НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

ДМИТРУК

Костянтин Васильович

УДК 579.222 + 577.214:577.164.1

ІДЕНТИФІКАЦІЯ СТРУКТУРНИХ ТА

РЕГУЛЯТОРНИХ ГЕНІВ БІОСИНТЕЗУ

РИБОФЛАВІНУ У ФЛАВІНОГЕННИХ

ДРІЖДЖІВ CANDIDA FAMATA

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів - 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України.

Науковий керівник: | доктор біологічних наук,

член-кореспондент НАН України, професор

Сибірний Андрій Андрійович,

Інститут біології клітини НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології.

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Лущак Володимир Іванович,

Прикарпатський національний університет ім. Василя Стефаника, завідувач кафедри біохімії;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Бабяк Любов Ярославівна,

Інститут біології клітини НАН України,

відділ регуляторних систем клітини.

Провідна установа: | Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 26 вересня 2006 р. о 14.00. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розіслано 11 серпня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В.М. Убийвовк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день досягнуто значних успіхів у вивченні шляху біосинтезу рибофлавіну (РФ) та його регуляції у флавіногенних дріжджів. Для подальшого дослідження молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу у цих мікроорганізмів і конструювання надпродуцентів РФ важливе значення має застосування методів роботи з рекомбінантною ДНК. Такі методи широко розроблені для пекарських та окремих видів неконвенційних дріжджів. Одним із зручних об'єктів для вивчення шляху біосинтезу РФ та конструювання надсинтетиків вітаміну В2 є флавіногенні дріжджі Candida famata. Цей вид дріжджів характеризується високим флавіногенним потенціалом – мутантні штами C. famata, отримані методами традиційної селекції, використовуються у світовому виробництві як промислові продуценти вітаміну В2 (зокрема, в США виробництво РФ налагоджено на базі штаму-суперпродуцента C. famata dep8). Розробка та застосування молекулярно-генетичних підходів може в майбутньому забезпечити створення нових штамів C. famata – надпродуцентів РФ.

Для вивчення молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу у дріжджів C. famata і конструювання надпродуцентів РФ важливе значення має ідентифікація структурних і регуляторних генів даного процесу та їх дослідження.

До початку даної експериментальної роботи не було ідентифіковано жодного гену, що бере участь в біосинтезі РФ та регуляції цього процесу у флавіногенних дріжджів C. famata.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАНУ за темами: ”Клонування структурних і регуляторних генів флавіногенезу та конструювання штамів-надсинтетиків рибофлавіну у еукаріотичних мікроорганізмів“ (№ держреєстрації 080401/00 2К-95), “Біохімічні та генетичні аспекти регуляції деградації і біогенезу пероксисом та біосинтезу флавінів у неконвенційних дріжджів“ (№ держреєстрації 0198V003026). Автор дисертаційної роботи є одним із виконавців вищеназваних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи була ідентифікація структурних та регуляторних генів біосинтезу РФ у флавіногенних дріжджів C. famata. Відповідно до мети, поставлені такі завдання:

1. Отримати та біохімічно охарактеризувати реципієнтні штами для клонування структурних генів, задіяних у біосинтезі РФ C. famata.

2. Клонувати гени RIB1, RIB2, RIB3, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної гомологічної/гетерологічної комплементації.

3. Проаналізувати ідентифіковані гени на здатність до гетерологічної комплементації відповідних мутацій у іншого виду флавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii.

4. Ідентифікувати регуляторні гени позитивного типу дії, що контролюють біосинтез РФ у C. famata методом функціональної гомологічної комплементації.

5. Оптимізувати метод інсерційного мутагенезу для ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії, що контролюють флавіногенез у дріжджів C. famata.

6. За допомогою інсерційного мутагенезу отримати мутанти C. famata з пошкодженою регуляцією біосинтезу РФ та ідентифікувати гени задіяні у регуляцію біосинтезу РФ.

Об’єкт дослідження даної роботи - біосинтез РФ та його регуляція у флавіногенних дріжджів C. famata. Предмет дослідження цієї роботи - структурні та регуляторні гени біосинтезу РФ дріжджів C. famata.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше отримано та охарактеризовано колекцію мутантів C. famata ауксотрофних за РФ; ідентифіковано структурні гени біосинтезу РФ RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної гомологічної/гетерологічної комплементації; за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ізольовано та ідентифіковано ген RIB3 Debaryomyces hansenii (спорогенна форма C. famata); оптимізовано систему інсерційного мутагенезу для C. famata; розроблено систему селекції для ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії, що контролюють флавіногенез у дріжджів C. famata; ідентифіковано та клоновано три гени СKА2, MET2, SEF1, залучені у регуляцію позитивного типу дії біосинтезу РФ у C. famata.

Практичне значення одержаних результатів. Ідентифіковані в результаті даної роботи структурні (RIB1, RIB2, RIB3, RIB5, RIB6 та RIB7) та регуляторні (СKА2, MET2, SEF1) гени формують ґрунтовну основу для вивчення різноманітних аспектів регуляції біосинтезу РФ у флавіногенних дріжджів на молекулярно-генетичному рівні. Ідентифіковані гени відкривають шлях до конструювання ефективних надпродуцентів вітаміну В2 із застосуванням методів методи генної інженерії.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму проведення досліджень, відібрано методи вирішення поставлених завдань. Практично вся експериментальна частина дисертаційної роботи була виконана здобувачем особисто, за винятком деяких експериментів, що проводилися спільно з співробітниками відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України (м. Львів, Україна). Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено з науковим керівником. Підготовку публікацій у профільних наукових журналах та збірниках тез конференцій за результатами дисертаційної роботи здобувач здійснював разом із співавторами.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені у вигляді тез стендових та усних доповідей на наступних наукових конференціях: 9-му міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів (м. Генджоу, Корея, 2002 рік), 1-ому FEMS-конгресі європейських мікробіологів (м. Любляна, Словенія, 2003 рік), XXI міжнародній конференції з генетики та молекулярної біології дріжджів (м. Гетеборг, Швеція, 2003 рік), Сімнадцятій науковій сесії наукового товариства ім. Шевченка (м. Львів, Україна, 2006 рік), конференції-конкурсі молодих учених (м. Київ, Україна, 2006 рік).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 експериментальні статті у провідних фахових виданнях, 1 патент США та тези 5 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, розділу, у якому викладено отримані результати та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 116 сторінках машинописного тексту. Вона містить 27 рисунків та 5 таблиць. Список використаної літератури охоплює 108 джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. У роботі використовували штами дріжджів: Pichia guilliermondii (hisXrib1, hisXrib2, hisXrib3, hisXrib5, hisXrib6, hisXrib7) (Шавловский Г.М. и др. 1979); штами дикого типу Debaryomyces hansenii CBS 767 та Candida famata VKM Y-9; РФ-залежні штами C. famata (leu2 rib1, leu2 rib2, leu2 rib3, leu2 rib5, leu2 rib6, leu2 rib7), штам leu2 rf(-Fe), що втратив здатність до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі, отримані шляхом ультрафіолетового-мутагенезу (УФ-мутагенезу) та штами rib1::LEU2, met2::LEU2, sef1::LEU2, отримані за допомогою інсерційного мутагенезу.

Дріжджі вирощували при 28oС на багатому середовищі (YPD, 1% дріжджовий екстракт, 1,5% пептон, 2% глюкоза), на стандартному мінімальному середовищі (YNB, 0,67% Yeast Nitrogen Base, 0,5% сульфат амонію, 1% глюкоза) або мінеральному середовищі Беркгольдера. Використовували середовища з оптимальним для росту (0,2 мг/л “+Fe”) і низьким (0,01 мг/л “-Fe”) вмістом іонів заліза. Середовище попередньо очищали від іонів металів за допомогою 8-гідроксихіноліну або при додаванні ферозину в агаризоване середовище. Амінокислоти додавались до середовища в концентрації 40-50 мг/л, РФ - 200 мг/л. Агаризовані середовища містили 2% агару.

Методи культивування бактерій E. сoli та молекулярно-генетичні методи описані в Sambrook et al., 1989. Електротрансформація, трансформація сферопластів, виділення сумарної ДНК з клітин дріжджів P. guilliermondii та C. famata описані в Voronovsky A. et al., 2002.

Концентрацію РФ в зразках визначали за допомогою флюориметра Turner Quantech Digital Filter Fluorometer FM109510-33. Статистичний аналіз експериментальних даних проводили як описано в Деркач М.П. и др. 1977. Мітотичну стабільність дріжджових трансформантів визначали методом описаним раніше у Cregg J.M. et al., 1985.

Результати досліджень та їх обговорення.

Ідентифікація структурних генів біосинтезу рибофлавіну C. famata.

Виділення та характеристика реципієнтних штамів для ідентифікації структурних генів, задіяних у біосинтезі рибофлавіну C. famata. З метою отримання реципієнтних штамів C. famata для ідентифікації структурних генів біосинтезу РФ як вихідний було використано ауксотрофний за лейцином штам L20105 (leu2) (Voronovsky A. et al., 2002). За допомогою УФ-мутагенезу було отримано колекцію ауксотрофних за РФ (leu2 rib-) мутантів.

Біохімічна характеристика РФ-залежних мутантів полягала в ідентифікації інтермедіатів біосинтезу РФ, як це було описано раніше для дріжджів P. guilliermondii (Шавловский Г.М. и др. 1979). Відібрані мутанти було поділено на п’ять біохімічних груп, в залежності від природи флуоресцентних компонентів, що акумулюються в культуральному середовищі після інкубації з діацетилом.

Мутанти першої біохімічної групи не акумулювали флуоресцентних продуктів у середовищі. У таких мутантів ймовірно пошкоджений ген rib1.

Мутанти другої, третьої та четвертої біохімічних груп акумулювали у середовищі 2,4,5-триамінопіримідин, 2,5-діаміно-6-гідрокси-4-рибітиламіно піримідин та 2,6-дигідрокси-5-аміно-4-рибітиламінопіримідин, які після конденсації з діацетилом перетворювалися в сполуки з блакитною, блакитно–зеленою та зеленою флуоресценцією, відповідно. У таких мутантів, ймовірно, пошкоджені гени rib2, rib3 та rib5 або rib6. Важливо зазначити, що мутанти четвертої біохімічної групи складаються з двох підгруп.

Мутанти п’ятої біохімічної групи акумулювали у середовищі 6,7-диметил-8-рибітиллюмазин (ДМРЛ), що виявляє зелену флуоресценцію як без так і з додаванням діацетилу. У таких мутантів, ймовірно, пошкоджений ген rib7.

Отримані та ідентифіковані мутанти були використані для подальших досліджень.

Клонування генів RIB1, RIB2, RIB6, RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної комплементації. Для клонування генів RIB1, RIB2, RIB6, RIB7 як реципієнтні штами були використані РФ-залежні мутанти C. famata першої, другої, третьої, четвертої та п’ятої біохімічних груп. Штами п’яти біохімічних груп трансформували банком генів C. famata. Відбір трансформантів проводили на синтетичному середовищі без РФ. З одержаних дріжджових колоній виділяли плазмідну ДНК. Плазмідну ДНК вдалося виділити з трансформантів штамів першої, другої, четвертої та п’ятої біохімічних груп. Плазміди, що несуть гени RIB1, RIB2, RIB6 та RIB7 отримали назви pCR1 (8,1 т.п.н.), pCR2 (11,3 т.п.н.), pRIV-2 (16,8 т.п.н.) та pCR7 (6,6 т.п.н.) (Рис. 1.). Після рестрикційного аналізу фрагменти геномної ДНК, що комплементують відповідні мутації було субклоновано до мінімально можливих розмірів у складі плазмід pCR1Xb (7,6 т.п.н.), pCR2-1 (6,9 т.п.н.), pF (8,0 т.п.н.) (Рис. 1.).

Клонування гену RIB5 з банку генів C. famata методом функціональної гетерологічної комплементації. Ідентифікувати гени C. famata, що комплементують мутації штамів третьої групи та першої підгрупи четвертої біохімічної групи, методом гомологічної комплементації не вдалося. Відповідні мутанти виявилися нестабільними та ревертували з високою частотою. Клонування проводили в гетерологічній системі близькоспорідненого виду флавіногенних дріжджів P. guilliermondii. Ауксотрофні штами P. guilliermondii були отримані та біохімічно охарактеризовані раніше (Шавловский Г.М. и др. 1979). Банк генів C. famata було сконструйовано на реплікативній для P. guilliermondii плазміді pPgARS19 (5,3 т.п.н.). Представництво банку генів складало 50% плазмід зі вставками, середня величина інсертів становила приблизно 3-5 т.п.н. Штами rib3 та rib5 P. guilliermondii тарансформували сконструйованим банком генів. Плазмідну ДНК вдалося виділити лише з трансформантів штаму rib5. Ізольована плазміда, що несе ген RIB5 отримала назву pRP5 (6,7 т.п.н.) (Рис. 1.)

Клонування гену RIB3 D. hansenii за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Спроби клонувати ген RIB3 C. famata за допомогою гетерологічної комплементації успіху не мали. Ймовірно, банк генів не містив фрагменту з повним геном RIB3 C. famata. Тому ген RIB3 було клонувано з дріжджів D. hansenii, що є спорогенною формою C. famata за допомогою ПЛР, оскільки геномна послідовність штаму D. hansenii є відомою (). Фрагмент, що містить ген RIB3 було ізольовано за допомогою ПЛР з використанням специфічних праймерів до 5’ (5’-AAA CTG CAG TCT ACT TCT GGC GGC GAA TC–3’) і 3’ (5’-AAA CTG CAG AGG AGG ACC ATA GAA ATA C–3’) фланкуючих ділянок локалізованої відкритої рамки трансляції (ВРТ) та хромосомної ДНК D. hansenii CBS 767 як матриці та клоновано у складі реплікативної для P. guilliermondii плазміди. Плазміда, що містить ген RIB3 отримала назву p19PR3 (7,82 т.п.н.).

Перевірка здатності ідентифікованих структурних генів біосинтезу рибофлавіну C. famata до гетерологічної комплементації відповідних мутацій у іншого виду флавіногенних дріжджів P. guilliermondii. Ізольовані та субклоновані фрагменти геномної ДНК C. famata або D. hansenii трансформували в ауксотрофні за РФ штами P. guilliermondii (hisXrib1, hisXrib2, hisXrib3, hisXrib5, hisXrib6, hisXrib7). Було показано, що клоновані фрагменти ефективно комплементують мутації структурних генів біосинтезу РФ P. guilliermondii. Проведено визначення послідовності нуклеотидів ізольованих фрагментів. Показано, що послідовності амінокислот, які кодуються нуклеотидними послідовностями у складі ізольованих фрагментів виявляють високий ступінь гомології та ідентичності до відповідних амінокислотних послідовностей (ГТФ-циклогідролази ІІ, 2,5-диаміно-4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5’-фосфатредуктази, 2,5-диаміно-4-окси-6-рибітиламінопі-римідин-5’-фосфатдезамінази, ДМРЛ-синтази, 3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфат-синтази (ДБФ-синтази) та РФ-синтази) інших видів неконвенційних дріжджів (Табл. 1.).

Рис. 1. Лінійні схеми плазмід. A: pCR1 (8,1 т.п.н.); Б: pCR1Xb (7,6 т.п.н.); В: pCR2 (11,3 т.п.н.); Г: pCR2-1 (6,9 т.п.н.); Д: pRIV-2 (16,8 т.п.н.); Е: pF (8,0 т.п.н.); Є: pCR7 (6,6 т.п.н.); Ж: pRP5 (6,7 т.п.н.).

Фрагмент ДНК S. сerevisiae, що несе ген LEU2, позначено товстою сірою лінією; CfARS-послідовність позначено товстим чорним відрізком; фрагменти ДНК C. famata, що несуть гени RIB1, RIB2, RIB6, RIB7, RIB5 позначено незабарвленими відрізками; PgARS – товстою посмугованою лінією; послідовність pUC19 - тонкою лінією. Скорочення сайтів рестрикції: H, HindIII; Sp, SphI; P, PstI; Sl, SalI; Hc, HincII; Xb, XbaI; B, BamHI; Sm, SmaI; K, KpnI; Sc, SacI; RI, EcoRI.

Таблиця 1.

Ідентичність (%) послідовності амінокислот RIB генів C. famata VKM Y-9 з іншими видами дріжджів.

Види дріжджів | Послідовність амінокислот

ГТФ-цикло

гідролаза II, (RIB1) |

Редуктаза,

(RIB2) |

Дезаміназа,

(RIB3) | ДМРЛ-синтаза,

(RIB5) | ДБФ-синтаза,

(RIB6) | РФ-синтаза,

(RIB7)

D. hansenii | 92 | 84 | 96 | 96 | 95

P. guilliermondii | 76 | 55 | 60* | 79 | 71

Candida albicans | 73 | 51 | 64* | 76 | 68

Hansenula polymorpha | 72 | 50 | 55* | 68 | 66 | 56

Saccharomyces cerevisiae | 66 | 46 | 60* | 68 | 55 | 60

Kluyveromyces lactis | 66 | 43 | 59* | 71 | 58 | 58

Candida glabrata | 65 | 44 | 59* | 73 | 57 | 58

Yarrowia lipolytica | 61 | 42 | 54* | 58 | 65 | 61

Schizosaccharomyces pombe | 58 | 28 | 49* | 54 | 58 | 55

*Порівняння послідовності амінокислот здійснювалось з дезаміназою D. hansenii CBS 767.

Отже, високий ступінь гомології послідовностей амінокислот, що кодуються клонованими генами C. famata або D. hansenii до відповідних послідовностей дріжджових структурних генів біосинтезу РФ, а також результати функціональної комплементації близькоспорідненого виду дріжджів P. guilliermondii переконливо свідчать, що клоновані фрагменти містять структурні гени біосинтезу РФ - RIB1, RIB2, RIB3, RIB5, RIB6, RIB7. Нумерація генів C. famata подана за аналогією до структурних генів біосинтезу РФ P. guilliermondii, а не S. cerevisiae. Клоновані структурні гени біосинтезу РФ C. famata придатні для конструювання нових покращених надсинтетиків вітаміну В2 цього виду дріжджів.

Ідентифікація регуляторних генів позитивного типу дії, задіяних у біосинтезі рибофлавіну C. famata.

Виділення та характеристика реципієнтних штамів для клонування регуляторних генів позитивного типу дії, задіяних у біосинтезі рибофлавіну C. famata. Експерименти для виділення штамів C. famata, що втратили здатність до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі було розпочато з отримання “leaky” (від англ. - протікати) мутантів із штаму другої біохімічної групи 33-1n (leu2 rib2). Такі мутанти є ауксотрофами за РФ на середовищі з оптимальним для росту вмістом іонів заліза, та проявляють прототрофність на середовищі з дефіцитом іонів заліза. Відомо, що іони кобальту (Со2+) стимулюють флавіногенез у флавіногенних дріжджів. Було визначено граничну концентрацію іонів кобальту (Со2+), що є нетоксичною для клітини C. famata та водночас стимулює надсинтез РФ. Така концентрація становить 15 мкг/мл. Після УФ-мутагенезу, клітини штаму 33-1n висівали на синтетичне агаризоване середовище без РФ з лейцином та іонами кобальту (15 мкг/мл). Було відібрано низку мутантів, що були ауксотрофами за РФ на середовищі з оптимальним для росту вмістом іонів заліза, та прототрофами за РФ на середовищі з дефіцитом іонів заліза або при додаванні іонів кобальту.

Виділення мутантів C. famata з пошкодженими генами позитивного типу дії було продовжено, опромінюючи отримані “leaky” мутанти УФ-променями. Оброблені мутагеном клітини інкубували на середовищі з дефіцитом іонів заліза на протязі 4, 22 та 31 годин. Далі клітини переносили на 54°С на 7 хв. та висівали на синтетичне середовище без РФ з лейцином та іонами кобальту (Со2+) (12,5 мкг/мл). За умов температурного шоку, клітини з порушеною дерепресією ферментів флавіногенезу, не ростуть і залишаються живими, тоді як вихідний штам з дерепресованими ферментами біосинтезу РФ росте і гине при підвищенні температури. Використовуючи такий підхід було виділено колекцію мутантів C. famata. Показано, що отримані мутанти C. famata нездатні до надпродукції вітаміну В2 та флуоресцентних інтермедіатів РФ при культивуванні у середовищі з дефіцитом іонів заліза.

Оскільки відомо, що промисловий продуцент РФ C. famata, штам dep8 виявляє закономірність: чим вища стійкість до фторацетату (інгібітор аконітази), тим вищий рівень флавіногенезу (неопубліковані дані), ми дослідили вплив фторацетату на ріст отриманих мутантів. Показано, що глюкоза репресує транспорт та метаболізм фторацетату, тому як джерело вуглецю використовували гліцерин. Ріст більшості мутантів інгібувався фторацетатом у концентраціях 0,2 – 1% на середовищі з гліцерином на відміну від штаму дикого типу VKM Y-9 або L20105 (leu2). Отримані мутанти були використані для клонування генів, залучених у регуляцію біосинтезу РФ.

Клонування гену СKА2 з банку генів C. famata методом функціональної комплементації. Для клонування гену позитивного типу дії C. famata, що регулює біосинтез РФ, було застосовано підхід функціональної комплементації відповідної мутації фрагментами геномної ДНК у складі банку генів цього виду дріжджів. Штам 4-126-31 (leu2) C. famata, що втратив здатність до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі, трансформували банком генів C. famata. Отримані Leu+-трансформанти за допомогою методу відбитків були перенесені на синтетичне середовище з гліцерином (1%) як джерелом вуглецю із додаванням фторацетату у концентрації 1%. Була відібрана одна колонія, що виявляла здатність до росту на селективному середовищі. З клітин трансформанта виділили плазмідну ДНК (отримала назву РР+). Одержану плазміду використали для електротрансформації штама 4-126-31. Leu+-трансформанти 4-126-31/РР+ перевіряли на здатність до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі та в середовищі з іонами кобальту (12,5 мкг/мл). Було показано, що 4-126-31/РР+ штами синтезують флавіни на вищезазначених середовищах у кількостях порівняльних до вихідного штаму C. famata VKM Y-9 (Рис. 2.). Отже, дана плазміда повертає мутанту 4-126-31 фенотип дикого типу.

Було проведено рестрикційний аналіз РР+, та показано, що вектор РР+ є похідним від pCf14 і містить фрагмент геномної ДНК величиною приблизно 2,2 т.п.н. (Рис. 3.).

Встановлено послідовність нуклеотидів фрагменту геномної ДНК, що комплементує нездатність мутанта C. famata 4-126-31 до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі. Виявлено присутність єдиної ВРТ довжиною 996 п.н., що кодує білок довжиною 332 а.з. Молекулярна маса цього білка становить 38,6 кДа та виявляє високу ступінь гомології до б’-субодиниці казеїнкінази 2 S. cerevisiae (ген CKA2).

Вивчення впливу СKА2 на біосинтез флавінів. Вивчення впливу СKА2 на біосинтез РФ було розпочато з конструювання плазміди, в якій ВРТ СKА2 була

поєднана із сильним конститутивним промотором TEF1 C. famata. Промотор TEF1 та ВРТ СKА2 отримали за допомогою ПЛР з використанням пари праймерів P7-2P 5’-AAA CTG CAG TAA CGA ACA GCT CAT CAG-3’ / P7-3S 5’-CAT GCA TGC CCC ATT TTG CTT AAT G-3’ та k35 5’-CAT GCA TGC ATG AGT GTA AAT ACA AGA G-3’ / k36 5’-CCC AAG CTT GGT TTT AGA ATT AAT TCG-3’, відповідно, та хромосомної ДНК C. famata VKM Y-9 як матриці. В результаті було сконструйовано плазміду рТСК (7,1 т.п.н.), яка забезпечує надекспресію гену CKA2 у дріжджів C. famata, див. рис. 3.

Плазміду рТСК трансформували у штам L20105 (leu2) C. famata. У відібраних Leu+-трансформантів визначали рівень флавіногенезу. Було показано, що надекспресія СKА2 призводила до підвищення продуктивності синтезу РФ в 6-7 разів на середовищі з оптимальним вмістом іонів заліза у порівнянні зі штамом дикого типу див. рис. 2. Алель СKА2 штаму 4-126-31 було клоновано та секвеновано. Виявилось, що послідовність нуклеотидів гена СKА2 мутантного штаму не виявила жодних відмінностей, порівняно зі штамом дикого типу. Отже, б’-субодиниця казеїнкінази 2 супресує мутантний фенотип нездатності до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі у штаму 4-126-31 та стимулює біосинтез РФ на середовищі з оптимальним для росту вмістом іонів заліза у штама дикого типу. Наведені вище експериментальні дані дозволяють стверджувати, що казеїнкіназа 2 опосередковано регулює біосинтез РФ.

Виділення та характеристика штамів C. famata, отриманих за допомогою методу інсерційного мутагенезу для клонування регуляторних генів позитивного типу дії біосинтезу рибофлавіну. Виділення штамів C. famata з пошкодженими регуляторними генами, що задіяні у біосинтезі РФ, було розпочато з оптимізації методу інсерційного мутагенезу для цих дріжджів. Для цього було сконструйовано інсерційну касету. Плазміду p19L2 обробляли рестриктазами PstI та HindIII, позбавлялись липких кінців та здійснювали самолігування. Аналогічну процедуру проводили використовуючи рестриктази XbaI та SacI. В результаті

Рис. 3. Лінійні схеми плазмід. A: РР+ (7,3 т.п.н.); Б: pТСК (7,1 т.п.н.).

Фрагмент ДНК S. сerevisiae, що несе ген LEU2, позначено товстою сірою лінією; CfARS-послідовність позначено товстим чорним відрізком; фрагмент ДНК, що несе ген СKА2 позначено незабарвленим відрізком. Промотор гену TEF1 C. famata – товстою посмугованою лінією; послідовність pUC19 - тонкою лінією. Скорочення сайтів рестрикції як на рисунку 1.

інсерційна касета містила ген LEU2 S. cerevisiae, бактерійну частину вектора pUC19 та унікальний сайт для рестриктази SalI і отримала назву pL2 (Рис. 4.). Відсутність додаткових сайтів рестрикції на касеті дозволяє використовувати відповідні рестриктази при вилучені геномних фрагментів, що оточують інсерційну касету. Важливо зазначити, що інсерційна касета не містить жодної послідовності, гомологічної ДНК C. famata, що запобігає гомологічній рекомбінації. Інсерційну касету трансформували у реципієнтний штам L20105 C. famata за допомогою електропорації. Було перевірено здатність ендонуклеази рестрикції підвищувати частоту трансформації при додаванні у трансформуючу суміш. Показано, що додавання SalI (1-10 од. акт.) підвищує частоту трансформації. Максимальне зростання частоти трансформації відбувалось лише в 1,5 рази при додаванні 5-6 од. акт. рестриктази. Додавання більше ніж 10 од. акт. SalI значно зменшувало частоту трансформації.

Відомо, що при інсерційному мутагенезі лінеаризована плазміда здатна до рециклізаціі за допомогою ДНК лігаз клітини господаря. Було перевірено стабільність 12 випадково відібраних Leu+-трансформантів. Успадкування ознаки Leu+-становило 100% в усіх проаналізованих штамах, що свідчить про стабільну інтеграцію інсерційної касети pL2 в геном C. famata.

Наступний крок полягав у перевірці здатності лінеаризованої pL2 до випадкової

Рис. 4. Інтеграція касети pL2 в геном C. famata. A. Схематична модель інтеграції SalI-лінеаризованої касети pL2 (4.9 т.п.н.) в геном C. famata. Фрагмент, що несе ген LEU2 S. cerevisiae, позначено товстою сірою лінією; бактерійна частина касети – тонкою лінією. Скорочення сайтів рестрикції як на рисунку 1. Б, B, та Г. Аналіз нуклеотидних послідовностей відібраних мутантів 101R, 4R та 1R, відповідно. У верхньому рядку зображена послідовність штаму дикого типу CBS 767 D. hansenii, у нижньому рядку - послідовності відібраних мутантів. Послідовність нуклеотидів касети зображена курсивом на сірому фоні. 5’ та 3’ кінцеві послідовності касети розділені за допомогою тире. Сайт EcoRI - підкреслений. ATG-старт кодон зображений білими літерами. Нуклеотиди, що ймовірно походять з послідовності нуклеотидів сайту SalI, виділено потовщеним шрифтом.

інсерції. Додатково визначали копійність інсерційних подій в геномну ДНК реципієнтного штаму. ДНК з 20 випадково відібраних Leu+-трансформантів, отриманих з додаванням чи без рестриктази SalI, було оброблено SalI та проаналізовано за допомогою Саузерн-гібридизації з використанням pL2 як зонду. Результати представлені на рисунку 5 вказують на те, що серед усіх проаналізованих трансформантів інсерції відбувалися випадково, про що свідчать різні розміри отриманих SalI-фрагментів. Окрім того, серед отриманих SalI-гібридизаційних сигналів не було жодного з розміром приблизно 4,9 т.п.н., що відповідав би розміру SalI-лінеаризованому вектору pL2 див. рис. 5. Це свідчить про те, що при інтеграції один або обидва SalI сайти зникають або інсерція в геномну ДНК відбувається поза сайтами SalI. В залежності від кількості гібридизаційних сигналів було визначено кількість копій касети pL2 у трансформантів. Встановлено, що поодинокі інсерції касети в геном C. famata зустрічаються у 95% трансформантів, дві копії pL2 спостерігались у 5% проаналізованих трансформантів, див. Рис. 5.

Оптимізований для C. famata метод інсерційного мутагенезу було використано для виділення штамів цього виду дріжджів з пошкодженими регуляторними генами, що залучені у біосинтез РФ. Реципієнтний штам C. famata L20105 (leu2) трансформували SalI-лінеаризованою плазмідою pL2 з додаванням або без рестриктази SalI. Близько 3000 Leu+ трансформантів, отриманих без додавання SalI, було перенесено методом реплік на стандартне мінімальне середовище з ферозином. Додавання ферозину у середовище створює умови дефіциту іонів заліза. Таким чином, були відібрані три мутанти 101R, 4R та 1R, що втратили здатність до надсинтезу РФ на середовищі з ферозином. Перевірено стабільність цих штамів. Мутанти виявились стабільними. Додатково, за допомогою ПЛР та праймерів, гомологічних до гену LEU2 S. cerevisiae, було показано присутність інсерційної касети в геномі відібраних штамів. Визначено продуктивність біосинтезу РФ у штамів 101R, 4R та 1R. Виявилось, що за умов дефіциту іонів заліза в середовищі, мутанти 101R, 4R та 1R нездатні до надсинтезу РФ. Отримані дані свідчать про те, що у відібраних штамів пошкоджена регуляція біосинтезу вітаміну В2.

Рис. 5. Аналіз за Саузерном 17 випадково відібраних трансформантів та мутантів 101R, 4R, 1R, отриманих після трансформації SalI-лінеаризованим вектором pL2 в присутності (лінії 1-10) або відсутності (лінії 11-20) рестриктази SalI у трансформаційній суміші. Хромосомна ДНК оброблялась SalI. Як зонд використовували SalI-лінеаризовану плазміду pL2. Величини фрагментів маркера молекулярної ваги представлені в т.п.н. WT - штам дикого типу.

Ідентифікація генів задіяних у регуляції позитивного типу дії біосинтезу рибофлавіну C. famata. Для ідентифікації сайтів інсерції касети pL2, було виділено хромосомну ДНК відібраних штамів, які втратили здатність до надсинтезу РФ при культивуванні в середовищі з дефіцитом іонів заліза. Вектор pL2 з фланкуючими послідовностями було отримано після трансформації E. coli продуктами самолігування геномної ДНК штамів 101R, 4R та 1R попередньо оброблених BamHI, HindIII та SacI, відповідно. Розщеплення геномної ДНК іншими ендонуклеазами рестрикції також призводило до появи трансформантів E. coli. Однак частоти трансформації в цих випадках були значно нижчі. У цих випадках, ймовірно, фланкуючі фрагменти геномної ДНК є занадто довгі для ефективного лігування та трансформації E. coli. Послідовності нуклеотидів, фланкуючих інсерційну касету фрагментів, у складі виділених плазмід були визначені за допомогою праймерів seqF 5’-CAC TCA ATG ACC TGA CCA TTT GAT G-3’ та seqR 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’. Щонайменше 300 нуклеотидів було проаналізовано та здійснено їх порівняння з послідовностями нуклеотидів, наявних в базі даних часткових геномних послідовностей ДНК аскоміцетних дріжджів “Genolevures”. Встановлено, що в ізольованих штамах 101R, 4R та 1R інсерційна касета розірвала гени RIB1 (ГТФ-циклогідролаза ІІ), ортологи генів MET2 S. cerevisiae (гомосерин-О-ацетилтрансфераза) та SEF1 (потенційний транскрипційний фактор), відповідно, див. рис. 4.Б-Г. Аналіз визначених послідовностей в усіх трьох випадках показав, що сайт SalI не відновлюється. Окрім того, при інтеграції інсерційної касети один або декілька нуклеотидів на виступаючих кінцях лінеаризованої плазміди pL2 зникають див. рис. 4.Б-Г.

При ідентифікації генів шляхом інсерційного мутагенезу необхідно довести, що потрібний фенотип обумовлений інтеграцією інсерційної касети в певний локус, а не іншою мутацією в геномі. Стандартний метод доведення локус-специфічної інсерції касети полягає в комплементації мутації відповідним геном.

Проведені нами експерименти показали, що C. famata є чутливою до флеоміцину. Концентрація антибіотика 2,0 мг/л повністю інгібує ріст C. famata. Відомо, що C. famata характеризується певними відмінностями генетичного коду, а саме, CUG кодує амінокислоту серин, тоді як у більшості організмів цей триплет кодує лейцин (“Genolevures” - hemiascomycete genome database: ). Тому в подальших експериментах використовувався ген ble Staphylococcus aureus, що забезпечує резистентність до флеоміцину та не містить жодного CUG кодону. Конструювання плазміди pTb, що містить ген ble під контролем промотора TEF1 C. famata здійснювалось за допомогою ПЛР. Промотор TEF1 та ВРТ ble отримали за допомогою праймерів Ко38 5’-TTT GGT ACC TAA CGA ACA GCT CAT CAG-3’ / Ко39 5’-ggt gag ctc TTT GCT TAA TGT ATA ATA ATA G-3’ та Ко36 5’-ttt gag ctc atg tta cag tct atc ccg gc-3’ / Ко37 5’-ggt GAA TTc aaa tct cca cct tta aac cc-3’, використовуючи як матрицю хромосомну ДНК C. famata VKM Y-9 та S. aureus MRSA252, відповідно. KpnI/SacI-фрагмент, що несе промотор гену TEF1 разом з SacI/EcoRI-фрагментом, що містить ВРТ ble клоновано у вектор pUC57, лінеаризований KpnI/EcoRI. В результаті сконструйовано плазміду pTb (4,0 т.п.н.) (Рис. 6.). EcoRI-лінеаризовану плазміду pTb трансформували в C. famata. Трансформанти, резистентні до флеоміцину, з’являлись із частотою 100 транс./мкг ДНК. Вектор pTb було використано як вихідну плазміду для подальших конструювань. Фрагменти ДНК, що містять гени CfRIB1, DhMET2 та DhSEF1 були отримані з геномної ДНК C. famata VKM Y-9 та D. hansenii CBS 767 за допомогою ПЛР з використанням праймерів К33 5’-GCA CTG CAG CTG CCT ATG CTT GAT GC-3’ / Ко35 5’-GCA CTG CAG GTC TCG TTT ACT CAT CC-3’, Ко32 5’- GAG CTG CAG AGA CAT ATG AAC AGG ATA ATC-3’ / Ко34 5’-GAG CTG CAG GTT ATA ATG CAA TTA CTG GAC-3’ та Ко29 5’- GAG CTG CAG TAA GCC TTG CTT ATT GTA TG-3’ / Ко31 5’-GAG CTG CAG ATT AGA CGG AAG CAA TAA TC-3’, відповідно. Отримані гени RIB1, MET2 та SEF1 та вектор pTb були оброблені рестриктазою PstI. В результаті лігування вектора із відповідними вставками були сконструйовані плазміди pTCfRIB1 (5,8 т.п.н.), pTDhMET2 (6,2 т.п.н.) та pTDhSEF1 (7,5 т.п.н.) (Рис. 6.Б-Г.). Лінеаризовані плазміди pTCfRIB1, pTDhMET2 та pTDhSEF1 було трансформовано у відповідні реципієнтні штами 101R, 4R та 1R, та відібрано колонії,

Рис. 6. Лінійні схеми плазмід. A: pTb (4,0 т.п.н.); Б: pTCfRIB1 (5,8 т.п.н.); В: pTDhMET2 (6,2 т.п.н.) та Г: pTDhSEF1 (7,5 т.п.н.).

Фрагмент ДНК C. famata, що несе промотор гену TEF1 позначено заштрихованою лінією. Фрагмент ДНК, що несе ген ble - товстою чорною стрілкою. Фрагменти ДНК, що несуть гени CfRIB1, DhMET2 та DhSEF1 позначені білою, сірою та картатою стрілками, відповідно. Послідовність pUC57 – тонкою лінією. Скорочення сайтів рестрикції як на рисунку 1.

резистентні до флеоміцину. За допомогою ПЛР та праймерів, гомологічних до гену ble S. aureus показано присутність інтегрованої плазміди в геномі цих штамів.

У резистентних до флеоміцину трансформантів визначали продуктивність флавіногенезу. Клоновані гени RIB1, MET2 та SEF1 успішно комплементували відповідні мутації, про що свідчило відновлення у трансформантів здатності до надсинтезу РФ при культивуванні в середовищі з дефіцитом іонів заліза (Рис. 7). Продуктивність флавіногенезу у трансформантів була дещо зниженою, порівняно зі штамом дикого типу. Таке зниження, особливо у трансформантів штамів 4R та 1R, можна пояснити незначними відмінностями у послідовностях нуклеотидів між C. famata та D. hansenii див. рис. 7. Результати функціональної комплементації штамів 101R, 4R та 1R C. famata плазмідами pTCfRIB1, pTDhMET2 та pTDhSEF1, переконливо свідчать, що фенотип відібраних мутантів є результатом розриву генів RIB1, MET2 та SEF1, відповідно.

Рис. 7. Продуктивність флавіногенезу у штамів 101R, 4R, 1R, їх трансформантів відповідними генами CfRIB1, DhMET2, DhSEF1, штаму 4R із додаванням метіоніну (4R/met) та штаму дикого типу 3L2, вирощених на середовищі з оптимальним для росту (“+Fe”) та низьким (“-Fe”) вмістом іонів заліза.

Розрив гену RIB1 не призводив штам 101R до РФ-ауксотрофності. Ймовірно інсерційна касета при інтеграції створила химерну ВРТ RIB1. Очевидно, це дозволяє ГТФ-циклогідролазі ІІ транскрибуватися на базальному рівні, що забезпечує ріст на мінімальному середовищі без РФ.

За допомогою методу інсерційного мутагенезу, нам вперше вдалося ідентифікувати гени позитивного типу дії, що беруть участь у регуляції біосинтезу РФ. Ними виявилися ортологи генів MET2 (кодує гомосерин-О-ацетилтрансферазу), а також SEF1 (ген транскрипційного фактора з невідомою функцією).

ВИСНОВКИ

В результаті виконання дисертаційної роботи було ідентифіковано 6 структурних генів біосинтезу рибофлавіну дріжджів Candida famata. Ідентифіковано гени позитивного типу дії CKA2, MET2 та SEF1, що регулюють процес біосинтезу вітаміну В2. Головні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Отримано та біохімічно охарактеризовано колекцію реципієнтних штамів для клонування структурних генів, задіяних у біосинтезі рибофлавіну C. famata (leu2rib1, leu2rib2, leu2rib5, leu2rib6, leu2rib7).

2. Клоновано гени RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної гомологічної/гетерологічної комплементації, що кодують ГТФ-циклогідролазу ІІ, 2,5-диаміно-4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5’-фосфат-редуктазу, 6,7-диметил-8-рибітиллюмазинсинтазу, 3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу та рибофлавінсинтазу, відповідно.

3. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ізольовано та ідентифіковано ген RIB3 D. hansenii, що кодує 2,5-диаміно-4-окси-6-рибітиламінопіримідин-5’-фосфатдезаміназу.

4. Показано здатність ідентифікованих генів біосинтезу рибофлавіну C. famata / D. hansenii комплементувати відповідні мутації у іншого виду флавіногенних дріжджів P. guilliermondii.

5. Виділено та охарактеризовано мутанти C. famata, що втратили здатність до надсинтезу рибофлавіну за умов дефіциту іонів заліза. Розроблено метод позитивної селекції для ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії з банку генів C. famata методом функціональної комплементації на середовищі з фторацетатом.

6. Ідентифіковано ген CKA2 (каталітична б’ субодиниця казеїнкінази 2), що супресує нездатність до надсинтезу рибофлавіну за умов дефіциту іонів заліза в середовищі.

7. Оптимізовано метод інсерційного мутагенезу для отримання мутантів та ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії, що контролюють флавіногенез у дріжджів C. famata.

8. Ідентифіковано гени позитивного типу дії CfMET2 (гомосерин-О-ацетилтрансфераза) та CfSEF1 (потенційний транскрипційний фактор), що залучені в регуляцію біосинтезу рибофлавіну.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Voronovsky A., Abbas C., Fayura L., Kshanovska B., Dmytruk K., Sibirna K., Sibirny A. Development of a transformation system for the flavinogenic yeast Candida famata. // FEMS Yeast Research. – 2002. –P. 1-8.

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті. Здобувач особисто здійснив конструювання банку генів флавіногенних дріжджів C. famata).

2. Dmytruk, K., Abbas, C., Voronovsky, A., Kshanovska, B., Sybirna, K., Sibirny, A. Cloning of structural genes involved in riboflavin synthesis of the yeast Candida famata // Ukr. Biokhim. Zh. – 2004. - Vol. 76. – P. 78–87.

(Дисертант опрацював дані літератури та власні результати, йому належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті).

3. Voronovsky, A.Y., Abbas, C.A., Dmytruk, K.V., Ishchuk, O.P., Kshanovska, B.V., Sybirna, K.A., Gaillardin, C., Sibirny, A.A. Candida famata (Debaryomyces hansenii) DNA sequences containing genes involved in riboflavin synthesis // Yeast. – 2004. - Vol. 21. – P. 1307-1316.

(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті).

4. Abbas C., Voronovsky A.,