Українська академія аграрних наук

Національний науковий центр

„ Інститут виноградарства і виноробства ім. В. Є. Таїрова “

Черевата Тетяна Михайлівна

УДК 634:8:631.532:631.544

РОЗРОБКА І ОПТИМІЗАЦІЯ ПРИЙОМІВ

КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА

САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ ВИНОГРАДУ

06.01.08 – виноградарство

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Одеса - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут виноградарства і виноробства ім. В. Є. Таїрова “ УААН (м. Одеса)

Науковий керівник : кандидат біологічних наук

Стицько С. А.

Національний науковий центр “Інститут виноградарства і виноробства ім. В. Є. Таїрова “

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

Хреновськов Едуард Іванович,

Одеський державний аграрний університет Мінагрополітики України, завідувач кафедри виноградарства і виноробства

кандидат сільськогосподарських наук, старший

науковий співробітник лабораторії клонової селекції

Чісніков Віталій Степанович, Національний

науковий центр “ Інститут виноградарства і

виноробства ім. В.Є. Таїрова” УААН

Провідна установа: Національний інститут винограду та вина

,,Магарач“ УААН ( м. Ялта ), відділ селекції,

генетики винограду і ампелографії

Захист відбудеться 12 жовтня 2006 р. о 13-00 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 41.374.01 в ННЦ “Інститут

виноградарства і виноробства ім. В. Є. Таїрова “ за адресою: 65496, м. Одеса,

смт. Таїрове, вул. 40-річчя Перемоги, 27, ННЦ “Інститут виноградарства і

виноробства ім. В. Є. Таїрова “

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ “Інститут

виноградарства і виноробства ім. В. Є. Таїрова “

Автореферат розісланий 6 вересня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор сільськогосподарських наук, головний

науковий співробітник Шерер В. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Переведення виноградарства України на сертифіковану основу є одним з шляхів стабілізації і інтенсивного розвитку виноградарсько – виноробної галузі України. В зв’язку з цим, закладання виноградних насаджень необхідно здійснювати безвірусним сертифікованим садивним матеріалом високих селекційних категорій клонового походження.

Одним з найбільш ефективних методів прискореного розмноження та виробництва вихідного садивного матеріалу, який відповідає європейським стандартам, є культура in vitro. Він дозволяє в короткі терміни розмножувати клоновий матеріал, вільний від вірусної і бактеріальної інфекції, в необхідній кількості. Одержаний в результаті клонального мікророзмноження генетично однорідний садивний матеріал є вихідним для створення базових насаджень і подальшого виробництва сертифікованого садивного матеріалу.

Методики клонального мікророзмноження винограду розробляються впродовж останніх десятиліть (R.Galzy, 1976; Р.Г. Абраменко, 1980; П.Я.Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарев, 1986; Н.П. Дорошенко, 1999), проте, на даний час в Україні відсутня цілісна високоефективна технологія клонального мікророзмноження для одержання садивного матеріалу винограду. Дослідження, спрямовані на розробку та оптимізацію прийомів розмноження винограду in vitro, мають велике значення в період гострої потреби виноградарської галузі в садивному матеріалі.

Актуальність дисертаційної роботи зумовлена необхідністю розробки високоефективної технології клонального мікророзмноження та впровадження її у виробництво сертифікованого садивного матеріалу винограду.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами.

Дисертаційна робота виконана в рамках науково - технічної програми УААН “Виноградарство і виноробство” ( номер держреєстрації 0198U002663), програми “Виноградарство 2001-2005” (номер держреєстрації 0104U005520). Тема дисертації є складовою частиною науково – дослідної роботи відділу розмноження інституту і виконана відповідно до завдання 02а „Розробити технологію виробництва вихідного клонового садивного матеріалу винограду в контрольованих умовах “.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було розробити та оптимізувати прийоми клонального мікророзмноження для створення цілісної технологічної схеми виробництва вихідного клонового садивного матеріалу винограду.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні задачі :

- розробити та науково обгрунтувати прийоми підвищення регенераційної

здатності винограду в культурі in vitro;

- визначити оптимальний тип вихідного матеріалу для клонального

мікророзмноження винограду;

- розробити оптимальний спосіб стерилізації ініціальних експлантів;

- оптимізувати склад поживного середовища для мікроклонування

винограду;

- розробити штучний поживний субстрат для розмноження винограду

in vitro;

- дослідити залежність процесів морфогенезу винограду in vitro від

спектрального складу світла та визначити оптимальний спектр освітлення

культуральних приміщень;

- розробити прийоми адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo;

- дати економічну оцінку розроблених прийомів клонального

мікророзмноження та виробництва садивного матеріалу винограду .

Об'єкт досліджень - морфогенез винограду в процесі клонального мікророзмноження і вирощування садивного матеріалу, прийоми оптимізації росту і розвитку рослин.

Предмет досліджень - експланти, мікроклони винограду на різних стадіях розвитку in vitro і іn vіvо.

Методи досліджень. В роботі використовували загальноприйняті методи: агробіологічні – для визначення динаміки росту і розвитку рослин, біотехнологічні – для визначення умов культивування і особливостей розвитку мікроклонів винограду in vitro; статистичні – для оцінки вірогідності одержаних результатів досліджень; порівняльно – розрахунковий – для визначення економічної ефективності розроблених прийомів процесу вирощування садивного матеріалу винограду з застосуванням культури in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на широкому спектрі експериментального матеріалу розроблена і науково обґрунтована цілісна технологічна схема клонального мікророзмноження і виробництва вихідного клонового садивного матеріалу винограду, яка базується на застосуванні змінних іонітних субстратів в поєднанні з оптимальними умовами культивування.

Розроблені та науково обґрунтовані прийоми підвищення регенераційної здатності винограду in vitro. Розроблено склад уніфікованого безгормонального поживного середовища для клонального мікророзмноження винограду; встановлено позитивний вплив додаткових джерел азоту в складі середовища на розвиток мікроклонів винограду. Вперше виявлена залежність морфогенезу винограду in vitro від спектрального складу світла, науково обґрунтований оптимальний спектр освітлення культуральних приміщень. Вперше розроблений і застосований для культури винограду in vitro штучний іонітний поживний субстрат, визначені його оптимальні фізико – хімічні параметри. Розроблений та теоретично обґрунтований спосіб поступової адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo, новизна якого підтверджена рішенням про видачу деклараційного патенту на корисну модель за заявкою № 20040402794 “Спосіб цілорічного вирощування садивного матеріалу рослин’’(2004р.).

Практичне значення роботи.

Розроблена ефективна технологічна схема клонального мікророзмноження та вирощування вихідного садивного матеріалу винограду, яка дозволяє підвищити рівень рентабельності виробництва. Розмножено та передано в базові господарства вихідний садивний матеріал 22 клонів 9 столових та технічних сортів винограду.

Розроблені рекомендації для науково – виробничих підприємств і лабораторій з застосування технологічної схеми клонального мікророзмноження та виробництва садивного матеріалу винограду.

Особистий внесок здобувача. На основі аналізу літературних джерел за темою дисертації дисертантом були визначені мета досліджень, завдання і шляхи їх вирішення, самостійно здійснена постановка експериментів, проведені обліки, статистична обробка і аналіз одержаних даних. Здобувачем особисто узагальнені теоретичні і експериментальні дані, сформульовані основні положення і наукові висновки дисертації, підготовлені статті за темою дисертації.

Апробація результатів досліджень. Основні результати досліджень були представлені на Міжнародній конференції „Биология культивируемых клеток и биотехнология” ( Алма-Ата, 1993 ), науково – практичній конференції „ Проблеми біотехнології клонального мікророзмноження плодовоягідних культур і винограду ”( Херсон, 1995 ), конференції молодих вчених та спеціалістів „ Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (20 -21 березня 2002 року, Київський національний аграрний університет), на Міжнародній конференції „Современные достиження биотехнологии в виноградарстве” (Новочеркаськ, липень 2005 року), на засіданнях Вченої ради ННЦ „ ІВіВ ім. В.Є.Таїрова” в 1995-2005рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано п’ять наукових статтей, чотири тези доповідей, одержано рішення на видачу деклараційного патента на корисну модель.

Структура та обсяг роботи.

Дисертація складається з вступу, дев’яти розділів основної частини, висновків, рекомендацій виробництву, списку цитованої літератури ( 210 найменувань, з них 109 – іноземних авторів) та додатків. Робота викладена на 159 сторінках друкованого тексту, містить 27 таблиць, 18 ілюстрацій, 5 додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Застосування методу клонального мікророзмноження в рослинництві

(огляд літератури)

Наведена і узагальнена інформація про стан досліджень з питань розмноження винограду in vitro. На основі аналізу робіт вітчизняних та іноземних авторів визначені недоліки технологічних етапів клонального мікророзмноження, обґрунтована необхідність і визначені напрямки оптимізації процесу мікроклонування. Актуальність даної проблеми і необхідність розробки прийомів для підвищення ефективності виробництва садивного матеріалу винограду зумовили проведення досліджень, результати яких представлені в даній дисертаційній роботі.

Об’єкти, матеріали та методика проведення досліджень

Робота виконувалась в лабораторії культури in vitro, теплицях Центру клонової селекції ННЦ “Інститут виноградарства і виноробства ім.В.Є.Таїрова” та його дослідних ділянках протягом 1994 - 2005рр. у відповідності до програм НДР.

При проведенні досліджень використовували методичні рекомендації Р.Г. Бутенко (1964), П.Я.Голодриги, В.А.Зленко, Л.А.Чекмарева, Б.А.Левенко (1986). Дослідження проводили на клонах столових, технічних і підщепних сортів винограду.

В якості вихідного матеріалу для введення в культуру in vitro використовували зелені пагони маточних кущів винограду на протязі вегетації. Визначення оптимального типу вихідного матеріалу проводили шляхом порівняння регенераційної здатності експлантів пагонів кущів, які культивуються на клонодослідній ділянці, в теплицях Центру клонової селекції, а також пагонів, одержаних пророщуванням визрілої лози в зимовий період. Кущі-донори проходили систематичне тестування на відсутність вірусної і бактеріальної інфекції.

Стерилізацію експлантів, введення їх в культуру in vitro, а також всі роботи, пов'язані з розмноженням in vitro, здійснювали в асептичних умовах ламінарних боксів, обладнаних пилозахисними камерами зі стерильною подачею повітря типу СМ - 5 і ультрафіолетовими опромінювачами типу УТД- 2. Для визначення режиму стерилізації вихідного матеріалу при введенні в культуру in vitro були випробувані розчини сульфохлорантину (0,2% ; 0,5%), гіпохлориту кальцію ( 2% ; 5%), та 700 і 600 етанол за умов різної експозиції.

Оптимальний тип ініціальних експлантів визначали, порівнюючи особливості розвитку мікрочубуків в залежності від їх розміру - 0,3 – 0,7 см; 0,8 – 1,0 см ; 1,2 - 1,5 см та місцезнаходження на вихідному пагоні - на рівні 1, 2, 3, 4, 5, 6- го вузлів від верхівки пагону.

Рослини культивували in vitro в боксах при сталих фізичних параметрах: t0 = + 27 0 С, освітленості 3 000 лк, 16 - годинному фотоперіоді; вологості повітря - 70 %. Для культивування мікроклонів використовували стакани діаметром 40 мм, висотою 150 мм. Об’єм поживного середовища складав 20 мл, іонітного субстрату – 45-50см3.

Розробку оптимального поживного середовища здійснювали шляхом модифікації складу середовища Ніча і Ніч - вмісту біологічно-активних речовин, вуглеводів, мінеральних солей. В якості додаткових джерел застосовували азотнокислий кальцій в концентрації 240 мг/л; 360 мг/л; 480 мг/л і комплекс амінокислот (мг/л) : гліцин - 4,0, цистін - 2,5, L - глутамінова кислота - 7,0, L- аланін – 5,0.

Розробку поживного субстрату для культивування винограду in vitro проводили спільно з інститутом фізіко - органічної хімії АН Білорусі (м. Мінськ). Досліджували вплив рівня рН - 6,0; 7,0; 8,0 та величини реалізованої ємкості аніоніту субстрату E - 1,5; 2,5; 3,0; 3,5; 4,5 мг-екв/г на розвиток мікроклонів.

Дослідження залежності морфогенезу винограду in vitro від спектрального складу світла проводили за умов освітлення культуральних боксів фітолампами

ЛР - 12,5 - з випроміненням в синій частині спектру (430 нм) - 12,5% , в червоній (625 нм ) - 87,5% та ЛР - 25 - з випроміненням в синій частині спектру–25%, червоній - 75%. Роботу проводено у співпраці з відділом люмінофорів Інституту Гіредмед (м. Москва.).

Адаптацію мікроклонів винограду до умов in vivo здійснювали шляхом поєднання етапів мікрочубукування, вирощування та адаптації мікроклонів. Для визначення оптимального типу поживного субстрату для адаптації вивчали особливості розвитку рослин на суміші іонітних субстратів Біона : цеоліт ( фракції 0,5-1,0; 2,0-3,0; 4,0-5,0 мм ) у співвідношенні 1 : 1; 3 : 1; 3 : 2.

В ході досліджень проводили обліки за показниками: регенераційна здатність (%); приживлюваність (%) ; період проліферації бруньки (діб) ; період ризогенезу (діб); довжина пагона (см); кількість вузлів на пагоні (шт); кількість коренів (шт); довжина коренів (см ), площа листової поверхні (см2), діаметр пагону (мм ), визрівання пагону ( % ).

В кожному варінті досліду використовували по 20 експлантів. Досліди виконували в п'ятикратній повторності.

Дорощування адаптованих мікроклонів до параметрів стандартних саджанців здійснювали в теплиці на цеолітовому субстраті та в польових умовах. Біометричні показники розвитку саджанців визначали за методикою С.О.Мельника та В.І. Щигловської (1957).

Статистична обробка одержаних експериментальних даних проведена з застосуванням дисперсійного, регресійного та кореляційного аналізу на 95 % рівні вірогідності за методикою Б.А.Доспєхова (1985), з використанням комп'ютерних програм Microsoft Excel, Аgrobase.

Оптимізація відбору вихідного матеріалу для клонального

мікророзмноження винограду

Порівняльне вивчення особливостей матеріалу різного походження встановило, що експланти пагонів, відібраних з кущів, які ростуть в польових умовах, при введенні в культуру in vitro виявляють високий рівень контамінації – 57,9 % і низьку регенераційну здатність – 26,4 %. При використанні пагонів з теплиці і з пророщеної лози інфекція проявлялась лише у 12,5 % експлантів. За рівнем регенераційної здатності – 71,8 % - експланти з пагонів тепличного походження істотно перевищували інші варіанти - на 6,7 %. В подальшому експланти пагонів кущів винограду, які культивуються в теплиці, відрізнялись активними морфогенними процесами, період формування мікроклонів був коротшим на 5,2 – 7,0 діб. Виявлено, що найвищий регенераційний потенціал мають молоді пагони винограду в фазі активного росту. Періодичний відбір верхівок пагонів стимулював розвиток пасинків, які в подальшому були донорами ініціальних експлантів.

Встановлено, що істотний вплив на розвиток експлантів винограду зумовлює їх місцезнаходження на вихідному пагоні. Проведений дисперсійний аналіз експериментальних даних виявив, що вплив фактора „сорт” на процеси регенерації експлантів істотно поступається впливу основного фактора –„ номер вузла”(рис.1).

Рис. 1 Залежність показників розвитку експлантів винограду від їх місцезнаходження на вихідному пагоні (середнє за 2002-2003рр.)

Так, процеси морфогенезу активніше проходили у апексів і мікрочубуків 3-го і 4-го вузлів. Період проліферації у них був на 1,5 - 2,5 доби коротшим, ніж у експлантів 2-го і 5-го вузлів та на 2,5 - 3,8 доби - ніж у мікрочубуків 6-го вузла, а ризогенез починався раніше на 4,7-5,1 доби. Найнижчий показник приживлюваності виявлено у мікрочубуків 5 – 6-го вузлів – 55,3 – 60,0 %, а у експлантів 1 -2–го вузлів він був на рівні 75,1 – 75,6 % . Істотно вище в порівнянні з іншими варіантами була приживлюваність мікрочубуків 3 – 4-го вузлів – 86,4 – 89,2 %. В подальшому рослини, які регенерували з експлантів, відібраних на рівні 3 – 4-го вузлів вихідного пагону, розвивалися інтенсивніше - період формування мікроклонів був коротшим на 4,5 – 5,0 діб в порівнянні з іншими варіантами. Виявлені залежності були характерні для всіх дослідних клонів.

Дослідження особливостей розвитку ініціальних експлантів в залежності від їх розміру, виявили істотні відмінності між варіантами (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив розміру ініціальних експлантів на розвиток мікроклонів винограду

(середнє за 2000 – 2002 рр.)

Сорт, клон | Розмір

експлан-

тів, см | Показники розвитку

приживлюва-ність,% | період про-

ліферації, діб | період ризо-

генезу, діб

Оригінал, 5861 | 0,3-0,7 | 84,0 | 7,0 | 9,5

0,8-1,0 | 85,5 | 3,8 | 4,1

1,1 -1,5 | 70,6 | 8,2 | 9,3

Мускат гамбурзький,2694 | 0,3- 0,7 | 80,4 | 6,2 | 8,9

0,8 -1,0 | 82,6 | 4,0 | 4,4

1,1 -1,5 | 69,5 | 8,5 | 9,2

Каберне Совіньйон, 441 | 0,3- 0,7 | 81,3 | 6,5 | 8,7

0,8 -1,0 | 88,4 | 4,0 | 5,0

1,1 -1,5 | 72,5 | 9,0 | 9,8

Марсельський чорний ранній, 1294 | 0,3- 0,7 | 78,2 | 6,1 | 8,3

0,8 -1,0 | 83,6 | 3,8 | 5,2

1,1 -1,5 | 71,8 | 7,8 | 9,8

РхР 101-14, 4923 | 0,3- 0,7 | 81,0 | 6,0 | 7,8

0,8 -1,0 | 83,7 | 3,7 | 6,0

1,1 -1,5 | 72,4 | 7,7 | 9,6

Середні значення і групи

вірогідності | 0,3- 0,7 | 80,9 b | 6,4 b | 8,6 a

0,8 -1,0 | 84,7 a | 3,9 c | 4,9 b

1,1 -1,5 | 71,4 c | 8,2 a | 9,5 a

HIP05 2,42 | 0,47 | 1,14

Математична обробка одержаних даних показала, що між варіантами існують вірогідні відмінності за всіма показниками розвитку.

Найкоротший період проліферації пазушної бруньки виявляли мікрочубуки розміром 0,8-1,0 см - 3,9 - 4,0 доби в порівнянні з експлантами розміром 0,3-0,7см – 6,2 – 6,4 доби і експлантами розміром 1,1-1,5см – 8,0 - 8,3 доби. У експлантів розміром 0,8-1,0 см утворення коренів починалося через 5,0 -5,5 доби. На відміну від них у експлантів малих ( 0,3-0,7 см) розмірів період ризогенезу був тривалішим - 8,5 - 9,0 діб. У експлантів розміром 1,1-1,5 см, внаслідок надмірного розростання базальної частини, корені та пагін формувалися повільно. За показником приживлюваності – 82,5 -87,8 % експланти розміром 0,8-1,0 см також істотно перевищували інші варіанти.

В результаті досліджень визначено, що оптимальним типом вихідного матеріалу для клонального мікророзмноження винограду є зелені пагони кущів винограду, які ростуть в теплиці. При цьому, краще приживлюються і мають найвищий регенераційний потенціал одновічкові мікрочубуки розміром 0,8 - 1,0 см, відібрані на рівні 3 – 4-го вузлів вихідних пагонів.

Оптимізація складу поживного середовища для клонального мікро-розмноження винограду. Для культивування дослідних клонів винограду in vitro було випробувано 10 типів поживних середовищах різного складу. Більш активний розвиток експлантів спостерігався на середовищі Ніча і Ніч (НН). Так, проліферація пазушної бруньки мікрочубуків починалася в середньому на 3,7 - 4,2 доби, ризогенез – на 3,9 - 4,7 доби раніше, а приживлюваність була на 17,3 – 25,1 % вище, порівняно з контролем (середовище Мурасіге і Скуга). При цьому, на середовищі НН сортова специфіка дослідних клонів проявлялась в меншій мірі, ніж в інших варіантах, тому його склад обрали в якості основи для розробки оптимального поживного середовища для клонального мікророзмноження винограду.

Для запобігання можливих хромосомних порушень у рослин (R.Galzy,1972) та для забезпечення генетичної однорідності садивного матеріалу, зі складу середовища були виключені синтетичні фітогормони. Оптимізацію складу середовища проводили шляхом зменшення концентрації мінеральних макросолей на 1/3, введення посиленого комплексу вітамінів по Стаба (1981). Для активізації процесів морфогенезу рослин в якості додаткових джерел азоту вводили азотнокислий кальцій та комплекс амінокислот. Результати досліджень виявили залежність процесів морфогенезу експлантів винограду від концентрації Са ( NO3)2 в середовищі (рис. 2)

Рис.2 Залежність показників розвитку мікроклонів винограду від концентрації
Са(NO3)2 в поживному середовищі (середнє за 2000-2002 рр.)

Встановлено, що оптимальною концентрацією Са(NO3)2 в середовищі є 360 мг/л. При цьому, за показником довжини пагону цей варіант перевищував контроль на 2,8 см, а за кількістю вузлів – на 1,9 шт. Приживлюваність була істотно вище – в середньому на 20,9 %. Встановлені тенденції поліпшення показників розвитку були характерні для всіх дослідних клонів. Результати дисперсійного аналізу встановили домінуючий істотний вплив концентрації Са(NO3)2 на відміну від впливу сорту. Дещо випереджали в розвитку експланти клонів підщепних сортів, але відмінності з показниками розвитку інших сортів були неістотними. Введення до складу середовища комплексу амінокислот зумовлювало певну активізацію процесів розвитку рослин. В дослідному варіанті приживлюваність експлантів підвищувалася на 8,1–9,6 % в порівнянні з контролем, а процеси проліферації і ризогенезу відбувалися актівніше - довжина пагонів мікроклонів перевищувала контроль – на 1,9 - 3,1 см, а вузлів формувалося на 2,6 – 2,9 шт. більше. Рослини на середовищі з додатковими джерелами азоту відзначалися більшою силою росту, строки формування мікроклонів скорочувалися на 2,8- 3,0 доби.

В результаті проведених досліджень з оптимізації поживного середовища для клонального мікророзмноження винограду in vitro визначено його склад (мг/л) : NH 4 NO3 - 480; Ca (NO3)2 - 360; KNO3 – 620; Mg SO4 • 7 H2O – 125 ; KH2PO4 - 130; Na2 ЕДТА • 2Н2О - 37,3; Fe SO4 • 7 H 2O - 27,8; H 3BO3 – 10,0; Mn SO4 • 4H 2O -25,0; Zn SO4 • 7 H2O – 10,0; KI - 0,65; Na2 MoO4• 2H2O - 0,25; Cu SO4 • 5 H2O – 0,025; мезоінозіт – 80; тіамін – 5,0; нікотинова кислота -10,0; піридоксин-HCl – 2,0; фолієва кислота- 2,0; біотин- 2,0; гліцин – 4,0;L- цистеін - 2,5; L-глутамінова кислота - 7,0; L - аланін - 5,0; вугілля активоване – 0,3 г/л; сахароза - 15 г/л; агар - 4,5 г/л.

Результати дисперсійного аналізу встановили відсутність істотних відмінностей між показниками розвитку дослідних клонів винограду на розробленому середовищі (Нм). Доведено, що величини приживлюваності, висоти рослин, кількості вузлів на пагоні при культивуванні на середовищі Нм вірогідно перевищували контроль. Так, приживлюваність експлантів підвищувалась на 12,3 -15,5 %, процеси проліферації бруньки і ризогенезу починались одночасно- на 3,2 – 4,0 добу. Висота пагону зростала порівняно з контролем в середньому на 3,5 - 4,0 см, кількість вузлів - на 2,9 – 3,4 шт. Повне виключення зі складу поживного середовища фітогормонів не мало негативних наслідків для розвитку мікроклонів. Застосування середовища Нм для культивування великої групи сортів виявило, що розвиток мікроклонів відбувається без проявів сортової специфіки.

Розробка поживного субстрату для розмноження винограду in vitro. З метою підвищення ефективності мікроклонування здійснювали заміну агарового середовища штучним поживним субстратом для розмноження та вирощування мікроклонів винограду in vitro. Субстрат розроблено на основі іонно - обмінних смол (суміш синтетичних катіоніту і аніоніту, насичених біогенними елементами з урахуванням особливостей живлення виноградної культури). Він є субстратом багаторазового використання. Дослідження були спрямовані на визначення оптимальних параметрів іонітного субстрату для живлення і розвитку мікроклонів винограду. Вивчення впливу рівня рН субстрату виявило певні закономірності морфогенезу мікроклонів. Доведена відсутність істотних відмінностей між досліджуваними показниками розвитку експлантів дослідних клонів на субстратах з рН = 7,0 і рН = 8,0. Величина приживлюваності експлантів на субстраті з рН = 8,0 була дуже низькою – 26,5 – 27,4 %. Розвиток мікрочубуків відбувався повільно: проліферація пазушної бруньки починалася на 10,5 - 11,5, ризогенез - на 12,5 – 13,0 добу, але коренева система надалі не розвивалася, рослини припиняли розвиток через 20-25 діб. Також невисокою – 33,2 -34,1 % - була приживлюваність експлантів на субстраті з рН = 7,0, а періоди проліферації і ризогенезу були тривалими - в середньому відповідно - 11,6 – 12,8 і 12,6 - 14,0 діб. Пожовтіння листової пластинки, загибель більшої частини мікрочубуків спостерігали через 7- 10 діб.

Розвиток мікроклонів на субстраті з рН=6,0 відбувався більш активно. Статистичний аналіз виявив істотні відмінності показників розвитку рослин порівняно з іншими варіантами. Приживлюваність мікрочубуків була вище на 32,7-34,2 %, період проліферації бруньки у більшості клонів складав 8,1-8,2 доби, а період ризогенезу дорівнював 9,4-9,6 доби. При цьому, процеси проліферації пазушної бруньки і коренеутворення проходили одночасно у мікроклонів всіх дослідних сортів. Аналіз експериментальних даних показав, що виявлені закономірності були характерні для експлантів всіх дослідних клонів.

Проведені дослідження показали, що розвиток мікроклонів винограду значною мірою залежить від величини реалізованої ємкості субстрату (рис.3).

Рис 3 Залежність показників розвитку мікроклонів винограду від ємкості іонітного субстрату (середнє за 1994-1997 рр.)

Проте, статистичний аналіз експериментальних даних показав істотність відмінностей не для всіх варіантів досліду. З вірогідністю 95 % істотними є відмінності за всіма показниками розвитку у рослин на субстраті з Е = 4,5 мг- экв/ г в порівнянні з іншими варіантами. Приживлюваність експлантів була вище на 45,4 – 48,6 %, а розвиток пазушної бруньки та ризогенез починалися на 3,0 -5,5 доби раніше. Таким чином, в результаті досліджень було встановлено, що оптимальний розвиток всіх дослідних клонів винограду спостерігався на іонітному субстраті (Біона) з параметрами рН = 6,0 та Е = 4,5 мг-екв/г.

Дослідження залежності розвитку мікроклонів винограду від спектрального складу світла. Одержані експериментальні дані виявили чітку залежність показників розвитку винограду in vitro від спектрального складу cвітла. В ході досліджень проявились неістотні сортові відмінності дослідних клонів. В цілому, всі клони однаково реагували на спектральний склад освітлення, але ступінь відгуку був різним ( рис. 4).

Рис. 4 Залежність показників розвитку мікроклонів винограду від спектрального складу світла (середнє за 1994-1997 рр.)

Найбільш інтенсивно росли мікроклони за умов освітлення лампами зі співвідношенням синього світла - 12,5% і червоного - 87,5% (ЛР-12,5). Висота рослин через 30 діб культивування складала в середньому 10,8 - 11,6 см, що на 3,3 см більше, ніж в контролі (ЛБ-36). За показником кількості вузлів на пагоні рослини в умовах освітлення лампами ЛР- 12,5 також істотно перевищували контроль. Збільшення частки синього світла до 25% (ЛР-25) значно уповільнювало процеси формування мікроклонів. За умов освітлення мікроклонів лампами з переважанням в спектрі червоного світла – 87,5% скорочувалися строки формування дорослих мікроклонів – в середньому на 1,8 – 2,1 доби в кожному пасажі, що сприяло підвищенню коефіцієнта розмноження.

Дослідження процесів морфогенезу мікроклонів в процесі адаптації виявили, що вони значною мірою залежать від спектрального складу світла (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив спектрального складу світла на розвиток мікроклонів винограду

на етапі адаптації ( середнє за 1994 - 1997 рр. )

Тип ламп | Приживлюваність, % | Приріст, см

Одеський сувенір, 7844

ЛР -12,5 | 88,2 | 9,3

ЛР - 25 | 80,5 | 8,2

ЛБ – 36 (контроль) | 79,2 | 8,3

Мускат таїровський, 371

ЛР -12,5 | 86,3 | 9,7

ЛР - 25 | 79,8 | 8,5

ЛБ – 36 (контроль) | 78,4 | 8,2

Каберне Совіньйон, 441

ЛР -12,5 | 87,1 | 9,2

ЛР - 25 | 81,1 | 8,1

ЛБ – 36 (контроль) | 79,5 | 8,0

Рислінг рейнський, 14172

ЛР -12,5 | 88,6 | 9,4

ЛР - 25 | 81,1 | 8,2

ЛБ – 36 (контроль) | 79,5 | 8,1

Р х Р Кобера 5 ББ, 21192

ЛР -12,5 | 89,6 | 10,4

ЛР - 25 | 80,8 | 8,6

ЛБ – 36 (контроль) | 79,3 | 8,5

НІР05 2,31 | 0,93

Активніший розвиток мікроклонів спостерігався при освітленні спектром, що містить 87,5 % червоного і 12,5 % синього світла. Приживлюваність рослин при освітленні лампами ЛР-12,5 істотно перевищувала цей показник в інших варіантах - на 8,8 - 9,2 контроль і на 8,0 - 8,2 % варіант з ЛР-25. При цьому, величина приживлюваності мікроклонів розрізнялася лише по варіантах досліду, різниця між дослідними сортами була неістотною. Через 30 діб приріст рослин був в середньому 9,7 см, що на 1,5 см більше, ніж в контрольному варіанті. Приріст пагону за умов освітлення фітолампами ЛР - 25 був на рівні контролю.

Одержані результати свідчать, що співвідношення компонентів спектрального складу світла -12,5% синього і - 87,5% червоного сприяє активізації процесів розвитку рослин in vitro та на етапі адаптації.

Розробка прийомів адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo. Оптимізацію процесу переведення рослин в умови in vivo проводили шляхом поєднання мікрочубукування, вирощування і адаптації мікроклонів на суміші іонітних субстратів (Біона і цеоліт).

При культивуванні мікрочубуків на суміші субстратів у співвідношенні 1 : 1 процес ризогенезу відбувався повільно, загальна довжина коренів не перевищувала 2,0 см, висота рослин в середньому досягала 3,8 см за 30 діб. Збільшення частки Біони в суміші (3 : 1) позитивно впливало на розвиток рослин - корені формувалися активніше, їх довжина перевищувала контроль на 2,3 см, приріст пагону був більшим на 1,6 см, а приживлюваність експлантів була вище на 48,6 – 57,2 % (табл.4).

Таблиця 4

Розвиток мікроклонів при адаптації на іонітних поживних субстратах

(сорт Каберне Совіньйон, 441, середнє за 2002 – 2004 рр.)

Співвідношення

Біона : цеоліт | Фракція

цеоліту

мм | Приживлю-ваність

% | Кількість

коренів,

шт | Довжина

коренів

см | Висота

рослин

ч-з 30 діб

1 : 1 | 0,5-1,0 | 27,2±1,76 | 2,0±0,03 | 1,5±0,51* | 2,8±0,67*

2,0-3,0 | 34,6±2,41* | 2,7±0,06 | 1,9±0,75 | 4,2±0,83

4,0-5,0 | 38,1±2,89 | 2,4±0,06 | 1,7±0,59* | 4,0±0,69

1 : 2 | 0,5-1,0 | 31,4±1,92 | 2,3±0,05 | 1,8±0,61 | 3,9±0,71*

2,0-3,0 | 42,0±2,08 | 2,8±0,07 | 2,2±0,92 | 4,8±1,08

4,0-5,0 | 67,3±3,34 | 2,5±0,05 | 2,0±0,85 | 4,5±1,15

3 : 1 | 0,5-1,0 | 49,4±2,95 | 3,7±0,08 | 3,5±1,01 | 4,6±1,22

2,0-3,0 | 90,8±4,16 | 4,3±0,12 | 4,4±1,12 | 6,7±1,58

4,0-5,0 | 75,2±3,87 | 4,0±0,11 | 3,9±1,03 | 5,8±1,34

Контроль: цеоліт | 3,0-5,0 | 23,5±1,58 | 2,9±0,07 | 1,4±0,64 | 4,1±1,17

Примітка. Дані вірогідні по відношенню до контролю (Р< 0,05), крім позначених *.

Поступове ( на протязі 8-10 діб) розкриття кришок культиваційних ємкостей сприяло пристосуванню рослин до умов зниженої вологості, підвищенню їх життєздатності. Виявлено, що для забезпечення високого рівня приживлюваності на момент пересадки в цеолітовий субстрат їх висота не повинна перевищувати 6,5 - 7,0 см, а діаметр пагону має бути не менше 3,0 мм. Такі рослини успішно адаптуються до нових умов, їх приживлюваність складає 93,2 – 95,3 %.

Адаптовані мікроклони висаджували на постійне місце в тепличні секції в цеолітовий субстрат. До листопада приріст пагону складав в середньому 105,2 – 110,7 см, його визрівання було на рівні 79% ( табл. 5).

Таблиця 5

Біометричні показники однорічних саджанців винограду, одержаних методом клонального мікророзмноження (середнє за 2003-2005р.)

Сорт, клон |

Довжина пагону, см | Площа

листової поверхні, см2 | Діаметр пагону,

мм | Визрівання пагону,

%

Каберне Совіньйон, 441 | 112,7 | 1337,5 | 5,1 | 78,7

Мускат таїровський, 371 | 109,4 | 1182,4 | 5,0 | 82,5

Марсельський чорний ранній, 1296 | 98,5 | 1015,2 | 4,8 | 79,8

НІР05 | 3,07 | 3,81 | 0,56 | 0,87

Впровадження розроблених прийомів при адаптації мікроклонів дозволило підвищити приживлюваність рослин до 93-96 % і збільшити загальний об'єм вирощування саджанців.

Обговорення результатів роботи

Узагальнено дані досліджень, теоретично обґрунтовано вплив розроблених і оптимізованих прийомів на процеси росту і розвитку мікроклонів винограду в процесі клонального мікророзмноження та вирощування садивного матеріалу.

Економічна ефективність клонального мікророзмноження і

вирощування вихідного садивного матеріалу винограду.

При визначенні економічної ефективності керувались рекомендаціями П.Я.Голодриги та ін.(1986) а також нашими фактичними витратами при проведенні клонального мікророзмноження та вирощування садивного матеріалу.

Основними факторами підвищення економічної ефективності виробництва при впроваджені розроблених прийомів оптимізації клонального мікророзмноження для вирощування садивного матеріалу винограду є: підвищення регенераційної здатності експлантів винограду на всіх етапах розмноження, збільшення рівня приживлюваності і прискорення процесів розвитку мікроклонів винограду, скорочення термінів вирощування і збільшення виходу саджанців. Застосування розроблених прийомів дозволяє зменшити виробничі витрати на придбання хімреактивів та матеріалів, витрати електроенергії, трудовитрати. Підвищення економічної ефективності забезпечуєтся за рахунок високого виходу саджанців і складає 31 грн. при вирощуванні 10 мікроклонів, з урахуванням виходу саджанців – 81%. Розрахунки показали, що виробництво вихідного садивного матеріалу за розробленою технологічною схемою забезпечує рентабельність на рівні 80 %.

Таблиця 6

Економічна ефективність технології виробництва садивного матеріалу винограду з застосуванням методу клонального мікророзмноження

( в розрахунку на 10 мікроклонів )

Найменування показників | Значення показників

базовий варіант | розроблений

Виробничі витрати, тис. грн. | 97 650,00 | 81 100,00

Собівартість саджанця, грн. | 13,90 | 10,00

Реалізаційна ціна, грн. | 18,00 | 18,00

Додатковий прибуток :

- на одиницю продукції

- на весь об’єм виробництва, грн. |

-

- |

3,90

31 ,00

Рівень рентабельності, % | 30,0 | 80,0

ВИСНОВКИ

1. На широкому спектрі експериментального матеріалу розроблена і науково обгрунтована технологічна схема розмноження і вирощування садивного матеріалу винограду з використанням методу in vitro. Розроблені та оптимізовані прийоми клонального мікророзмноження, забезпечили підвищення регенераційної здатності винограду in vitro і прискорення процесів розвитку рослин. Результати досліджень свідчать про перспективність використання методу in vitro для цілорічного виробництва вихідного садивного матеріалу винограду.

2. Визначена залежність регенераційної здатності винограду in vitro від походження і фізіологічного стану вихідного матеріалу. Встановлено, що оптимальним матеріалом винограду для введення в культуру in vitro є зелені пагони кущів, які ростуть в теплиці. Виявлені відмінності в розвитку експлантів in vitro залежно від їх розміру і місцеположення на пагоні. Оптимальним типом ініціальних експлантів для клонального мікророзмноження винограду, є одновічкові мікрочубуки розміром 0,8 – 1,0 см, відібрані на рівні 3- 4 -го вузлів молодих пагонів. Використання даного типу експлантів для введення в стерильну культуру дозволяє підвищити приживлюваність на 18,4- 20,3 % і скоротити терміни розвитку рослин на 2,0 – 2,3 доби .

3. Експериментально доведено, що оптимальним способом стерилізації для встановленого типу вихідного матеріалу винограду є ступінчата обробка експлантів 600 етанолом (20 сек.) і 2% розчином гіпохлориту кальцію (5 хв.), яка знижує рівень інфікованості до 5 - 6 % і забезпечує високий рівень приживлюваності експлантів – 85,3 – 89,0 %.

4. Розроблено уніфіковане безгормональне поживне середовище для клонального мікророзмноження винограду in vitro, яке містить (мг/л) : NH 4 NO3 - 480; Ca (NO3)2 - 360; KNO3 – 620; Mg SO4 • 7 H2O – 125 ; KH2PO4 - 130; Na2 ЕДТА • 2Н2О - 37,3; Fe SO4 • 7 H 2O - 27,8; мікросолі по Нічу і Ніч, вітаміни по Стаба, гліцин – 4,0; L- цистін - 2,5; L-глутамінову кислоту - 7,0; L - аланін - 5,0; вугілля активоване – 0,3 г/л; сахарозу - 15 г/л; агар - 4,5 г/л. Розвиток дослідних клонів винограду на модифікованому середовищі Нм відбувається без проявів сортової специфіки на всіх етапах культивування. Оптимальний склад середовища сприяє активізації процесів морфогенезу винограду in vitro, та скороченню термінів формування мікроклонів на 4,3 - 4,5 доби.

5. Розроблений і вперше застосований для розмноження винограду in vitro штучний іонітний поживний субстрат багаторазового використання. Встановлено, що оптимальний розвиток мікроклонів відбувався на субстраті з рН = 6,0 і величиною ємкості аніоніту Е= 4,5 мг – экв/г.

6. Виявлена залежність регенераційної здатності винограду in vitro від спектрального складу світла. Доведено, що співвідношення червоного світла - 87,5 % і синього – 12,5% сприяє скороченню строків формування мікроклонів на 1,8-2,1 доби в кожному пасажі, при адаптації - підвищенню приживлюваності на 8,7 % і збільшенню приросту пагону на 1,5 см порівняно з контролем.

7. Розроблено спосіб адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo, який полягає в суміщенні етапів мікрочубукування, вирощування та адаптації. Визначено, що оптимальним субстратом для адаптації є суміш Біони і цеоліту (фракція 2-3мм) у співвідношенні 3:1. Проведення поступової одночасної адаптації кореневої системи і надземної частини рослин дозволяє скоротити період адаптації на 10-12 діб, і підвищити приживлюваність адаптованих мікроклонів до 93- 96 % .

8. Економічна ефективність застосування розроблених прийомів зумовлена скороченням термінів розвитку мікроклонів і підвищенням виходу саджанців. При вирощуванні 10 мікроклонів економічний ефект складає 31590 грн. Вирощування безвірусного садивного матеріалу винограду за оптимізованою технологічною схемою забезпечує підвищення рівня рентабельності виробництва на 50%.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Результати проведених досліджень і виробничих випробувань прийомів оптимізації клонального мікророзмноження і вирощування садивного матеріалу винограду дозволяють дати наступні рекомендації по практичному використанню розробленої технологічної схеми науково-дослідним і виробничим біотехнологічним центрам, що спеціалізуються на виробництві садивного матеріалу винограду.

Процес клонального мікророзмноження слід здійснювати наступним чином:

1. В якості ініціальних експлантів для введення в культуру in vitro використовувати одновічкові мікрочубуки молодих зелених пагонів кущів винограду, які вирощуються в теплиці, в стані активного росту розміром 0,8 – 1,0 см, відібрані на рівні 3 – 4-го вузлів. Техніка стерилізації повинна включати послідовну обробку 600 етанолом ( 20 сек. ) і 2 % розчином гіпохлориту кальцію ( 5 хв. ).

2. Для введення в стерильну культуру використовувати уніфіковане поживне середовище Нм .

3. Прискорене мікророзмноження винограду in vitro