаза – ацетонітрит-вода). Для оцінки впливу біологічно активних сполук сформували дві групи бджолиних маток по 4 в кожній, яких після штучного осіменіння підгодовували медом (контрольна група) та медом з додаванням розчину біологічно активних сполук (дослідна група), виділених із сперми трутнів (100 мл меду : 1 мл водного розчину біологічно активних сполук). На 4-й день бджолиних маток підсаджували в нуклеуси, а потім на основі проведення контрольних оглядів стільників визначили дату початку відкладання ними яєць.

Поведінку трутнів української породи вивчали візуально, проводячи обліки їх кількості в різних частинах гнізда протягом травня-липня та удосконалили спосіб утримання в сім’ях. Для перевірки його ефективності сформували дві групи батьківських сімей (по 6 у групі). Трутнів у бджолиних сім’ях контроль-ної групи утримували в звичайних умовах, дослідної групи – ізолювали. В обох групах бджолиних сімей визначали затрати часу на відбір у садки 50 трутнів.

Взаємозв’язок між фізіологічним станом і продуктивністю трутнів вив-чали, визначаючи їх живу масу шляхом зважування на торсійних вагах ВТ-500 щодоби протягом 12 днів. Одночасно з проведенням цього досліду щоденно від батьківських сімей відбирали по 10 трутнів, у яких визначали морфологічні зміни окремих органів статевої системи, а також реакцію їх на больове подразнення – вивертання цибулини з ріжками та ендофаллуса (Руттнер Ф. и др., 1981).

Оцінку господарсько-корисних ознак бджолиних сімей проводили на основі використання СО2. Від бджолиних сімей відбирали по 30 бджіл у поліетиленовий пакет, куди подавали СО2 витрати якого становили 4-5 л/год. Секундоміром фіксували час входження 70-80робочих бджіл у стан гіпобіозу та виходу з нього. Одночасно фіксували дані стану бджолиних сімей, який визначали, користуючись загальноприйнятими методиками (Кривцов Н.И. и др., 1999). На основі цих даних сформували 4 групи бджолиних сімей по 4 сім’ї в кожній, які характеризувались різною реакцією робочих бджіл на дію СО2. Оцінку стану бджолиних сімей проводили в кінці сезону.

Третій етап досліджень було присвячено удосконаленню існуючих та розробці нових способів репродукції, збереження та використання бджолиних маток. Вплив різних факторів на ефективність вирощування маточного розплоду вивчали з метою удосконалення обладнання (шпатель, матковивідна надставка), а також способів виховання маточного розплоду. Їх оцінку проводили порівняно до базового варіанту виведення бджолиних маток. Визначали такі показники: затрати часу на прищеплення однієї партії личинок, кількість прийнятих личинок, об’єм і довжину маточників, масу неплідних маток та їх вихід (Таранов Г.Ф., 1987).

Ефективність способу збереження племінного матеріалу вивчали порівняно з базовим варіантом. У досліді здійснювали облік кількості загиблих бджолиних маток та тих, що були травмовані, додатково визначали відсоток їх прийому при підсаджуванні у бджолині сім’ї.

Економічну ефективність результатів експериментальних досліджень визначали на основі порівняльного аналізу вартісних показників, одержаних при застосуванні потокової технології штучного осіменіння бджолиних маток та загальноприйнятого способу.

Отримані у дослідженнях дані оброблено біометрично з використанням загальноприйнятих методів варіаційної статистики (Плохинский Н.А., 1969) і застосуванням комп’ютерних програм.

результати ВЛАСНИХ досліджень

Обґрунтування та розробка способу штучного введення сперми в зону піхви. З метою наближення процесу штучного осіменіння бджолиних маток до умов природного спаровування, уникнення труднощів, пов’язаних із проведенням технологічних операцій введення сперми трутнів, запобігання травмувань статевої системи, які виникають при застосуванні загальноприйня-тих способів, запропоновано вводити статеву продукцію трутнів в зону піхви бджолиної матки, використовуючи штучний шлейф (рис. 2).

Запропонований спосіб введення сперми в статеві шляхи матки відрізняється від базового варіанту зоною ін’єкції статевої продукції та послідовністю виконання робіт з бджолиною маткою (використання штучного шлейфу, введення сперми за відсутності анестезії) (табл. 1).

При розробці нового способу штучного осіменіння необхідно було дос-лідити кратність, тривалість і кількість введення сперми трутнів, а також вплив цих факторів на репродуктивну функцію бджолиних маток. Встановлено, що при введенні сперми трутнів протягом 25-30 хв бджолині матки відкладають запліднені яйця без пропусків комірок. При скороченні цього періоду (5-15 хв) відкладання бджолиними матками гаплоїдних яєць збільшується до 14-49%.

Таблиця 1 — Технологічний процес при штучному осіменінні бджолиних маток за базовим і новим способами

Послідовність виконання технологічних операцій

Базовий варіант | Новий варіант

Відбір сперми у трутнів

Фіксація матки в маткоутримувачі та введення її в стан гіпобіозу за допомогою СО2

Розкриття камери жала матки за допомогою вентрального та жального гачків

Введення інжектора в непарний яйцепровід бджолиної матки | Введення інжектора з штучним шлейфом в зону піхви бджолиної матки—

Вивільнення від гачків жалоносного апарата і останнього стерніту черевця бджолиної матки—

Виведення бджолиної матки з стану гіпобіозу

Введення сперми трутнів у статеві шляхи бджолиної матки

Вилучення інжектора із статевих шляхів бджолиної матки | Вилучення інжектора із статевих шляхів бджолиної матки без штучного шлейфа

Вивільнення від гачків жалоносного апарата і останнього стерніту черевця—

Вивільнення бджолиної матки з маткоутримувача

Виведення бджолиної матки з стану гіпобіозу—

При підрахунку кількості сперматозоїдів, які потрапили до спермоприйма-чів бджолиних маток, встановлено, що найбільше їх акумулюється за нового ва-ріанту штучного осіменіння, коли сперму трутнів вводити одно-, дво- або три-разово загальним об’ємом 12-15 мкл (табл. 2). Із зменшенням об’єму введення сперми трутнів кількість сперматозоїдів у спермоприймачах бджолиних маток зменшується. Враховуючи встановлену залежність об’єму введеної сперми трутнів від кількості сперматозоїдів у спермоприймачі бджолиної матки, варто вказати на те, що це є одним із важливих пояснень необхідності поліандрії у медоносної бджоли, оскільки вона має безпосередній вплив на продукування бджолиною маткою диплоїдних яєць.

Гістологічні дослідження розвитку яєчників маток. На підставі прове-дених нами гістологічних досліджень яєчників бджолиних маток за різних спо-собів штучного осіменіння і отримання експериментальних даних щодо наяв-ності в спермі трутнів сполук гормональної природи, встановлено існування за- лежності розвитку яєчників від способу та об’єму введення статевої продукції.

Яєчники бджолиних маток віком від 1 до 5 діб знаходяться у сталій, незмінній формі (рис. 3).

Таблиця 2 – Кількість сперматозоїдів у спермоприймачі бджолиної матки залежно від об’єму введеної сперми трутнів та кратності осіменінь, млн. (n=5)

Об’єм введеної сперми, мкл | Базовий варіант | Новий варіант | td

M±m | Lim | Cv, % | M±m | Lim | Cv, %

Одноразове осіменіння

8 | 2,2±0,44 | 1,21-3,67 | 44,83 | 3,3±0,30 | 2,26-4,03 | 20,10 | 2,07

10 | 2,4±0,38 | 1,45-3,54 | 35,72 | 3,6±0,33 | 2,34-4,18 | 20,37 | 2,38

12 | 3,2±0,43 | 1,84-4,18 | 30,20 | 4,9±0,41 | 3,47-5,72 | 18,58 | 2,86

15 | 3,6±0,47 | 2,12-4,65 | 29,35 | 5,1±0,41 | 3,72-6,25 | 18,04 | 2,41

18 | 3,6±0,42 | 2,36-4,71 | 26,60 | 4,3±0,32 | 3,56-5,43 | 16,75 | 2,46

Дворазове осіменіння

4х4 | 2,7±0,38 | 1,56-3,94 | 31,63 | 3,4±0,28 | 2,52-4,25 | 18,31 | 1,48

5х5 | 3,0±0,36 | 1,72-3,75 | 26,71 | 3,7±0,34 | 2,42-4,36 | 20,54 | 1,41

6х6 | 3,3±0,38 | 2,39-4,36 | 25,79 | 4,9±0,44 | 3,53-6,18 | 20,02 | 2,75

8х7 | 3,7±0,44 | 2,78-4,94 | 26,40 | 5,2±0,42 | 3,92-6,37 | 18,15 | 2,47

9х9 | 4,0±0,53 | 2,22-5,14 | 29,63 | 4,5±0,41 | 3,64-5,93 | 20,26 | 0,75

Триразове осіменіння

3х3х2 | 3,1±0,36 | 2,31-4,18 | 25,77 | 4,3±0,35 | 3,26-5,35 | 17,99 | 2,40

4х3х3 | 3,4±0,49 | 1,83-4,68 | 31,74 | 4,4±0,40 | 3,19-5,54 | 20,45 | 1,58

4х4х4 | 4,3±0,48 | 2,52-5,23 | 25,35 | 4,9±0,52 | 3,41-6,42 | 23,73 | 0,85

5х5х5 | 4,8±0,49 | 3,67-6,32 | 22,77 | 5,2±0,50 | 3,83-6,58 | 21,68 | 0,57

6х6х6 | 4,8±0,50 | 3,09-6,13 | 23,18 | 4,9±0,32 | 4,18-6,05 | 14,63 | 0,17

Природне спаровування

- | 4,2±0,24 | 3,65-4,82 | 13,15 | - | - | - | -

Рис. 3. Гістологічні зрізи яєчників бджолиних маток через різний період після введення сперми

А — 1-й день; Б — 3-й день; В — 4-й день; Г — яєчники плідних маток

При міграції сперми трутнів до яйцепроводів бджолиних маток у будові яєч-ників змін не відбувається. У тих бджолиних маток, у яких виявили спермато-зоїди в спермоприймачі, стінки епітелію яйцевих трубочок потовщились і збіль-шились у діаметрі. Крім того, спостерігали збільшення розміру клітин стінок епі-телію. Отже, початок міграції сперматозоїдів до спермоприймача у бджолиних ма-ток є стимулюючим фактором розвитку яйцевих трубочок та яєчників.

Якщо у бджолиних маток переміщення сперматозоїдів у спермоприймач завершувалось за 24 год, яйцеві трубочки розвивались швидше, ніж у маток, де цей процес ще не закінчився. Із збільшенням тривалості переміщення сперматозоїдів до 36, 48, 72 год уповільнювався і розвиток яйцевих трубочок. Однак максимального розвитку яєчники матки досягали лише на 2, 4, 6-й день після виділення з камери жала “спермієвих хвостиків”. Уповільнення переміщення сперми затримує і початок відкладання бджолиною маткою яєць. При завершенні переміщення сперматозоїдів за 24 год яєчники матки досягали максимального розвитку вже через 2 доби, за 48 год – через 4 доби і за 72 год – понад 6 діб. Встановлено, що інтенсивність розвитку яєчників матки залежить від кількості сперматозоїдів, які потрапляють до спермоприймача.

Отже, збільшення дози введення сперми за штучного осіменіння та надход-ження її в статеві шляхи бджолиної матки у надмірній кількості посилює інтен-сивність розвитку яєчників і прискорює початок відкладання яєць, що є, на на-шу думку, одним із механізмів поглиблення диференціації жіночих індивідів на плідних і неплідних та розширення ролі поліандрії в еволюції виду Apis mellifera.

Функція піхвового клапану в плідних і неплідних бджолиних маток. При проведенні штучного осіменіння бджолиної матки з використанням загаль-ноприйнятого способу введення сперми часто відбувається травмування її статевих шляхів. Перш за все, травмується піхвовий клапан. За даними W. (1966), у плідних бджолиних маток цей орган інтенсивно дегенерує. Однак у проведених нами дослідженнях вперше виявлено наявність декількох гілок піхвового клапану у плідних бджолиних маток різного віку. Тому важливо було з’ясувати його роль при міграції сперматозоїдів трутнів за введення сперми в зону піхви та функціональне призначення у плідних бджолиних маток.

З цією метою нами удосконалено методику гістологічних досліджень статевої системи, суть якої полягає у прижиттєвій фіксації бджолиних маток на різних стадіях переміщення яєць.

Гістохімічні дослідження статевих органів плідних і неплідних бджолиних маток показали (рис. 4), що піхвовий клапан сприяє міграції сперматозоїдів з камери жала до яйцепроводів і спермоприймача та регулює обсіменіння яєць. Дотепер питання регулювання відкладання гаплоїдних і диплоїдних яєць бджо-линою маткою залишалось на рівні гіпотез. Нами вперше доведено, що яйцеклі-тини у яйцепроводах переміщуються в спеціальному субстраті. У латеральних яйцепроводах яйця розміщені горизонтально декількома шарами, а при перехо-ді до непарного за допомогою піхвового клапана переміщуються у вертикальне положення. Дорсальна частина яйця за участі клапана торкається витоку вивідного протоку спермоприймача, а вентральна – переміщується в бік отвору піхви, в результаті відбувається обсіменіння його мікропілярної зони.

Рис. 4. Схема положення піхвового клапана в процесі обсіменіння яєць

А, Б, В, Г, Д, Ж – положення яйця на різних стадіях його переміщення в зоні витоку вивідного протоку спермоприймача; І, ІІ – гістологічні зрізи статевої системи матки (І – обсіменіння відсутнє; ІІ – обсіменіння яйця); 1 – яйце;

2 – спермоприймач; 3 – піхвовий клапан; 4 – непарний яйцепровід; 5 – камера жала

Така робота клапана є раціональною ще й з погляду економного витрачання сперми трутнів у процесі запліднення яєць, що забезпечує мож-ливість репродуктивної діяльності бджолиної матки протягом всього її життя в сі-м’ї бджіл. На нашу думку, цим пояснюється, що з віком бджолина матка зменшує відкладання запліднених і збільшує репродукцію незапліднених яєць, оскільки, цей орган може не завжди забезпечувати спрямування яйця до витоку вивідного протоку для обсіменіння. Враховуючи важливу функцію клапана при переміщенні сперми та регуляції обсіменіння яєць, проводити штучне осіменіння бджолиної матки з введенням сперми трутнів у непарний яйцепровід не доцільно, оскільки це може негативно позначатись на її репродуктивній діяльності.

Міграція сперми трутнів у статевих шляхах бджолиної матки. Резуль-тати вивчення міграції сперми різних трутнів у статевих шляхах бджолиних маток, яким ін’єкцію здійснювали з використанням флуоресцентних мембранних зондів у зону піхви, показані на рис. 5.

Рис. 5. Гістологічні зрізи статевої системи бджолиних маток за різної кратності введення сперми трутнів у зону отвору піхви

І – одноразове введення сперми маркованої різними зондами; ІІ – триразове введення сперми маркованої різними зондами; 1 – штучний шлейф у камері жала; 2 – жалоносний апарат; 3 – маркована сперма в зоні піхви; 4 – піхвовий клапан; 5 – маркована сперма в зоні непарного яйцепроводу; 6 – спермо-приймач; 7 – стінка спермоприймача; 8 – сперма маркована зондом В; 9 – сперма маркована зондом А; 10 - сперма маркована зондом Б

Гістологічні дослідження спермоприймачів бджолиних маток різних груп показали, що розміщення в них сперми трутнів залежить не тільки від розподілу її в яйцепроводах, але й від кратності осіменінь. При триразовому введенні кожна порція сперми розміщується в спермоприймачі матки С-подібними шарами, не змішуючись з сперматозоїдами інших трутнів. Навпаки, одноразове осіменіння матки сприяє незначному купажуванню порцій сперми в спермоприймачі завдяки тому, що при міграції її з яйцепроводів у спермоприймач відбувається захоплення окремих згустків іншої сперми.

Встановлено, що за одноразового введення у зону піхви порцій сперми, міченої флуоресцентними мембранними зондами А, Б і В, у бджолиних маток, яких фіксували через 5 хв, ще не спостерігалось інтенсивне купажування еякулятів трутнів. На гістологічних зрізах чітко помітні ділянки сперматозоїдів з кольором зондів А та Б. Крім того, за цей період не встановлено активного переміщення сперми з камери жала до яйцепроводів.

Через 30 хв після фіксації бджолиних маток пофарбовані порції сперми трутнів частково перемістились до їх яйцепроводів, але в спермоприймачі сперматозоїдів не було. Сперма, яка знаходилась у статевих шляхах бджолиних маток, була змішаною, а стінки парних яйцепроводів розширились мало.

Встановлено, що по завершенні осіменіння в яйцепроводи бджолиних маток через 60 хв переміщується близько 80% всієї введеної сперми. Парні яйцепроводи значно збільшуються у діаметрі. Ближче до яєчників у них сперма розміщувалась в менш змішаному стані. Тут можна було розрізнити ділянки з спермою пофарбованою зондами А, Б і В. Ближче до яєчників і центральної частини парних яйцепроводів найбільшу частку займала сперма з зондом А, тобто та, яку вводили бджолиній матці останньою. Починаючи від середини парних яйцепроводів і далі до піхви, порції були змішані настільки, що виявити суцільні ділянки маркованої сперми тим чи іншим зондом не вдалось. У спермоприймачі бджолиних маток потрапили перші порції сперми, маркованої флуоресцентними зондами А і Б.

Гістологічні зрізи бджолиних маток, яких фіксували через 60 і 80 хв після штучного осіменіння, показали, що сперма в статевих шляхах і спермоприймачі перебуває у змішаному стані. Подальше переміщення сперми в яйцепроводах уповільнюється, а до спермоприймача, навпаки, зростає. Гістологічні зрізи статевої системи бджолиних маток, яких фіксували через 12 год, свідчать, що залишки сперми, які не потрапили у спермоприймач, переважно знаходились у камері жала та непарному яйцепроводі біля піхвового клапана. Отже, при переміщенні порцій сперми до яйцепроводів відбувається їх купажування в камері жала. Не виключено, що цей процес продовжується і в каналі піхви.

Встановлено, що за одноразового осіменіння в зону піхви незалежно від співвідношення об’ємів порцій введеної сперми у спермоприймачах маток відбувається її змішування. При розгляді зрізів не виявлено певних закономірних перерозподілів згустків сперматозоїдів. У групі бджолиних маток, яким ввели на 3 мкл більше сперми, маркованої зондом Б, на всій площі зрізів спермоприймачів домінувала статева продукція, пофарбована цим барвником.

За триразового осіменіння бджолиних маток у зону піхви пофарбовані різ-ними зондами сперматозоїди розміщувались в спермоприймачах у вигляді С-по-дібних згустків без наявності в їх зоні ділянок іншого забарвлення. Встановле-но, що в процесі фізіологічного витоку сперми для запліднення яєць відбу-вається купажування різних порцій в зоні, що прилягає до вивідного протоку. Співвідношення потомства за батьківським походженням залежить від кількості та розподілу сперматозоїдів різних трутнів у зоні витоку із спермоприймача. Цим фактом пояснюється механізм розширення можливостей вибіркового запліднення яйцеклітин при наявності в зоні мікропіле сперматозоїдів не тільки одного індивида, а й інших генотипів. У контексті еволюції виду Apis mellifera бджолина матка набула через поліандрію глибокої диференціації від робочих особин і високого рівня досконалості виконання функції відтворення.

Отже, спосіб, кратність, послідовність введення еякулятів сперми трутнів у статеві шляхи бджолиних маток впливають на розміщення статевої продукції в спермоприймачі. сперма різних трутнів активно змішується в статевих шляхах бджолиних маток лише в тому випадку, якщо її вводити в зону піхви. Навпаки, введення сперми трутнів до непарного яйцепроводу не призводить до інтенсивного її змішування при переміщенні до спермоприймача. За нашим уявленням, при природному спаровуванні міграція сперми у статевих шляхах бджолиної матки має відбуватись так саме як і при її введенні в зону піхви за штучного осіменіння. Залежно від кратності спаровувань маток сперма різних трутнів може перебувати у спермоприймачі як у змішаному, так і в уособленому вигляді.

Для з’ясування впливу кратності введення сперми трутнів на розміщення в спермоприймачі та витрачання її маткою дослідили бджіл за морфологічними ознаками. Неплідних бджолиних маток осіменяли за різних варіантів введення сперми трутнів контрастних за зовнішніми ознаками порід (українська, італійська, сіра гірська кавказька). З початком репродуктивної діяльності бджолиних маток від сімей протягом двох сезонів відбирали проби бджіл з інтервалом у 12 днів, у яких за промірами екстер’єру визначали породну належність за батьком (рис. 6, 7).

Встановлено, що співвідношення потомства різного батьківського по-ходження, яке продукують матки, одержані від штучного осіменіння, залежить від способу введення сперми. При введенні сперми в яйцепроводи бджолині матки продукують потомство, де співвідношення бджіл різних генотипів у сім’ях за динамікою змінюється синусоїдально. Одноразове введення сперми в зону піхви сприяє її змішуванню в процесі міграції у статевих шляхах бджолиної матки. Незалежно від співвідношення статевої продукції, такі бджолині матки продукують яйця, які запліднюються сперматозоїдами різних трутнів (рис. 7). Уособлене введення сперми трутнів, навпаки, забезпечує виве-дення бджіл різного батьківського походження, динаміка розподілу яких зоб-ражується синусоїдами. Отже, купажування сперми трутнів у спермоприймачах

бджолиних маток за тривалої їх репродуктивної діяльності не відбувається, оскільки одержуване жіноче потомство характеризується стабільним розподілом за батьківським походженням. Навпаки, при ін’єкції статевої продукції в зону піхви відбувається інтенсивне купажування сперми в спермоприймачі, а це в свою чергу призводить до продукування потомства з не керованим розподілом за батьківським походженням.

Розробка та апробація потокової технології штучного осіменіння бджолиних маток. Поряд з перевагами введення сперми в зону піхви, існує недолік цього способу - значні затрати часу на виконання робіт зі