(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів. Дисертантом особисто ізольовано з банку генів та проаналізовано фрагменти, що комплементують мутації першої та п’ятої біохімічних груп штамів C. famata ауксотрофів по РФ).

5. Andrii Sibirny, Kostyantyn Dmytruk, Olena Ishchuk, Oksana Chmil, Barbara Kshanovska, Andrii Voronovsky, Charles Abbas. Development of a transformation system for the flavinogenic yeast Candida famata. // 9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Abstracts of 9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Gyeongju, Korea, 2002, P. 130.

(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді).

6. A.Y. Voronovsky, K.V. Dmytruk, O.P. Ishchuk, C.A. Abbas, A.A. Sibirny. Cloning of structural genes involved in riboflavin synthesis of industrial flavinogenic yeast Candida famata. // 1st FEMS Congress of European Microbiologist, Abstracts of 1st FEMS Congress of European Microbiologist, Lubljana, Slovenia, 2003, P. 477.

(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді).

7. Andrei A. Sibirny, Kostyantyn V. Dmytruk, Olena P. Ishchuk, Andriy Y. Voronovsky, Charles A. Abbas. Cloning of structural and regulatory genes of riboflavin synthesis of industrial flavinogenic yeast Candida famata. // 21st International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Abstracts of 21st International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gotheburg, Sweden, 2003, P. S222.

(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді. Дисертант особисто ідентифікував регуляторний ген позитивного типу дії СKА2 C. famata, що кодує каталітичну субодиницю казеїнкінази 2).

8. Дмитрук К.В. Розробка методу інсерційного мутагенезу флавіногенних дріжджів Candida famata з метою клонування регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну // Сімнадцята наукова сесії наукового товариства ім. Шевченка. м. Львів, Україна, 2006, С. 20.

(Дисертант особисто проводив дослідження, опрацювання та аналізі експериментальних даних. Дисертант вперше ідентифікував регуляторні гени позитивного типу дії MET2, SEF1, залучені в регуляції біосинтезу РФ C. famata).

9. Дмитрук К.В. Розробка методу інсерційного мутагенезу флавіногенних дріжджів Candida famata // Конференція-конкурс молодих учених (м. Київ, Україна, 2006, С. 12).

(Дисертант проводив дослідження, опрацювання та аналізі експериментальних даних. Дисертант вперше ідентифікував регуляторні гени позитивного типу дії MET2, SEF1, залучені в регуляції біосинтезу РФ C. famata).

АНОТАЦІЯ

Дмитрук К.В. Ідентифікація структурних та регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у флавіногенних дріжджів Candida famata. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2006.

Дисертацію присвячено ідентифікації структурних та регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну (РФ) у флавіногенних дріжджів C. famata. Методом гомологічної / гетерологічної комплементації клоновано гени RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata що кодують ГТФ-циклогідролазу ІІ, 2,5-диаміно-4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5’-фосфатредуктазу, 6,7-диметил-8-рибітиллюмазин-синтазу, 3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу та рибофлавінсинтазу, відповідно. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ізольовано та ідентифіковано ген RIB3 D. hansenii, що кодує 2,5-диаміно-4-окси-6-рибітиламінопіримідин-5’-фосфатдезаміназу. Показано, що б’-субодиниця казеїнкінази 2 опосередковано залучена у регуляцію біосинтезу РФ. За допомогою оптимізованого для C. famata методу інсерційного мутагенезу, вперше ідентифіковано регуляторні гени позитивного типу дії, що контролюють флавіногенез у дріжджів C. famata: CfMET2 (гомосерин-О-ацетилтрансфераза) та CfSEF1 (потенційний транскрипційний фактор).

Ключові слова: рибофлавін, флавіногенні дріжджі, клонування генів, регуляторні гени, регуляція біосинтезу рибофлавіну.

АННОТАЦИЯ

Дмитрук К.В. Идентификация структурных и регуляторных генов биосинтеза рибофлавина у флавиногенных дрожжей Candida famata. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2006.

Диссертация посвящена идентификации структурных и регуляторных генов биосинтеза рибофлавина (РФ) у флавиногенных дрожжей C. famata. Биохимическая характеристика позволила идентифицировать РФ-зависимые мутантны C. famata и разделить полученные штаммы по биохимическим группам. Штаммы пяти разных биохимических групп трансформировали генной библиотекой C. famata. Плазмиды, восстанавливающие ауксотрофность по РФ, были выделены из трансформантов штаммов первой, второй, второй подгруппы четвертой и пятой биохимических групп. Идентификация генов, комплементирующих мутации третьей и первой подгруппы четвертой биохимических групп проводилась в гетерологичной системе флавиногенных дрожжей P. guilliermondii из-за нестабильности гомологичных реципиентных штаммов. Таким образом, был клонирован ген RIB5. С помощью полимеразной цепной реакции удалось выделить и идентифицировать ген RIB3 D. hansenii. Фрагменты ДНК C. famata / D. hansenii в составе изолированных плазмид эффективно комплементировали соответствующие мутации ранее идентифицированных РФ-зависимых мутантов P. guilliermondii. Последовательности нуклеотидов изолированных фрагментов характеризировались высокой степенью гомологии к ортологам других видов дрожжей. Следовательно, фрагменты, комплементирующие дефекты пути биосинтеза РФ несут гены RIB1, RIB2, RIB3, RIB5, RIB6 и RIB7, кодирующие ГТФ-циклогидролазу ІІ, 2,5-диамино-4-окси-6-рибозиламинопиримидин-5’-фосфатредуктазу, 2,5-диамино-4-окси-6-рибитиламино-пиримидин-5’-фосфатдезаминазу 6,7-диметил-8-рибитиллюмазинсинтазу, 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу и РФ-синтазу, соответственно.

Выделение мутантов с поврежденными генами позитивного типа действия проводили с помощью ультрафиолетового мутагенеза в два этапа. Первоначально были отобраны штаммы, которые проявляли ауксотрофность по РФ на среде с оптимальным для роста содержанием ионов железа и прототрофность на среде с дефицитом ионов железа или при добавлении ионов кобальта (Со2+). Далее отбирались мутанты, которые после кратковременного температурного шока в условиях дерепрессии генов биосинтеза РФ оставались жизнеспособными. В результате проведенной селекции были отобраны штаммы неспособные к сверхсинтезу РФ и накоплению флуоресцентных интермедиатов РФ при культивировании в среде с дефицитом ионов железа. Полученные мутанты проявляли повышенную чувствительность к фторацетату (0,2 – 1%) при росте на среде с глицерином. Последующее клонирование соответствующих мутаций проводилось с помощью позитивной селекции на среде с фторацетатом. С помощью гомологичной комплементации, используя мутантные штаммы с дефектом регуляции биосинтеза РФ, идентифицирован ген СKА2 (кодирует б’-каталитическую субъединицу казеинкиназы 2), который супрессирует данную мутацию. Усиление экспрессии СKА2 привело к увеличению продуктивности флавиногенеза в 6-7 раз. Из этого следует, что СKА2 вовлечен в позитивную регуляцию биосинтеза РФ.

Для последующего клонирования генов, регулирующих биосинтез РФ, был оптимизирован метод инсерционного мутагенеза. В качестве инсерционного агента использовали нерепликативную плазмиду с маркерным геном LEU2 S. cerevisiae. Перед электротрансформацией вектор линеаризировали рестриктазой SalI. Соответствующую эндонуклеазу рестрикции добавляли также и в трансформирующую смесь. Максимальная частота трансформации наблюдалась при добавлении 5 – 6 МЕ SalI и составляла приблизительно 200 трансформантов/мкг ДНК. Увеличение количества рестриктазы до 10 МЕ не влияло на частоту трансформации. Добавление больших количеств эндонуклеазы рестрикции значительно уменьшало частоту трансформации. При трансформации линеаризированной плазмидой без добавления ресриктазы, частота трансформации снижалась лишь в 1,5 раза и составляла приблизительно 130 трансформантов/мкг ДНК. С помощью Саузерн-гибридизации показано, что инсерционная кассета интегрируется случайно, вне сайтов SalI независимо от добавления рестриктазы. Также было показано, что 95% трансформантов содержат одну копию инсерционной кассеты в геноме, и лишь 5% - две копии. Секвенирование сайтов инсерции продемонстрировало, что последовательность сайтов рестрикции не восстанавливается, кроме того, при инсерции наблюдается делетирование нескольких нуклеотидов в интегрируемом локусе. Используя методологию инсерционного мутагенеза, нам впервые удалось идентифицировать гены, принимающие участие в регуляции биосинтеза рибофлавина. Ими оказались ортологи генов S. cerevisiae: MET2 (кодирует гомосерин-О-ацетилтрансферазу), а также SEF1 (ген транскрипционного фактора с неизвестной функцией).

Ключевые слова: рибофлавин, флавиногенные дрожжи, клонирование генов, регуляторные гены, регуляция биосинтеза рибофлавина.

SUMMARY

Dmytruk K.V. Identification of structural and regulatory genes for riboflavin biosynthesis in the flavinogenic yeast Candida famata. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology by speciality 03.00.07 – microbiology. – Institute of Cell Biology, National Academy of Science of Ukraine, Lviv, 2006.

The work is devoted to identification of structural and regulatory genes for riboflavin (RF) synthesis in the flavinogenic yeast C. famata. Genes RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 and RIB7 of C. famata (coding for GTP cyclohydrolase II, 5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil reductase, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase, 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase and RF synthetase, respectively) were cloned using functional complementation method. The gene RIB3 of D. hansenii (coding for 2,5-diamino-6-ribitylamino-4(3H)-pyrimidinone-5'-phosphate deaminase) was PCR-isolated and identified. There was demonstrated that the б’ subunit of casein kinase 2 is involved in the regulation of RF synthesis. Using the developed method of insertional mutagenesis, the two positive regulatory genes of RF synthesis were identified. Such genes are CfMET2 (homoserine-O-acetyltransferase) and SEF1 (putative transcription factor).

Key words: riboflavin, flavinogenic yeasts, gene cloning, regulatory genes, regulation of riboflavin biosynthesis.