НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ

Дмитренко Ірина Віталіївна

УДК 577.21:575:616.155.392-053.2

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ПОРУШЕННЯ,

АСОЦІЙОВАНІ З ГОСТРИМИ ЛЕЙКЕМІЯМИ У ДІТЕЙ

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клінічної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України

Науковий керівник |

доктор біологічних наук

Мінченко Жана Миколаївна,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології

Офіційні опоненти |

доктор біологічних наук

Дьоміна Емілія Анатоліївна,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології АМН України,

провідний науковий співробітник відділу радіобіології

доктор біологічних наук

Заставна Данута Володимирівна,

Інститут спадкової патології АМН України, м. Львів,

завідувач відділення діагностики спадкової патології

Провідна установа |

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

кафедра загальної та молекулярної генетики

Захист дисертації відбудеться “ 23 ” березня 2006 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 Наукового центру радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53).

Автореферат розісланий “ 21 ” лютого 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради ________________________ А.В. Стефанович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасна молекулярно-генетична діагностика лейке-мій базується на визначенні специфічних генетичних порушень, пов’язаних із злоякісною трансформацією клітин. Генодіагностика надає можливість не тільки судити про ступінь злоякісності пухлини, але і проводити ранню ідентифікацію маркерів несприятливого прогнозу щодо перебігу хвороби. що у великій мірі вилучає фактор суб’єктивності в оцінці конкретного клінічного синдрому і є вкрай важливим для вибору тактики лікування (Киселев Ф.Л. с соавт., 1990; Greaves M., Wiemels J., 2003; Steelman I.S. et al., 2004).

На сьогодні вже описана більшість специфічних транслокацій, пов’язаних із гострими лейкеміями (ГЛ) (Сергеев А.Г. с соавт., 2000). Транслокації при-водять до утворення химерних генів та експресії химерних білків з онкоген-ними власти-востями. Однак, у випадках гострих лімфобластних лейкемій (ГЛЛ) такі транслокації та відповідні химерні гени виявляються у невеликому відсотку хворих. Це обумо-вило необхідність пошуку інших пухлинних марке-рів, які б представляли більш зручну мішень для детекції лімфоїдної кло-нальності. До таких маркерів належать гени важких та легких ланцюгів імуноглобулінів (IgH та IgK), оскільки перебудови в них виникають на ранніх етапах В-клітинної проліферації (Ruiz-Arguelles G.J. et al., 2000). Оскільки пухлинна маса походить з однієї злоякісно-трансформованої клі-тини, то перебудови генів імуноглобулінів (Ig) всіх пухлинних клітин будуть ідентичні.

У випадках, коли специфічні транслокації відсутні і походження злоякісного процесу залишається нез’ясованим, ключову роль можуть відігравати інші генетичні пошкодження, що стосуються, наприклад, мутацій в генах-супресорах пухлини або в генах репарації дезоксірибонуклеїнової кислоти (ДНК). За даними більшості авторів непрямим доказом порушень в генах репарації є поява мікросателітної не-стабільності, що характеризується змінами у мікросателітній ДНК. Вони виникають внаслідок зниження ефективності клітинних репараційних систем. Порушення репа-рації ДНК розглядають як частину молекулярного механізму канцерогенезу (Chung.C., Rustgi A.K., 1995; Indraccolo S. et al., 1999).

Дані про наявність мікросателітної нестабільності при гемобластозах досить суперечливі. В експериментальних роботах виявлено взаємозв’язок між інактива-цією генів репарації і наступною мікросателітною нестабільністю з одного боку та із злоякісною лімфоїдною проліферацією з іншого боку (Lowsky R. et al., 1997). Окремі дослідники розглядають мікросателітну нестабільність як ознаку прогресії гострих та хронічних лейкемій (Wada C. et al., 1994). Існують дані про те, що наявність мікросателітної нестабільності у початковому пе-ріоді гострої лейкемії або неходжкінської злоякісної лімфоми є не-сприятливим прогностичним фактором. При цьому рецидиви, які розвиваються досить швидко, резистентні до хіміотерапії (Indraccolo S. et al., 1999).

Не дивлячись на прогрес в галузі молекулярно-генетичної діагностики лей-кемій, на сьогоднішній день немає єдиної думки про діагностичне і про-гностичне значення відносно перебігу захворювання як транслокацій і пов’я-заних з ними химерних генів, так і маркерів клональності (перебудови у генах імуноглобулінів та в мікросателітних локусах) при гострих лейкеміях у дітей. Практично відсутні роботи по дослідженню взаємозв’язку між неста-більністю мікросателітної ДНК, утворенням химерних генів, цитогенетичними пору-шеннями і іншими маркерами клональності.

Безумовно, сучасна діагностика гострих лейкемій у дітей для встанов-лення діагнозу повинна включати дані про генетичні зміни, які обумовлюють властивості пухлини та особливості перебігу захворювання, що вимагає роз-робки відповідної схеми дослідження клональних генетичних порушень у таких хворих. Засто-сування встановлених цитогенетичних та молекулярно-генетичних ознак пато-логічного клону дасть змогу визначити ступінь злоякісності процесу та визначити групу ризику щодо перебігу хвороби, виділити групи лейкемій з однаковими генетичними механізмами для подальшої модифікації програми лікування, збіль-шити термін тривалості життя хворих, що буде мати соціально-економічний ефект. Наведене визначає актуальність проблеми і обгрунтовує вибір теми дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковим програмами, планами, темами. Дисер-таційна робота виконувалась на базі Інституту клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України в лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології, а також в Лестерському університеті (Великобританія) на кафедрі генетики (керівник наукової групи проф. Ю.Є. Дуброва). Робота виконана в рамках науково-дослідних робіт за тема-тикою АМН України: “Створити програму проведення трансплантації стовбу-рових клітин кісткового мозку з урахуванням особливостей реакції організму постраждалих у віддалений період після радіоло-гічної катастрофи” (№ держре-єстрації 0100U00338, 2000–2003 рр.), “Вив-чити особ-ли-вості перебігу лейкемій та лімфом у дітей і підлітків, які проживають на за-бруднених радіонуклідами територіях України, та удосконалити сучасні методи лікування їх у віддалений період після аварії на ЧАЕС. Розробити та впровадити систему лікувально-профілактичних заходів у дітей і підлітків груп радіаційного ризику з онко-гематологічної патології” (№ держреєстрації 0102U005694, 2002–2005 рр.), “Визначення ролі генетичних систем крові та деяких молекулярно-гене-тичних маркерів пухлинних клонів в комплексній оцінці ефективності транс-план-тації стов-бурових гемопоетичних клітин у хворих на лейкемії, лімфоми та солідні пухлини” (№ держреєстрації 0103U001408, 2003–2006 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – визначення моле-кулярно-генетичних маркерів пухлинних клонів з урахуванням клональних пе-ребудов в генах імуноглобулінів і мікросателітної нестабільності як прогностичних факторів перебігу гострих лейкемій у дітей, розробка оптимальної схеми дослідження клональних генетичних порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі задачі:

1. Вивчити цитогенетичні порушення у дітей, хворих на гострі лейкемії.

2. Вивчити експресію химерних генів у дітей, хворих на гострі лейкемії.

3. Вивчити клональні перебудови в генах легких та важких ланцюгів імуноглобулінів у дітей, хворих на гострі лейкемії.

4. Вивчити порушення мікросателітної ДНК у дітей, хворих на гострі лейкемії.

5. Визначити найбільш діагностично значущі генетичні порушення при гострих лейкеміях, розробити схему дослідження клональних генетичних пору-шень у дітей, хворих на гострі лейкемії.

6. Вивчити взаємозв’язок між молекулярно-генетичними порушеннями (хи-мер-ними генами, клональними перебудовами в генах Ig, мікросателітною неста-більністю) та клініко-гематологічними факторами прогнозу і перебігом гострих лейкемій у дітей.

Об’єкт дослідження: цитогенетичні та молекулярно-генетичні пору-шення при гострих лейкеміях у дітей.

Предмет дослідження: характеристика молекулярно-генетичних пору-шень як критериїв щодо перебігу гострих лейкемій у дітей.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань викори-сто-вували цитогенетичні, молекулярно-генетичні методи дослідження. Статистич-на обробка даних проводилася за допомогою програми Microsoft Excell та програмних пакетів STATISTIKA (версія 7.0) і SYSTAT (версія 10.0).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проаналізовані та описані характер, частота та складність порушень каріотипу, експресія хи-мер-них генів, кло-нальні перебудови генів імуноглобулінів та порушення в мікро-сателітній ДНК (локуси D9S171 та D12S98) в співставлені з показниками перебігу гострих лейкемій у дітей.

Показано, що наявність клітин із спорідненими клонами є прогностично несприятливою ознакою перебігу ГЛ.

Вперше встановлено, що складні клональні порушення каріотипу у дітей, хворих на ГЛ, є незалежним прогностично несприятливим чинником інди-ві-дуальної відповіді на терапію, а делеція 16-ї хромосоми в сегменті 16q13 специфічна для хворих на гостру мієлобластну лейкемію (ГМЛ) і не погіршує прогноз перебігу захворювання.

Встановлено, що транскрипт AML/ETO не є специфічним виключно для М2_варіанту ГМЛ, що обумовлює необхідність його дослідження у всіх хворих на гостру мієлобластну лейкемію. Показано, що ПЛР-позитивні хворі щодо генів AML1/ETO та TEL/AML1 мають кращу відповідь на терапію.

Показано, що клональні перебудови генів імуноглобулінів, а також порушення в мікросателітних локусах D9S171 та D12S98 можуть бути вико-ристані як моле-кулярні маркери пухлинного клону у дітей, хворих на ГЛЛ. А залучення декількох пар праймерів для кожного гена та аналіз двох генів імуноглобулінів (IgH та IgK) збільшує виявлення клональності.

Встановлено, що контроль за мінімальною резидуальною хворобою, який грунтується на скринінгу химерних транскриптів та клональних порушень генів імуноглобулінів, дозволяє виділити пацієнтів з найвищим ризиком розвитку ранньо-го рецидиву ГЛ.

Практичне значення одержаних результатів. На основі вивчення цито-генетичних та молекулярно-генетичних порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії, визначені критерії прогнозу перебігу цього захворювання, надана оцінка інфор-ма-тивності різних методів дослідження окремих маркерів пух-линних клонів у па-цієнтів з ГМЛ та ГЛЛ. Обгрунтована доцільність вико-ристання клональних пере-будов генів імуноглобулінів та мікросателітної нестабільності як маркерів кло-нальності лейкемічного процесу у дітей.

Розроблена схема дослідження клональних молекулярно-генетичних пору-шень у дітей, хворих на гострі лейкемії.

За результатами роботи розроблено “Методичні рекомендації щодо прин-ципів формування груп ризику з онкогематологічних захворювань та прогноз перебігу лейкемій у дітей, які мешкають на забруднених радіонуклідами територіях Ук-раїни”, співавтори В.Г. Бебешко, О.В. Кучер, К.М. Бруслова, О.Є. Кузнєцова.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, проаналізовано літературу за обраною темою, визначено мету і задачі дослідження. Особисто виконані постановка культури клітин кіст-кового мозку, приготування та диференційне G-фарбування препаратів хро-мосом обстеже-них пацієнтів, цитогенетичний аналіз, дослідження експресії хи-мерних генів методом зворотнотранскриптазної полімеразної ланцюгової реак-ції (ЗТ-ПЛР), кло-нальних перебудов генів імуноглобулінів методом полі-меразної ланцюгової реакції (ПЛР), вивчення мікросателітної нестабільності методом ПЛР з подальшим сікве-нуванням, статистичний аналіз матеріалу. Самостійно проведено аналіз та уза-галь-нення даних, сформульовано висновки, написано і оформлено всі розділи дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на III науково-практичній конференції “Onсogenetic problems: scientific and applied aspects” (Київ, 2002), 8-му щорічному конгресі Євро-пейської асоціації гематологів (Ліон, Франція, 2003), 9-му щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Женева, Швейцарія, 2004), 5-й парна-сів-ській міжнародній конференції “Molecular mechanisms of cellular signaling” (Київ, 2005), міжнародній науково-практичній конференції “Гематологія і транс-фузіологія”, присвяченій 5_річчю “Українського журнала гематології та трансфузіології” (Київ, 2005).

Публікації. Основні положення роботи викладено в 12 друкованих працях, в тому числі в 5 cтаттях у фахових наукових журналах та 7 тезах доповідей на кон-ференціях.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 180 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, описання матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел (9 російською та українською мовами та 153 іноземних). Дисертаційна робота проілюстрована 39 таблицями та 16 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Групу обстеження склали 110 пацієнтів у віці від одного до 18 років, у яких був встановлений діагноз ГМЛ (35 дітей) та ГЛЛ (75 дітей). Додатково було обстежено 19 дорослих віком від 19 до 32 років, хворих на ГМЛ. Контрольну групу складали 20 здорових дітей віком від 4 до 18 років.

Діагноз лейкемії встановлювався співробітниками відділення радіа-цій-ної гематології дитячого віку (зав. відділення – д.мед.н. К.М. Бруслова), відділу гема-тології та трансплантології (зав. відділу – чл.-кор. АМН України, д.мед.н., проф. В.Г. Бебешко) Інституту клінічної радіології Наукового центру радіа-ційної меди-цини АМН України, а також відділу гематології дитячого віку Нау-ково-дослідного інституту гематології та переливання крові АМН України (зав. відділу – к.мед.н. В.Д. Дроздова).

Оцінка первинного клінічного статусу включала огляд шкірних покривів, враховувала розміри печінки та селезінки, а також наявність збільшених лім-фовузлів, лейкемічних проявів з боку центральної нервової системи (ЦНС) та осалгій. У гемограмі до уваги брали абсолютну кількість лейкоцитів, тром-боцитів, рівень гемоглобіну та відсоток бластних клітин. У кістковому мозку оцінювали відсоток бластних клітин. Діагноз ГЛ формувався у відповідності до FAB-класи-фікації і імунофенотипу бластних клітин.

Для оцінки особливостей клінічного перебігу захворювання аналізували від-повідь на терапію на 33-й день від початку лікування (наявність або від-сутність ремісії), тривалість ремісії (безрецидивне виживання), наявність рецидиву, а також п’ятирічне загальне виживання. Лікування хворих прово-дилося за стандартними протоколами інтенсивної поліхіміотерапії відповідно до імуноцитоморфологічного варіанта захворювання. Шістьом пацієнтам була проведена трансплантація гемо-поетичних стовбурових клітин периферичної крові. Медіана тривалості спо-сте-реження за пацієнтами складала 32 місяці (від 1 до 182 місяців). Обсяг проведених досліджень наведено в табл. 1.

Цитогенетичні дослідження проводили на прямих та 24-годинних нести-мульованих культурах клітин кісткового мозку. Препарати метафазних хро-мо-сом фарбували за G-методом. Ідентифікацію кожної пари хромосом та їх змін проводили згідно з критеріями ISCN (1995). У кожного пацієнта аналізували від 7 до 30 метафазних пластинок. В облік брали тільки клонові порушення (Mitelman F., 1995). Клоном вважали порушення, яке повторювалося не менше ніж двічи на 10 про-аналізованих пластинок. Клон з втратою чи придбанням хромосоми врахову-вався тільки при наявності мінімум трьох клітин з одна-ковою чисельною аномалією на 10 проаналізованих клітин.

Таблиця 1

Методи дослідження та групи пацієнтів, які були обстежені

Найменування дослідження | Кількість обстеже-них пацієнтів з ГМЛ | Кількість обстеже-них пацієнтів
з ГЛЛ | Всього

Цитогенетичне дослідження каріотипу | 19 | 26 | 45

ПЛР-дослідження експресії химерних генів | 32 | 61 | 93

ПЛР-дослідження клональних перебудов генів IgK і IgH |

12 |

40 |

52

Дослідження порушень в мікросателітних локусах D6S268, D9S171, D12S98 |

7 |

21 |

28

Вилучення геномної ДНК з клітин кісткового мозку, периферичної крові та букального епітелію проводили за стандартною методикою “висолювання” (Miller S. et al., 1988). Вилучення РНК з клітин кісткового мозку та пери-феричної крові проводили за Chomchinski P., 1987.

Визначення експресії химерних генів BCR/ABL, E2A/PBX1, MLL/AF4, MLL/AF9, AML/ETO, TEL/AML1 та CBF-в/MYH11 проводили за допомогою двораун-дової “гніздової” ЗТ-ПЛР. Праймери для ампліфікації генів BCR/ABL, MLL/AF4 та AML/ETO синтезували згідно до протоколів, рекомендованих Євро-пейською програ-мою BIOMED-1 (van Dongen J., 1999). Праймери для амплі-фікації генів E2A/PBX1, MLL/AF9, TEL/AML1 та CBF-в/MYH11 входили до скла-ду комерційних наборів (Гематологічний науковий центр РАМН, Москва). Продукт ампліфікації візуалізу-вали методом электрофорезу в 2 % агарозному гелі.

Для визначення клональних перебудов в генах імуноглобулінів (IgK та IgH) праймери, склад ПЛР-суміші та температурні режими ампліфікації від-повідали протоколам, рекомендованим Європейською програмою BIOMED-1 (Pongers-Willemse M.J. et al., 1999), а також згідно Garsia-Sаnz R. et al. (1999). Для визначення перебудов у гені IgK використовували 5 пар праймерів, а IgH – 2 пари праймерів. Після ампліфікації проводився гетеродуплексний аналіз для виділення клональних ПЛР-продуктів (Garsia-Sаnz R. et al., 1999). Отриманий продукт візуалізували методом электрофорезу в 6 % поліакріламідному гелі.

Для дослідження перебудов у мікросателітній ДНК у кожного пацієнта порівнювали мікросателітну пухлинну та конституційну ДНК. Джерелом пух-линної ДНК були клітини кісткового мозку або периферичної крові в гострому періоді захворювання. Конституційну ДНК отримували з букального епітелію або в деяких випадках з клітин кісткового мозку в фазі клініко-гематологічної ремісії. Проводили мультиплексну ПЛР мікросателітних маркерів D6S268, D9S171, D12S98. Праймери та умови ампліфікації відповідали наведеним в базі даних Genome DataBase (). Результати аналізували за допомогою автоматичного аналізатора ABI PRISM 3100 (“Applied Biosystems”, США) з використанням про-грамного забезпечення GeneMapper, версія 3.0. Появу в пух-линній ДНК нового алеля в даному локусі враховували як мікро-сателітну неста-більність (МСН), втрату алелей порівняно з конституційною ДНК – як втрату гетерозиготності (ВГ).

Цифровий матеріал оброблявся методом варіаційної статистики (критерій Likelihood ratio ч2). Розподіл тривалості ремісії (безрецидивного виживання) та загального виживання оцінювалися методом Каплан і Мейер, дані про ви-живання порівнювали за результатами log-rank-тесту. Для всіх досліджу-ваних показників статистично вірогідною вважалася величина р<0,05. Комп’ютерна обробка даних проводилася за допомогою програми Microsoft Excel та про-грамних пакетів STATISTIKA (версія 7.0) і SYSTAT (версія 10.0).

Результати роботи та їх обговорення. Гостра лейкемія – гетерогенне за-хворювання з різним результатом лікування. Наявність певних законо-мір-ностей і відмінностей в перебізі патологічного процесу дозволяють припустити, що ГЛ можуть бути розділені на декілька біологічних підгруп за особливостями гене-тичних порушень. Тому основу дослідження склало вивчення порушень каріотипу, експресії химерних генів, що виникають при специфічних для ГЛ транслокаціях, дослідження клональних перебудов генів IgK та IgH, а також порушень мікроса-телітної ДНК у дітей з різними морфологічними формами ГЛ.

Клініко-гематологічна характеристика обстежених пацієнтів. Групи дітей з ГМЛ та ГЛЛ вірогідно (р<0,001) відрізнялися віковими піками. Серед хворих на ГМЛ переважали діти, старші за 10 років (середній вік 12,34±0,85 років, медіана 14 років), тоді як в групі дітей з ГЛЛ вік більшості пацієнтів був до 10 років (середній вік 8,63±0,55 років, медіана 8 років). До групи обстеження входили 64 особи чоловічої статі і 46 дівчаток. Розподіл за статтю був однаковим обох групах нагляду.

Аналіз ініціальних клініко-лабораторних показників показав, що в групі хворих на ГЛЛ вірогідно частіше (р<0,05) відмічалася органомегалія, збіль-шення лімфовузлів та скарги на осалгії. У цих дітей вірогідно частіше (р<0,05) виявлялися бластні клітини в периферичній крові, та відносна кількість бластних клітин у аспіраті кісткового мозку.

Серед хворих на ГМЛ двоє дітей були резистентні до терапії, що було віро-гідно частіше (р<0,05), ніж в групі дітей з ГЛЛ. Хворі на ГМЛ характе-ризувалися вірогідно меншим (p<0,05) загальним п’ятирічним виживанням.

Відмінності в ініціальних клінічних проявах та тривалості життя хворих на ГМЛ та ГЛЛ дали підставу окремо розглядати генетичні порушення в кожній групі обстежених. Були окреслені основні клініко-лабораторні пара-мет-ри і сформовані групи пацієнтів з ГЛ за віком, спільними ініціальними клініко-лабораторними показ-никами та особливостями перебігу захворювання для спів-ставлення з молекулярно-генетичними порушеннями, які можуть їх обумов-лювати.

Характеристика цитогенетичних порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії, та їх прогностичне значення. Клональні хромосомні порушення мали місце у 7 з 19 хворих на ГМЛ та 5 з 26 хворих на ГЛЛ. Ці показники дещо нижчі в порівнянні з літературними даними (Rooney D.E., Czepulkowski B.H., 1992; Xue Y. еt al., 2001; Jarosova M., 2003). Однією з можливих причин такого розмаїття у виявленні хромосомних аномалій при аналізі диференційно забарвлених хромосом може бути різне співвідношення підваріантів гострих лейкемій в обстежених групах.

Не було виявлено вірогідних відмінностей у розповсюдженості порушень каріо-типу в группах хворих на ГМЛ та ГЛЛ та специфічних асоціацій з морфо-цитохімічними підваріантами ГМЛ. У групі пацієнтів з ГЛЛ цитоге-не-тичні пору-шення виявлялися тільки у хворих на В-клітинну лейкемію.

Найчастіше до клональних перебудов залучалася 16-та хромосома (у 6 ви-падках з 25 подій). При цьому в більшості випадків (5 з 7) такі порушення були специфічні для хворих на ГМЛ (р=0,07). Треба відзначити, що тільки у одного з цих пацієнтів була зареєстрована інверсія 16-ої хромосоми, яка вва-жається специфічною для ГМЛ М4Ео (Lo-Coco F. et al., 2003). У решти хворих спостерігалися делеції довгого плеча 16-ої хромосоми на різних рівнях і транслокація t(16;21)(p11.2;q22). Делеція довгого плеча 16-ї хромосоми в сегменті q13 мала місце виключно у хворих на ГМЛ (р<0,05).

В окремих повідомленнях про хворих на ГМЛ з del(16q) автори вказують наявність інших криптичних перебудов із залученням 16-ї хромосоми, які, можливо, й визначали особливості перебігу захворювання ( K. еt al., 1996; P. еt al., 1999). У наших дослідженнях використання молекулярно-генетичних методів підтвердило, що вказана делеція не була результатом криптичної транслокації t(16;16) або інверсії inv(16). Всі хворі на ГМЛ з del(16)(13q) досягли повної ремісії до 33-го дня індукційної терапії і не мали дуже ранніх рецидивів.

Була виділена група хворих із складними порушеннями каріотипу, коли мали місце декілька структурних і/або чисельних хромосомних порушень у одного і того ж пацієнта (2 з 7 хворих на ГМЛ і 2 з 5 хворих на ГЛЛ). З них у жодного хворого на ГМЛ не було зареєстровано повної ремісії на 33-й день лікування. Навпаки, обидва хворі на ГЛЛ досягли ремісії в стандартні терміни, але мали дуже ранні рецидиви. Хворі на ГМЛ із складними порушеннями каріотипу відрізнялися вірогідно меншою тривалістю життя (р<0,05). Серед них у одного хворого спостерігалися клітини зі спорідненими клонами, що свідчить про прогресію захворювання.

В одному випадку М4Ео ГМЛ мала місце інверсія inv(16), специфічна для даного варіанту ГМЛ, яка супроводжувалася появою додаткової 22-ої хромо-соми, що на нашу думку сприяло розвитку раннього рецидиву у цієї пацієнтки. Наявність inv(16) дозволяє віднести хворого до групи низького ризику, тоді як поява додат-кової хромосомної аберації погіршує прогноз перебігу захворю-вання. Цей висновок повністю узгоджується з думкою Douet-Guilbert N. з співавт. (2003). На наш погляд, не дивлячись на присутність специфічних про-гностично сприятливих цитогене-тич-них порушень, складні зміни каріотипу у вигляді додаткових клонових хромосом-них аномалій є несприятливою прогностичною ознакою і погіршують перебіг захворювання.

Дуже злоякісний перебіг захворювання спостерігався у дитини з М5а ГМЛ, яка мала в каріотипі 3 споріднених клона. У всіх клітинах була присутня рідкісна транслокація t(16;21)(p11.2;q22). Подібно до даних Kong X.T. з співавт. (1997), об-стежена нами дитина без виходу в ремісію померла через 8 місяців від встановлення діагнозу. Проте, первинна резистентність до хіміотерапії і такий бурхливий розви-ток захворювання, можливо, були обумовлені не тільки трансло-кацією t(16;21), яка є несприятливою прогностичною ознакою (Kong X.T. et al., 1997), але і персистенцією додаткових клонів у вигляді делеції del(6q) (16клітин), а також рідкої транс-локації дуплікованого фрагмента довгого плеча 1-ої хромосоми на довге плече 13-ої хромосоми. І хоча був зареєстрований тільки один випадок резистентності до терапії, вірогідність асоціації такого перебігу захворювання із наявністю складного каріотипу та ознак прогресії пухлини мала статистично значущий рівень (р<0,05).

Поява додаткових хромосомних аномалій характерна для прогресії захво-рювання ( E.V. еt al., 2002). Складні порушення каріотипу з однаковою частотою описані у всіх групах ризику, що обумовлює корисність цього маркера в ідентифікації пацієнтів з несприятливим прогнозом перебігу захворювання ( H. et al., 2002; Jarosova M. et al., 2003; . et al., 2003). Як один із запропонованих механізмів розвитку складних генетич-них порушень висловлена гіпотеза про вирішальне значення для еволюції пух-лини не появи нових спе-ци-фічних порушень, а зміни дози генів, що виявляється у вигляді моносомій, трисомій, делецій і призводить до генетич-ного дисбалансу (. et al., 1994). Наші спостереження також показали, що це припу-щення може бути цілком справедливим.

Різний початок і перебіг захворювання мали хворі на ГЛЛ із складними каріотипами, до складу яких входили порушення в довгому плечі 11-ої хромосоми (11q23), де розташований MLL-ген. У хворого з каріотипом 46,XY,del(11)(q23)[6]/ 46,XY,del(11)(q23),i(10)[1]/46,XY,i(10)[1]/46,XY[12] під час встановлення діагнозу клінічно виявлялася тільки спленомегалія та осалгії, в показниках крові – тромбо-цитопенія і низький рівень гемоглобіну. Незалежно від наявності порушень в 11q23 та додаткових хромосомних аберацій, клініко-гематологічна ремісія трива-ється у нього 33 місяці. Цей випадок збігається з даними інших дослідників про те, що хворі з делецією 11q23 відповідають на терапію краще, ніж пацієнти з будь-якою іншою перебудовою в сегменті 11q23 (Raimondi S.C. et al., 1995; Pui C. et al., 2002). Цей факт може бути пов’язаний із тим, що при незбалансованих транслокаціях і делеції 11q23 ген MLL рідко залучається до перебудови, що і обумовлює відносно сприятливий пребіг захворювання у хворих цієї групи (Raimondi S.C. et al., 1995).

Маніфестація і перебіг хвороби різко відрізнялися в іншої хворої з транс-ло-кацією t(4;11), яка була частиною складного каріотипу 49,XX,t(4;11)(q21;q23),+X,+2mar. Клініко-лабораторні показники (високий ініціальний лейкоцитоз, гепатосплено-мега-лія, залучення центральної нервової системи) повністю відповідали описаним в літературі у хворих з t(4;11) (Сергеев А.Г. и др., 2000; Cazzaniga G. et al., 2002). Через 2 місяці лікування за протоколом високого ризику у неї розвинувся рецидив, резистентний до тера-пії. Очевидно, що наявність складного каріотипу у поєднанні з транслокацією t(4;11), яка сама по собі є несприятливою ознакою, повинна розгля-датися як чинник вибору протоколу лікування для групи високого ризику, можливо, з подальшою трансплантацією стовбурових кровотворних клітин периферичної крові (ТСККПК) в першій ремісії.

Таким чином, ряд виявлених хромосомних порушень має прогностичне зна-чення і є чинником віднесення хворого до тієї або іншої групи ризику. Відсутність асоціативних зв’язків між порушеннями каріотипу та ініціальними клініко-лабораторними показниками у хворих на ГЛ свідчить про те, що виділені клональні порушення є незалежними прогностичними чинниками щодо перебігу захво-рю-вання. Отримані результати підкреслюють необхідність комбінування цитоге-не-тичних і молекулярно-генетичних досліджень для більш повного виявлення гене-тичних порушень, особливо при бідній морфології хромосом, низькому виході, або повній відсутності метафаз. Збереження ранньої смертності, а також дуже ранніх рецидивів в групі хворих без порушень каріотипу спонукає до пошуку додаткових генетичних порушень, які, з одного боку, є маркерами клональності, а з іншого – визначають біологічні механізми канцерогенезу.

Експресія химерних генів у дітей, хворих на гострі лейкемії, та їх прогностичне значення. Експресія химерних генів мала місце у 27 з 93 обстежених дітей. Вірогідно частіше (р<0,01) вона виявлялася у дітей з ГМЛ (у 15 з 32), ніж дітей з ГЛЛ (12 з 61).

Найбільш поширеним серед хворих на ГМЛ (у 8 з 32 обстежених дітей та у 6 з 19 дорослих) виявився транскрипт AML1/EТО, що утворюється внаслідок транс-локації t(8;21). Він не був специфічним для М2-варіанту, який реєстру-вався тільки у половини ПЛР-позитивних хворих на ГМЛ. Враховуючи, що хворі на ГМЛ, у яких мала місце така перебудова, відрізнялись кращою відпо-віддю на терапію (5 повних ремісій серед 8 обстежених дітей) та меншим від-сотком дуже ранніх рецидивів (2 рецидива з 8 обстежених дітей), ми вважаємо доцільним розглядати транслокацію t(8;21) з химерним геном AML1/EТО як ознаку сприятливого прогнозу щодо пере-бігу захворювання.

Транскрипт CBFB/MYH11 був специфічним (р<0,05) для М4Ео-варіанту ГМЛ. Ми не виявили вірогідних відмінностей у перебізі захворювання у дітей з цією перебудовою порівняно із хворими, у яких не реєструвалися химерні транс-крипти.

Специфічною виключно для хворих на ГЛЛ в нашому дослідженні була експресія химерних генів E2A/PBX і TEL/AML1. Експресія химерного гена E2A/PBX1 була виявлена у 2 з 61 дитини з ГЛЛ. За результатами клініко-гема-тологічного об-сте-ження при встановленні діагнозу у таких хворих були відсутні скарги на осалгії та мав місце ініціальний лейкоцитоз більше за 20 Г/л, який є чинником не-сприят-ливого перебігу захворювання. Особливостей відпо-віді на терапію у дітей з експресією химерного гена E2A/PBX1 виявлено не було.

Експресія гена TEL/AML1, що утворюється в результаті криптичної транс-локації t(12;21), виявлялася у двох дітей. Наші результати щодо сприятливого перебігу захво-рювання у цих хворих (обидва пацієнта досягли повної ремісії і не мали ранніх ре-цидивів) не досягли рівня статистичної значущості. Але до-слідження, проведені на великих групах обстежених (Jamil A. et al., 2000), ви-являють кореляцію між експресією химерного гена TEL/AML1 і тривалим за-галь-ним і безподійним виживанням, що свід-чить про позитивний результат лікування хворих з t(12;21) і дає можливість роз-глядати це порушення як прогностично сприятливу ознаку.

Експресія химерного гена BCR/ABL мала місце у 3-х хворих на ГЛЛ і у одного хворого на ГМЛ. При цьому хворі відрізнялися різними варіантами химерного продукту. Для хворих на ГЛЛ характерним вважається переважання транскрипту BCR/ABL р190 (Cazzaniga G. et al., 2002). В нашому дослідженні в групі дітей з ГЛЛ виявлена як експресія химерного гена BCR/ABL р190, так і BCR/ABL р210. При ГМЛ мав місце лише транскрипт BCR/ABL р210. У всіх обстежених нами BCR/ABL-по-зитивних хворих цитогенетично не виявлялася t(9;22) і інші клональні порушення каріотипу. Схожі результати наведені в роботі (Wells S.J. et al., 1996). Причиною може бути наявність інших, не завжди помітних перебудов, що приводять до формування химерного гена BCR/ABL без Ph хромосоми. Аналіз показників перебігу захворювання не виявив яких-небудь відмінностей у групі хворих з експресією гена BCR/ABL.

Перебудови, що задійснюють ген MLL, зокрема MLL/AF4, також були присутні як у пацієнтів з ГМЛ (у одного з 32 дітей), так і з ГЛЛ (у 2 з 61 дитини). Проведення цитогенетичного дослідження у цих хворих виявило транслокацію t(4;11) тільки в однієї дитини з дуже злоякісним перебігом за-хворювання. В наших дослідженнях не вдалося показати особливості пере-бігу захворювання, обумовлені цією перебудовою. Можливо, це пов’язано з тим, що за віком всі хворі (за винятком вищезазначеного випадку) не виходили за межі вікової групи від одного до 10 років, яка відрізняється кращими показниками виживання серед хворих з t(4;11) (Forestier. et al., 2000). У всіх випадках транскрипти MLL/AF4 розрізнялись місцями розриву задіяних генів. Можливо, кожний з них має своє прогностичне значення і є специфічним для того чи іншого варіанту гострої лейкемії. Дослідження не показало розбіжностей у розповсюдженості експресії химерного гена MLL/AF4 серед дітей (від 1 до 18 років) та дорослих віком від 19 до 32 років, хворих на ГМЛ. В той же час транскрипт MLL/AF9 виявлявся тільки в обстеженій групі дорослих, хворих на ГМЛ.

Дослідження мінімальної резидуальної хвороби (МРХ) показало, що чинни-ком прогнозу перебігу захворювання є також динаміка пухлинного клону після проведення терапії. Серед 16 обстежених дітей в клініко-гематологічній ремісії МРХ визначалася у 10 осіб (зберігалася ПЛР-позитивність). Серед хворих на ГЛЛ кількість ПЛР-негативних дітей в клініко-гематологічній ремісії була вірогідно більша (р<0,05) порівняно з групою хворих на ГМЛ. Аналіз асоційованості МРХ з типом химерного гена показав, що елімінація пухлинного клону вірогідно частіше (р<0,05) мала місце у пацієнтів, у яких в гострому періоді захворювання було виявлено експресію TEL/AML1 та BCR/ABL химерних генів. Не встановлено жод-ного випадку реверсії до ПЛР-негативності у пацієнтів з AML1/ETO, CBFB/MYH11 та MLL/ AF4 химерними генами.

Порівнюючи відповідь на терапію у ПЛР-позитивних та ПЛР-негативних хворих на стадії клініко-гематологічної ремісії, було виявлено, що кількість повних ремісій на 33-й день у хворих без ознак персистенції пухлинного клону (ПЛР-негативні хворі) вірогідно більше (р<0,05).

Згідно отриманим даним відсутність МРХ асоціюється з хорошою від-повіддю на терапію (серед 6-ти ПЛР-негативних хворих тільки у одного було зареєстровано ранній рецидив і ще у одного – пізній). В той час, коли зберіганя експресії химерних генів як маркерів пухлинних клонів може супро-воджу-ватися як тривалою ремісією, так і раннім рецидивом (з 10-ти ПЛР-позитивних дітей у 6-ти розвинувся ранній рецидив). Тобто, ПЛР-позитивність у клініко-гематологічній ремісії не є прогно-стич-ним тестом.

Факт існування МРХ після відміни цитостатичного лікування свідчить, з одного боку, про недостатній протипухлинний ефект хіміотерапії і селекції стійких до певної цитостатичної дії субклонів пухлинних клітин, проліферація яких у будь-який момент може привести до рецидиву захворювання (Ford A.M. et al., 2001). З іншого боку, можливо, в період ремісії відновлюється імуноло-гічний контроль за резидуальними пухлинними клітинами (Foa R. et al., 1996). Три-вала персистенція таких маркерів пухлинних клонів, як AML1/ETO, CBFB/MYH11, підтверджує припущення Greaves M. (1997), що окремі транс-локації є тільки першими з кроків, необхідних для розвитку лейкемії, тому для реактивації захворювання необхідні додаткові генетичні порушення. Це поло-ження продовжує багатокрокову гіпотезу канцерогенезу і дозволяє розглядати наявність пухлинних маркерів під час стійкої ремісії як повернення в пре-лейкемічний стан.

Таким чином, аналіз отриманих результатів свідчить про те, що для ГМЛ специфічними є химерні гени MLL/AF9, AML1/ETO, CBFB/MYH11, а для ГЛЛ – BCR/ABL p190, TEL/AML1 і E2A/PBX1. Транскрипти BCR/ABL p210 і MLL/AF4 зустрічаються як при мієлоїдній, так і при лімфоїдній лейкеміях.

Прогностичним чинником є не наявність чи відсутність аберантних мета-фаз або експресії химерних генів, а саме характер генетичних аномалій, таких як складний каріотип, наявність споріднених клонів, експресія AML1/ETO, TEL/AML1 та MLL/AF4.

Оцінка мінімальної резидуальної хвороби на основі скринінгу химерних транскриптів дозволяє виділити пацієнтів з вищим ризиком розвитку раннього рецидиву. При дослідженні МРХ прогностично сприятливим фактором є відсутність маркерів пухлинних клонів на стадії ремісії.

Клональні перебудови генів IgH та IgK у дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію, та їх прогностичне значення. В гострому періоді ГЛЛ клональні перебудови в генах імуноглобулінів виявлялися в 22 з 40 хворих дітей. У 11 з них (50 % від усіх хворих, у яких виявлені клональні перебудови в генах імуноглобулінів) були присутні два маркери – клональні порушення як в гені IgH, так і в гені IgK.

Отримані дані показали доцільність використання мінімум двох прай-мерів (до ділянок FR2 і FR3) при дослідженні клональних реаранжировок гена IgH. Такий підхід дозволив нам, використовуючи пари праймерів FR2/JHс і FR3/JHс, збільшити виявлення клональності до 48(19/40) в порівнянні з максимальним відсотком клональності, рівним 40при використанні тільки пари праймерів FR3/JHс. Схожа ситуація спостерігалася також при дослідженні генів легких ланцюгів імуногло-бу-лінів, коли при послідовному використанні п'яти пар прай-мерів (VkI/Kde, VkII/Kde, VkIII/Kde, VkIV/Kde і іntron/Kde), моно-клональний ПЛР-продукт був виявлений у 3_х, 6-ти, 2-х, 3-х і 3-х дітей відповідно, а суммарний ефект від одночасного вико-ристання всієї панелі праймерів склав 35 % (14/40) дітей з ГЛЛ.

У групі хворих з В-клітинною ГЛЛ клональні перебудови генів Ig частіше зустрічалися при pro-B-імунофенотиповому варіанті ГЛЛ (у 6 з 8 обстежених дітей). Виявлено, що перебудови генів Ig вірогідно частіше (р<0,05) мали місце в групі пацієнтів, у яких кількість лейкоцитів в периферичній крові на момент встановлення діагнозу не перевищувала 20 Г/л, а кількість тромбоцитів була менше за 180 Г/л.

Клональні перебудови генів Ig на різних стадіях терапії досліджували у 13 дітей. У хворих, у яких зберігалися обидва маркери клональності була зареєстрована гірша відповідь на терапію – у всіх розвинувся ранній рецидив (р<0,05). Краща відповідь на терапію була у хворих, у яких зареєстрована елімінація пухлинного клону на підставі зникнення обох маркерів клональності (перебудов як в генах IgK, так і в генах IgH). Проте, відсутність МРХ на момент завершення лікування ГЛЛ у дітей повністю не виключала вірогідність розвитку рецидиву.

У всіх обстежених ПЛР-позитивних хворих розвинувся ранній рецидив, хоча за даними Hoeltzer D. (2000) при наявності ознак МРХ ризик розвитку рецидиву складає 61 %. У групі ПЛР-негативних дітей з 8-ми пацієнтів у 4-х також було зареє-стровано зрив ремісії. У трьох з них в гострому періоді захворювання як пухлинний маркер були присутні клональні порушення тільки генів IgH. При моніторингу МРХ елімінація перебудов гена IgH може бути обумовлена його природньою гіперва-ріабельністю та наявністю вторинних рекомбінацій, що може бути, на думку деяких авторів, наслідком проти-пух-линної терапії (Sсzepanski T. et al., 2000). При цьому пухлинний клон зберігається, і такі хворі рецидивують. Тому більш інформа-тивним ми вважаємо аналіз двох генів імуноглобулінів (IgH та IgK).

Таким чином, клональні перебудови генів імуноглобулінів є специ-фіч-ними для лімфоїдної злоякісної проліферації і можуть бути використані як молекулярний маркер пухлинного клону у хворих на ГЛЛ при дослідженні МРХ. Це дозволить виділити пацієнтів з вищим ризиком розвитку раннього рецидиву.

Порушення мікросателітної ДНК у дітей, хворих на гострі лейкемії. Мікросателітні перебудови були виявлені у 6 з 21 дитини з ГЛЛ. У пацієнтів з ГМЛ, а також у здорових дітей подібні генетичні зміни не виявлялися. Мікро-сателітна нестабільність (МСН) не була типова для лейкемій і виявлялася тіль-ки в одного хворого в локусі D9S171. Втрата гетерозиготності (ВГ) з однаковою частотою (по 3 з 6 випадків в кожному локусі) зустрічалася як в локусі D9S171, так і в локусі D12S98, в той час, як в локусі D6S268 молекулярні порушення не ідентифікувалися. Maeck L. et al., (2000), досліджуючи групи хворих на ГМЛ та мієлодиспластичний синдром МДС, також описували більш часту ВГ ніж МСН.

ВГ в досліджуваних мікросателітних локусах була специфічна для лім-фоб-ластної лейкемії, що узгоджеється з даними інших авторів (Indraccolo S. et al., 1999). Втрата гетерозиготності досліджуваних мікросателітних ділянок відобра-жає мож-ливе місце локалізації генів-супресорів пухлини. У зв'язку з цим треба віддати належ-не припущенню, що інактивація або делеція генів-супресорів пухлини – основний патологічний шлях лейкемогенеза при дитячих ГЛЛ (Takeuchi S. et al., 1995; N.A. et al., 2000). Не було виявлено асоціативних зв’язків ВГ